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Corynebacterium pseudotuberculosis é o agente causador da Linfadenite caseosa (LC), doença que acomete pequenos ruminantes e acarreta diminuição de produtividade e prejuízos no agronegócio. Diferentes abordagens são estudadas visando o controle desta doença através da identificação de novas drogas ou desenvolvimento de testes diagnóstico e vacina. No entanto, ainda não foi alcançada eficácia satisfatória para o controle da LC. O sequenciamento de genomas de Corynebacterium pseudotuberculosis tem possibilitado a identificação de novos fatores de virulência deste microrganismo o que contribui para o melhor entendimento de sua biologia e das relações patógeno-hospedeiro. Neste trabalho, foram selecionadas como alvo de estudo, com base em análises in silico e busca na literatura, as proteínas PLD, PknG, SpaC, SodC e NanH. A PLD representa o principal fator de virulência de C. pseudotuberculosis e as demais são indicadas como potenciais fatores de virulência. Foram realizadas as caracterizações in silico destas proteínas a partir de predições de parâmetros físico-químicos, peptídeo sinal, domínios conservados, avaliação da sua conservação em eucariotos e epítopos. Além disso, as proteínas foram expressas utilizando sistema de expressão heteróga em Escherichia coli e foram testadas cinco diferentes linhagens de expressão. A partir das linhagens que apresentaram o melhor nível de expressão de cada uma das proteínas, avaliou-se a cinética de expressão e a solubilidade da fração protéica. A proteína PknG foi purificada após otimização do protocolo de expressão para obtenção da proteína na fração solúvel e a purificação foi confirmada por Western blot. A partir da purificação das demais proteínas, esperamos avaliá-las quanto à sua antigenicidade e proteção contra infecção. Uma vez que fatores de virulência são importantes candidatos a alvos de drogas, testes diagnóstico ou, ainda, alvos vacinais, a obtenção destas proteínas é importante por viabilizar diversos estudos que podem contribuir para o desenvolvimento de uma estratégia de controle da LC. Corynebaterium pseudotuberculosis is the causative agent of Caseous lymphadenitis (CL), a disease that affects small ruminants and results in decreased productivity and loss in the agribusiness. Different approaches aim the control of this disease by identifying new drugs and developing new vaccines and diagnostic tests. However, there is not yet an satisfactory and efficient method for the control of LC; nevertheless, the sequencing of the genomes of Corynebacterium pseudotuberculosis has enabled the identification of new virulence factors of this microorganism that may contribute to a better understanding of its biology and host-pathogen relationships. In this work, proteins PLD, PknG, SpaC, SodC and NanH were selected as targets of the study based on in silico analysis and literature data mining. PLD is the major virulence factor of C. pseudotuberculosis whereas the others are pointed as potential virulence factors. In silico characterization of these proteins were performed from predictions of physicochemical parameters, signal peptide, conserved domains, assessment of their conservation in eukaryotes and epitopes. In addition, the proteins were also expressed using a heterologous expression system in Escherichia coli and five different strains were tested for expression. By using the strains that showed the highest level of expression of each protein, we assessed the expression kinetics and solubility of the recombinant proteins. The PknG protein was successfully purified after an optimization step of the expression protocol that aimed to obtain the protein in the soluble fraction. Its purification was confirmed by Western blot. Following the purification of the other proteins we will now evaluate them regarding their antigenicity and protection against infection. Since virulence factors are important candidates for drug targets, diagnostic tests or even vaccine targets, obtaining these proteins is important to perform studies that may contribute to the development of a control strategy against LC.

Corynebacterium pseudotuberculosis é uma bactéria patogênica, responsável por diferentes patologias, que trazem grandes prejuízos à agropecuária, como linfangite ulcerativa. Esta doença se manifesta, principalmente, em equinos infectados pela linhagem 258 de C. pseudotuberculosis (biovar equi). Com o objetivo de melhor compreender a biologia deste microrganismo e a dinâmica da expressão gênica no início da fase exponencial de crescimento, um estudo transcricional foi realizado. Através do RNA-seq foi possivel identificar os transcritos presentes nos estresses ácido, térmico e osmótico, condições que simulam o ambiente enfrentado pelo patógeno, durante o processo infeccioso no hospedeiro, e compará-los à condição fisiológica. Assim, após sequenciamento pela plataforma SOLiD V3 plus, os transcritos foram montados pela metodologia ab initio e os dados processados no software Blast2go com atribuições GO (Gene Ontology). As CDSs (coding sequences) foram organizadas dentro de cada categoria e termo GO, pelo software CSI (CoreStImulon), e a categoria processo biológico foi selecionada para análise dos genes. Entre os stimulons, conjunto de genes regulados por uma determinada condição ambiental, o estresse ácido foi o que mais contribuiu para um catálogo gênico, os quais genes relacionados ao combate de espécies reativas de oxigênio, ao estresse térmico, entre outros, foram identificados. O stimulon térmico apresentou resultados interessantes, envolvendo as HSPs (heat shock proteins) como moduladoras da expressão, além de genes de aquisição de ferro e síntese da parede celular. No stimulon osmótico não foi possível verificar a presença de genes relevantes ao estresse, mas possíveis genes envolvidos na virulência e sobrevivência do patógeno foram descritos. Entre os genes compartilhados entre duas ou três condições, destacam-se os genes fts, envolvidos na divisão e ciclo celular, e os envolvidos na síntese de osmoprotetores. Os genes codificantes das proteínas MraZ, Trx, TrxR, proteína semelhante ferritina, SDH, Drp1 e Drp2, já demonstraram um papel protetor relevante em outros organismos, e por isso foram considerados os mais promissores à contribuir para soluções eficazes contra doença provocada por C. pseudotuberculosis e assim minimizar os prejuízos trazidos ao agronegócio. Corynebacterium pseudotuberculosis is a pathogenic bacterium responsible for patologies that may cause losses to livestock. Ulcerative lymphangitis, one of these pathologies, manifests mainly on horses infected by the strain 258 of C. pseudotuberculosis (biovar equi). Aiming a better understanding of the microorganism biology, as well as the dynamic of the gene expression during exponential growth phase, a transcriptional study was realized. Through RNAseq it was possible to identify the transcripts on osmotic stress, acidity, and heat shock, which simulate the environment encountered by the pathogen during the infection process, and compare them to the physiological condition. After sequencing through SOLiD V3 plus, the transcripts were assembly by ab initio methodology and data processed on Blast2go with GO (Gene Ontology) attributions. The CDSs (coding sequences) were organized in each category and GO term through CSI (CoreStlmulon) software, and the biological process category was selected for gene analysis. Among stimulons, a group of genes regulated by a certain environmental condition, acidity stress contributed further for the genic catalog. Genes related to combat against reactive oxygen species and heat shock stress were also identified. The heat shock stimulon involved the HSPs (heat shock proteins) as expression modulators, as well as iron uptake genes and cell wall synthesis. On osmotic stimulon, it was not possible to verify the presence of genes relevant to stress, but genes that may be involved on virulence and pathogen survival were described. Among genes shared on two or three conditions, we highlight fts genes, involved on cell division and cycle, and genes related to osmoprotection synthesis. Coding genes of the proteins MraZ, Trx, TrxR, Dps, ferritin like protein, Drp1 e Drp2 have already demonstrated being relevant on other organisms and, therefore, they may contribute to efficient solutions against C. pseudotuberculosis disease and minimize livestock economic losses.

O desenvolvimento de alimentos que promovem a saúde humana tem sido o foco de diversas pesquisas. Dentre eles, destacam-se os leites fermentados, queijos e iogurtes produzidos a partir de algumas linhagens de bactérias lácticas (BL), consideradas probióticas, pois quando ingeridas exercem efeitos benéficos sobre o hospedeiro. Dentre as BL, Lactococcus lactis figura como microrganismo modelo, devido a sua importância econômica e biotecnológica e por ser considerada segura para consumo humano. Por esse motivo, L. Lactis vêm sendo utilizada como usina para a produção heteróloga de moléculas terapêuticas. Estudos recentes vêm demonstrando o potencial terapêutico de linhagens recombinantes de L. lactis no tratamento de algumas doenças, como as doenças inflamatórias intestinais (IBDs). As IBDs caracterizam-se por causar inflamação severa no trato gastrointestinal. Sua etiologia não é bem compreendida e os tratamentos disponíveis acarretam em sérios efeitos colaterais aos acometidos. Neste contexto, a utilização de linhagens recombinantes de L. lactis expressando moléculas com potencial antiinflamatório, como a 15-Lipoxigenase-1 (15-LOX-1), representa um tratamento alternativo interessante. A 15-LOX-1 é uma enzima envolvida no metabolismo de ácidos graxos, conhecida por possuir potente atividade antiinflamatória. Dessa forma, o presente projeto teve como objetivo construir linhagens de L. lactis capazes de expressar a 15-lox-1 e avaliar sua capacidade antiinflamatória utilizando modelo de inflamação DSS em murinos. A linhagem expressando a forma citoplasmática da enzima mostrou-se capaz de diminuir a inflamação nos animais tratados reduzindo os níveis de citocinas proinflamatórias (IFN-, IL-17, IL-4) e aumentando a citocina regulatória IL-10. Os níveis de imunoglobulina A secretória não apresentaram diferença significativa entre os grupos tratados e não tratados. Portanto, a presente estratégia apresentou-se promissora no tratamento das IBDs em um futuro próximo. Functional foods that are able to promote human health have been the focus of several studies. Fermented milks, cheeses and yogurts produced by some probiotic lactic acid bacteria (LAB) strains are an example as they can exert beneficial effects on the host. The model LAB, Lactococcus lactis, has a great economic importance as it is safe for human consumption and widely used for industrial dairy fermentations. Therefore, L. lactis has been engineered to express and secrete a variety of therapeutic molecules. Recent studies showed the therapeutic potential of recombinant L. lactis strains in the treatment of some diseases, such as inflammatory bowel diseases (IBDs). IBDs are characterized by severe inflammation of the gastrointestinal tract. Its etiology is not well understood and the treatments available may have serious side effects. In this context, the use of recombinant L. lactis strains expressing molecules with potential anti-inflammatory properties, such as 15-Lipoxygenase-1 (15-LOX-1), represents an interesting alternative. 15-LOX-1 is an enzyme involved in fatty acid metabolism, which is known for its strong antiinflammatory activity. Thus, this project aimed to construct L. lactis strains able to express 15-LOX-1 and verify its anti-inflammatory capacity in a chemically induced mouse model of intestinal inflammation (DSS). The strain expressing the cytoplasmic form of the enzyme was able to decrease inflammation in treated animals by reducing the levels of proinflammatory cytokines (IFN-, IL-17, IL-4) and increasing the regulatory cytokine IL-10. No differences were observed in the levels of secretory IgA among treated and untreated groups. This study showed recombinant L. lactis strains expressing 15-Lipoxygenase-1 (15-LOX-1) was able to reduce damage in colon segments from treated animals. Taken together, this strategy appeared to be very promising for the treatment of IBDs in the near future.

As bactérias Streptococcus dysgalactiae e Weissella ceti são consideradas patógenos emergentes para a piscicultura nacional, causando perdas significativas nas cadeias produtivas de tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus) e truta arco-íris (Onchorhynchus mykiss), respectivamente. Os objetivos do presente estudo foram avaliar a diversidade genética de amostras de S. dysgalactiae e W. ceti provenientes de regiões geográficas diversas e desenvolver vacinas eficazes na proteção contra esses patógenos. Diferentes métodos (REP-PCR, ERIC-PCR e PFGE) foram utilizados para caracterização genética das bactérias. A análise do sequenciamento do gene sodA foi utilizada somente para a genotipagem de amostras de S. dysgalactiae. Duas diferentes vacinas foram testadas: bacterina e bacterina emulsificada com adjuvante Montanide. A técnica de PFGE foi a mais eficaz para a genotipagem dos isolados de S. dysgalactiae, detectando três perfis genéticos diferentes. Os padrões genéticos estão associados com a origem geográfica dos isolados. De acordo com os métodos testados, as amostras brasileiras de W. ceti apresentam alta similaridade genética, sendo consideradas clonalmente relacionadas. As vacinas formuladas a partir de células inteiras inativadas (bacterina) emulsificadas em adjuvante oleoso conferiram proteção frente as infecções por S. dysgalactiae (RPS = 92,5) e W. ceti (RPS = 92,0) em tilápia do Nilo e truta arco-íris, respectivamente. Os resultados do presente projeto fornecem informações científicas e ferramentas fundamentais para o controle de duas doenças infecciosas emergentes da piscicultura nacional. Streptococcus dysgalactiae and Weissella ceti have been considered emergent pathogens for Brazilian Nile tilapia (Oreochromis niloticus) and rainbow trout (Onchorhynchus mykiss) farming, respectively. Both diseases cause great economic losses in fish farms. Disease prevention by vaccination is a fundamental method for pathogen control in aquaculture. The aims of this study were to evaluate the genetic diversity of S. dysgalactiae and W. ceti strains isolated from distinct geographic origins and to develop efficient vaccines against these pathogens. Different methods (REP-PCR, ERIC-PCR and PFGE) were used for the genetically characterization of strains of both bacteria, and sodA gene sequencing was also tested for genotyping of S. dysgalactiae isolates. Aqueous-based whole cell killed bacterin and oil-adjuvanted vaccine were tested. The PFGE was the best genotyping method for S. dysgalactiae and detected three different genetic profiles among the evaluated strains. The genetic variability of patterns was clearly associated with the geographic origin of isolates. According to the methods used, Brazilian W. ceti isolates was found to be highly homogeneous with a clonal population. Vaccines formulated with whole cell bacterin emulsified in oil adjuvant provided significant protection against S. dysgalactiae (RPS = 92,5) and W. ceti (RPS = 92,0) infections in Nile tilapia and rainbow trout, respectively. The present results provide scientific information for development of adequate methods to control two emerging infectious diseases that threaten Brazilian fish farming industry.

A evolução das tecnologias de sequenciamento de DNA tem permitido a elucidação da sequência genômica de um número cada vez maior de organismos. Contudo, a obtenção da sequência nucleotídica do genoma é apenas a primeira etapa no estudo dos organismos. O processo de anotação consiste na identicação as diferentes regiões de interesse no genoma e suas funcionalidades. Várias ferramentas computacionais foram desenvolvidas para auxiliar o processo de anotação, porém nenhuma delas permite ao usuário selecionar sequências, processá-las de forma a encontrar evidências a respeito das regiões genômicas, como predição gênica e de domínios protéicos, analisá-las gracamente e adicionar informações a respeito de suas regiões em um mesmo ambiente. Assim, o objetivo desse projeto foi o desenvolvimento de uma plataforma gráca para a anotação genômica que permite ao usuário realizar as tarefas necessárias para o processo de anotação em uma única ferramenta integrada a um banco de dados. A idéia é proporcionar ao usuário liberdade para trabalhar com o seu conjunto de dados, possibilitando a seleção de sequências para análise, construção dos pipelines processamento das mesmas e análise dos resultados encontrados a partir de visualizador que permite ao usuário adicionar in- formações às regiões e fazer a curadoria das sequências. A ferramenta resultante é facilmente extensível, permitindo o acoplamento modular de novas funcionalidades de anotação e sua estrutura permite ao usuário trabalhar tanto com projetos de sequências expressas como anotação de genomas. The evolution of the technologies of DNA sequencing has permitted the elucidation of genomic sequence of an increasing number of organisms. Though, the obtainment of the genome nucleotide sequence is only the rst step in the study of organisms. The annotation process consists in the identication of different regions of interest on the genome and their features. Several computational tools were developed to support the annotation process, however none allow the user to select sequences, process them, analyze them graphically and add information about its regions in the same surrounding. Thus, the aim of this project was to develop a graphic platform to genome annotation that allows the user to realize your tasks required from the annotation process in a single tool integrated to a database. The idea is to provide from the user liberty to work with your dataset, enabling the selection of sequences for analyze, pipeline construction, processing them and analyze of results from the viewer that allows the user to add information in the regions and to do the trusteeship of sequences. The resulting tool is easily extensible; allowing the engagement modular of new functionalities of annotation and its structure allows the user works both projects of expressed sequences and with genome annotation.

Corynebacterium pseudotuberculosis é uma bactéria Gram-positiva, patógeno intracelular facultativo, causador da Linfadenite Caseosa (LC) em caprinos e ovinos. Essa doença consiste em desenvolvimento de abscessos em linfonodos superficiais e internos. A infecção por C.pseudotuberculosis representa um grande impacto na produção de subprodutos da ovinocaprinocultura em diversos países, e até o presente momento não existem informações suficientes a respeito da profilaxia imunológica contra a doença. Portanto, é necessário odesenvolvimento de novas alternativas vacinais contra a LC. Através da mutagênese aleatória utilizando-se o sistema TnFuZ, foi obtida uma linhagem atenuada de C. pseudotuberculosis, chamada de CP13, a qual demonstrou resultados promissores em ensaios de imunização em camundongos. O objetivo deste trabalho foi avaliar a capacidade protetora da CP13 em modelo murino e caprino. Na primeira parte do estudo foram avaliadas as respostas imunes humoral e celular produzidas após uma inoculação intraperinotenal com a linhagem mutante CP13 em camundongos BALB/c. As respostas induzidas foram avaliadas durante 28 dias, com posterior desafio utilizando linhagem virulenta. Títulos de IgG1 e IgG2a no soro foram determinados e as respostas imunes celulares foram medidas por mensuração de TNF-alfa, IL-10, IL-4 e IFN-gama em células esplênicas. O ensaio piloto de imunização em caprinos avaliou o potencial desta linhagem na redução das lesões causadas pela LC. Vinte e três cabritos jovens receberam uma ou duas doses da CP13, por via subcutânea, e uma infecção experimental com linhagem virulenta MIC-6 de C. pseudotuberculosis foi feita 30 dias após a imunização. O perfil de resposta imune do tipo Th1 induzido por esta linhagem recombinante em modelo murino provavelmente é responsável pela proteção observada. Em caprinos, as avaliações realizadas revelaram que o tratamento com duas doses apresenta potencial na redução das lesões em linfonodos após desafio com linhagem virulenta. Corynebacterium pseudotuberculosis is a Gram-positive, facultative intracellular pathogen that causes Caseous Lymphadenitis (CLA) in goats and sheep. CLA consists of abscesses development in superficial and internal lymph nodes. Infection with C. pseudotuberculosis represents a significant economic impact in sheep and goat herd worldwide. Until now, there is no efficient tool for the immune prophylaxis of the disease. Thus, it is need the development of new alternatives against CLA. Through random mutagenesis using TnFuZ, it was obtained an attenuated strain of C. pseudotuberculosis, CP13, which presented promising results in mice vaccination trials. Firstly, theaim of this study was to evaluate the humoral and cellular immune responses in BALB/c mice following one intraperinotenal inoculation with the live mutant strain of C. pseudotuberculosis. The induced responses were assessed over a twenty-eight days period and mice were challenged with a virulent strain. Titers of IgG1 and IgG2a in serum were determined and cellular immune response were evaluated by quantification of TNF-alfa, IL-10, IL-4, IFN-gamma by enzyme linkedimmunosorbent assay in splenocyted. Secondly, a pilot test assessed the potential of this vaccine strain in reducing injuries caused by LC in goats. Twenty-three young goats received one or two doses of the recombinant strain, and an experimental infection with virulent strain MIC-6 of C. pseudotuberculosis were done 30 days post-immunization. The Th1 immune response profile characteristic induced by this recombinant strain in mice is probably responsible for the protection observed. Also the observations in goats revealed that treatment with two doses can be more effective in reducing injuries in lymph nodes.

Nesta dissertação é descrito a gestão do conhecimento científico e tecnológico gerado na Universidade Federal de Minas Gerais - UFMG pautadas em quatro vertentes. Na primeira, foi analisada a gestão da propriedade intelectual aplicada à inovação, por meio das atividades de competência do seu Núcleo de Inovação Tecnológico - NIT, denominado Coordenadoria de Transferência e Inovação Tecnológica CTIT, com o objetivo de apurar os aspectos positivos e negativos da dinâmica realizada e contribuir para a implantação de outros NITs em ambiente universitário. A segunda foi dedicada à análise dos instrumentos jurídicos utilizados na formalização das negociações referente à matéria. Na terceira, foi abordado o regime jurídico que envolve as patentes de medicamentos, com o objetivo de mostrar a atuação do Brasil na tentativa de corrigir os problemas do sistema de patentes brasileiro garantindo o acesso aos medicamentos pela população. E por fim, a quarta e última vertente foi a apresentação de uma compilação das leis brasileiras referente à pesquisa na área biotecnológica, visando analisar sua influência, desde o processo de desenvolvimento da pesquisa utilizando os procedimentos biotecnológicos e a devida proteção dos resultados, até a colocação desses produtos no mercado mediante autorização da Agência Nacional de Vigilância Sanitária ANVISA, com o objetivo de contribuir e facilitar a compreensão dos pesquisadores dedicados à área referente à regulamentação, gerando resultados passíveis de serem produzidos e comercializados, respeitados os procedimentos estabelecidos em lei, para o bem comum. Os resultados auferidos demonstraram que a gestão da inovação é uma atividade relativamente recente no Brasil e em crescente importância, levando o NIT da UFMG a criar uma estrutura organizacional, capacitação de recursos humanos, além de estabelecer regras contratuais específicas na elaboração de instrumentos jurídicos para a formalização dessas transações, identificando as melhores estratégicas que conduzirão à inovação tecnológica. Foi verificada também, a necessidade de formulação de melhores políticas públicas sérias na área da saúde, que reconheça a relevância das pesquisas para a geração de novos medicamentos com melhores poderes de cura, estabelecendo um razoável controle de preços para garantir o acesso da população sem o desrespeito da Propriedade Intelectual; concluindo que as leis brasileiras que regulamentam as pesquisas biotecnológicas, muitas vezes, funcionam como entraves ao desenvolvimento das pesquisas e geração de novos produtos biotecnológicos, merecendo uma revisão legal urgente, visando a fluidez dessas pesquisas em prol da sociedade. In this article, the management of scientific and technological knowledge generated at the Federal University of Minas Gerais - UFMG is described based on four aspects. Foremost, by analyzing the intellectual property management applied to its innovation activities in order to ascertain both positive and negative aspects of the dynamics of the Technological Innovation Center called Coordenadoria de Transferência e Inovação Tecnológica - CTIT, as well as contributing to the implementation of other Technological Innovation Centers in the university environment. The second is dedicated to the analysis of legal instruments used in the formalization of negotiations regarding the matter. In the third, the legal system involving drug patents is covered in order to show the performance of Brazil in an attempt to fix the Brazilian patent system problems of the ensuring the populations access to medicines. The fourth and final part of the presentation is a compilation of the Brazilian law relating to biotechnology researches in order to analyze their influences from the development process of researches using biotechnological procedures and proper protection of the results, up to the placement of these products in the market with the permission of the National Agency for Sanitary Surveillance (Agência Nacional de Vigilância Sanitária ANVISA), with the objective of meeting the needs of dedicated researchers to the regulation field and its knowledge, thereby guaranteeing the results of their research which can generate products capable of being produced and commercialized, since the established procedures by the law is respected and the benefits of this technology is enjoyable by the Brazilian population in the most efficient manner. The Actual results demonstrate that innovation management is a relatively recent and increasingly important activity in Brazil, which warrants the Núcleo de Inovação Tecnológico (NIT) UFMGs creation of an organizational structure, human resources training, and specific contractual rules in the preparation of legal instruments to formalize these transactions, identifying the best strategies that will lead to technological innovation. There was also verification of the need for serious public policy formulation in the health field which recognizes the importance of research in generating new drugs with better healing powers by establishing a reasonable price control of these drugs to ensure access of the population without disregarding the Intellectual Property aspect; besides concluding that the Brazilian laws which regulate biotechnology research often act as barriers to the development of research and generation of new biotechnology products, and such deserve urgent legal review aiming at the fluidity of this research in benefit of the society.

Corynebacterium pseudotuberculosis is the causative agent of diverse communicable diseases in small ruminants (biovar ovis), horses, camels, buffalo and other animals (biovar equi), which mainly differ in symptoms and site of infection. Additionally, the diseases present a highly important economic problem worldwide and there is still a lack of efficient treatments against C. pseudotuberculosis. In this work, we describe the steps from the first genome sequencing of a strain of C. pseudotuberculosis to the pangenomic analyses of 15 strains isolated from different hosts and countries with diverse symptoms. Briefly, we introduce the genus Corynebacterium and the in silico analyses performed in pathogenic species of this genus to date. Then, we describe the implementation of a software for the prediction of pathogenicity islands (PAIs) in bacteria (PIPS), which outperformed the other available software, and identified 7 PAIs with important virulence factors in C. pseudotuberculosis biovar ovis. Moreover, we extend the analyses of PAIs to strains of C. pseudotuberculosis biovar equi and predict 49 putative vaccine targets, in silico, which are commonly shared by both biovars, ovis and equi. Finally, we present the phylogenomic, pan-genomic, core genomic, singletons and genomic plasticity analyses of the 15 strains of C. pseudotuberculosis, from both biovars. All the analyses performed here point for a clonal-like behavior of C. pseudotuberculosis, which could be the result of the facultative intracellular behavior of the species. Moreover, the biovar equi presents a higher variability in gene content when compared to biovar ovis, specially in PAI regions. Noteworthy, the strains from biovar ovis present a high degree of similarity in pili clusters of genes, whereas the biovar equi strains are very variable. The conservation of pili clusters of genes in biovar ovis could account for the ability of these strains to spread inside host tissues and penetrate live cells to live intracellularly, where they would have less contact to other organisms, thus, possibly explaining the clonal-like behavior of the biovar ovis.

Corynebacterium pseudotuberculosis (Cp) é o agente etiológico de diversas doenças infecciosas e contagiosas crônicas, incluindo linfadenite caseosa (LC), linfangite ulcerativa, mastite e doença edematosa da pele e afeta um amplo número de hospedeiros. Neste trabalho, primeiramente, foi realizada a anotação gênica manual em duas linhagens de C. pseudotuberculosis utilizando a ferramenta Artêmis. A linhagem Cp162, isolado de camelo no Reino Unido e a P54B96, isolada de antílope na África do Sul, as quais tem genomas de 2.293.464 pb e 2.337.657 pb, 52,17% e 52,2% de conteúdo GC, 2002 e 2084 sequências codificadoras, 87 e 62 pseudogenes respectivamente. Ambas possuem 49 genes de tRNA e 4 operons de rRNA. Os genomas foram depositadas no banco de dados do NCBI GenBank sob os números de acesso CP003652 e CP003385, respectivamente. No segundo momento foram usados 15 genomas de C. pseudotuberculosis para um estudo em larga escala das proteínas preditas a partir destas sequências genômicas, através de técnicas de bioinformática e modelagem comparativa, usando o workflow MHOLline. Somente as sequências de qualidade, categorizadas em muito alta, alta, boa e média a boa foram usadas a partir dos grupos classificados por MHOLline. Usando alguns scripts desenvolvido pela equipe do LGCM, foram selecionadas um conjunto de 331 proteínas conservadas, que apresentavam estruturas 3D e considerando 95-100% de similaridade entre sequências intra-espécies. Visando identificar proteínas essenciais homólogas e não homólogas aos hospedeiros humano, equino, bovino e ovino, o core-modeloma foi filtrado resultando em um conjunto final de 10 proteínas. Apenas quatro proteínas foram identificadas como essenciais e não homólogas e foram consideradas como alvos putativos para drogas e vacinas, submetidos a triagem virtual e análises de docking. Adicionalmente, entre outros, um parâmetro para avaliar a drogabilidade de todas as proteínas, também foi calculado, permitindo a predição de cavidades das proteínas. Pesquisamos as outras 6 proteínas essenciais e homólogas realizando uma análise profunda das suas estruturas (Cp e dos hospedeiros) em nível de resíduos confirmando alguns resíduos conservados nos sítios ativos com conformações diferentes ou resíduos completamente diferentes. A conservação desses resíduos foi validada através de um alinhamento múltiplo de sequências. Além disso, o papel destes alvos em diferentes vias metabólicas bacterianas, patogenicidade e virulência também foram determinados. Baseado nesses estudos, as 4 proteínas essenciais e não homólogas foram propostas como potenciais alvos para tratamento e as 6 proteínas essenciais e homólogas também podem ser utilizadas como possíveis alvos terapêuticos devido às diferenças observadas em resíduos conservados. Espera-se que os nossos dados possam ajudar na seleção de proteínas de C. pseudotuberculosis para o desenvolvimento bem sucedido de novas drogas e vacinas para uma ampla classe de hospedeiros. Corynebacterium pseudotuberculosis (Cp) is the etiological agent of several infectious and contagious chronic diseases, including caseous lymphadenitis (CLA), ulcerative lymphangitis, mastitis, and edematous skin disease thus affecting a broad spectrum of animal hosts, including ruminants that cause a huge decrease in wool production and carcass quality, thus threatening economic and dairy industries worldwide. In this work, first, manual annotation was performed using Artemis: the annotation tool, for two C. pseudotuberculosis strains. For Cp162, isolated from a camel in UK and completely sequenced using the SOLiD v3 Plus NGS platform, a genome of 2,293,464 bp in size, having 52.17% GC content, 2,002 coding sequences, 4 rRNA operons, 49 tRNA genes, and 87 pseudogenes, was obtained. For strain P54B96, isolated from an antelope in South Africa and sequenced using the Ion Torrent PGM NGS platform, a genome of 2,337,657 bp in size, having 52.2% GC content, 2,084 coding sequences, 4 rRNA operons, 49 tRNA genes, and 62 pseudogenes, was obtained. They were deposited in the NCBI GenBank database under accession numbers CP003652 and CP003385, respectively. Motivated by an increasing demand for new drug and/or vaccine targets, secondly, a novel strategy using a highthroughput workflow, called MHOLline, was followed to construct the modelome (3D models) of 15 C. pseudotuberculosis strains from various hosts and countries. Only Very High, High, Good and Medium to Good quality sequences were used from MHOLline classified groups(G2). Using a locally installed BALST NCBI tool, a set of 331 conserved proteins with 3D structures was selected showing 95-100% intra-species sequence similarity. The host proteomes considered in this study were human, horse, cow and sheep. Further filtering this core-modelome for essential and non-host homologous proteins, resulted in a final set of 10 proteins. Among these, only 4 proteins were identified as essential and non-host homologous and were considered as putative drug and vaccine targets, subjected to virtual screening and docking analyses. The druggability score, a drug target prioritization parameter, among others, was also calculated for all these proteins, allowing the prediction of druggable protein cavities. We further extrapolated our research to the other 6 essential host homologous proteins. A deep structure analysis at their residue level confirmed some conserved active site residues either exhibiting different conformations or even completely different residues. A multiple sequence alignment proved the residues conservation in these targets. Further, the role of these targets in different bacterial metabolic pathways, pathogenicity and virulence were also determined. It was proposed that the 6 essential host homologous proteins might also provide an extended choice for therapeutic targets. It is expected that our data will facilitate selection of C. pseudotuberculosis proteins for successful designing of new drugs and vaccines for a broad range of hosts.

In the last decade, robust sequencing technologies have revolutionized the genomic science. As a result, comparative genomics is now recognized as a new discipline. Comparative microbial genomics exploits both similarities and differences in the genomes, proteome, trascriptome, and regulatory regions of different organisms to infer the evolutionary relations, along with conserved and unique characteristics of species. These analyses have resulted in some surprising biological discoveries in the recent past. This study presents comparative genomic analysis of multiple pathogenic and non-pathogenic bacteria from related species, to dissect the genomic information and to get insights into evolutionary relationships, conserved information and mechanisms of pathogenicity. Starting from genus Corynebacterium, 11 representative species are analysed and compared, resulting in 741 conserved Gene Families (GFs) in all of them, and significant intra-species proteome similarities (98-99%) were observed. Subsequently, the pan- (7059 GFs) and core genome (552 GFs) of genus Campylobacter is estimated. A detailed comparative pathogenomic study of Campylobacter fetus subspecies resulted in identification of common and novel regions associated with pathogenicity; and species specific virulence factors and vaccine candidates have been characterized. Furthermore, comparative genomics and pathogenomics analysis of the genus Helicobacter (46 genomes) is accomplished. 38 Helicobacter pylori were found to share 1,185 core gene families representing ~77% of the average genome size. The core essential genes families (EGFs) are ascertained, and explored for potential therapeutics against H. pylori. In conclusion, we propose that, these observed genomic variations, species specific features and core virulence factors will enhance understanding of the lifestyle of the organisms, and will contribute to the development of antibiotics, drugs and vaccines.

Objetivou-se com o presente trabalho realizar um levantamentoepidemiológico da linfadenite caseosa em rebanhos mistos de ovinos ecaprinos e rebanho de ovinos nas mesorregiões Norte e Vale doJequitinhonha no estado de Minas Gerais. A amostragem foi realizada em dois níveis: propriedades e animais. Foram analisadas, de forma aleatória, 38 fazendas, 28 delas na mesorregião Norte 14 rebanhos mistos e 14 rebanhos de ovinos e 10 fazendas no Vale do Jequitinhonha, com rebanhos de ovinos. Em cada propriedade foi aplicado um questionário, e 10% do rebanho adulto, com o número mínimo de oito animais, foi submetido a análise clínica e coleta de sangue para o teste sorológico. A distribuição da frequência de soropositivos foi comparada com variáveis individuais por meiodo teste de qui-quadrado com 0,05 de significância. O número de animais soropositivos foi maior que o número de animais clinicamente positivos. Todos os animais que apresentaram positividade no exame clínico tiveram confirmação no exame sorológico. Todas as propriedades possuíam pelo menos um animal clinicamente positivo. Não houve diferença estatística entre as mesorregiões para ambos os testes. Os rebanhos com ovinos apresentaram menor positividade (44,8%) em relação aos rebanhos mistos (56,2%) no teste sorológico e não diferiram no teste clínico. Ao analisar as espécies de pequenos ruminantes independente do rebanho, a frequência foi de 70,7% em caprinos, enquanto que para ovinos foi de 44,3%. Todas as propriedades amostradas não realizavam quarentena ao introduzir umanimal, realizavam trânsito de animais entre as propriedades próximas e não vacinavam os animais contra a linfadenite. Quanto à limpeza das instalações, nenhuma propriedade apresentou limpeza excelente, e as propriedades cuja higienização foi classificada como ruim tiveram a maior incidência da doença. A incidência da linfadenite caseosa nas propriedades que adquiriam animais de outros estados foi maior do que as que compravam apenas de Minas Gerais. As propriedades que contavam com acompanhamento de um profissional tiveram menor incidência da linfadenite, além disso foi verificado também a influência do manejo correto da doença. Diante disso é possível inferir que o exame sorológico consiste na forma mais eficaz de verificação da doença, e apresentou maior ocorrência em caprinos do que ovinos. Omanejo higiênico-sanitário, bem como o controle da linfadenite caseosa, pode auxiliar na redução da ocorrência dessa doença, que encontra disseminada nas mesorregiões estudadas. The aim of this study was to perform an epidemiological survey of Caseous Lymphadenitis in mixed herds of sheep and goats and sheep herd in the northern and Jequitinhonha Valley mesoregions in the state of Minas Gerais. The sampling was conducted at two levels, property and animals. They were analyzed 38 randomly farms, 28 in the North mesoregion, 14 mixed herds and 14 sheep herds, and 10 farms in Jequitinhonha Valley with sheep herds. In each farm was applied a questionnaire, and 10% of adult herd, with the minimum of eight animals was submitted to clinical examination and blood sampling for serological testing. The frequency distribution of seropositive was compared with individual variables by means of chi-square with 0,05 significance level. The number of seropositive animals was greater than the number of animals clinically positive. All animals that were positive on clinicalexamination were confirmed by serological examination. All the properties had at least one clinically positive animals. There was no statistical difference between the mesoregions for both tests. The herds with sheep showed lower positivity (44,8%) compared to mixed herds (56,2%) in serum test and did not differ in clinical testing. In analyzing the species of small independent ruminants of the herd, the frequency was 70.7% in goats, while for sheep was 44,3%. All properties sampled did not perform to enter a quarantine animal, performed movement of animals between properties near and did not vaccinate the animals against lymphadenitis. As regards the cleaning the premises, no property had excellent cleaning and properties which sanitizing were classified as poor had the highest incidence of the disease. The incidence of Caseous Lymphadenitis in the properties that acquired animals from other states was higher than those who just bought of Minas Gerais. In the properties that relied on a professional monitoring had lower incidence of lymphadenitis, furthermore it was also verified the influence of the correct management of the disease. At this it is possible to infer that the serological test is the most effective way to check the disease and occurred mostly in goats than sheep. The hygienic-sanitary management as well as the control of Caseous Lymphadenitis can help reduce in the occurrence of this disease, which is widespread in the mesoregions studied.

Corynebacterium pseudotuberculosis é uma bactéria Gram-positiva que causa a Linfadenite Caseosa (LC), uma doença infecto-contagiosa crônica que acomete pequenos ruminantes, promovendo a redução da produtividade dos animais infectados. A doença se caracteriza pela formação de abscessos em nódulos linfáticos superficiais e/ou órgãos internos. Vários métodos para o diagnóstico da LC subclínica foram desenvolvidos, porém não alcançaram eficácia e praticidade satisfatórias. Assim, nesse trabalho selecionamos seis alvos protéicos dos 104 previamente descritos, caracterizamos os produtos gênicos das Open Reading Frame(ORFs) e produzimos as proteínas recombinantes para a otimização de um Teste Intradérmico de Hipersensibilidade (TIH) paraa LC. Os insertos das seis ORFs foram amplificados após a extração do DNA genômico da linhagem 1002 de C. pseudotuberculosiscom a utilização de iniciadores específicos, que ligados aos vetores pAE e pET-28a foram transformados em Escherichia coliDH5para a clonagem molecular. Para verificar a expressão das proteínas recombinantes, os clones foram transformados em E. coli C43 pLysSe a cinética de expressão realizada. Duas proteínasrecombinantes foram produzidas e submetidas a Western blotcom soros de caprinos infectados com C. pseudotuberculosis, demonstrando antigenicidade nesses testes preliminares. Novos testes de caracterização das proteínas recombinantes serão realizados e esperamos que as mesmas possam ser utilizadas na otimização de um TIH de elevada acurácia, para o controle da LC nos rebanhos de ovinos e caprinos. Corynebacterium pseudotuberculosisis a Gram-positive bacterium that causes caseous lymphadenitis (CLA), a chronic infectious disease that affects small ruminants, promoting the reduction of productivity of infected animals. The disease is characterized by the formation of abscesses in the lymph nodes surface and/or internal organs. Several methods for the diagnosis of subclinical CLA been developed, but have not reached satisfactory efficacy and practicability. Thus, this study selected six of the 104 proteins targets previously described, we characterize the genics products of the Open Reading Frame(ORF) and produce recombinant proteins for the optimization of an Intradermal Hypersensitivity Test (IHT) to LC. The inserts of the six ORFs were amplified after extraction of genomic DNA from strain 1002 of C. pseudotuberculosiswith the use of specific primers which bound to vectors pAE and pET-28a were transformed into Escherichia coliDH5for molecular cloning. To verify the expression of recombinant proteins, clones weretransformed into E. coliC43 pLysS and expression kinetics performed. Two recombinant proteins were produced and subjected to Western blotwith sera from goats infected with C. pseudotuberculosis, demonstrating antigenicity in these preliminary tests. New tests for characterization of recombinant proteins will be made and hopefully they can be used in the optimization of an IHT high accuracy for control of CLA in flocks of sheep and goats.

Corynebacterium pseudotuberculosis é uma bactéria Gram-positiva pertencente à Classe das Actinobactérias. Esta bactéria é um patógeno intracelular facultativo causadora da patologia Linfadenite Caseosa (LC) em ovinos e caprinos. Durante o processo de infecção estas bactérias são contidas por células da resposta imune inata, sendo as principais células efetoras dessa defesa os neutrófilos e macrófagos. Este trabalho foi proposto com o intuito de avaliar a resposta de macrófagos murinos derivados de monócitos de medula, in vitro, em infecção por C. pseudotuberculosis linhagem CP13, um mutante para um gene relacionado ao transporte de ferro em Corynebacterium diphtheriae, que gerou bons níveis de proteção em subsequentes desafios contra C. pseudotuberculosis, e observar o perfil de resposta gerado por essas culturas. Este tipo de caracterização possibilita inferir a participação da resposta imune inata na ação contra infecções desta bactéria. Com os resultados obtidos neste trabalho, conseguimos observar que esta bactéria é responsável por diminuir a viabilidade das culturas de macrófagos em uma proporção que depende da concentração de bactérias inoculadas nas culturas de células. A infecção, em macrófagos, por C. pseudotuberculosis, foi responsável por ativar a produção de óxido nítrico (NO) e induzir a atividade da enzima arginase I, além de mostrar que este aumento da produção de NO e atividade da enzima arginase I estão relacionados ao aumento da expressão do RNAm para a enzima Inducible Nitric Oxide Synthase (iNOS) e arginase I. Nossos resultados mostram, também, que a linhagem CP13 não induz a produção de ROS e que comparada com a linhagem T1, linhagem selvagem do qual foi derivada a linhagem CP13, induz maior produção da citocina IL-10 e menos TNF-, em macrófagos. Com estes dados, pudemos inferir que a linhagem CP13 apresenta um perfil similar de ativação dos macrófagos, quando comparados com a linhagem T1. Entretanto houve diferença no perfil de citocinas induzidas por infecção em macrófagos pelas linhagens T1 e CP13, onde está última induziu mais IL-10 (citocina associada a um perfil de maior susceptibilidade a infecções microbianas). Corynebacterium pseudotuberculosis is a Gram-positive bacterium that belongs to the class Actinobacteria. This bacterium is a facultative intracellular pathogen that causes the disease caseous lymphadenitis (CL) in sheep and goats. During the process of infection by these bacteria are contained cells of the innate immune response, among which the main effectors defensives cells are neutrophils and macrophages. This work has been proposed with the aim of assessing the response of murine bone marrow monocyte-derived macrophages in in vitro infection with the CP13 strain of C. pseudotuberculosis - a knockout mutant for a gene related to the transportation of iron in Corynebacterium diphtheriae that generated good levels of protection against subsequent infections C. pseudotuberculosis - and observe the response profile generated by these cultures. This type of characterization allows the inference of the involvement of innate immune response against infections caused by this bacterium. So far, it was observed that this bacterium is responsible for diminishing the viability of the macrophage cultures in a ratio which depends on the concentration of bacteria inoculated in the cell cultures. The infection of macrophages by C. pseudotuberculosis was responsible for triggering the production of nitric oxide (NO) and inducing the activity of the enzyme arginase I. Also, it showed that the increase in the production of NO and in the activity of the enzyme arginase I are associated with increased expression of the enzyme Inducible Nitric Oxide Synthase (iNOS) and arginase I mRNA. The results also show that strain CP13 does not induce the production of ROS and, compared to the strain T1 - wild-type strain from which the CP13 strain was derived; it induces increased production of the cytokine IL-10 and decreased production of TNF- in macrophages. With these data, it could be infered that the strain CP13 has a similar profile of activation of macrophages compared to the strain T1. However, there was no difference in the profile of cytokines induced in macrophages by infection by strains T1 and CP13, in which the latter induced more IL-10 (cytokine profile associated with an increased susceptibility to microbial infection).

Apresenta-se o desenvolvimento de um método para recuperar proteínas que são alvos drogáveis. A partir da representação desses alvos como vetores definidos a partir das anotações do InterPro, instrumentos da álgebra linear relacionados com a decomposição por valores singulares são utilizados para organizar semanticamente o espaço vetorial e permitir a recuperação eficiente das proteínas similares a uma dada consulta. Relações não observadas prima facie são descortinadas indicando, oportunidades para reposicionamento de fármacos conhecidos, estratégias para o desenvolvimento racional de novos compostos e a predição de potenciais alvos drogáveis e de efeitos colaterais latentes. As assinaturas do InterPro mais relevantes para discriminar alvos drogáveis e não-drogáveis foram determinadas por regressão logística. Os resultados são avaliados estatisticamente por análise de curvas ROC e dados corroborados em outros trabalhos. This work presents the development of a method for recovering target proteins that are druggable. From the representation of drug targets defined as vectors by using InterPro annotations, tools of linear algebra related to singular value decomposition are used to organize the semantic vector space and allow the efficient recovery of proteins related to a given query. Not prima facie relationships arise and indicate drug repositioning opportunities, rational development strategies and, the prediction of potential druggable targets and latent side-effects. The InterPro signatures which are most relevant to drug target/non-drug target discriminating were selected by logistic regression. The results are statistically evaluated by ROC curves analysis and data corroborated in the literature.

Corynebacterium pseudotuberculosis e um patogeno intracelular de grande relevancia veterinaria que infecta pequenos ruminantes, causando uma enfermidade conhecida como Linfadenite Caseosa (LC). Esta doenca e distribuida mundialmente e esta associada a grandes perdas economicas. Apesar do processo patologico da LC ser bem entendido, existem poucos estudos sobre os determinantes moleculares de virulencia de C. pseudotuberculosis. Neste contexto, nosso grupo de pesquisa tem se dedicado ao estudo das proteinas moduladoras da expressao genica, tais como os fatores sigmas da RNA polimerase bacteriana. A regulacao da expressao genica realizada por fatores sigma alternativos e crucial para a sobrevivencia bacteriana em condicoes ambientais hostis, como a encontrada no ambiente intrafagossomico durante a infeccao. O fator sigma ÐE e o regulador transcricional mais estudado de C. pseudotuberculosis, tendo sido demonstrado seu envolvimento na resposta adaptativa deste microrganismo ao estresse nitrosativo. Entretanto, ainda nao tinha sido realizado um estudo aprofundado acerca da regulacao da expressao do gene sigE, que codifica este fator. Neste trabalho foi realizada a caracterizacao in silico da estrutura da unidade transcricional deste gene e ensaios de RT- PCR na tentativa de confirmar se o gene sigE da linhagem 1002 de C. pseudotuberculosis estaria organizado em operon juntamente com os genes cseE e tatB, genes que codificam respectivamente um possivel regulador negativo do fator sigma E e um componente de um sistema de secrecao alternativo, Twin Arginine Translocase. Alem disso, os niveis de transcricao dos genes sigE, cseE e tatB foram avaliados pela tecnica de RT-qPCR em culturas expostas aos estresses nitrosativo e acido induzidos in vitro a fim de se confirmar envolvimento destes genes na resposta adaptativa especifica a estes estresses. Os resultados obtidos confirmaram que os genes sigE, cseE e tatB constituem um operon que os genes sigE e cseE sao ativados na resposta de C. pseudotuberculosis 1002 aos estresses nitrosativo e acido enquanto que o gene tatB e ativado somente na resposta ao estresse nitrosativo. Tomados juntos, esses dados sugerem que os genes deste operon possam ser regulados diferencialmente, por um mecanismo complexo a nivel transcricional, dependendo do estimulo do ambiente. Corynebacterium pseudotuberculosis is an intracellular pathogenic bacteria of great veterinary importance that infects small ruminants, causing a disease known as Caseous Lymphadenitis. This disease is distributed worldwide and has been associated with economic losses. Although the pathogenesis of this disease is well understood, there are few studies on the molecular determinants of pathogenicity of this microorganism. In this context, it Ls required new studies on the biological mechanisms involved during the course of infection, mainly because there are no satisfactory treatment and vaccines to fight the disease yet. In order to understand the role of the determinants of pathogenicity and how they are regulated during the process of infection, our research group has focused in proteins that modulate gene expression such as sigma factors of bacterial RNA polymerase. The regulation of gene expression by alternative sigma factors is crucial for adaptation and survival of intracellular pathogens by promoting the transient activation of specific genes involved in response to hostile conditions encountered in intrafagossomic environment, generated by the host immune system. In C. pseudotuberculosis, ÐE is the most well studied alternative sigma factor and it has been demonstrated its role in the adaptive response of this microorganism. However, it has not been carried out a detailed study on the regulation of expression of the sigE gene, which encodes sigma factor E. This work was done a characterization of the structure of the transcriptional unit of this gene using bioinformatics algorithms and by RT-PCR method in an attempt to confirm whether the gene sigE of C. pseudotuberculosis 1002 would be arranged in an operon in conjunction with the genes cseE and tatB, which encode, respectively, a possible negative regulator of sigma factor E and a component of an alternative secretion system, the Twin Arginine Translocase System. Moreover, the level of transcription of the genes sigE, tatB and cseE were evaluated by RT-qPCR essays in cultures exposed to nitrosative and acid stresses in order to confirm their involvement in adaptive response to environmental stress. The results of this study confirmed that the genes sigE, cseE and tatB constitute an operon in this species and that the genes sigE and cseE are activated in response to nitrosative and acidic stress while tatB is only activated in response to nitrosative stress. Taken together, these data suggests that the operon genes could be differentially regulated, by a complex transcriptional mechanism, when the bacteria is exposed to different environmental stimuli.

Foram depositadas no sítio do NCBI os genomas das linhagens 1002, C231, I19, PAT10 e FRC41 da Corynebacterium pseudotuberculosis, entre os anos de 2009 e 2011. Utilizou-se a pangenômica aliada à predição de proteínas exportadas, primeira etapa da Vacinologia Reversa (VR), sobre esses cinco genomas de C. pseudotuberculosis, uma metodologia que ao buscar alvos vacinais parte de um conjunto genomas completos, de predições in silico, ao invés de antígenos isolados por abordagens tradicionais. Dentre estas linhagens, adotou-se como modelos as linhagens 1002 e C231 que infectam caprinos e ovinos, respectivamente. Apesar da C. pseudotuberculosis causar outras doenças em animais como, por exemplo, equinos e bovinos, a escolha das linhagens 1002 e C231 como modelo baseou-se na importância da enfermidade linfadenite caseosa (LC). A LC é uma doença contagiosa crônica associada com perdas econômicas consideráveis e distribuída mundialmente. A inexistência de vacinas eficientes e métodos de diagnóstico contra a LC impulsionaram a pesquisa sobre os mecanismos moleculares da patogênese dessa bactéria. Para realizar a predição in silico de proteínas exportadas nas cinco linhagens de C. pseudotuberculosis, foi utilizado um pipeline com programas de predição de motivos proteicos de exportação combinados, no qual o resultado de processamento de um programa serve como parâmetro para iniciar o processamento de outros programas. De um total aproximado de 17 mil proteínas, nos cinco genomas, essa análise resultou em 750 proteínas preditas como secretadas. Dentre estas, foram preditas 139 e 149 proteínas secretadas nos genomas de C. pseudotuberculosis linhagens 1002 e C231, respectivamente. Dentre essas predições, foram confirmadas 87 e 77 proteínas como sendo secretadas, por meio de trabalhos de proteômica, nas linhagens 1002 e C231, respectivamente. Dentre essas proteínas, 55 são comuns a ambas as linhagens. Ao considerarmos a grande similaridade entre os genomas de C. pseudotuberculosis, supõemse que os resultados experimentais das linhagens modelos são válidos para as demais linhagens da espécie. Análises in silico sobre o potencial imunogênico do proteoma predito, juntamente com o proteoma comprovado experimentalmente, evidenciaram quinze proteínas detentoras de uma concentração maior de epitopos preditos por extensão da porção madura dessas proteínas. Dentre essas quinze proteínas, quatro se destacaram em termos de seus potenciais imunogênicos analisados in silico e estão em fase de testes experimentais na busca de vacinas, drogas e diagnósticos contra LC. Between the years of 2009 and 2011, the genomes of strains 1002, C231, I19, PAT10 and FRC41 of Corynebacterium pseudotuberculosis were deposited at the site of NCBI. We used pangenomics allied to the prediction of exported proteins on these five genomes as the first step of Reverse Vaccinology (RV), a methodology that aims at finding vaccines starting from in silico predictions of full genomes rather than isolated antigens by traditional approaches. Among all five strains, strains 1002 and C231, that infect goats and sheep respectively, were adopted as models. Although C. pseudotuberculosis also causes other diseases in animals, such as horses and cattle, the selection of strains 1002 and C231 as models was based on the importance of the disease caseous lymphadenitis (CLA) and also due to the high similarity degree between these genomes. CLA is a worldwide distributed chronic infectious disease associated with considerable economic losses. The absence of effective vaccines and diagnostics against CLA boosted research on the molecular mechanisms of pathogenesis of this bacterium. To predicted in silico exported proteins into five C. pseudotuberculosis strains, a combination of exportation motifs predicting programs were arranged in a pipeline, a schema were a program's processing result serves as initial parameter to initiate the processing of the other programs. We obtained 750 proteins predicted as secreted, out of approximately 17.000 proteins of the five genomes. Among these results, 139 and 149 were predicted as secreted proteins in strains 1002 and C231 respectively. Within these predictions, there were 87 and 77 proteins confirmed as secreted by proteomics studies in the strains 1002 and C231 respectively. Within these proteins, 55 are common to both model strains. The results obtained for the model strains were considered valid also for the other strains of this species. in silico analysis of the predicted immunogenic potential of the exoproteome, allied with the experimentally proven exoproteome demonstrated fifteen proteins owning a differential predicted epitope's concentration per protein's mature portion. Among these fifteen proteins, four stood out in terms of their in silico immunogenic potential and are currently under experimental tests in the search for vaccines, drugs and diagnosis against CLA.

Corynebacterium pseudotuberculosis é uma bactéria Gram-positiva, parasita intracelular facultativa, causadora da linfadenite caseosa (LC), uma doença infecto-contagiosa crônica que acomete pequenos ruminantes e acarreta sérias perdas econômicas para as atividades de ovinocaprinocultura. A ampla ocorrência e importância econômica da enfermidade estimulam estudos sobre as bases moleculares da virulência deste patógeno, cujas informações ainda são escassas. Dentre os fatores moleculares associados à virulência de bactérias patogênicas, têm-se destacado os internalizadores de peptídos (Opp), que são complexos protéicos multi-subunitários, pertencentes à família dos ABC transportadores. Esses internalizadores ficam localizados na membrana plasmática e tem como principal função a captação de peptídeos do meio extracelular para que sirvam como fonte de carbono e nitrogênio. Além do papel nutricional os peptídeos podem ser utilizados, por bactérias Gram-positivas, como moléculas sinalizadoras em um processo de comunicação intercelular, o qual permite às bactérias coordenarem a expressão de determinados genes em uma escala populacional. O controle de diversos processos celulares já foi relacionado ao mecanismo de comunicação via peptídeos sinalizadores dentre os quais incluem: esporulação, conjugação e virulência. Com o objetivo de se estudar o papel do transportador de peptídeos (Opp) na bactéria C. pseudotuberculosis foi construída uma linhagem mutante para o transportador Opp utilizando um plasmídeo suicida. Essa linhagem foi crescida na presença do peptídeo tóxico glutationa (GSH) nas concentrações de 5mM e 10 mM, como forma de se obter uma confirmação fenotípica da perda da capacidade da linhagem mutante em internalizar peptídeos. Porém, a linhagem mutante se mostrou sensível aos efeitos tóxicos do GSH, demonstrando que esse peptídeo pode estar sendo internalizado pela bactéria por uma via diferente do Opp ou que não exista a necessidade dele ser internalizado para ser tóxico à bactéria. Posteriormente, através de uma análise proteômica comparativa entre as proteínas extracelulares das linhagens selvagem e oppD mutante, utilizando 2-DE, foi gerado mapas protéicos que demonstraram a presença de 11 spots exclusivos na linhagem selvagem e 17 spots exclusivos na linhagem mutante. Esse resultado indica que o transportador Opp pode estar relacionado a algum processo de controle da expressão gênica em C. pseudotuberculosis. Por fim, para verificar se o transportador de peptídeos de C. pseudotuberculosis possui alguma relação com a virulência e patogenicidade dessa bactéria foram realizados ensaios in-vitro, de adesão e colonização de macrófagos, e in vivo, de infecção de camundongos BALB/c. Os resultados desses ensaios demonstraram que apesar da linhagem mutante possuir uma capacidade reduzida de aderir e infectar macrófagos em cultura durante a primeira hora de experimentação, ambas as linhagens apresentaram o mesmo potencial de causar morte, lesão, e de colonizar o baço de camundongos infectados. Através desse estudo podemos concluir que provavelmente a mutação do gene oppD não afetou a virulência da linhagem mutante. E que será necessário realizar o sequenciamento dos spots protéicos exclusivos de cada linhagem para que possamos inferir em quais processos celulares essas proteínas estão relacionadas Corynebacterium pseudotuberculosis is a Gram-positive, facultative intracellular parasite, which causes caseous lymphadenitis (CL), a chronic infectious disease in small ruminants, generating great economic losses for sheep and goat producers. Its worldwide occurrence, economic gravity and scarce information stimulate studies on the molecular basis of C. pseudotuberculosis virulence mechanisms. Among molecular factors associated to virulence of many pathogenic bacteria, the oligopeptide importers (Opp), which are multi sub-unitary protein complexes belonging to the ABC transporters family, can be highlighted. These Opp are located in the membrane and their main function is to capture peptides from the extracellular environment to serve as carbon and nitrogen source. In addition to their nutritional role, these peptides may also be used by Gram-positive bacteria as signaling molecules in a process of intercellular communication, which allows bacteria to coordinate the expression of certain genes in a population scale. The control of several cellular processes has been linked to the signal peptides communication system, which include: sporulation, conjugation, and virulence. In order to study the role of the peptide transporter (Opp) in the C. pseudotuberculosis bacterium, a mutant strain for the Opp transporter was constructed using a suicide plasmid. This strain was grown in the presence of the toxic peptide glutathione (GSH) with concentrations of 5mM and 10 mM in order to confirm the lack of ability of the mutant strain to internalize peptides. However, the mutant strain was sensitive to the toxic effects of GSH, showing that this peptide could be internalized by the bacteria through a different mechanism than Opp transport system or that it may not need to be internalized to be toxic to bacteria. In addition, a comparative proteomic analysis between the extracellular proteins from wild and mutant strains using 2-DE, made it possible to generate protein maps showing the presence of 11 unique spots for the wild strain and 17 unique spots for the mutant strain. This result indicates that the transporter Opp may be related to some regulation process of gene expression in C. pseudotuberculosis. Finally, to verify if the peptide transporter of C. pseudotuberculosis has any relation to its virulence and pathogenicity, in vitro tests, adhesion and colonization of macrophages in vivo and infection assays of BALB/c mouse were carried out. The results of these tests showed that although the mutant strain has a reduced capacity to adhere and infect macrophages in culture during the first hour of experimentation, both strains showed the same potential to cause death, injury, and to colonize the spleens of infected mice. As such, we can conclude for this study that the oppD gene mutation did probably not affect the virulence of the mutant strain of C. pseudotuberculosis and that the individual protein spots of each strain should be sequenced to infer to which cellular processes these proteins are related.

A campilobacteriose genital bovina (CGB) é uma doença venérea de grande importância para a pecuária mundial. Apesar de relevante, poucas são as informações a respeito de sua patogenia e resposta imunológica, o que poderia ser suprimido através de um modelo de infecção experimental em um animal de laboratório. O objetivo deste estudo foi infectar camundongos BALB/c com Campylobacter fetus subsp. venerealis por via intravaginal e estabelecer um modelo de infecção experimental em que possa ser estudado este microrganismo. Camundongos BALB/c fêmeas foram inoculados, via intravaginal, com C. fetus subsp. venerealis, e a infecção foi avaliada por 7 dias. Durante este período, foram realizados lavados vaginais, os quais foram submetidos às técnicas de isolamento, Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) e Imunofluorescência direta (IFD) para a identificação da bactéria. Durante todos os dias, após a eutanásia, o trato genital foi retirado e submetido às técnicas de Imunoistoquímica (IHQ), Hematoxilina e Eosina (HE), IFD da impressão do tecido vaginal em lâmina e PCR do tecido. Foi observado que camundongos BALB/c são infectados por C. fetus subsp. venerealis, por via intravaginal, em qualquer estágio do ciclo estral sem a necessidade de imunossupressão ou modificação do ciclo, permanecendo na vagina destes animais por até 7 dias após a inoculação experimental, o que permite concluir que o camundongo BALB/c pode ser estabelecido como modelo de infecção experimental para estudos sobre o C. fetus subsp. venerealis. The bovine genital campylobacteriosis (BGC) is a venereal disease of great importance to the world's livestock. Despite its relevance, there is little information about its pathogenesis and animal immune response, which could be demonstrated by a model of experimental infection in a laboratory animal. The objective of this study was to infect BALB/c mice with Campylobacter fetus subsp. venerealis, intravaginally, and establish an animal model in which this microorganism can be studied. BALB/c mice were inoculated intravaginally with C. fetus subsp. venerealis and infection was assessed by 7 days. During this period, they were collected vaginal washes for carrying out culture and Direct Immunofluorescence (DIF) techniques to identify the bacteria. Every day, after euthanasia, the genital tracts were removed and subjected to Immunohistochemistry (IHC), Hematoxylin and Eosin (HE) and DIF of the vaginal tissue imprint in slide. It was observed that BALB/c mice are infected by C. fetus subsp. venerealis, intravaginally, at any stage of estrous cycle without the need of immunosuppression or estrous cycle modification, remaining in the vagina of these animals for up to 7 days after experimental inoculation, which allows conclude that the BALB/c mouse can be established as experimental infection model for studies about C. fetus subsp. venerealis

Corynebacterium pseudotuberculosis é uma bactéria que causa a Linfadenite Caseosa (LC) em pequenos ruminantes, promovendo redução da produtividade dos animais infectados. A doença se caracteriza pela formação de abscessos em nódulos linfáticos superficiais e/ou órgãos internos. Vários métodos diagnósticos para a LC na forma subclínica foram desenvolvidos, mas nenhum deles com eficácia e praticidade satisfatórias. Assim, neste trabalho foi realizada a padronização de um Teste Intradérmico de Hipersensibilidade (TIH) com proteínas secretadas de C. pseudotuberculosis para o diagnóstico subclínico da LC em pequenos ruminantes. Os animais utilizados nos experimentos foram avaliados através de exames clínicos e laboratoriais, e separados em dois grupos constituídos de 10 caprinos positivos (grupo A) e 10 caprinos negativos (grupo B) para a LC. Paralelamente, as proteínas secretadas da linhagem bacteriana MIC6 de C. pseudotuberculosis foram extraídas através da técnica de fracionamento em três fases (TPP) e quantificadas pelo método de Bradford. Posteriormente, o TIH foi padronizado e aplicado por via intradérmica na dose de 0,1mL na região cervical esquerda em uma área tricotomizada. Nos mesmos animais foi aplicado 0,1mL de Tris-HCl (pH 7,4) sem as proteínas secretadas, na região cervical direita para controle do experimento. As mensurações do TIH foram realizadas com cutímetro Hauptner, antes da inoculação e a cada 24h nos seis dias subsequentes. O grupo A apresentou a média geral dos valores do TIH em todos os dias avaliados, significativamente superior ao grupo B. Nas primeiras 24h houve um pico de reação, com maior evidência no grupo A, declinando até as 72h, com retorno à normalidade após 96h da aplicação do TIH. Todos os controles mantiveram seus valores semelhantes em ambos os grupos e ao decorrer dos dias avaliados. O TIH padronizado para diagnóstico subclínico da LC em caprinos demonstrou resultados promissores e será aprimorado para utilização no controle da LC Corynebacterium pseudotuberculosis is a bacterium that can cause Caseous Lymphadenitis (CLA) in small ruminants and consequently reduce the productivity of infected animals. The disease is characterized by the formation of abscesses in superficial lymph nodes and / or internal organs. Several diagnostic methods for the subclinical form of CLA have been developed, but none of them with satisfactory efficiency and practicability. Thus, a standardized Intradermal Hypersensitivity Test (IHT) with proteins secreted by C. pseudotuberculosis for the diagnosis of subclinical CLA in small ruminants was developed in this study. The animals used in experiments were evaluated by clinical examination and laboratory assays and separated into two groups consisting of 10 positive goats (group A) and 10 negative goats (group B) for CLA. In parallel, proteins secreted from the bacterial strain MIC6 of C. pseudotuberculosis were extracted using the technique of three-phase partitioning (TPP) and quantified by the method of Bradford. Subsequently, the IHT has been standardized and applied intradermally at a dose of 0.1 mL in the left cervical region in a shaved area. In order to control the experiment it was applied 0.1 mL of Tris-HCl (pH 7.4) without the secreted proteins in the right cervical region in the same animals. The measurements of the IHT were performed with a Hauptner® cutimeter before inoculation and every 24 hours in six days. Group A showed the overall mean of the values of HIT on all days studied, significantly higher than in Group B. In the first 24 hours there was a peak of reaction, most obviously in group A, declining until 72h, tending to normality after 96 hours of application of HIT. All controls maintained their similar values in both groups during all days of evaluation. The standardized IHT for subclinical CLA diagnosis in goats showed promising results and will be improved for use in the control of the CLA

Uma nova tecnologia de sequenciamento de cDNA tem permitido uma análise detalhada e aprofundada dos transcritos em procariotos. Corynebacterium pseudotuberculosis, uma bactéria causadora de doenças, como a linfadenite caseosa, que trazem grandes prejuízos econômicos para o agronegócio mundial, foi o alvo de nossos estudos. Neste contexto, caracterizamos o perfil transcricional diferencial deste microrganismo em algumas condições que simulam o ambiente encontrado pela bactéria no hospedeiro no processo de infecção como, estresse osmótico (2M), térmico (50°C) e acidez (pH=5). No presente estudo escolhemos a plataforma SOLiDTM para tentar compreender o desenvolvimento da doença e a modulação da resposta a partir dos genes envolvidos no processo da infecção. Conseguimos detectar todas as regiões transcricionalmente ativas preditas no genoma (2057 genes), sendo que na condição controle (condição fisiológica normal), foi possível observar que 97,58% dos genes são transcritos, apresentando 2,42% de região não transcrita com valor de RPKM (Reads Per Kilobase of coding sequence per Million mapped) igual a zero. Nas condições de estresse osmótico, estresse térmico e acidez, 98,05%, 97,34%, 97,81% dos genes são transcritos, respectivamente. Dos 2064 transcritos do estresse osmótico, 48,01% foram considerados diferencialmente expressos em relação ao controle, 45,68% genes considerados diferencialmente expressos no térmico e no estresse ácido, 48,08%. Grande parte dos genes em todas as condições, induzidos ou reprimidos foi composta por proteínas de funções desconhecidas (hipotéticas) confirmando quão pouco este microrganismo é caracterizado. As análises revelaram uma forte correlação entre resposta ao estresse ácido e expressão de genes relacionados à virulência. O processo de regulação da transcrição e adesão celular estão entre os principais resultados do Blast2GO. No estresse osmótico processo de reparo e transporte transmembrana foram destaques, além do processo de adesão. No estresse térmico, menor número de genes diferencialmente expressos fizeram parte da análise e entre os principais processos estão o de oxidoredução e catabólico de ATP, gerando energia para célula sobreviver no ambiente hostil. Dentro do core estimulon (genes compartilhados entre os estresses), genes de virulência se destacaram, demonstrando que já no inicio da fase exponencial a bactéria regula a transcrição para uma resposta específica e adaptativa. Entre os reprimidos, os genes envolvidos no processo metabólico e biossintéticos foram os mais representados, demonstrando redução no crescimento, que é uma importante estratégia de ajuste da fisiologia celular para uma nova condição. O presente estudo permitiu criar um catálogo gênico que é utilizado como recurso para sobrevivência dentro de ambientes prejudiciais e conseguir escapar da resposta imune do hospedeiro. Estes resultados nos permitem sugerir possíveis candidatos à obtenção de vacinas eficientes com potencial redução das perdas no agronegócio, em estudos futuros. A new cDNA sequencing technology has allowed deep analysis of prokaryotic transcripts. Corynebacterium pseudotuberculosis, our study target, is a bacterium responsible for several diseases, such as caseous lymphadenitis that causes important economic losses in global agrobusinesses. In this context, we characterized its differential transcriptional profile in some conditions that mimic the environment found during an infectious process, namely osmotic (2M), termic (50°C) and acid (pH=5) stresses. For this work, SOLiDTM platform was chosen to try to understand the development of the disease and modulation of the response from the genes involved in the infectious process. All transcriptionally active regions that were predicted in the genome (2057 genes) were detected, observing 97,58% of transcript genes under the control condition, and 2,42% of non-transcribed regions with a RPKM value (Reads Per Kilobase of coding sequence per Million mapped) equal to zero. During conditions of osmotic, termic and acid stresses, 98,05%, 97,34% and 97,81% of genes, respectively, were found to be transcribed. During osmotic stress, 48,01% of the transcripts were considered differentially expressed with relation to the control, whereas during termic and acid stress, 45,68% and 48,08% respectively were found. It was observed that most genes for all stresses were formed by proteins of unknown function (hypothetical), highlighting the need for more information about this microorganism. Our analysis revealed a strong relationship between acid stress response and gene expression of genes previously associated to virulence. The process of transcription regulation and cell adhesion are among the main results of Blast2GO. During osmotic stress, repair process and transmembrane transport, as well as adhesion process, were highlighted. During heat shock, fewer differentially expressed genes were part of the analysis and oxidoreduction processes and ATP catabolic process were among the main energy generators for cell survival in the hostile environment. Within the core estimulon (genes shared between the stresses), virulence genes stood out, demonstrating that already at the beginning of the exponential phase the bacteria regulates the transcription for a specific and adaptive response. Among the repressed genes, those involved in metabolic and biosynthesis were the most represented, demonstrating reduced growth, an important strategy for adjusting cell physiology to a new condition. The present study allowed the creation of a gene catalog that can be used as a resource for survival in adverse environments and escape of the host immune response. These results allow us to suggest, in future studies, possible candidates for efficient vaccines regarding potential loss reduction in agribusinesses.

Corynebacterium pseudotuberculosis é uma bactéria Gram-positiva, causadora da linfadenite caseosa em ovinos e caprinos. Para causar uma infecção bem sucedida, este patógeno intracelular facultativo precisa responder de modo eficiente às alterações do ambiente extracelular, sendo capaz de sobreviver às condições adversas encontradas no organismo hospedeiro. Um dos principais mecanismos utilizados por bactérias patogênicas para alcançar este objetivo consiste na ativação transitória de genes específicos de resposta aos estresses ambientais extracelulares por fatores sigma (s) alternativos da RNApolimerase. Com o seqüenciamento do genoma de C. pseudotuberculosis pela Rede Genoma de Minas Gerais e Rede Paraense de Genômica e Proteômica, foi possível identificar sete fatores sigma alternativos nesta bactéria: os fatores sigma B, C, D, E, H, K e M. Dentre estes, destaca-se o fator sH, o qual tem sido associado à irulência em Mycobacterium tuberculosis, uma bactéria filogeneticamente próxima de C. pseudotuberculosis, e à regulação de componentes importantes da resposta aos estresses térmico e oxidativo tanto em M. tuberculosis quanto em Corynebacterium glutamicum. Neste contexto, nosso grupo de pesquisa tem se dedicado ao estudo do papel dos fatores sigma alternativos de C. pseudotuberculosis na resposta a diferentes condições de estresse in vitro e na virulência da bactéria. Neste trabalho, foi construída uma linhagem de C. pseudotuberculosis deficiente para o fator sH, utilizando-se um plasmídeo que não se replica nessa espécie bacteriana, e foi avaliada a resistência desta linhagem aos estresses ácido, térmico, oxidativo e osmótico, in vitro, por meio da comparação das curvas de crescimento da linhagem mutante para o fator sH e da linhagem 1002 selvagem quando expostas às diferentes condições de estresse. Não foram observadas diferenças significativas na susceptibilidade da linhagem mutante para o fator sH aos estresses ácido, térmico e oxidativo em relação à linhagem 1002 selvagem. Contudo, foi verificado que esta linhagem é significativamente mais susceptível ao estresse osmótico do que a linhagem 1002 selvagem,indicando que o fator sH deve desempenhar um papel importante para a resposta da bactéria a esta condição de estresse e, possivelmente, para a sua sobrevivência no interior dos macrófagos e para a sua virulência Corynebacterium pseudotuberculosis is a Gram-positive bacterium, which causes caseous lymphadenitis in sheep and goats. In order to cause a successful infection, this facultative intracellular pathogen needs to respond efficiently to changes in the extracellular environment, thus, being able to survive to the harsh conditions encountered in its hostorganism. One of the main mechanisms used by pathogenic bacteria to achieve this goal is the transient activation of specific genes in response to extracellular stresses by the action of the alternative sigma (s) factors of RNA polymerase. After the sequencing of the genome of C. pseudotuberculosis by Rede Genoma de Minas Gerais and Rede Paraense de Genômica e Proteômica, it was identified seven alternative sigma factors in this bacterium, namely the sigma factors B, C, D, E, H, K and M. Among these, the sH factor stands out since it has been linked to virulence in Mycobacterium tuberculosis, a bacterium that is closely related to C. pseudotuberculosis, and to the regulation of important components of M. tuberculosiss as well as of C. glutamicums response to heat shock and oxidative stress. In this context, our research group has been studying the role of the alternative sigma factors in C. pseudotuberculosiss response to different stress conditions in vitro and in its virulence. In this work, therefore, we constructed a strain of C. pseudotuberculosis deficient for the sH factor, using a plasmid that does not replicate in this species, and evaluated its resistance to acid, heat, oxidative and osmotic stresses in vitro by the comparison of the growth curves of the mutant strain and of the wild-type strain when they were exposed to these stress conditions. There were no significant differences in the susceptibility of the mutant strain for acid, heat and oxidative stresses in relation to the susceptibility of wild-type strain. However,it was found that this strain is significantly more susceptible to osmotic stress than the wildtype strain, showing that the sH factor most probably plays an important role in C. pseudotuberculosiss response to this stress condition and, possibly, in this bacteriums survival within macrophages and in its virulence

A linfadenite caseosa (LC) é uma doença causada por Corynebacterium pseudotuberculosis, que acomete principalmente caprinos e ovinos. Esta enfermidade é responsável por perdas econômicas significativas relacionadas à produtividade dos animais infectados. E, apesar de sua importância, atualmente não existem vacinas, diagnóstico e tratamentos satisfatórios para LC. No presente trabalho, foi utilizada a ferramenta Phage Display a qual seleciona peptídeos através de bacteriófagos geneticamente modificados para expressar aleatoriamente sequências de peptídeos na sua superfície. Estas bibliotecas têm demonstrado sucesso em numerosas aplicações, como mapeamento e mimetismo de antígenos reconhecidos por anticorpos, desenvolvimento de vacinas, e em testes de imunogenicidade. Sendo assim, este trabalho teve como objetivos selecionar e identificar pela técnica de Phage Display peptídeos ligantes específicos para proteínas secretadas e/ou excretadas e totais de C. pseudotuberculosis linhagem 1002. Para isso foi utilizada uma biblioteca comercial de 12 peptídeos lineares (Ph.D.-12 mer - New England Biolabs - NEB) e após três ciclos de seleção foram obtidos 366 peptídeos, sendo que 116 são seqüências distintas. Foram realizadas análises in silico desses peptídeos com o proteoma predito de C. pseudotuberculosis, onde apresentaram similaridade com proteínas envolvidas na sinalização, nutrição, metabolismo, patogênese bacteriana e fatores de transcrição entre outras. A reatividade e especificidade dos clones isolados foram testadas por ELISA e Spot síntese. Através de imunoensaios para ambas as metodologias foi possível selecionar 12 peptídeos (dos 116 identificados por Phage Display), entre os quais três foram sintetizados, agregados a duas formulações distintas de lipossomas, uma com fosfatidilcolina hidrogenada (HPC) e a outra com fosfatidilcolina de soja (SPC), e utilizados em ensaios de imunização de camundongos BALB/c. A imunização com os peptídeos sintetizados foi capaz de induzir uma elevada resposta imune do tipo Th1 antes da infecção. Após o desafio, foi observada uma produção elevada de IFN- nos animais imunizados tanto com peptídeo/SPC quanto com peptídeo/HPC, e os níveis de IL-10 foram mais elevados nos animais imunizados com peptídeo/SPC. Em contraste, camundongos dos grupos controle exibiram baixos níveis de IFN e de IL-10. A identificação de novos antígenos ou genes específicos de C. pseudotuberculosis pode prover novos biomarcadores específicos potencialmente antigênicos para a obtenção de antígenos candidatos à vacina e diagnósticos subclínicos mais acurados para o controle e erradicação da LC. The Caseous Lymphadenitis (CL) is a disease caused by Corynebacterium pseudotuberculosis, which affects mainly sheep and goats. This illness is responsible for significant economic losses related to productivity of animals. Currently, there is no satisfactory diagnosis for CL. In this work the tool Phage Display was used that selects peptides using bacteriophages to express random sequences of peptides on their surface. Phage Display has been used successfully in many applications such as mapping and mimicry antigens, vaccine development and immunogenicity tests. The main goal of the study was to perform the selection and identification of mimotopes peptides of secreted and /or excreted and total C. pseudotuberculosis 1002 proteins through Phage Display technique. A commercial librarary of 12 linear peptides (Ph.D.-12 mer - New England Biolabs - NEB) was used. After three cycles of selection, 366 peptides were obtained, including 116 distinct sequences. In silico analysis of the peptides obtained in Phage Display were tested against the predicted proteome of C. pseudotuberculosis 1002. The indentified proteins showed similarity to protein involved in signaling, nutrition, metabolism, bacterial pathogenesis and transcription factors. The reactivity and specificity of isolated clones were tested by ELISA and Spot synthesis. Through immunoassays for both methods, was possible to select 12 peptides among them three were synthesized, bound to two different formulations of liposomes, with a hydrogenated phosphatidylcholine (HPC) and soy phosphatidylcholine (SPC), the three peptide were used for testing and immunization of BALB/c. Immunization with the peptides 1 and 2 was able to induce a high Th1 immune response before infection. After the challenge, we observed a high production of IFN- in animals immunized with either peptide/SPC or peptide/HPC, and the levels of IL-10 were higher in animals immunized with peptide/SPC only. In contrast, control groups of mice exhibited low levels of IFN- and IL-10. The identification of new antigens or C. pseudotuberculosis specific genes can potentially provide new specific biomarkers with antigens for obtaining vaccine candidate antigens and sub-clinical diagnosis tests for more accurate control and eradication of the CL.

A Corynebacterium pseudotuberculosis é o agente etiológico da linfadenite caseosa, doença infecto-contagiosa crônica que acomete pequenos ruminantes. Os principais fatores de virulência desta bactéria são a exotoxina fosfolipase D e lipídios tóxicos da parede celular. Estudos demonstraram que proteínas extracelulares são importantes para: aquisição de nutrientes, interação com hospedeiro, sobrevivência da bactéria em diversos ambientes e por tanto representam alvos para a produção de vacinas de métodos de diagnóstico. Os genomas das linhagens 1002 e C231 de C. pseudotuberculosis isoladas de caprino do Brasil e de ovino da Austrália respectivamente foram seqüenciados e predições in silico geraram uma lista destas proteínas com suas prováveis funções. Neste trabalho, através de abordagens proteômicas, foi realizada uma analise comparativa entre proteínas extracelulares das duas linhagens para gerar mapas proteícos, avaliar a diferença de expressão e validar os resultados preditos in silico. As amostras protéicas foram obtidas através da técnica de fracionamento em três fases. Para estudar a diferença de expressão foi utilizada a técnica de 2D-DIGE que após a análise por espectrometria de massa resultou na caracterização de 10 proteínas, 5 na linhagem 1002 e 5 na linhagem C231, relacionadas a fatores de virulência, resposta a estresse, componentes estruturais e funções desconhecidas. Através da associação 2-DE/MALDI-TOF MS/MS foi possível gerar mapas protéicos e caracterizar 55 e 45 proteínas extracelulares das linhagens 1002 e C231 respectivamente. A união dos dados obtidos neste trabalho com os resultados obtidos Pacheco et al. (2011), possibilitou caracterizar experimentalmente 104 proteínas do exoproteoma de C. pseudotuberculosis. Este estudo demonstrou que, mesmo sendo bactérias da mesma espécie, há diferenças de expressão e a presença de proteínas específicas para cada linhagem, estando estas relacionadas a fatores de virulência e fisiologia celular que podem influenciar no mecanismo de infecção e adaptação ao hospedeiro, favorecendo a progressão e instalação da doença. Além disso, este trabalho abre perspectivas para estudos específicos com as proteínas identificadas, para possível aplicação no desenvolvimento de métodos de diagnóstico e vacinas. Corynebacterium pseudotuberculosis is the etiological agent of caseous lymphadenitis - a chronic infectious disease that affects small ruminants. The main virulence factors of this bacterium are exotoxin phospholipase D and toxic lipid on cell wall. Studies have shown that extracellular proteins are important for: nutrient acquisition, interaction with the host, survival of bacteria in different environments and targets for vaccine production and methods for diagnosis. The genomes of strains 1002 and C231 of C. pseudotuberculosis isolated from Brazil goat and sheep and from Australia, respectively, were sequenced and a list of the aforementioned proteins with their likely functions was generated by in silico predictions. In the advent of this work, a comparative analysis was performed between two strains of extracellular proteins for characterization, assessment of difference in expression and validation of the results predicted in silico using proteomic approaches. The protein samples were obtained by fractionation technique in three phases. To study the difference in expression, 2D-DIGE technique was used. After analysis by mass spectrometry resulted in the characterization of 10 proteins (5 from 1002 and 5 from strain C231 strain), related to virulence factors, stress response, structural components and unknown functions. Through the association of 2-DE/MALDI-TOF MS/MS it became posible to generate maps and characterize 55 and 45 extracellular proteins of strains 1002 and C231 respectively. The union of the present data with those obtained Pacheco et al. (2011), allowed experimentally characterized 104 proteins from the exoproteoma of the C. pseudotuberculosis. This work portrays the fact that even though the bacteria of the same species, there exist differences in expression and presence of specific proteins in each strain, as they are related to virulence factors and cellular physiology that may influence the mechanism of infection and adaptation to the host, which contribute to the progression and onset of illness. Furthermore, this work opens perspectives for specific studies of the proteins identified for possible application in the development of diagnostic methods and vaccines

A possível indução de resistência bacteriana devido à inclusão de antibióticos na alimentação animal tem levado as autoridades competentes a proibir a utilização dos tradicionais promotores de crescimento baseados em drogas antimicrobianas para este fim. Além disso, os consumidores começaram a preferir produtos de origem animal com alta qualidade, sem possíveis resíduos destes antibióticos, promovendo uma pressão no mercado por compostos alternativos. Assim, os probióticos têm emergido como potenciais substitutos, pois proporcionam benefícios à microbiota intestinal e mostram capacidade imunomoduladora em seu hospedeiro. Neste contexto, este estudo teve como objetivo isolar e identificar novas linhagens de bactérias do ácido láctico a partir de diferentes mucosas de suínos que possam ser utilizadas para suplementação alimentar, promoção do crescimento e como adjuvante imune. Cinquenta e seis isolados foram obtidos a partir de fezes, focinho e boca de oito suínos e, em seguida, foram identificadas ao nível de gênero por amplificação das regiões espaçadoras entre os genes 16S-23S do rRNA. Aqueles isolados que apresentaram amplificação típica do grupo Lactobacillus e Weissella foram identificados ao nível de espécie por digestão com endonucleases de restrição dos amplicons 16S-23S rRNA e caracterizados quanto às suas propriedades probióticas. Vinte e quatro microrganismos do grupo Lactobacillus/Weissella foram identificados como pertencentes a oito espécies: Lactobacillus acidophilus, L. brevis, L. murinus, L. reuteri B, L. plantarum A, L. plantarum B/ L. paraplatarum/ L. pentosus, Weissella paramesenteroides, W. cibaria. Estas bactérias foram selecionadas quanto ao seu potencial probiótico com base na resistência aos sais bileres, tolerância ao baixo pH, hidrofobicidade da superfície celular e produção de substâncias antimicrobianas. Os resultados mostraram a presença de sete isolados com potencial probiótico, com dois destaques, o Lactobacillus acidophilus 1ANH4 e a Weissella paramesenteroides 1ANK4, que cumpriram plenamente todas as condições testadas, demonstrando maior potencial em relação às propriedades funcionais testadas in vitro. The possible acquisition of bacterial resistance due to the inclusion of antibiotics in animal feed has led the qualified authorities to ban the use of antimicrobial drugs for this purpose. Moreover, consumers began to prefer products of animal origin with high quality, without possible residues of the referred antibiotics. Thus, probiotics have emerged as potential substitutes to the traditional use of antimicrobial drugs because provide intestinal microbiota benefits and show immunomodulatory capacity in its host. Therefore, this study aimed to isolate and identify new strain of lactic acid bacteria from different mucosae of swine select candidates for feed supplementation, growth promotion and as immune adjuvant. Fifty-six isolates were obtained from feces, snout and mouth of eight swines and then were identified to genus level by amplification of the 16S-23S rRNA intergenic spacer. Those isolate that showed typical amplification of Lactobacillus and Weissella group were identified to the specie level by restriction endonuclease digestion of 16S-23S rRNA amplicons and characterized by their probiotic properties. Twenty-four microorganism of the Lactobacillus/Weissella group were identified as belonging to eight species: Lactobacillus acidophilus, L. brevis, L. murinus, L. reuteri B, L. plantarum A, L. plantarum B/ L. paraplatarum/ L. pentosus, Weissella paramesenteroides, W. cibaria. These bacteria were selected as potential probiotics based on their bile-salt resistance, low pH tolerance, cell surface hydrophobicity and production of antimicrobial substances. The results showed the presence of seven isolates with probiotic potential features, with two highlights, Lactobacillus acidophilus 1ANH4 and Weissella paramesenteroides 1ANK4, which fulfilled all conditions tested, proving highest potential with functional properties in vitro.

Corynebacterium pseudotuberculosis é uma bactéria Gram-positiva, causadora da linfadenite caseosa em ovinos e caprinos. Para causar uma infecção bem sucedida, este patógeno intracelular facultativo precisa responder de modo eficiente às alterações do ambiente extracelular, sendo capaz de sobreviver às condições adversas encontradas no organismo hospedeiro. Um dos principais mecanismos utilizados por bactérias patogênicas para alcançar este objetivo consiste na ativação transitória de genes específicos de resposta aos estresses ambientais extracelulares por fatores sigma alternativos da RNA polimerase. Com o seqüenciamento do genoma de C. pseudotuberculosis pela Rede Genoma de Minas Gerais e Rede Paraense de Genômica e Proteômica, foi possível identificar sete fatores sigma alternativos nesta bactéria: os fatores sigma B, C, D, E, H, K e M. Dentre estes, destaca-se o fator sigma C, o qual tem sido associado à virulência em Mycobacterium tuberculosis, e cujo gene se encontra em uma ilha de patogenicidade em C. pseudotuberculosis. Neste contexto, nosso grupo de pesquisa tem se dedicado ao estudo do papel dos fatores sigma alternativos de C. pseudotuberculosis na resposta a diferentes condições de estresse in vitro e na virulência da bactéria. Neste trabalho, foi construída uma linhagem de C. pseudotuberculosis deficiente para o fator sigma C, utilizando um plasmídeo suicida, e foi avaliada a resistência desta linhagem aos estresses oxidativo, ácido, osmótico e térmico in vitro, através da comparação das diferenças no crescimento relativo e na viabilidade relativa das bactérias expostas às condições de estresse em relação às bactérias crescidas sob condições normais, entre os tempos sucessivos de exposição das linhagens 1002 selvagem e mutante para o fator sigma C a cada agente gerador de estresse. Não foi observada uma diferença significativa na susceptibilidade da linhagem mutante para o fator sigma C ao estresse ácido em relação à linhagem 1002 selvagem. Contudo, foi verificado que esta linhagem é significativamente mais susceptível aos estresses oxidativo, osmótico e térmico do que a linhagem 1002 selvagem, indicando que o fator sigma C deve desempenhar um papel importante para a resposta da bactéria a estas condições de estresse, e possivelmente, para a sua sobrevivência no meio ambiente e no interior do hospedeiro e para a sua virulência. Corynebacterium pseudotuberculosis is a Gram-positive bacterium, which causes caseous lymphadenitis in sheep and goats. To cause a successful infection, this facultative intracellular pathogen needs to respond efficiently to the changes in the extracellular environment, being able to survive faced with the harsh conditions found in the host organism. One of the main mechanisms used by pathogenic bacteria to achieve this goal is the transient activation of specific genes in response to extracellular environmental stresses by alternative sigma factors of RNA polimerase. After the sequencing of the genome of C. pseudotuberculosis by Rede Genoma de Minas Gerais e Rede Paraense de Gen?ica e Prote?ica, it was identified seven alternative sigma factors in this bacterium, the sigma factors B, C, D, E, H, K and M. Between these, the sigma factor C stands out, which has been linked to virulence in Mycobacterium tuberculosis, and whose gene is located in a pathogenicity island in C. pseudotuberculosis. In this context, our research group has been studying the role of the alternative sigma factors of C. pseudotuberculosis in response to different stress conditions in vitro and in virulence of the bacterium. In this work, we constructed a strain of C. pseudotuberculosis deficient for the sigma factor C, using a suicide plasmid, and evaluated the resistance of this strain to oxidative, acid, osmotic and heat stresses in vitro, by comparing the differences in relative growth and relative viability of bacteria exposed to stress conditions in relation to bacteria grown under normal conditions, between the successive times of exposure of 1002 wild strain and the strain mutant for the sigma factor C for each stress generator agent. There was no significant difference in the susceptibility of the strain mutant for the sigma factor C for the acid stress in relation to the 1002 wild strain. However, it was found that this strain is significantly more susceptible to oxidative, osmotic and heat stresses than the 1002 wild strain, showing that the sigma factor C should play an important role for the bacteriums response to this stress conditions, and possibly, for its survival in the environment and in the host and for its virulence.

A difteria é considerada por várias agências de saúde internacionais como uma doença re-emergente. A forma clássica da doença, causada pela bactéria Corynebacterium diphtheriae, afeta primariamente o trato respiratório superior. No entanto, existem alguns isolados desta bactéria capazes de causar infecções invasivas, como endocardite. No Brasil, linhagens de C. diphtheriae causadoras deste tipo de infecção têm sido isoladas nos últimos anos. Estas linhagens foram capazes de infectar pessoas vacinadas com o toxóide diftérico (DT) e suas principais características distintivas foram, na maioria dos casos, a capacidade de fermentar sacarose e o perfil não-toxigênico. A escassez de infromações sobre os mecanismos que levam ao fenótipo invasivo evidencia a necessidade de estudos genéticos desta sub-população de C. diphtheriae. O objetivo do presente estudo foi realizar uma análise epidemiológica molecular destas linhagens invasivas brasileiras, utilizando a técnica de Multilocus Sequence Typing (MLST). Um esquema de MLST padronizado para tipagem de C. diphtheriae foi utilizado, composto por sete genes housekeeping desta bactéria: atpA, dnaE, dnaK, fusA, leuA, odha, e rpoB. Como controles, foram tipadas linhagens padrão de C. diphtheriae. Os resultados obtidos foram comparados com perfis de MLST de grupos clonais de C. diphtheriae isolados em diferentes países, os quais estão depositados no banco de dados PubMLST. Os perfis obtidos para as linhagens invasivas foram divididos em três complexos clonais pelo programa eBURST. As linhagens foram consideradas como sendo de um mesmo complexo clonal quando pelo menos seis dos sete alelos estudados no MLST eram compartilhados. As linhagens brasileiras do biotipo gravis agruparam-se em complexos clonais com cepas originárias da Europa, indicando uma circulação mundial dos clones deste biotipo e alta estabilidade genética. Por outro lado, linhagens invasivas do biotipo mitis apresentaram maior diversidade genética e uma circulação aparentemente associada à América do Sul. As análises realizadas sugerem que a alta diversidade genética encontrada para as linhagens invasivas é devida a um elevado potencial recombinogênico dos isolados. Diphtheria is a reemerging disease worldwide. The classic form of the infection, caused by the bacterium Corynebacterium diphtheriae, primarily affects the upper respiratory tract. However, there are some strains of this bacterium that can cause invasive infections such as endocarditis. In Brazil, strains of C. diphtheriae causing this type of infection have been isolated in recent years. These strains were able to infect vaccinated and non-vaccinated individuals. The main distinguishing features of the invasive strains were mostly the ability to ferment sucrose and the non-toxigenic profile. The mechanisms leading to the invasive phenotype are poorly understood; this demonstrates the need for genetic studies of this subpopulation of C. diphtheriae. The aim of this study was to perform a molecular epidemiological analysis of the invasive C. diphtheriae strains isolated in Brazil, using the Multilocus Sequence Typing (MLST) method. A standardized MLST scheme for typing this bacterium was used, composed of seven housekeeping genes: atpA, dnaE, dnaK, fusA, leuA, odha, e rpoB. Type strains of C. diphtheriae were used as controls. The results obtained were compared with MLST profiles of strains isolated in different countries, which are accessible in the public database PubMLST. The profiles obtained for the invasive strains were divided into three clonal complexes by eBURST program. The strains were considered to be of the same clonal complex when at least six of the seven alleles studied in the MLST were shared. The Brazilian strains of biotype gravis were grouped into clonal complexes with strains from Europe, indicating a worldwide circulation of clones of this biotype and some genetic stability. Moreover, invasive strains of biotype mitis had a higher genetic diversity and an apparently associated with movement within South America. Analyzes suggest that high genetic diversity found among the invasive strains is due to a high recombinogenic potential of the isolates.

Bacillus subtilis é uma bactéria gram positiva de solo, não patogênica, não colonizadora de tecidos, naturalmente transformável e formadora de esporos utilizada como modelo de estudo de bactérias gram-positivas. Essas características acarretam em vantagens para a produção de proteases de interesse industrial e para utilização como veículo de antígenos vacinais, porém a falta de vetores induzíveis torna sua utilização como ferramenta biológica pouco explorada. No presente trabalho descrevemos a construção de diferentes vetores capazes de expressar os antígenos subunidade B da toxina termo-lábil (LTB) e subunidade estrutural da fímbria CFA/I (CFAB) de Escherichia coli enterotoxigênica (ETEC) e avaliamos seu potencial vacinal. Foi avaliada a imunogenicidade de linhagens capazes de expressar LTB sob o controle de diferentes promotores: PgsiB (induzido em condições de estresse), PlepA (promotor constitutivo) e Pspac (induzido pela adição de IPTG) e em diferentes locais da célula (ancorada à parede celular ou secretada para o meio externo). Avaliamos ainda a imunogenicidade de linhagens capazes de co-expressar LTB e a listeriolisina O (LLO) de Listeria monocytogenes. O antígeno CFAB foi produzido no citoplasma ou ancorado à parede celular de B. subtilis em condições de estresse e as linhagens bacterianas administradas sozinhas ou conjuntamente com a toxina termo-lábil (LT) como adjuvante de mucosa. Camundongos imunizados com células ou esporos de B. subtilis recombinantes desencadearam respostas de anticorpos sistêmicos e secretados específicos para os antígenos (LTB e CFAB), não alterados pela adição do adjuvante. A expressão de LLO causou a supressão da resposta de anticorpos específicos para o antígeno LTB. Os resultados obtidos demonstram a viabilidade do uso de B. subtilis como veículo vacinal. Bacillus subtilis is a gram positive, generally regarded as safe and spore forming soil bacteria used as a model for genetic and phisiological studies. This safety status allow its use as host for production of industrial protases and its application as vaccine vehicles, however the lack of epissomal inducible expression systems disable the exploration of this organism as a biotechnologic tool. In this work we describe the construction of epissomal vectors able to express the B subunit of the heat-labile toxin (LTB) and the structural subunit of the CFA/I fimbrae (CFAB) from the enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC). We evaluate strains able to express LTB under the control of three promoters: PgsiB (stress inducible), PlepA (constitutive) e Pspac (IPTG inducible) and allowing the expression of LTB secreted or anchored to the cell wall We also evaluate the immunogenicity of strains able to co-express LTB and the listeriolysin O (LLO) from Listeria monocytogenes. CFAB was expressed in the cytoplasm or anchored to the cell wall and administred alone or with the mucosal adjuvant LT. Mice immunized both with cells or spores elicited secreted and systemic specific antibodies responses, which were not altered by the addition of the adjuvant LT. LLO expression suppressed the antibodies responses against LTB. The data shows the ability of B. subtilis to be used as vaccine vehicle.

Entre as bactérias do gênero Bacillus algumas espécies destacam-se como controladores biológicos microbianos de insetos vetores e pragas, dentre estas destaca-se o Bacillus thuringiensis, bactéria de solo, aeróbia e gram-positiva. Suas características tóxico/específicas para larvas de inseto, a sua inocuidade para o homem e outros mamíferos vertebrados, bem como fauna e flora, estão relacionadas com endotoxina, corpo paraesporal protético intracitoplasmático, denominado ä-endotoxina, produzido durante a fase de esporulação das bactérias. No presente estudo, avaliou-se a atividade larvicida de 12 sorovares de Bacillus thuringiensis, KYU, BRA, OSW, NIG, TOU, KUR, THO, MOR, CAN, DAR, OST e ISR contra tres espécies de mosquitos: Aedes aegypti, Aedes fluviatilis & Culex quinquefasciatus, bem como foram realizadas curvas de crescimento dos referidos sorovares com o intuito de observar o comportamento das bactérias. Também foram realizados PCR com iniciadores específicos para determinação da presença de genes Cry4A/B de Bti e variabilidade genômica observadas por AP-PCR. Os resultados da atividade larvicida mostraram diferenças significativas para as tres espécies de mosquitos estudadas. As larvas de Aedes aegypti foram susceptíveis a somente ao controle positivo, entretanto as larvas de Aedes fluviatilis apresentaram taxas de mortalidade para os sorovares KUR, KYU enquanto que, as larvas de Culex quinquefasciatus foram 100% sensíveis ao sorovar DAR. Nas curvas de crescimento os sorovares apresentam comportamento semelhante, iniciando a esporulação em 32 horas de crescimento, exceto para o MOR, que iniciou sua esporulação em 24 horas de crescimento. O tempo de crescimento para estas bactérias ficou estimado em 0,50 hora e a velocidade de crescimento foi de 1,381 horas-1 A técnica de PCR para amplificação dos genes cry4A/B mostrou um produto já esperado de 439bp para o sorovar ISR. A reação de AP-PCR apresentou produtos (RAPD), que foram equacionados utilizando-se a fórmula de DICE (1945), para estabelecer coeficientes de similaridade entre referidos sorovares. Através de fenograma, pode-se concluir um percentual de similaridade entre os bacilos partindo da linha de fenon. Os sorovares de maior coeficiente de similaridade foram NIG e KYU aproximadamente 92% de similaridade. Enquanto que, os sorovares MOR e o KUR apresentaram-se isolados no fenograma. ISR aparece mais próximo do sorovar OST e as duas variedades nacionais BRA e OSW mostram um coeficiente de similaridade em torno de 65%.