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This work aims to study the process of enzymatic proteolysis "controlled" by the initial structural state of the substrate in order to assess its influence on the proteolysis kinetics as well as the physico-chemical properties and associated bioactivity of released peptides. For this study, rapeseed meal napins, known for its antimicrobial activity were used as a substrate. First, a selective extraction and purification process of napines were optimized by an appropriate experimental design. The extraction and purification process initially made at laboratory scale was easily scaled-up. We showed that the operating conditions of these processes would not damage the secondary and tertiary structure of the protein. Moreover, we confirmed an antimicrobial activity of the obtained napins on various microorganisms (Bacillus coagulans and Fusarium langsethiae). In a second step, the study on the influence of the parameters can have an effect on the structure of the protein was performed. The objectives were to see if it was possible to place the protein under conditions of pH and temperature for a progressive breakdown in function of time, and observe any impact on the kinetics of the proteolysis of napines extracted and the nature of the released peptides. The results showed that for a couple of pH / T given the "incubation duration" becomes a key factor for the denaturation of napines. This significantly influences the kinetics of proteolysis, the mechanism of action of the protease, and therefore, the composition of mixtures released. Subsequently, the influence of hydrolysates on the growth of antibody-producing animal cells grown in serum-free medium, and foaming and emulsifying capacity, were evaluated. The initial results showed a major influence of the structural state of the substrate (via the degree of hydrolysis achievable for each of the conditions studied) on such properties. Ultimately, these studies have highlighted not only the potential for increased value of napines rapeseed meal but also, and especially, a key parameter "to control" the process of enzymatic proteolysis for production directed peptides; Ce travail se propose d'étudier le procédé de protéolyse enzymatique « contrôlé » par l'état structural initial du substrat en vue d'évaluer son influence sur la cinétique de protéolyse, ainsi que sur les propriétés physico-chimiques et les bioactivités associées des peptides libérés. Pour l'étude, nous avons utilisé un substrat modèle, une protéine connue pour ses propriétés antimicrobiennes, les napines. Cette catégorie de protéines est issue d'un co-produit de l'industrie oléifère faiblement valorisé : le tourteau de colza. Tout d'abord, un procédé d'extraction sélectif et de purification de napines a été mis en oeuvre et optimisé à l'aide d'un plan d'expériences multicritère approprié. Le procédé d'extraction et de purification, réalisé initialement à l'échelle du laboratoire, a pu être extrapolé à plus grande échelle, en respectant une démarche d'éco-conception pour produire des napines en quantité suffisante pour la suite de l'étude. Ce travail a montré que les conditions opératoires du procédé retenu n'endommagent pas les structures secondaire et tertiaire de la protéine. Des activités antimicrobiennes des napines ainsi produites ont été validées sur différents micro-organismes pathogènes (Bacillus coagulans et Fusarium langsethiae). Dans un second temps, une étude concernant l'influence des paramètres pouvant avoir une action sur la structure de la protéine, a été réalisée. L'objectif a été de voir s'il était possible de placer la protéine dans des conditions de pH et de température permettant une déstructuration évolutive, en fonction du temps, et d'observer un éventuel impact sur la cinétique de la protéolyse des napines extraites et sur la nature des peptides libérés. Les résultats ont montré que pour un couple de pH/T donné, la « durée d'incubation » devient un facteur clé pour la dénaturation de napines. Ce dernier influence significativement la cinétique de la protéolyse, le mécanisme d'action de la protéase et, par conséquent, la composition des mélanges libérés. Par la suite, l'influence des hydrolysats sur la croissance de cellules animales productrices d'anticorps, cultivées en milieu sans sérum, et leurs capacités moussantes et émulsifiantes, ont été évaluées. Les résultats ont montré une influence majeure de l'état structural initial du substrat (via le degré d'hydrolyse atteignable pour chacune des conditions étudiées) sur les dites propriétés. Au final, ces études ont mis en avant non seulement le potentiel d'une valorisation accrue des napines de tourteau de colza mais aussi, et surtout, un paramètre déterminant sur le « contrôle » du procédé de protéolyse enzymatique pour la production dirigée de peptides

This work aims to study the process of enzymatic proteolysis "controlled" by the initial structural state of the substrate in order to assess its influence on the proteolysis kinetics as well as the physico-chemical properties and associated bioactivity of released peptides. For this study, rapeseed meal napins, known for its antimicrobial activity were used as a substrate. First, a selective extraction and purification process of napines were optimized by an appropriate experimental design. The extraction and purification process initially made at laboratory scale was easily scaled-up. We showed that the operating conditions of these processes would not damage the secondary and tertiary structure of the protein. Moreover, we confirmed an antimicrobial activity of the obtained napins on various microorganisms (Bacillus coagulans and Fusarium langsethiae). In a second step, the study on the influence of the parameters can have an effect on the structure of the protein was performed. The objectives were to see if it was possible to place the protein under conditions of pH and temperature for a progressive breakdown in function of time, and observe any impact on the kinetics of the proteolysis of napines extracted and the nature of the released peptides. The results showed that for a couple of pH / T given the "incubation duration" becomes a key factor for the denaturation of napines. This significantly influences the kinetics of proteolysis, the mechanism of action of the protease, and therefore, the composition of mixtures released. Subsequently, the influence of hydrolysates on the growth of antibody-producing animal cells grown in serum-free medium, and foaming and emulsifying capacity, were evaluated. The initial results showed a major influence of the structural state of the substrate (via the degree of hydrolysis achievable for each of the conditions studied) on such properties. Ultimately, these studies have highlighted not only the potential for increased value of napines rapeseed meal but also, and especially, a key parameter "to control" the process of enzymatic proteolysis for production directed peptides, Ce travail se propose d'étudier le procédé de protéolyse enzymatique « contrôlé » par l'état structural initial du substrat en vue d'évaluer son influence sur la cinétique de protéolyse, ainsi que sur les propriétés physico-chimiques et les bioactivités associées des peptides libérés. Pour l'étude, nous avons utilisé un substrat modèle, une protéine connue pour ses propriétés antimicrobiennes, les napines. Cette catégorie de protéines est issue d'un co-produit de l'industrie oléifère faiblement valorisé : le tourteau de colza. Tout d'abord, un procédé d'extraction sélectif et de purification de napines a été mis en oeuvre et optimisé à l'aide d'un plan d'expériences multicritère approprié. Le procédé d'extraction et de purification, réalisé initialement à l'échelle du laboratoire, a pu être extrapolé à plus grande échelle, en respectant une démarche d'éco-conception pour produire des napines en quantité suffisante pour la suite de l'étude. Ce travail a montré que les conditions opératoires du procédé retenu n'endommagent pas les structures secondaire et tertiaire de la protéine. Des activités antimicrobiennes des napines ainsi produites ont été validées sur différents micro-organismes pathogènes (Bacillus coagulans et Fusarium langsethiae). Dans un second temps, une étude concernant l'influence des paramètres pouvant avoir une action sur la structure de la protéine, a été réalisée. L'objectif a été de voir s'il était possible de placer la protéine dans des conditions de pH et de température permettant une déstructuration évolutive, en fonction du temps, et d'observer un éventuel impact sur la cinétique de la protéolyse des napines extraites et sur la nature des peptides libérés. Les résultats ont montré que pour un couple de pH/T donné, la « durée d'incubation » devient un facteur clé pour la dénaturation de napines. Ce dernier influence significativement la cinétique de la protéolyse, le mécanisme d'action de la protéase et, par conséquent, la composition des mélanges libérés. Par la suite, l'influence des hydrolysats sur la croissance de cellules animales productrices d'anticorps, cultivées en milieu sans sérum, et leurs capacités moussantes et émulsifiantes, ont été évaluées. Les résultats ont montré une influence majeure de l'état structural initial du substrat (via le degré d'hydrolyse atteignable pour chacune des conditions étudiées) sur les dites propriétés. Au final, ces études ont mis en avant non seulement le potentiel d'une valorisation accrue des napines de tourteau de colza mais aussi, et surtout, un paramètre déterminant sur le « contrôle » du procédé de protéolyse enzymatique pour la production dirigée de peptides

Durch Proteolyse werden sowohl cytosolische Proteine als auch integrale Membranproteine gespalten. Bei diesem Prozess werden entweder falsch gefaltete Proteine abgebaut oder Proteine spezifisch durch eine gezielte Spaltung proteolysiert, um eine neue Funktion zu erhalten, was als "Regulierte Intramembran Proteolyse" (RIP) bezeichnet wird. Bisher sind drei Klassen von Intramembran-Proteasen bekannt, zu denen auch die Rhomboid-Proteasen zählen. Rhomboid-Proteasen kommen in nahezu allen sequenzierten Genomen von Eukaryoten, Prokaryoten und Archaea vor. Da ihre physiologische Bedeutung, speziell in Prokaryoten, bisher jedoch nahezu unbekannt ist, wurde im Rahmen der vorliegenden Dissertation die funktionelle Rolle von Rhomboid-Proteasen in Prokaryoten am Beispiel von \(\textit {Corynebacterium glutamicum}\) untersucht. Hierzu wurden die Gene der Rhomboide deletiert und die physiologischen Auswirkungen insbesondere auf Proteomebene charakterisiert.

Das Enzym 11beta-HSD1 stellt im intrazellulären Glucocorticoidstoffwechsel eine wichtige Prärezeptorkontrolle dar. Es reguliert die intrazelluläre Cortisolkonzentration durch die enzymatische Umwandlung des aus dem Blutkreislauf aufgenommenen und hormonell inaktiven Cortisons zum aktiven Cortisol. Die Bedeutung einer erhöhten 11beta-HSD1 Expression und Aktivität bei der Entstehung von Übergewicht und Insulinresistenz wurde bisher vorwiegend in Leber und Fettgewebe untersucht und nachgewiesen. Wenig erforscht sind die Funktionen der 11beta-HSD1 im Muskelgewebe. In dieser Arbeit wurde die Funktion und Regulation der 11beta-HSD1 im Skelettmuskel mithilfe der murinen Skelettmuskelzelllinie C2C12 und primärer humaner Myoblasten untersucht. Es konnte demonstriert werden, dass die 11beta-HSD1 in Abhängigkeit des Differenzierungsgrades exprimiert wird und als Oxo-Reduktase aktiv ist, sowie selbst einen Regulator der Differenzierung darstellt. Es zeigte sich ein Feed-Forward-Mechanismus des Cortisons, das die 11beta-HSD1 in den Skelettmuskelzellen akut und chronisch induzierte, sowie eine gleichzeitige Veränderung der GRalpha- und MRalpha-Expressionen gegenregulatorisch zur 11beta-HSD1. Die Daten aus der Mauszelllinie konnten zum größten Teil in primären humanen Myoblasten bestätigt werden. Zudem konnten mehrere Transkriptionsfaktoren wie CREB, Myogenin und MEF-2c identifiziert werden, die in den verschiedenen Phasen der Differenzierung unterschiedliche Relevanz für die Regulation der 11beta-HSD1 Promotoraktivität hatten. Des Weiteren wurden die Proteolyserate und die Expression der E3-Ubiquitin-Ligasen Atrogin-1 und MuRF-1 11beta-HSD1-abhängig durch Cortison induziert. Trotz alledem führte eine Langzeit-Stimulation mit Cortison zu einer 11beta-HSD1-abhängigen Induktion der Differenzierung mit einer Veränderung der Muskelfasertypen in Richtung langsam-zuckender Muskelfasern, was eine Bedeutung für das klinische Bild der glucocorticoid-induzierten Muskelatrophie haben kann. The enzyme 11beta-HSD1 functions as an important pre-receptor control of intracellular glucocorticoid action regulating the intracellular cortisol concentration by enzymatic conversion of the hormonal inactive cortisone up-taken from blood circulation to the active cortisol. A pivotal role of an increased 11beta-HSD1 expression and activity for the development of overweight and insulin resistance has been analysed and demonstrated particularly in liver and adipose tissue. However, the functions of 11beta-HSD1 in skeletal muscle tissue are rarely investigated. For analysis of function and regulation of the 11beta-HSD1 in skeletal muscle the murine skeletal muscle cell line C2C12 as well as primary human myoblasts from healthy volunteers were used. 11beta-HSD1 was shown to be expressed and functionally active as oxo-reductase in human and murine skeletal muscle cells dependent on the differentiation but as well to function as a regulator of differentiation itself. The stimulation experiments revealed a feed-forward-mechanism of cortisone that induced 11beta-HSD1 acutely and chronically. Concurrently, GRalpha and MRalpha were expressed contra-regulatory to 11beta-HSD1. For the most part these data were confirmed in human primary myoblasts. Several transcription factors as CREB, Myogenin and MEF-2c were identified having different relevance for regulation of 11beta-HSD1 promoter activity during the different phases of differentiation. Furthermore, treatment with cortisone increased protein degradation and expression of the two E3-ubiquitin-ligases Atrogin-1 and MuRF-1 in an 11beta-HSD1-dependent way. Nonetheless, a long-term stimulation by cortisone revealed an 11beta-HSD1-dependent induction of differentiation accompanied by modification of muscle fiber type composition towards slow-twitch muscle fibers that may play a role for the clinical picture of glucocorticoid-induced muscle atrophy.

Regulierte Proteolyse zur Anpassung des Proteoms an verändernde Umweltbedingungen wird in Escherichia coli unter anderem von der essentiellen und membranverankerten Protease FtsH durchgeführt. Obwohl FtsH unerlässlich für den Organismus ist, sind nur wenige Substrate und Substraterkennungsprinzipien bekannt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden mit Hilfe einer inaktiven FtsH-Variante bislang unbekannte Substrate gebunden, mit FtsH co-gereinigt und durch Massenspektrometrie identifiziert. Zwei dieser neu identifizierten Substrate (IscS und DadA) werden konstitutiv degradiert. Differenziell werden hingegen die Proteine FdoH (wuchsphasen- und sauerstoffabhängig) und YfgM (wuchsphasenabhängig und bei osmotischem Stress) abgebaut. Eine Charakterisierung des Membranproteins YfgM indizierte, dass YfgM bei der Regulation von verschiedenen Stressantworten involviert ist. Dazu wurde durch gerichtete Mutagenese eine Erkennungssequenz für FtsH am cytosolischen N-Terminus von YfgM identifiziert.

The best model for studying food digestion remains the Human himself. An alternative to in vivo assays is to use in vitro digestion system. The complexity is to perform a device able to mimic accurately the fate of the food occurring in the human digestive tract. The objective of this work was to develop a simple and rather cheap dynamic digestion system enabling the study of the disintegration occurring in the gastro-intestinal tract of neonate and to validate it towards in vivo data. Digestion of an infant formula was studied both in vitro and in vivo using the piglet model. The formula was adapted to the energy and protein requirements of piglets. Six piglets were slaughtered 30, 90 and 210 min after the meal intake. Effluents from the different compartments of the gut were collected at these 3 time points. In parallel, the same infant formula was digested using the in vitro dynamic digestion system. The device consists in two compartments i.e. stomach and small intestine, and is computer-controlled. Milk proteolysis was followed by SDS-PAGE and ELISA both in vivo and in vitro. The validation was assessed by comparing the kinetics of residual immunoreactivity of β-lactoglobulin and caseins. Results showed a good accordance between the 2 systems of digestion. A level of in vitro/in vivo correlation was established with a correlation coefficient of 0.987. Casein content decreased rapidly during the first 30 minutes of gastric digestion. In contrast, β-lactoglobulin remained much longer intact in the stomach (120 min after ingestion). Intestinal digestion resulted in rapid and drastic hydrolysis, no more intact proteins were detected. This validation on infant formula, using the piglet model, has confirmed that this in vitro dynamic digestion system is reliable.

Histidine-aspartate signaling systems are used by bacteria, archaea and eukarya to integrate stimuli over time and space generating coordinated, fine-tuned cellular responses. A hallmark feature is the high modularity of the signaling protein modules which can form simple ’two-component‘ systems, and also sophisticated ’multi-component’ systems. The deltaproteobacterium Myxococcus xanthus contains a large repertoire of signaling proteins, many of which regulate its complex multicellular developmental program. In this respect, one important systems is the Esp signaling system, consisting of the hybrid histidine protein kinase, EspA, two serine/threonine protein kinases (PktA5 and PktB8), and a putative transport protein (EspB). In the presented study, I assign an orphan hybrid histidine protein kinase, EspC, to the Esp signaling system which negatively regulates progression through the M. xanthus developmental program. The genetic analysis revealed that EspC is an essential component of this system, because ΔespA, ΔespC, and ΔespAΔespC double mutants shared an identical early developmental phenotype. Surprisingly, disruption of EspC’s auto-phosphorylation in vivo did not produce a mutant developmental phenotype, whereas substitution of its phospho-accepting residue within the receiver domain resulted in the null phenotype. Furthermore, it is shown that although the EspC histidine kinase could efficiently autophosphorylate in vitro, it did not act as a phospho-donor to its own receiver domain. Instead, both, in vitro and in vivo analyses elucidated that the phospho-donor instead is EspA’s histidine kinase. Therefore, EspA and EspC participate in a novel hybrid histidine protein kinase signaling mechanism involving both inter- and intraprotein phosphotransfer. This inter- and intraprotein phosphotransfer results in the combined phosphorylation of EspA’s and EspC’s receiver domains which represents the output of the Esp signaling system. Further genetic analyses suggested that this Esp system is regulated on the level of its phosphatase activity, likely involving the sensing domains of EspC for regulation. Finally, I uncovered that the Esp system stimulates the proteolytic turnover of MrpC, a crucial transcription factor of the developmental program, via as yet unidentified serine protease. Altogether, these data unravel a novel signaling mechanism of His-Asp signaling systems, and thus expand the knowledge about the complexity and plasticity of these crucial signal transduction systems.

Alle levende organismen hebben een beperkte levensduur, net als de afzonderlijke ‘componenten’ waaruit ze zijn opgebouwd. UMCG-promovendus Laxmi Krishnappa onderzocht hoe eiwitsplitsende enzymen (proteases) 'leven en dood' van eiwitten bepalen, die door bacteriën vanaf de plaats van hun synthese in het cytoplasma naar de cytoplasmamembraan, de celwand en het extracellulaire milieu getransporteerd worden. Hiertoe gebruikte Krishnappa de gram-positieve bacterie Bacillus subtilis als modelorganisme. Deze bacterie produceert tenminste tien belangrijke extracytoplasmatische proteases. Uit eerder onderzoek bleek dat verschillende extracytoplasmatische proteases de biotechnologische inzetbaarheid van B. subtilis beperken. Het was echter niet bekend in welke mate deze proteases de eigen eiwitten van de bacterie afbreken. Krishnappa laat zien dat eiwitten in de cytoplasmamembraan, de celwand en het extracellulaire milieu in grote mate aan proteolyse blootgesteld zijn. Daarbij viel op dat een aantal proteases zelfs componenten van de cellulaire ewitsecretiemachinerie afbreekt. Dit verklaart op zijn minst ten dele waarom mutante bacteriën, die meerdere proteases missen, beter in staat zijn om eiwitten af te scheiden (te secreteren). Daar staat tegenover dat sommige extracytoplasmatische eiwitten proteases nodig hebben voor hun stabiele productie. Dit heeft wellicht te maken met het feit dat deze proteases een belangrijke rol spelen in de eiwitkwaliteitscontrole. De bevindingen uit dit onderzoek dragen bij aan de ontwikkeling van nieuwe super-secreterende bacteriën, die kunnen worden ingezet om aan de steeds groter wordende behoefte aan industriële enzymen en farmaceutische eiwitten te voldoen. Tevens heeft het onderzoek tot nieuwe inzichten geleid, die van belang kunnen zijn voor de bestrijding van ziekteverwekkende bacteriën die verwant zijn aan B. subtilis.

Prolonged inactivity induces muscle loss due to an activation of proteolysis and decreased protein synthesis; the latter is also involved in the recovery of muscle mass. The aim of the present work was to explore the evolution of muscle mass and protein metabolism during immobilization and recovery and assess the effect of a nutritional strategy for counteracting muscle loss and facilitating recovery. Adult rats (6–8 months) were subjected to unilateral hindlimb casting for 8 days (I0–I8) and then permitted to recover for 10 to 40 days (R10–R40). They were fed a Control or Experimental diet supplemented with antioxidants/polyphenols (AOX) (I0 to I8), AOX and leucine (AOX + LEU) (I8 to R15) and LEU alone (R15 to R40). Muscle mass, absolute protein synthesis rate and proteasome activities were measured in gastrocnemius muscle in casted and non-casted legs in post prandial (PP) and post absorptive (PA) states at each time point. Immobilized gastrocnemius protein content was similarly reduced (-37%) in both diets compared to the non-casted leg. Muscle mass recovery was accelerated by the AOX and LEU supplementation (+6% AOX+LEU vs. Control, P

Alle levende organismen hebben een beperkte levensduur, net als de afzonderlijke ‘componenten’ waaruit ze zijn opgebouwd. UMCG-promovendus Laxmi Krishnappa onderzocht hoe eiwitsplitsende enzymen (proteases) 'leven en dood' van eiwitten bepalen, die door bacteriën vanaf de plaats van hun synthese in het cytoplasma naar de cytoplasmamembraan, de celwand en het extracellulaire milieu getransporteerd worden. Hiertoe gebruikte Krishnappa de gram-positieve bacterie Bacillus subtilis als modelorganisme. Deze bacterie produceert tenminste tien belangrijke extracytoplasmatische proteases. Uit eerder onderzoek bleek dat verschillende extracytoplasmatische proteases de biotechnologische inzetbaarheid van B. subtilis beperken. Het was echter niet bekend in welke mate deze proteases de eigen eiwitten van de bacterie afbreken. Krishnappa laat zien dat eiwitten in de cytoplasmamembraan, de celwand en het extracellulaire milieu in grote mate aan proteolyse blootgesteld zijn. Daarbij viel op dat een aantal proteases zelfs componenten van de cellulaire ewitsecretiemachinerie afbreekt. Dit verklaart op zijn minst ten dele waarom mutante bacteriën, die meerdere proteases missen, beter in staat zijn om eiwitten af te scheiden (te secreteren). Daar staat tegenover dat sommige extracytoplasmatische eiwitten proteases nodig hebben voor hun stabiele productie. Dit heeft wellicht te maken met het feit dat deze proteases een belangrijke rol spelen in de eiwitkwaliteitscontrole. De bevindingen uit dit onderzoek dragen bij aan de ontwikkeling van nieuwe super-secreterende bacteriën, die kunnen worden ingezet om aan de steeds groter wordende behoefte aan industriële enzymen en farmaceutische eiwitten te voldoen. Tevens heeft het onderzoek tot nieuwe inzichten geleid, die van belang kunnen zijn voor de bestrijding van ziekteverwekkende bacteriën die verwant zijn aan B. subtilis.

Matrixmetalloproteïnases (MMP's) zijn bij een groot aantal pathologische processen betrokken die gerelateerd zijn aan een verstoring van hun proteolytische activiteit. Daarom is de meting van actieve MMP's nuttiger voor de karakterisering van biologische of pathologische voorvallen, dan de bepaling van het totale overschot. Het doel van dit PhD-project was de ontwikkeling van analytische technieken ter controle van MMP-activiteit. Daarvoor is onderzoek gedaan naar fotogevoelige labeling , absolute kwantificering met massaspectrometrie in de Selected Reaction Monitoring (SRM) modus, en naar op activiteit gerichte verrijkingstechnieken. Het labelen met een S1’ fotogevoelige, op activiteit gerichte probe en het katalytisch domein van recombinant MMP-12, resulteerde in een verhouding van 1:1 (hoofdstuk 2). Daarnaast kon het gelabelde eiwit geconcentreerd worden met monomere avidine deeltjes, gebaseerd op de biotine keten die deel uitmaakt van de probe. De karakterisering van de aminozuur(en) die vastgehouden worden door covalente binding(en) met de kunstmatige probes wordt nog onderzocht. Door de toepassing van LC-MS/MS (SRM modus) is er een doelgerichte analyse van MMP-9 in bronchoalveolaire lavage vloeistof (BALF) ontwikkeld (hoofdstuk 3) . Deze SRM analyse maakt de absolute kwantificering van MMP-9 naar het lage ng / mL niveau mogelijk. De ontwikkelde analyse werd aangepast voor MMP-12 door het meten van een andere set van signatuurpeptiden. Met behulp van deze bepaling wordt de activiteit van MMP-9 nog nietgeanalyseerd, Daarom werd de op activiteit gerichte opzuiverbenadering gecombineerd met de MMP-9 en MMP-12 SRM analyse (hoofdstuk 4). We hebben deze methodologie verder uitgebreid door de peptiden die behoren tot het pro-domein van MMP-9 alsmede die van de belangrijkste endogene remmer van MMP-9, TIMP-1 te meten. Tenslotte worden de voor- en na-delen van de ontwikkelde technieken en hun potentieel voor automatisering besproken (hoofdstuk 5).

Matrixmetalloproteïnases (MMP's) zijn bij een groot aantal pathologische processen betrokken die gerelateerd zijn aan een verstoring van hun proteolytische activiteit. Daarom is de meting van actieve MMP's nuttiger voor de karakterisering van biologische of pathologische voorvallen, dan de bepaling van het totale overschot. Het doel van dit PhD-project was de ontwikkeling van analytische technieken ter controle van MMP-activiteit. Daarvoor is onderzoek gedaan naar fotogevoelige labeling , absolute kwantificering met massaspectrometrie in de Selected Reaction Monitoring (SRM) modus, en naar op activiteit gerichte verrijkingstechnieken. Het labelen met een S1’ fotogevoelige, op activiteit gerichte probe en het katalytisch domein van recombinant MMP-12, resulteerde in een verhouding van 1:1 (hoofdstuk 2). Daarnaast kon het gelabelde eiwit geconcentreerd worden met monomere avidine deeltjes, gebaseerd op de biotine keten die deel uitmaakt van de probe. De karakterisering van de aminozuur(en) die vastgehouden worden door covalente binding(en) met de kunstmatige probes wordt nog onderzocht. Door de toepassing van LC-MS/MS (SRM modus) is er een doelgerichte analyse van MMP-9 in bronchoalveolaire lavage vloeistof (BALF) ontwikkeld (hoofdstuk 3) . Deze SRM analyse maakt de absolute kwantificering van MMP-9 naar het lage ng / mL niveau mogelijk. De ontwikkelde analyse werd aangepast voor MMP-12 door het meten van een andere set van signatuurpeptiden. Met behulp van deze bepaling wordt de activiteit van MMP-9 nog nietgeanalyseerd, Daarom werd de op activiteit gerichte opzuiverbenadering gecombineerd met de MMP-9 en MMP-12 SRM analyse (hoofdstuk 4). We hebben deze methodologie verder uitgebreid door de peptiden die behoren tot het pro-domein van MMP-9 alsmede die van de belangrijkste endogene remmer van MMP-9, TIMP-1 te meten. Tenslotte worden de voor- en na-delen van de ontwikkelde technieken en hun potentieel voor automatisering besproken (hoofdstuk 5).

L’industrie laitière rencontre parfois des problèmes d’instabilité du lait UHT (Ultra Haute Température) au cours de son stockage. Cette instabilité se traduit généralement par une gélification ou par une séparation de phases. Parmi les causes qui sont multifactorielles (zoologique, enzymatique, physico-chimique...) la protéolyse des micelles de caséines des laits UHT au cours de leur stockage par des protéases thermorésistantes appartenant au genre Pseudomonas est souvent évoquée. Ce travail a donc été effectué dans le but de mieux comprendre la déstabilisation du lait UHT dont le lait cru a été préalablement contaminé par des bactéries protéolytiques du genre Pseudomonas. La spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier a été explorée afin de détecter cette cause et de prédire la stabilité des laits avant leurs transformations technologiques. Dans un premier temps, 32 souches du genre Pseudomonas ont été sélectionnées en fonction de leur caractère protéolytique et de la présence de la protéase AprX (seule protéase extracellulaire identifiée à partir de Pseudomonas isolée du lait). Toutes les souches des espèces P. fluorescens et P. tolaasii ainsi que quelques souches des espèces P. chlororaphis, P. fragi et P. aeruginosa sécrétaient cette protéase. Parmi les espèces P. aeruginosa et P. fragi, certaines souches sécrétaient une protéase de masse moléculaire différente de celle de la protéase AprX. Indépendamment de l’espèce étudiée et de la protéase secrétée, il existait une variabilité de protéolyse au sein des 32 souches. Certaines souches étaient protéolytiques alors que d’autres ne l’étaient pas. Dans un second temps, le suivi de la stabilité de laits UHT préalablement et indépendamment inoculés par 9 souches de P. fluorescens, sécrétant AprX mais au caractère protéolytique différent, a montré que cette hétérogénéité de protéolyse existait aussi dans le lait UHT. Certaines souches déstabilisaient le lait UHT avant la fin des 90 jours de stockage alors que d’autres non. L’addition de la protéase AprX, dans le lait cru avant traitement UHT a également engendré une déstabilisation du lait UHT avant la fin des 90 jours de stockage confirmant le rôle de cette enzyme dans le phénomène de déstabilisation. L’étude réalisée avec la souche P. fragi 9.12 qui semblait sécréter une protéase différente d’AprX nous a montré qu’elle était capable de déstabiliser le lait UHT au cours du stockage. Ce résultat nous a conforté sur le fait qu’AprX ne serait pas la seule protéase extracellulaire des bactéries du genre Pseudomonas ayant un effet sur la déstabilisation du lait UHT. Pour chaque expérimentation effectuée, la déstabilisation se traduisait par une apparition d’agrégats, des augmentations des teneurs en azote non protéique et non caséinique (NPN et NCN) et des diminutions de l’hydratation micellaire et du potentiel zêta, nous indiquant une protéolyse des micelles de caséines. Les résultats obtenus par l’analyse HPLC couplée à la spectrométrie de masse des fractions NCN des laits déstabilisés par les 5 souches de P. fluorescens déstabilisantes et la protéase AprX, ont montré qu’AprX avait un large spectre d’action et était capable d’hydrolyser les caséines β, s1, s2 et κ. Dans un troisième temps, la spectroscopie IRTF a été utilisée dans le but de détecter la présence de bactéries du genre Pseudomonas protéolytiques. Cette phase exploratoire nous a permis de déterminer le seuil de détection d’un lait contaminé par une bactérie du genre Pseudomonas ainsi que le seuil de discrimination d’un lait contenant des Pseudomonas protéolytiques d’un lait contenant des Pseudomonas non protéolytiques (5.102 UFC/mL). Cependant, l’analyse d’un lait contenant minoritairement des Pseudomonas protéolytiques nous a montré que le caractère protéolytique ne ressortait pas sur le spectre IR alors que le risque de protéolyse était bien présent. Des travaux supplémentaires sont donc à réaliser afin que la spectroscopie IRTF soit utilisée comme un outil de prédiction de la stabilité des laits., Dairy industries have sometimes problems of instability of UHT milk (Ultra High Temperature) during storage. This instability usually results in gelation or phase separation. Among the multifactorial causes (Zoological enzyme, Physico-chemical ...), proteolysis of casein micelles of UHT milk by heat-resistant proteases belonging to the genus Pseudomonas during storage, is often mentioned. This work has been conducted to understand the destabilization of UHT milk with raw milk previously contaminated by proteolytic Pseudomonas. Infrared spectroscopy Fourier transform has been explored in order to detect the cause and predict the stability of milk before their technological transformations. Initially, 32 strains of the genus Pseudomonas were selected according to their proteolytic potential and the presence of protease AprX (unique extracellular protease identified from Pseudomonas isolated from milk). All strains of the species P. fluorescens and P. tolaasii and some strains of the species P. chlororaphis, P. fragi and P. aeruginosa secreted this protease. Among the species P. aeruginosa and P. fragi, some strains secreted a protease with a molecular mass different from the one of the protease aprx. Regardless of the species studied and protease secreted, there was a proteolysis variability of the 32 strains. Some strains were proteolytic, while others were not. In a second step, the monitoring of the stability of UHT milk previously and independently inoculated by nine strains of P. fluorescens, secreting AprX but with different proteolytic potential, showed that this heterogeneity of proteolysis also happened in UHT milk. Some strains destabilized UHT milk before the end of 90 days of storage, while others did not. The addition of protease AprX in raw milk before UHT treatment also resulted in a destabilization of UHT milk before the end of 90 days of storage, confirming the role of this enzyme in the phenomenon of destabilization. The study with the strain P. fragi 9.12 that secreted a protease different from AprX, showed that it was able to destabilize UHT milk during storage. This result confirmed the fact that AprX was not the only extracellular protease bacteria of the genus Pseudomonas having an effect on the destabilization of UHT milk. For each experiment performed, the destabilization resulted in a formation of aggregation, in increases of non-protein and non-casein nitrogen contents (NPN and NCN) and in decreases of hydrations and zeta potentials of caseins micelles, indicating proteolysis of casein micelles. The results obtained by HPLC analysis coupled with mass spectrometry of NCN fractions of milk destabilized by 5 proteolytic strains of P. fluorescens and the protease AprX showed that this enzyme had a large action spectrum and was able to hydrolyze β, s1, s2 and κ casein. In a third step, FTIR spectroscopy was used to detect the presence of proteolytic bacteria of the genus Pseudomonas. This exploratory phase allowed us to determine the threshold for detection of milk contaminated with bacteria of the genus Pseudomonas and the discrimination threshold of milk containing proteolytic Pseudomonas from milk containing non-proteolytic Pseudomonas (5.102 CFU / mL). However, the analysis of milk containing a smaller quantity of proteolytic Pseudomonas than non proteolytic Pseudomonas, showed us that the character proteolytic dit not appears in the IR spectrum, while the risk of proteolysis was present. Further works have to be undertaken to use FTIR spectroscopy as a tool for predicting the stability of milk.

Alle levende organismen hebben een beperkte levensduur, net als de afzonderlijke ‘componenten’ waaruit ze zijn opgebouwd. UMCG-promovendus Laxmi Krishnappa onderzocht hoe eiwitsplitsende enzymen (proteases) 'leven en dood' van eiwitten bepalen, die door bacteriën vanaf de plaats van hun synthese in het cytoplasma naar de cytoplasmamembraan, de celwand en het extracellulaire milieu getransporteerd worden. Hiertoe gebruikte Krishnappa de gram-positieve bacterie Bacillus subtilis als modelorganisme. Deze bacterie produceert tenminste tien belangrijke extracytoplasmatische proteases. Uit eerder onderzoek bleek dat verschillende extracytoplasmatische proteases de biotechnologische inzetbaarheid van B. subtilis beperken. Het was echter niet bekend in welke mate deze proteases de eigen eiwitten van de bacterie afbreken. Krishnappa laat zien dat eiwitten in de cytoplasmamembraan, de celwand en het extracellulaire milieu in grote mate aan proteolyse blootgesteld zijn. Daarbij viel op dat een aantal proteases zelfs componenten van de cellulaire ewitsecretiemachinerie afbreekt. Dit verklaart op zijn minst ten dele waarom mutante bacteriën, die meerdere proteases missen, beter in staat zijn om eiwitten af te scheiden (te secreteren). Daar staat tegenover dat sommige extracytoplasmatische eiwitten proteases nodig hebben voor hun stabiele productie. Dit heeft wellicht te maken met het feit dat deze proteases een belangrijke rol spelen in de eiwitkwaliteitscontrole. De bevindingen uit dit onderzoek dragen bij aan de ontwikkeling van nieuwe super-secreterende bacteriën, die kunnen worden ingezet om aan de steeds groter wordende behoefte aan industriële enzymen en farmaceutische eiwitten te voldoen. Tevens heeft het onderzoek tot nieuwe inzichten geleid, die van belang kunnen zijn voor de bestrijding van ziekteverwekkende bacteriën die verwant zijn aan B. subtilis.

Huntington’s disease (HD) is an autosomal dominant inherited neurodegenerative disorder caused by an abnormal polyglutamine (polyQ) expansion in the N-terminus of the protein huntingtin (HTT). A crucial step in HD pathogenesis is the cleavage of full-length HTT into smaller N-terminal (N-ter) fragments that contain the polyQ stretch and that are toxic to neurons. HTT cleavage generates short N-ter fragments whose amino-acid positions range from 1-105 to 1-586. These fragments are observed in HD post mortem brain samples and their participation in neuronal death in HD is well characterized. During my PhD research, I investigated the consequences of full-length mutant HTT proteolysis by developing a time and site-specific controlled system for HTT proteolysis. I have assessed HTT cleavage on two sites caspase-6 and cathepsin Z. My results show that HTT cleavage induces neurotoxicity in vitro as well as in vivo, toxicity which depends on HTT proteolysis pattern. Briefly, we described an intramolecular interaction within the HTT domains which is impaired upon successive proteolysis of HTT. We found that HTT intramolecular interaction buffer mutant N-ter HTT-induced toxicity. Moreover, specific cleavages of the mutant HTT generated toxic N-ter fragments as they translocate into the nucleus. To conclude, my PhD work has shown that additional cleavage of mutant HTT induces cytotoxicity by different mechanisms., La maladie de Huntington (MH) est une maladie neurodégénérative héréditaire autosomique dominante. Elle est due à l’expansion anormale de polyglutamine dans la partie N-terminal de la protéine huntingtine (HTT). Une des étapes clés de la pathologie est le clivage de la HTT pleine longueur en fragments N-terminaux plus petits, contenant l’expansion de polyglutamine, et qui sont toxiques pour les neurones. En effet, les clivages de la HTT mutée génère des fragments N-terminaux (N-ter) de tailles comprises entre les acides aminés 1-105 et 1-586 observés dans des extraits de cerveaux de patients MH post-mortem et dont l’implication dans la mort neuronal est bien caractérisée. Mes travaux de thèse ont visé à modéliser le clivage de la HTT et à évaluer les conséquences sur la survie neuronale.Au cours de ma thèse, j’ai développé un outil permettant de contrôler le clivage de la HTT dans le temps et à des sites spécifiques. J’ai étudié le clivage de la HTT à deux sites stratégiques : les positions clivées par la caspase-6 et par la bléomycine hydrolase/cathepsine Z. A l’aide de cet outil, j’ai montré que le clivage de la HTT confère une toxicité cellulaire qui dépend du profil du clivage. Plus précisément, J’ai décrit une interaction intramoléculaire au sein des domaines de la HTT. Mes résultats indiquent que cette interaction protège les cellules de la toxicité induite par le clivage de la HTT mutée. En effet, les clivages successifs de la HTT annulent cette interaction, ce qui induit la libération des fragments N-ter mutants et provoque la mort cellulaire à l’issue de leur translocation nucléaire. Pour conclure, au cours de ma thèse, j’ai montré que la protéolyse successive de la HTT induit des processus cytotoxiques différents.

Matrixmetalloproteïnases (MMP's) zijn bij een groot aantal pathologische processen betrokken die gerelateerd zijn aan een verstoring van hun proteolytische activiteit. Daarom is de meting van actieve MMP's nuttiger voor de karakterisering van biologische of pathologische voorvallen, dan de bepaling van het totale overschot. Het doel van dit PhD-project was de ontwikkeling van analytische technieken ter controle van MMP-activiteit. Daarvoor is onderzoek gedaan naar fotogevoelige labeling , absolute kwantificering met massaspectrometrie in de Selected Reaction Monitoring (SRM) modus, en naar op activiteit gerichte verrijkingstechnieken. Het labelen met een S1’ fotogevoelige, op activiteit gerichte probe en het katalytisch domein van recombinant MMP-12, resulteerde in een verhouding van 1:1 (hoofdstuk 2). Daarnaast kon het gelabelde eiwit geconcentreerd worden met monomere avidine deeltjes, gebaseerd op de biotine keten die deel uitmaakt van de probe. De karakterisering van de aminozuur(en) die vastgehouden worden door covalente binding(en) met de kunstmatige probes wordt nog onderzocht. Door de toepassing van LC-MS/MS (SRM modus) is er een doelgerichte analyse van MMP-9 in bronchoalveolaire lavage vloeistof (BALF) ontwikkeld (hoofdstuk 3) . Deze SRM analyse maakt de absolute kwantificering van MMP-9 naar het lage ng / mL niveau mogelijk. De ontwikkelde analyse werd aangepast voor MMP-12 door het meten van een andere set van signatuurpeptiden. Met behulp van deze bepaling wordt de activiteit van MMP-9 nog nietgeanalyseerd, Daarom werd de op activiteit gerichte opzuiverbenadering gecombineerd met de MMP-9 en MMP-12 SRM analyse (hoofdstuk 4). We hebben deze methodologie verder uitgebreid door de peptiden die behoren tot het pro-domein van MMP-9 alsmede die van de belangrijkste endogene remmer van MMP-9, TIMP-1 te meten. Tenslotte worden de voor- en na-delen van de ontwikkelde technieken en hun potentieel voor automatisering besproken (hoofdstuk 5).

Destabilisation of ultra high temperature (UHT) treated milk has been linked to residual proteolytic activity after UHT treatment. To understand the physico-chemical modifications of casein micelles by the protease AprX, produced by Pseudomonas fluorescens F, this enzyme was purified and added to raw milk before UHT treatment. Destabilisation of the UHT milk, over three months of storage, was investigated at macroscopic, colloidal and molecular scales. A visual destabilisation appeared progressively over time. At colloidal scale, aggregates were formed and a parallel decrease in zeta potential and hydration of casein micelles was observed. At molecular scale, peptides were released from casein micelles and identified by reversed-phase liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry. The aS1-, aS2-, b- and kcaseins were hydrolysed, with a preference for b-casein. The results were consistent with the proposition that proteolysis by Ps. fluorescens leading to the destabilisation of milk was due to the activity of AprX.

Skeletal muscle is the main reservoir of body amino acids. Thus, muscle atrophy induced by immobilization can lead to a weakening and to a lengthening of recovery periods, leading to elevated healthcare costs. Surprisingly, a worsening of tibialis anterior (TA) muscle atrophy prevailed after cast removal and thus delayed recovery. The aim of my Ph.D was to understand mechanisms underlying the worsening of TA atrophy during early recovery by studying i) the muscle structure and phenotype, ii) the composition of the extracellular matrix (ECM), iii) proteolysis and apoptosis, and iv) the signaling pathways via integrins. Rats were subjected to hindlimb casting for 8 days of one hindllimb, the other leg served as control, and then were allowed to recover for 10 days. The worsening of TA atrophy appeared immediately after cast removal and correlated with i) a decrease in fiber crosssection area associated to fiber deformation, ii) a redistribution of myosin heavy chain isoforms, iii) an increase in apoptosis localized in the connective tissue, iv) a thickening of the endomysium during remobilization, v) some adaptations in collagen remodeling processes, and vi) a pronounced and sustained activation of the ubiquitin-proteasome proteolytic system (UPS) and of the apoptosome. We also showed an increase in the remobilized TA of mRNA levels vii) of tenascin-C and Sparc immediately after cast removal, and viii) of some autophagy markers, when atrophy stabilized. Finally, we showed an elevation of mRNA levels encoding ix) myogenic factors, and x) transmembrane integrins and their partners during TA immobilization and after cast removal. In conclusion, my Ph.D project showed that the worsening of the TA atrophy occurred early after cast removal, was associated with a significant remodeling of the structure and composition of the ECM and of the phenotype of muscle fibers, and may result from pronounced and sustained increase in the UPS and apoptosis. This work suggests that changes in the matricellular matrix molecules during remobilization could influence integrin-dependent signaling and muscle regeneration., Le muscle squelettique est le réservoir principal d’acides aminés libres de l’organisme. Ainsi, l’atrophie musculaire induite par l’immobilisation peut entraîner un affaiblissement et un allongement des périodes de récupération générant des coûts de santé publique élevés. Une aggravation de l’atrophie caractérise de façon surprenante le muscle tibialis anterior (TA) après le déplâtrage, retardant la récupération. Mon objectif a été de comprendre les mécanismes à l’origine de l’aggravation de l’atrophie du TA pendant les phases précoces de récupération en étudiant i) la structure et le phénotype des muscles, ii) la composition de la matrice extracellulaire (MEC), iii) la protéolyse et l’apoptose, et iv) les processus de signalisation via les intégrines. Des rats ont été soumis à une immobilisation par plâtrage pendant 8 jours d’une des deux pattes arrière, l’autre servant de témoin, et placés en récupération pendant 10 jours. L’aggravation de l’atrophie du TA apparaît dès déplâtrage, corrélée avec i) une baisse de l’aire des fibres associée à leur déformation, ii) une redistribution des isoformes des chaines lourdes de myosines, iii) une augmentation de l’apoptose localisée dans le tissu conjonctif, iv) un épaississement de l’endomysium pendant la remobilisation, v) des adaptations au niveau des processus de remodelage des collagènes, et vi) une activation prononcée et persistante du système protéolytique ubiquitine-protéasome (UPS) et de l’apoptosome. Nous montrons également une élévation des niveaux ARNm dans le TA remobilisé vii) de la ténascine-C et de Sparc dès le déplâtrage, et viii) de marqueurs de l’autophagie à partir du moment où l’atrophie se stabilise. Enfin, nous montrons également une élévation des ARNm dans le TA immobilisé ix) des facteurs myogéniques, et x) des intégrines membranaires et de leurs partenaires pendant l’immobilisation et après le déplâtrage. En conclusion, mon travail de thèse a permis de montrer que l'aggravation de l’atrophie du TA est précoce, associée à un remodelage important de la structure et de la composition de la MEC et du phénotype des fibres musculaires, et pourrait résulter de l’augmentation persistante et prononcée de la voie UPS et de l’apoptose. Ce travail suggère que des modifications au niveau des molécules matricielles pendant la remobilisation pourraient influencer la signalisation dépendante des intégrines et la régénération musculaire.

Milk lipids supply 50-60 % of the calories necessary for newborn growth under the form of maternal milk or infant formulas. Infant formulas have been optimized in terms of chemical composition but not with regards to the structure of the emulsion. An important difference remains between the native emulsions of milk fat globules (4 µm) as opposed to the processed submicronic emulsions (0.5 µm) of infant formulas. This structural difference may modify the kinetics of digestion and disintegration of the emulsion in the digestive tract of the newborns. Indeed the native emulsions develop an interfacial surface of 1.8 m2/g of lipid stabilized by a natural trilayered membrane based of phospholipids and proteins, whereas infant formulas present a much higher neoformed interfacial surface (30 m2/g of lipid) stabilized by dairy proteins. This higher interfacial surface is supposed to increase infant formula susceptibility to lipolysis but also to proteolysis through the higher accessibility of proteases to adsorbed proteins. To check this hypothesis, 3 matrices were formulated: M1 containing raw bovine milk fat globules dispersed in an infant formula-type serum phase, M2 similar to M1 with an additional high pressure homogenization treatment and M3 similar to M2 with the addition of a pasteurization treatment. The matrices were subjected to the semi-dynamic gastric phase of an in vitro digestion mimicking the conditions reported in newborns. The disintegration and the kinetics of lipolysis and proteolysis were monitored during the 180 minutes of digestion. The initial structure affected both the kinetics of the hydrolysis and the disintegration of the matrices. The initial rate of lipolysis of M1 was ~ 55 times lower than for M2 or M3 which was partially explained by its lower specific surface. Total proteolysis of caseins was observed at 30 minutes on M3 whereas it only occurred after 120 minutes for M1. The initial structure impacted the gastric destabilization with the formation of larger aggregates for M1 (mode at 190 µm at 30 min) than on the two other matrices. Since the free fatty acids and amino acids liberated in the gastric phase can act as second messenger and modulate the gastric emptying, this effect of structure may have important physiologic consequences. The gastric in vitro semi-dynamic model allowed rapid screening of matrices and limitations of consumption of digestive enzymes. In the future, it will be employed on maternal milk to determine the additional effect of the endogenous lipase on the digestion.

In this manuscript, we describe the development and the optimization of an original strategy for the characterization of protein N-termini and protease cleavage sites. The strategy is based on specific chemical derivation of alpha-amines. We applied this method to the characterization of mitochondrial proteins’ transit peptides which allowed us to experimentally validate/correct their prediction in protein databases. In another study, the strategy was applied to the analysis of the proteome of the malaria parasite Plasmodium falciparum. The optimization of ingel N-terminal derivation and its application to the study of parasite exported proteins allowed us to determine the role of implicated amino acid residues in the signaling and export mechanism of these proteins to the host cell. To enable differential studies of proteolysis, we introduced an isotope labeled derivation reagent. This quantitative method was applied in the context of a study of the rat liver proteome after experimental long-term fasting. Other applications of proteomics in biology are also presented in this manuscript., Dans ce travail de thèse, nous avons développé et optimisé une stratégie originale pour la caractérisation des extrémités N-terminales des protéines et des sites de clivages protéolytiques. Elle s’appuie sur la dérivation chimique spécifique des amines N-terminales et nous l’avons adapté à différents types d’échantillons biologiques. L’application de cette stratégie dans des études en biologie nous a permis d’apporter plusieurs éléments de réponse à différentes problématiques. Nous avons ainsi caractérisé les peptides de transit des protéines mitochondriales humaines et ainsi validé/corrigé expérimentalement leurs prédictions dans les banques de données. Nous avons aussi appliqué cette stratégie à l’étude du protéome du parasite P. falciparum. La mise au point de la dérivation N-terminale de protéines immobilisées dans un gel SDS PAGE nous a permis d’étudier le mécanisme d’export des protéines de ce parasite vers sa cellule hôte et de déterminer le rôle des acides aminés impliqués dans cet export. Un réactif de dérivation marqué aux isotopes stables permet d’effectuer des études différentielles des processus protéolytiques que subissent les protéines. Cette stratégie quantitative a été appliquée à l’étude du protéome hépatique du rat soumis au jeûne expérimental. D’autres applications de l’analyse protéomique en biologie sont aussi présentées dans ce manuscrit.

In this manuscript, we describe the development and the optimization of an original strategy for the characterization of protein N-termini and protease cleavage sites. The strategy is based on specific chemical derivation of alpha-amines. We applied this method to the characterization of mitochondrial proteins’ transit peptides which allowed us to experimentally validate/correct their prediction in protein databases. In another study, the strategy was applied to the analysis of the proteome of the malaria parasite Plasmodium falciparum. The optimization of ingel N-terminal derivation and its application to the study of parasite exported proteins allowed us to determine the role of implicated amino acid residues in the signaling and export mechanism of these proteins to the host cell. To enable differential studies of proteolysis, we introduced an isotope labeled derivation reagent. This quantitative method was applied in the context of a study of the rat liver proteome after experimental long-term fasting. Other applications of proteomics in biology are also presented in this manuscript.; Dans ce travail de thèse, nous avons développé et optimisé une stratégie originale pour la caractérisation des extrémités N-terminales des protéines et des sites de clivages protéolytiques. Elle s’appuie sur la dérivation chimique spécifique des amines N-terminales et nous l’avons adapté à différents types d’échantillons biologiques. L’application de cette stratégie dans des études en biologie nous a permis d’apporter plusieurs éléments de réponse à différentes problématiques. Nous avons ainsi caractérisé les peptides de transit des protéines mitochondriales humaines et ainsi validé/corrigé expérimentalement leurs prédictions dans les banques de données. Nous avons aussi appliqué cette stratégie à l’étude du protéome du parasite P. falciparum. La mise au point de la dérivation N-terminale de protéines immobilisées dans un gel SDS PAGE nous a permis d’étudier le mécanisme d’export des protéines de ce parasite vers sa cellule hôte et de déterminer le rôle des acides aminés impliqués dans cet export. Un réactif de dérivation marqué aux isotopes stables permet d’effectuer des études différentielles des processus protéolytiques que subissent les protéines. Cette stratégie quantitative a été appliquée à l’étude du protéome hépatique du rat soumis au jeûne expérimental. D’autres applications de l’analyse protéomique en biologie sont aussi présentées dans ce manuscrit.

Durch regulierte Proteolyse kann das zelluläre Proteom schnell und effektiv an die jeweiligen Umweltbedingungen angepasst werden. In Bakterien wird der Energieabhängige Abbau von Proteinen durch die spezifische Substraterkennung von \(AAA^{+}\)-Proteasen (\(\bf A\)TPases \(\bf a\)ssociated with various cellular \(\bf a\)ctivities) ermöglicht. Während die Protease FtsH in der inneren Membran verankert ist, handelt es sich bei Lon um eine cytoplasmatische Protease. FtsH kontrolliert in \(\textit {Escherichia coli}\) unter anderem die Hitzeschockantwort und die Biosynthese von Lipopolysacchariden durch Degradation der Proteine RpoH und LpxC. Im Rahmen dieser Arbeit wurde (i) die Substraterkennung von RpoH durch FtsH, (ii) die Konservierung der Regulation der LPS-Synthese über Proteolyse in verschiedenen Gram-negativen Bakterien sowie (iii) die Substratvielfalt von FtsH analysiert. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass der Replikationsinhibitor CspD in \(\textit {E. coli}\) über Lon-abhängige Proteolyse reguliert wird. Regulated proteolysis is a powerful mechanism to rapidly adjust the cellular proteome to changing environmental conditions. In bacteria the energy-dependent degradation of proteins is mediated by the specific substrate recognition of \(AAA^{+}\) proteases (\(\bf A\)TPases \(\bf a\)ssociated with various cellular \(\bf a\)ctivities). While the protease FtsH is anchored to the inner membrane, Lon is a cytoplasmic protease. In Escherichia coli, FtsH e. g. controls the heat shock response and the biosynthesis of lipopolysaccharides (LPS) through degradation of its substrates RpoH and LpxC. In this work (i) the substrate recognition of RpoH by FtsH, (ii) the conservation of regulation of LPS biosynthesis by proteolysis in different Gram-negative species and (iii) the substrate diversity of the FtsH protease were analyzed. Furthermore it was demonstrated that the replication inhibitor CspD is a substrate of the Lon protease in \(\it {E. coli}\).

The objective of this study was to optimize the extraction of chitin by acid proteolysis. The novelty of the method is based on the stabilization of pH by the balance between substrate composition and the acid solvent. This principle allows a simultaneous demineralization and deproteinization, the two main reactions associated with the purification of chitin. To evaluate the performance of this purification, the composition of the substrate and products was characterized. Different methods of quantification of chitin and proteins have been compared. As traditional assays were not satisfaying, a direct method of amino acids determination by gaz chromatography was selected to estimate the amount of protein. The estimate of chitin amount was based on indirect methods, mainly gravimetry, elemental analysis and thermogravimetric analysis (TGA). Kinetics of demineralization and deproteinization were examined to optimize the purification of chitin. Mass balances confirmed the consistency of results. The quality of chitin extracted by enzymatic or chemical techniques was compared with the degree of acetylation and depolymerization and the crystallinity index of chitin. The structure of chitin was also observed by scanning electron microscopy (SEM). Finally, compounds solubilized by enzymatic hydrolysis were identified and quantified., L’objectif de l’étude porte sur l’optimisation de l’extraction de la chitine par protéolyse acide. L’originalité du procédé repose sur la stabilisation du pH grâce à l’équilibre entre la composition du substrat et le solvant acide. Ce principe permet de réaliser simultanément la déminéralisation et la déprotéinisation, les deux principales réactions associées à la purification de la chitine. Pour évaluer les performances de cette purification, la composition du substrat et des produits est caractérisée. Différentes méthodes de quantification de la chitine et des protéines sont comparées. Contrairement aux dosages traditionnels, une méthode directe de dosage des acides aminés est sélectionnée pour estimer la quantité de protéines. L’estimation de la quantité de chitine repose sur des méthodes indirectes, principalement la gravimétrie, l’analyse élémentaire et l’analyse thermogravimétrique (ATG). Les cinétiques de déminéralisation et de déprotéinisation sont étudiées en vue d’optimiser la purification de la chitine. Les bilans massiques confirment la cohérence des résultats. Les caractéristiques physico-chimiques de la chitine obtenue par voie enzymatique, le degré d’acétylation, le degré de dépolymérisation et l’indice de cristallinité, sont comparées à la chitine obtenue par voie chimique. La structure de la chitine a également été observée par microscopie électronique à balayage (MEB). Enfin, les composés solubilisés par l’hydrolyse enzymatique sont identifiés et quantifiés.

Digestion of nutrients is an essential function for human to allow normal growth and development. During digestion, the structure of the food is strongly modified and detailed characterization of the digestion products is essential for a better understanding on how food is disintegrated in the gastro-intestinal tract. It appears therefore crucial to have methods for characterizing the evolution of the matrix at different scales, from the macroscopic to the molecular level. Different methods such as biochemical techniques (SDS-PAGE, mass spectrometry) but also molecular immunology (ELISA) have been developed and allowed the monitoring of the proteolysis throughout the gastro intestinal tract at a molecular level. Evolution of the food at the microscopic level was evaluated by confocal microscopy and light scattering. In order to characterize the rheological properties and the clotting ability of a liquid dairy sample in the stomach, an infant formula was placed in an AR 1000 rheometer (TA Instrument) and glucono-delta lactone (GDL) was added in order to mimic the decrease in pH that will occur in the stomach of the neonate after meal ingestion. Formation of the acid gels was monitored using low-amplitude dynamic oscillation by measuring the elastic modulus (G’), the loss modulus (G”) and the loss tangent of the sample under acidification at 37◦C. The applied deformation was 0.1%, frequency was 1Hz, and gel formation was followed for at least 4h. The onset of gelation was defined as the time when G’ > 1Pa. Combination of this set of techniques allowed demonstrating that an increase in the intensity of the heat-treatment applied to the milk concentrate during infant formula manufacture increased significantly the firmness of the bolus in gastric conditions and modified the kinetics of proteolysis of the milk proteins. We also demonstrated that the presence of insoluble particles in a rehydrated infant formulas lead to the absence of gel formation in the stomach.

Skeletal muscle demonstrated a remarkable plasticity in response to physiological changes, such as physical activity, and pathological situations. He suffered such severe atrophy during cachexia that accompanies various pathologies such as cancer, AIDS, etc.. Muscle atrophy is also a component of sarcopenia that occurs during normal aging, and is characterized by a decline in strength and muscle mass. Muscle atrophy, which leads to increased mortality and decreased treatment efficacy, thus constitutes a health problem majeur.La muscle wasting is characterized by an impaired balance between protein synthesis and degradation in adult fibers. Particularly high levels of circulating cytokines, including TNF, which affect muscle homeostasis via different signaling pathways appear to be the cause of atrophy. Mechanisms of muscle atrophy response to these elevated circulating levels are however unclear. TNFa has complex effects. It may activate multiple signaling pathways, including the induction of the synthesis of sphingolipids, especially ceramides, for the de novo pathway and the activation of sphingomyelinases. In muscle, ceramides are known for their effects on insulin signaling on apoptosis and myogenic differentiation. By cons, their involvement in the context of atrophy was never taken into account. The objective of this work was firstly to demonstrate the role of ceramides in atrophy. In a second step, we characterized the signaling pathway by which increased intramuscular ceramide induced by TNF leads to a fall in protein synthesis, coupled with an increase in proteolysis. For this purpose, we have developed in vitro models of atrophy involving myotubes treated with physiological concentrations of TNF . We studied in parallel an in vivo model of cachexia induced in mice by implantation of adenocarcinoma C26. Analysis of sphingolipids we showed increased levels of ceramide concomitant atrophy generated in vitro and in vivo. The role of ceramide in atrophy has been demonstrated by the protective effect of inhibitors of their synthesis in the in vitro and in vivo. We show further in an in vitro model that atrophic effects of ceramides are due to inhibition of phospholipase D signaling pathway / mTOR / Akt. Our results allowed us to prove the role of sphingolipids in the homeostatic control of muscle protein. Modulation of sphingolipid metabolism appears to be a promising new therapeutic target in the treatment of muscle wasting associated with various pathologies., Le muscle squelettique fait preuve d'une remarquable plasticité en réponse aux changements physiologiques, comme l’activité physique, et aux situations pathologiques. Il subit notamment une atrophie sévère lors de la cachexie qui accompagne diverses pathologies chroniques comme le cancer, le SIDA, etc. L’atrophie musculaire est aussi une composante de la sarcopénie qui survient lors du vieillissement normal, et se caractérise par un déclin de la force et de la masse musculaire. L'atrophie musculaire, qui entraîne une augmentation de la mortalité et diminue l’efficacité des traitements, constitue donc un problème de santé majeur.La fonte musculaire se caractérise par une altération de l’équilibre entre synthèse et dégradation protéiques dans les fibres adultes. Des taux particulièrement élevés de cytokines circulantes, dont le TNFα, qui affectent l’homéostasie du muscle via différentes voies de signalisation, semblent être à l’origine de l'atrophie. Les mécanismes de la réponse atrophique musculaire à ces taux circulants élevés sont cependant mal définis. Le TNFα a des effets complexes. Il peut activer de multiples voies de signalisation, parmi lesquelles l'induction de la synthèse de sphingolipides, et plus particulièrement de céramides, par la voie de novo et par l'activation des sphingomyélinases. Au niveau musculaire, les céramides sont connus pour leurs effets sur la signalisation de l'insuline, sur l'apoptose et sur la différenciation myogénique. Par contre, leur implication dans le cadre de l'atrophie n'avait jamais été prise en compte. L’objectif de ce travail a été dans un premier temps de démontrer le rôle des céramides dans l’atrophie. Dans un deuxième temps, nous avons caractérisé la voie de signalisation par laquelle l’augmentation intramusculaire de céramide induite par le TNFα aboutit à une chute de la synthèse protéique, couplée à une augmentation de la protéolyse. Dans ce but, nous avons mis au point des modèles in vitro d'atrophie, impliquant des myotubes traités par des concentrations physiologiques de TNF . Nous avons en parallèle étudié un modèle in vivo de cachexie induite chez la souris par l'implantation d’un adénocarcinome C26. L’analyse des sphingolipides nous a permis de montrer l’augmentation des taux de céramides concomitante à l’atrophie générée in vitro et in vivo. Le rôle des céramides dans l’atrophie a été démontré par l’effet protecteur des inhibiteurs de leur synthèse, dans les modèles in vitro et in vivo. Nous montrons de plus dans un modèle in vitro que les effets atrophiques des céramides sont dus à l’inhibition de la voie de signalisation Phospholipase D/mTOR/Akt. Nos résultats nous ont permis de prouver le rôle des sphingolipides dans le contrôle de l’homéostasie protéique du muscle. La modulation du métabolisme des sphingolipides apparaît donc comme une nouvelle cible thérapeutique prometteuse dans le traitement de la perte musculaire associée à diverses pathologies.

Skeletal muscle demonstrated a remarkable plasticity in response to physiological changes, such as physical activity, and pathological situations. He suffered such severe atrophy during cachexia that accompanies various pathologies such as cancer, AIDS, etc.. Muscle atrophy is also a component of sarcopenia that occurs during normal aging, and is characterized by a decline in strength and muscle mass. Muscle atrophy, which leads to increased mortality and decreased treatment efficacy, thus constitutes a health problem majeur.La muscle wasting is characterized by an impaired balance between protein synthesis and degradation in adult fibers. Particularly high levels of circulating cytokines, including TNF, which affect muscle homeostasis via different signaling pathways appear to be the cause of atrophy. Mechanisms of muscle atrophy response to these elevated circulating levels are however unclear. TNFa has complex effects. It may activate multiple signaling pathways, including the induction of the synthesis of sphingolipids, especially ceramides, for the de novo pathway and the activation of sphingomyelinases. In muscle, ceramides are known for their effects on insulin signaling on apoptosis and myogenic differentiation. By cons, their involvement in the context of atrophy was never taken into account. The objective of this work was firstly to demonstrate the role of ceramides in atrophy. In a second step, we characterized the signaling pathway by which increased intramuscular ceramide induced by TNF leads to a fall in protein synthesis, coupled with an increase in proteolysis. For this purpose, we have developed in vitro models of atrophy involving myotubes treated with physiological concentrations of TNF . We studied in parallel an in vivo model of cachexia induced in mice by implantation of adenocarcinoma C26. Analysis of sphingolipids we showed increased levels of ceramide concomitant atrophy generated in vitro and in vivo. The role of ceramide in atrophy has been demonstrated by the protective effect of inhibitors of their synthesis in the in vitro and in vivo. We show further in an in vitro model that atrophic effects of ceramides are due to inhibition of phospholipase D signaling pathway / mTOR / Akt. Our results allowed us to prove the role of sphingolipids in the homeostatic control of muscle protein. Modulation of sphingolipid metabolism appears to be a promising new therapeutic target in the treatment of muscle wasting associated with various pathologies., Le muscle squelettique fait preuve d'une remarquable plasticité en réponse aux changements physiologiques, comme l’activité physique, et aux situations pathologiques. Il subit notamment une atrophie sévère lors de la cachexie qui accompagne diverses pathologies chroniques comme le cancer, le SIDA, etc. L’atrophie musculaire est aussi une composante de la sarcopénie qui survient lors du vieillissement normal, et se caractérise par un déclin de la force et de la masse musculaire. L'atrophie musculaire, qui entraîne une augmentation de la mortalité et diminue l’efficacité des traitements, constitue donc un problème de santé majeur.La fonte musculaire se caractérise par une altération de l’équilibre entre synthèse et dégradation protéiques dans les fibres adultes. Des taux particulièrement élevés de cytokines circulantes, dont le TNFα, qui affectent l’homéostasie du muscle via différentes voies de signalisation, semblent être à l’origine de l'atrophie. Les mécanismes de la réponse atrophique musculaire à ces taux circulants élevés sont cependant mal définis. Le TNFα a des effets complexes. Il peut activer de multiples voies de signalisation, parmi lesquelles l'induction de la synthèse de sphingolipides, et plus particulièrement de céramides, par la voie de novo et par l'activation des sphingomyélinases. Au niveau musculaire, les céramides sont connus pour leurs effets sur la signalisation de l'insuline, sur l'apoptose et sur la différenciation myogénique. Par contre, leur implication dans le cadre de l'atrophie n'avait jamais été prise en compte. L’objectif de ce travail a été dans un premier temps de démontrer le rôle des céramides dans l’atrophie. Dans un deuxième temps, nous avons caractérisé la voie de signalisation par laquelle l’augmentation intramusculaire de céramide induite par le TNFα aboutit à une chute de la synthèse protéique, couplée à une augmentation de la protéolyse. Dans ce but, nous avons mis au point des modèles in vitro d'atrophie, impliquant des myotubes traités par des concentrations physiologiques de TNF. Nous avons en parallèle étudié un modèle in vivo de cachexie induite chez la souris par l'implantation d’un adénocarcinome C26. L’analyse des sphingolipides nous a permis de montrer l’augmentation des taux de céramides concomitante à l’atrophie générée in vitro et in vivo. Le rôle des céramides dans l’atrophie a été démontré par l’effet protecteur des inhibiteurs de leur synthèse, dans les modèles in vitro et in vivo. Nous montrons de plus dans un modèle in vitro que les effets atrophiques des céramides sont dus à l’inhibition de la voie de signalisation Phospholipase D/mTOR/Akt. Nos résultats nous ont permis de prouver le rôle des sphingolipides dans le contrôle de l’homéostasie protéique du muscle. La modulation du métabolisme des sphingolipides apparaît donc comme une nouvelle cible thérapeutique prometteuse dans le traitement de la perte musculaire associée à diverses pathologies.

Muscle wasting: a crosstalk between protein synthesis and breakdown signalling

A new method was developed to determine proteolysis activity in dry-cured ham using fluorescamine. A new proteolysis index (PI) was defined as the percentage ratio of the N-terminal α-amino group content to the total protein content of the ham extract. The robustness of the method was evaluated by measuring PI in laboratory pork meat samples subjected to standardized processing conditions and in samples extracted from industrial hams taken at different stages of processing. For the industrial samples, a comparison with the classic nitrogen procedure of PI determination was performed and a formula relating the two PIs was established. The rapidity, sensitivity and specificity of the procedure make it a good candidate for a screening test to evaluate ham quality in industry.

The ATP–dependent proteases ClpCP and ClpXP are involved in general and regulatory proteolysis in the Gram–positive bacterium Bacillus subtilis. In general proteolysis, they degrade misfolded and aggregated proteins during stress and contribute to protein quality control, survival at high temperatures and thermotolerance together with chaperones. The same protease complexes act as key players in cellular regulation by controlled proteolysis of regulators. Regulatory proteolysis is important for gene regulation, signal transduction and differentiation into specialized cell types, such as endospores and competent cells. ClpCP and ClpXP are required for swimming motility in B. subtilis. The results presented in this work suggest that one function of ClpCP in motility regulation is to reduce the levels of the response regulator DegU, which acts as a repressor of motility genes. ClpXP positively regulates swimming motility by proteolysis of the oxidative stress regulator Spx. Furthermore, it could be demonstrated that Spx transiently downregulates motility genes when the regulator is stabilized during oxidative stress. Initial studies of the mechanism, by which Spx regulates motility genes imply that Spx acts indirectly by transcriptional activation of an unknown negative regulator of motility. In the second part of this study, the degradation of Hag, the structural component of the flagellum, was investigated. Hag was degraded in vitro by ClpCP assisted by the adaptor protein YpbH and protected from proteolysis by FliW. However, Hag was only degraded in the absence of the export chaperone FliS in vivo, which was independent of ClpP. These results suggest that two distinct pathways of Hag proteolysis exist, one of which may be important to prevent Hag aggregation or premature assembly, when its secretion is compromised. Spx was also shown to be required for thermotolerance, probably through the activation of unknown protective target genes. Furthermore, it was demonstrated that gsiB, mcsB and ywlE are important for thermotolerance development. Finally, evidence for a ClpP–independent function of ClpC in thermotolerance was acquired. Possibly, ClpC acts as a protein disaggregase, similar to ClpB and Hsp104., Die ATP-abhängigen Proteasen ClpCP und ClpXP sind an der generellen und regulatorischen Proteolyse in dem grampositiven Bakterium Bacillus subtilis beteiligt. Im Rahmen der generellen Proteolyse bauen sie unter Stress falsch gefaltete und aggregierte Proteine ab und tragen gemeinsam mit Chaperonen zur Proteinqualitätskontrolle, zum Überleben bei hohen Temperaturen und zur Thermotoleranz bei. Die gleichen Proteasekomplexe beeinflussen die zelluläre Regulation durch kontrollierten Abbau von Regulatorproteinen. Regulatorische Proteolyse spielt eine wichtige Rolle bei der Genregulation, Signaltransduktion und bei der Differenzierung in spezialisierte Zelltypen wie Endosporen und kompetente Zellen. ClpCP und ClpXP sind essentiell für die Motilität von B. subtilis. Die hier gezeigten Daten sprechen dafür, dass eine Funktion von ClpCP während der Motilitätsentwicklung darin besteht, durch Proteolyse die Konzentration des Regulators DegU zu vermindern, der als Repressor von Motilitätsgenen wirkt. ClpXP reguliert die Motilitätsentwicklung durch Abbau des Redoxstressregulators Spx. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass Spx die Motilitätsgene transient herunter reguliert, wenn der Regulator durch oxidativen Stress stabilisiert wird. Erste Ergebnisse zum Mechanismus der Spx-vermittelten Motilitätsregulation sprechen dafür, dass Spx indirekt durch Transkriptionsaktivierung eines unbekannten negativen Motilitätsregulators wirkt. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Proteolyse von Hag, der Hauptstruktureinheit des Flagellums, untersucht. Hag wurde in vitro von ClpCP mit Hilfe des Adapterproteins YpbH abgebaut und von FliW vor der Proteolyse geschützt. In vivo wurde Hag jedoch nur in Abwesenheit des Exportchaperons FliS unabhängig von ClpP abgebaut. Diese Ergebnisse sprechen für die Existenz von zwei unterschiedlichen Wegen der Hag-Proteolyse. Einer dieser Wege könnte dazu dienen, die Aggregation oder verfrühte Assemblierung von Hag zu verhindern, wenn seine Sekretion gestört ist. Es konnte ebenfalls gezeigt werden, dass Spx für die Ausprägung der Thermotoleranz benötigt wird, wahrscheinlich durch Aktivierung unbekannter schützender Zielgene. Außerdem wurde gezeigt, dass gsiB, mcsB und ywlE wichtig für die Thermotoleranzentwicklung sind. Schließlich wurden Hinweise auf eine ClpP- unabhängige Funktion von ClpC in der Thermotoleranz gefunden. Möglicherweise wirkt ClpC als Proteindisaggregase, ähnlich wie ClpB und Hsp104.

The deposition of nitrogen has increased many-fold due to anthropogenic activities. Since forest ecosystems are often limited by N availability, elevated N inputs from the atmosphere can have a fertilization effect but in the long-term, excess N can influence above- and below-ground production. One of the consequences of N deposition and increased N inputs is a shift in microbial community structure and function as ecosystems move towards N saturation. Soil microorganisms through the action of enzymes play an important role in N dynamics. Thus, the availability and turnover of N depends strongly on microbial abundance, diversity and activity which are in turn influenced by soil properties. Studies on the effects of high nitrogen inputs and the response of forest ecosystems to nitrogen saturation are many and well understood. However, the reversibility of N-induced shifts in forest ecosystem processes is largely unknown. This thesis was therefore designed to study the response of soil microorganisms to reduced N deposition. A biphasic approach was employed to look into (i) the general microbial functional status of the Solling forest site as well as (ii) the microbial community structure which may be a key regulator of two important processes of N transformation: denitrification and proteolysis. The goal of the present thesis was addressed in three studies. Denitrification is considered sensitive to environmental changes and the response of nitrate-reducers and denitrifiers to reduced N deposition was determined in the first study. The goal of the second study was to investigate the overall microbial activity of the Solling forest profiles especially focussing on enzymes involved in the N cycle. This revealed a pronounced activity of peptidases whereby a set of novel pepN primers encoding alanine aminopeptidase enzyme was designed in the third study to determine the group of bacteria involved in proteolysis in forest as well as agricultural and grassland soils. The Solling experimental station was established more than two decades ago and it gave the opportunity to study the N cycle in a natural forest ecosystem at different sampling dates and depths. A combination of classical biological methods and modern molecular techniques were used in the studies. Soil physico-chemical parameters (OC, Nt, NO3-, NH4+, pH, % Water content) were analysed to gain more information on mineralization and immobilization of N in the soil profiles. The analysis of microbial biomass, ergosterol content and the activity of several enzymes of the N, C and P cycles as well as enzyme activity of nitrate reducers was determined in order to interpret microbial functions. The abundance of nitrate reducers and denitrifiers were determined by quantitative PCR of 16S rRNA, nitrate reductase (narG and napA) and denitrification (nirK, nirS and nosZ) genes. The diversity of peptide degrading bacteria was analysed by PCR, cloning and sequencing and the construction of pepN gene libraries. The results of the first study indicated that time and space were the main drivers influencing the abundance and activity of the nitrate reducers and denitrifier communities in the forest soil profiles. Reduced N deposition had a of minimal effect. Interestingly, the ratios of nosZ to16S rRNA gene and nosZ to nirK increased with soil depth thereby tempting to conclude that the size of denitrifiers capable of reducing N2O into N2 might be bigger in the mineral horizons. In the second study, a stronger response of N cycling enzymes to reduced N deposition could be seen. However, these responses especially that of specific peptidases differed in magnitude which could be indicative of a modification of the reaction rates of the different N cycling enzymes. Correlation of nutrients (N, C, P) with microbial biomass and enzyme activities in the soil profiles revealed that substrate availability was the main factor influencing microbial activity. In the third study, analyses of gene libraries from extracted DNA from forest, agricultural and glacier soil samples revealed a high diversity of pepN sequences related to mainly α-Proteobacteria. A majority of the sequences showed similarity to published data revealing that the amplified region of pepN might be conserved. Linking diversity and enzymatic data, lowest diversity was observed in the agricultural soil where activity levels of alanine aminopeptidase were lowest indicating the importance of diversity studies for ecosystem functioning. In conclusion, this thesis offers valuable contributions to understanding the impact of N deposition. The approach used was suitable to assess the response of the different microbial communities to reduced N deposition. The magnitude of the response depended strongly on space, time and substrate availability in soils as well as their interactions. Anthropogene Aktivitäten haben die Deposition von Stickstoff (N) um ein Vielfaches erhöht. Da Waldböden häufig N-limitiert sind, können erhöhte N-Einträge aus der Atmosphäre einen Düngungseffekt haben. Dies kann langfristig die oberirdische und unterirdische Pflanzenproduktion beeinflussen. Eine Folge von erhöhtem N-Eintrag ist die Veränderung der mikrobiellen Gemeinschaft sowie deren Funktion sobald das Ökosystem in Richtung N-Sättigung strebt. Aufgrund ihrer Enzymaktivitäten spielen Bodenmikroorganismen eine wichtige Rolle in N-Dynamiken. Die Verfügbarkeit und Umsetzung von N hängt daher stark von der mikrobiellen Abundanz, Diversität und Aktivität ab, die wiederum durch Bodeneigenschaften beeinflusst wird. Studien, die den Effekt von hohem N Eintrag und die Folgen von N-Sättigung in Waldökosystemen untersuchen, sind zahlreich und die Effekte und Folgen gut verstanden. Hingegen ist wenig bekannt inwieweit sich diese Veränderungen bei reduzierter N-Deposition umkehren. Daher wurden in dieser Doktorarbeit die Folgen einer reduzierten N-Deposition auf Bodenmikroorganismen untersucht. Ein biphasischer Ansatz wurde verwendet um 1) den generellen funktionellen mikrobiellen Status des Waldstandortes Solling und 2) die mikrobielle Gemeinschaftsstruktur, die ein wichtiger Regulator für zwei wichtige N-Transformationsprozesse, die Denitrifikation und die Proteolyse, sein könnte, zu untersuchen.Zur Erreichung des Ziels dieser Arbeit wurden drei Studien durchgeführt. Denitrifikation reagiert sensitiv auf Veränderungen der Umweltbedingungen und die Reaktion von nitratreduzierenden und denitrifizierenden Mikroorganismen auf reduzierte N Bedingungen wurde in der ersten Studie untersucht. Das Ziel der zweiten Studie war es, mit dem Fokus auf die Enzyme, die in den N-Kreislauf involviert sind, die mikrobielle Aktivität der Solling Waldprofile zu untersuchen. Eine ausgeprägte Aktivität von Peptidasen wurde festgestellt woraufhin in der dritten Studie ein neuer Satz pepN primer entwickelt wurden, die Alanin Aminopeptidasen kodieren, um die Gruppen der Bakterien zu bestimmen, die an der Proteolyse in Waldböden sowie in landwirtschaftlich genutzten und Grünland Böden beteiligt sind.Die Solling Forschungsstation wurde vor mehr als 20 Jahren aufgebaut und gab uns die Möglichkeit den N-Kreislauf in einem natürlichen Waldökosystem zu unterschiedlichen Zeitpunkten und Bodentiefen zu untersuchen. Eine Kombination klassischer und moderner molekularer Methoden wurde in den Studien verwendet. Wir analysierten bodenphysikochemische Parameter (OC, Nt, NO3-, NH4+, pH, % Wassergehalt), um mehr Informationen über Mineralisation und Immobilisation von N in den Bodenprofilen zu erhalten. Die Bestimmung der mikrobiellen Biomasse, des Ergosterol Gehalts und die Aktivität von mehreren Enzymen des N, C und P-Kreislaufs wie auch Enzymaktivitäten nitratreduzierender Organismen wurde genutzt, um die mikrobiellen Funktionen interpretieren zu können. Die Abundanz von nitratreduzierenden und denitrifizierenden Bakterien wurde mit quantitativer PCR der 16S rRNA, Nitratreduktase (narG und napA) und denitrifizierenden (nirK, nirS und nosZ) Funktionsgenen bestimmt. Die Diversität der peptidabbauenden Bakterien wurde mittels PCR, Klonierung und Sequenzierung sowie des Aufbaus von pepN Genbibliotheken untersucht. Die Ergebnisse der ersten Studie deuten darauf hin, dass Zeitpunkt und Bodentiefe die Haupteinflussfaktoren für die Abundanz und die Aktivität der nitratreduzierenden und denitrifizierenden Gemeinschaften im Waldprofil darstellen. Reduzierte N Deposition war von geringer Bedeutung. Interessanterweise erhöhten sich die Verhältnisse von nosZ zu 16S rRNA Genen und nosZ zu nirK in der Tiefe, was darauf schließen lässt, dass denitrifizierende Organismen, die fähig sind N2O zu N2 zu reduzieren, im Mineralbodenhorizont in größerer Zahl vorkommen könnten als in den oberen Horizonten. In der zweiten Studie wurde eine stärkere Reaktion der am N-Kreislauf beteiligten Enzyme bei reduzierter N Deposition festgestellt. Diese Reaktionen, insbesondere die der spezifischen Peptidasen, veränderten sich, was darauf hindeuten könnte, dass sich die Effizienz der unterschiedlichen am N-Kreislauf beteiligten Enzyme anpassen. Korrelationen von Nährstoffen (N, C, P) mit der mikrobiellen Biomasse and den Enzymaktivitäten im Bodenprofil verdeutlichen, dass die Substratverfügbarkeit der Hauptfaktor für die mikrobielle Aktivität war. In der dritten Studie, in der Gen-Bibliotheken von aus Wald-, landwirtschaftlichen und Gletscher Böden extrahierter DNA analysiert wurden, zeigte sich eine hohe Diversität der pepN Sequenzen, die hauptsächlich α-Proteobakterien zugeordnet werden konnten. Ein Großteil der Sequenz zeigte Ähnlichkeit mit bereits publizierten Daten, was darauf hindeuten könnte, dass die amplifizierte Region pepN konserviert ist. Bei der Betrachtung der Diversitäts- und Enzymdaten wurde die geringste Diversität in dem landwirtschaftlich genutzten Boden gefunden, der auch die geringsten Aktivitäten der Alanin-Aminopeptidase aufwies, was auf die Bedeutung von Diversitätsstudien für das Funktionieren von Ökosystemen hindeutet.Zusammenfassend leistet diese Doktorarbeit wertvolle Beiträge, um den Einfluss von N Deposition zu verstehen. Der verwendete Ansatz war geeignet, um die Reaktion der unterschiedlichen mikrobiellen Gemeinschaften auf reduzierte N Deposition einzuschätzen. Die Höhe der Reaktion hing stark von der Bodentiefe, des Zeitpunktes und der Substratverfügbarkeit sowie deren Interaktion ab.

Molecular systems described for Archaea show primitive and simple characteristics, compared to their homologous eukaryotes. In addition, extremophilic characteristic results in an hyper-robust which makes in vitro manipulation and structural studies much easier. Thus, Archaea represent good models for understanding complex cellular functions, particularly those that involve large molecular machines, such as those involved in proteolysis. My thesis consisted in understanding the resistance mechanisms and the importance of proteolytic systems in the adaptation of halophilic Archaea to environmental stresses. Halophilic Archaea accumulate multi-molar concentrations of KCl / NaCl in their cytosol (3.4M KCl / NaCl 1.1M for Halobacterium Salinarum). This requires a very special biochemistry that allows operation in solvents where free water is scarce. Thus, the proteins of these organisms are themselves halophilic and are soluble and folded only in extreme salinity conditions (2 to 5 M). This particular biochemistry partly explain the extraordinary ability of halophilic Archaea to resist physical and chemical stress (temperature, radiation, dehydration). We study the response of the halophilic Archaea strict H. salinarum at low-salinity stress. Indeed, beyond the osmotic shock, the fall of the environment salt concentration causes a decrease in the intracellular KCl concentration, which should have a direct effect on the folding state of intracellular protein, as in case of heat stress. In the first part of this thesis, a study was conduct to determine viability limits and cytosolic modifications, associated with a salinity decrease. These studies involve intracellular salt dosages, viability studies (microscopic counts, color live / dead), induction of chaperone proteins linked to stress response and biophysical neutron experiments, to evaluate the effect of stress on proteins folding. In this work, a phenomenon of survival at low salinity linked to morphological changes was revealed. To describe this phenomenon, this second study involves confocal microscopy experiences, fluorescence microscopy, viability tests, counting on box, scanning electron microscopy, electron microscopy by negative staining, salt intracellular dosages and proteins separation experiments, to study the overall proteome composition during low salinity stress. In this study, a fall of the intracellular K⁺ concentration and the proteome clarification during stress was revealed. Low salt concentrations causes halophiles proteins denaturation, the accumulation of misfolded proteins in the cytoplasm involves chaperones systems and intracellular proteolysis machinery. In this context, another objective of my thesis was to contribute to the understanding of the intracellular proteolysis role in the PAN-proteasome system and in the aminopeptidase TET complex, in stress conditions established in previous studies. This part of the thesis involves experiments of endopeptidase activity assay, aminopeptidase activity assay, quantification of mRNA genic expression by Northern blot, immunoprecipitation, proteins separation by sucrose gradient and proteasome chemical inhibition (drug). We show the role of the PAN-proteasome system in stress response and we deepen our understanding of the aminopeptidase TET role in vivo. This protease appears to have an independent role of the proteasome complex. The protease TET seems to participate at the amino acids treatment in cells to maintain the metabolic activities in nutritional deficiencies., Les systèmes moléculaires décrits chez les Archaea mettent en évidence un caractère primitif et une simplicité, comparativement à leurs homologues eucaryotes. Par ailleurs, leur caractère extrêmophile a pour conséquence une hyper-robustesse qui rend leur manipulation in vitro et les études structurales beaucoup plus aisées. Ainsi les Archaea représentent de bons modèles pour comprendre les fonctions cellulaires complexes, particulièrement celles qui mettent en jeu de grandes machineries moléculaires, comme celles impliquées dans la protéolyse. Mon travail de thèse a consisté à comprendre les mécanismes de résistance et l'importance des systèmes de protéolyse dans l'adaptation des Archaea halophiles aux stress environnementaux. Les Archaea halophiles accumulent des concentrations multi-molaires de KCl/NaCl dans leur cytosol (3.4M KCl / 1.1M NaCl chez Halobacterium salinarum). Ainsi, les protéines de ces organismes sont elles-mêmes halophiles et ne sont solubles et repliées que dans des conditions de salinité extrêmes (de 2 à 5M).Nous avons étudié la réponse de l'Archaea halophile stricte H. salinarum à des stress, dont les stress à basse salinité, en se focalisant en particulier sur les modifications de la dynamique moléculaire du protéome in vivo (diffusion neutronique). Au cours de ce travail, il a été mis en évidence un phénomène de survie à la basse salinité associé à des modifications morphologiques.Un autre objectif de ma thèse a été de contribuer à la compréhension du rôle dans la protéolyse intracellulaire du complexe aminopeptidasique TET, dans les conditions de stress mises en place dans les études précédentes.

La perte de masse et de force musculaires liée à l'âge, ou sarcopénie, pourrait être partiellement expliquée par un défaut de récupération de masse musculaire après des épisodes générateurs d'atrophie musculaire. Ainsi, les périodes d'immobilisation qui augmentent avec l'âge (alitement, convalescence, fracture) pourraient être suivies d'une absence de récupération musculaire et contribuer à la fonte musculaire au cours du vieillissement. Les causes de ce défaut de récupération impliquent notamment un déséquilibre du taux de renouvellement protéique et du taux de renouvellement cellulaire. L'objectif de cette thèse a donc été de mettre en évidence les mécanismes responsables de l'atrophie musculaire chez le rat âgé au cours de l'immobilisation et ceux qui seraient défaillants afin de déceler les mécanismes à cibler pour favoriser la récupération musculaire. Des rats âgés ont été immobilisés pendant 8 jours par plâtrage unilatéral de la patte arrière, puis laissés en récupération pendant 40 jours après le déplâtrage. Nous avons montré que chez ces animaux nourris avec un régime contenant 13% de caséine, l'immobilisation entraîne une atrophie des muscles immobilisés mais, contrairement au rat adulte, le rat âgé ne récupère jamais la masse musculaire perdue. L'atrophie des muscles immobilisés peut être expliquée par 1/ une augmentation de l'apoptose et de la protéolyse ubiquitine-protéasome-dépendante musculaires, 2/ une diminution de la régénération des cellules musculaires et 3/ une diminution de la protéo synthèse musculaire à l'état nourri. Tous ces phénomènes pourraient résulter de la présence d'un fort stress oxydant et d'une importante inflammation intramusculaire. Tous ces paramètres sont normalisés dès 10 jours de récupération, ce qui permet de stopper l'atrophie mais ne permet pas d'initier la phase de récupération musculaire. Nous avons donc testé l'effet de différentes supplémentations nutritionnelles au cours de la période de récupération afin de favoriser un gain de masse musculaire post immobilisation. Des supplémentations en leucine (acide aminé bien connu pour stimuler la protéo synthèse et inhiber la protéolyse) ont ainsi été réalisées. Chez les rats supplémentés, une amélioration de la synthèse protéique et une normalisation plus précoce des activités protéolytiques du protéasome ont été observées. Cependant cette amélioration du métabolisme protéique ne s'est pas traduite par un gain de masse musculaire. Par contre, la modulation qualitative et quantitative des apports en protéines a pu permettre d'obtenir une récupération significative de masse musculaire :ainsi des régimes contenant 13% de lactosérum et des régimes hyper-protéinés ont permis de gagner50% de la masse perdue et ce, dès 20 jours de récupération. Nos résultats montrent que l'immobilisation chez le rat âgé aggrave la sarcopénie. Une forte altération du métabolisme protéique permet d'expliquer la perte de muscle et la seule normalisation de la protéolyse et de la protéo synthèse permet d'expliquer l'absence de récupération musculaire. Nous avons montré que la modulation des apports en protéines au cours de la phase de récupération pouvait permettre un gain de protéines., Sarcopenia, the age-related muscle mass loss, might be partially explained by an impaired muscle mass recovery of skeletal muscle mass after a catabolic state. Thus, immobilization periods which increase with aging could induce a muscle atrophy followed by a lack of muscle mass recovery. An imbalance of protein and cellular metabolisms are certainly involved in this absence of recovery. The aim on this Ph.D thesis was to explore the mechanisms involved in muscle mass atrophy during immobilization and their possible alteration during the recovery period in old rats. Old rats were immobilized for 8 days by unilateral hind limb casting and then allowed to recover for 40 days. Our results showed that animals fed a 13% casein diet wasted muscle mass in immobilized muscles but, contrarily to adult animals, they never recovered the muscle mass loss. Muscle atrophy was due to 1/ an increase of apoptotic and ubiquitine-proteasome-dependent proteolytic pathways, 2/ a decrease of muscle regeneration processes and 3/ a decrease of muscle protein synthesis at the fed state. These changes paralleled an increase of intracellular inflammation and oxidative stress. As these parameters were only normalized during the recovery period, the resultant nitrogen balance was then not enough positive as required for the muscle protein gain, hence contributing to the age-related incomplete muscle mass recovery. We tested free leucine supplementation (an amino acid known for its stimulatory effect on protein metabolism) during there covery period to improve muscle mass gain. This supplementation induced a greater muscle protein synthesis in supplemented animals, but without any muscle mass gain. However, we demonstrated here for the first time that muscle protein accretion after immobilization-induced atrophy could be achieved with whey protein or high protein diets. In conclusion, we demonstrated that immobilization in old rats induced a muscle mass atrophy followed by an incomplete recovery, hence contributing to the development of sarcopenia. We also demonstrated that this lack of recovery cannot be overcome by a dietary free leucine supplementation, despite a positive effect on protein metabolism, contrarily to high protein and whey protein diets.

Nutritional recommendations concern the reduction of the consumption of certain saturated fatty acids (SFA), which are associated with the risk of cardio-vascular diseases, in favour of increased amounts of unsaturated fatty acids (UFA) in the human diet. In this context, adapting the FA profile of high-fat content dairy products such as cheeses is of considerable interest for industrials and consumers. The objectives of this study were i) to produce an experimental UFA-enriched milk by adapting the cows diet (corn silage + grass silage + rapeseed) and to collect control milk in a local dairy plant during winter season (corn silage based diet), ii) to evaluate the possibility of manufacturing mould-ripened soft cheeses, iii) to characterize the physico-chemical and sensory properties of the UFA-enriched and control cheeses. Camembert-type cheeses have been chosen since they are highly appreciated by French consumers and about 108.000 tons are produced each year (CNIEL 2009).These experiments have been performed in the project “AGILAIT” (ANR 06-PNRA-012).

Proteolytic milk-clotting enzymes are extracted from various sources (animals, plants, fungi) and processed according to various methods that are specific to each manufacturer or cheese-maker. Chemical composition and polypeptide patterns of 24 milk-clotting preparations from animal and fungal sources: 10 commercial rennets, 9 artisanal calf rennets, 2 recombinant chymosin preparations and 3 microbial preparations, were compared in order to identify differences according to both their manufacturing process and their source. The preparation from Cryphonectria parasitica had the highest ammonia and small peptide content. Commercial rennets and preparations from Rhizomucor miehei had the highest NaCl and pH values while artisanal rennets had the lowest and recombinant chymosins were intermediate. In comparison with the other commercial preparations, commercial rennets had the highest variability in chemical composition and their polypeptide profiles showed numerous protein bands ranging from 15 kDa to 197 kDa, like artisanal rennets. Protein composition of commercial rennets revealed the presence of bovine serum albumin, either native or degraded, and degraded chymosin. The results indicated that the source of coagulating enzymes and the conditions applied for enzyme extraction led to specific chemical compositions, polypeptide patterns and protein composition which are described in this article. (C) 2012 Elsevier Ltd. All rights reserved.

International audience; Protein in vitro digestion was characterized by pepsin proteolysis of myofibrillar proteins extracted from processed beef samples using 2 descriptors of the kinetics: maximum value (ODmax) and half life time (t 1/2). An experimental fractional factorial design with 32 trials was used to investigate the effect of processes variables; it consists of 5 factors each taking 2 levels (muscle type, mincing, pH, NaCl content, cooking time) and 1 factor taking 4 levels (cooking temperature). The statistical analysis showed that (i) cooking temperature and time have a major effect, (ii) there is interaction between muscle type and NaCl content and (iii) mincing and pH have little effect. The evolutions of the 2 descriptors with cooking time were then analyzed with the 2 muscles at 2% NaCl content, 60 and 90°C. They show that the main changes occur in the first 10 minutes.

Cette publication est également parue dans la revue "Journal of Animal Science", Vol.89, E-Suppl.1.; In contrast to other lactic acid bacteria, Lactobacillus helveticus can possess two cell-envelope proteinases (CEPs) called PrtH2 and PrtH (Genay et al 2009, Appl. Env. Microbiol.. 75 (10), 3238-3249; Sadat et al 2011a, in press Int. J. Food Microbiol.). These CEPs exhibit different cleavage specificity on pure s1 -casein (Sadat-Mekmene et al., 2011b, Appl. Env. Microbiol. 77(1) 179-186). The aim of this work was to investigate the proteolytic activity of L. helveticus strains in cheese matrix according to the number of their CEPs and the cheese stretchability. Two strains were selected, ITGLH77 and ITGLH1 which possess one CEP, PrtH2, and two CEPs, PrtH and PrtH2, respectively. The proteolysis was monitored during ripening:i) casein hydrolysis by urea-PAGE; ii) peptide pattern of the cheese aqueous extracts first by SDS-PAGE and second by RP-HPLC. Three chromatographic fractions were collected and peptides identified by RP-HPLC coupled on-line with tandem mass spectrometry. In parallel, the dynamic of stretchability of Emmental cheese was measured in order to determine the contribution of CEPs in its generation, since L. helveticus is known to enhance stretching properties in contrast to other lactobacilli, such as L. delbrueckii subsp. lactis . The microstructure of the strands of Emmental cheeses was observed by confocal laser scanning microscopy. The stretchability of Emmental was significantly higher in cheese manufactured with strain ITGLH77. By using Principal Component Analyses, the stretching properties were found to be correlated with the presence of peculiar peptides derived from primary proteolysis, hydrophobic peptides, containing more than 20 amino acid residues and derived from s1 -casein, which were accumulated in cheese manufactured using strain ITGLH77. The presence of these peptides suggest their less hydrolysis by this strain, in agreement with results observed in vitro (Sadat-Mekmene et al., 2011b), namely different cleavage specificity of CEPs PrtH et PrtH2 on pure s1 -casein.

Cette publication est également parue dans la revue "Journal of Animal Science", Vol.89, E-Suppl.1.; Cheese ripening is usually described in terms of kinetics of proteolysis, lipolysis and aroma compound production, which provides an averaged view of ripening. However, after milk inoculation and rennet action, bacteria are immobilized as colonies into the curd and grow as such. This colonial distribution is a reality in all kind of cheeses. The efficiency of bacteria within these colonies to act on dairy matrices (gene expression and activity of the enzymes produced) will thus depend on local physico-chemical conditions, matrix structure, diffusion limitations and inter-colony distance. The ambition of our team is to understand the ripening mechanisms in situ at a microscopic scale level, considering the colonial distribution. For that purpose, the following fields were explored: i) to characterize the spatial distribution of bacterial colonies according to the level of inoculation by mathematical modelization and by in situ validation using confocal laser microscopy (Jeanson et al., 2011 Appl. Environ. Microbiol. doi:10.1128/AEM.02233-10); ii) to estimate the diffusion rate of small solutes in dairy matrices differing in composition and microstructure. Indeed diffusion of water and salt were extensively characterized (Floury et al., 2010 Dairy Sci. Technol. 90:477-508) but not the diffusion of small solutes which are crucial for the bacterial metabolic activity and the ripening reactions. Moreover, the impact of cheese composition and microstructure on this diffusion is far from being well understood. The diffusion coefficient of a small solute was estimated for the first time by a noninvasive way within a cheese matrix using new imaging approaches, the Fluorescence Recovery After Photobleaching and using fluorescent 4 and 20 kDa dextran molecules. iii) to reveal in situ bacterial enzymes within and around the colonies immobilised in cheese. Cell wall protease and intracellular peptidases were first detected in situ by immunofluorescent antibodies and confocal microscopy.

The first amino acid incorporated in nascent polypeptide chain is always methionine so called N-terminale methionine. However, in a given proteome, more than fifty percent of proteins have not this first methionine. Indeed, the early proteolytic event affecting a majority of proteins is N-terminal Methionine Excision (NME) as soon as few residues exit from the ribosome. Enzymes ensuring NME process are conserved along species. This mechanism takes place in all compartments where protein synthesis occurs including cytoplasm, plastids and mitochondria and the enzymes responsible of N-methionine excision are METhionine AminoPeptidases (METAP). Early functional studies of gene deletion has quickly showed that NME is an essential process. Ten years ago, METAPs have been identified as the molecular target of natural compounds with anticancer activities. Now, a growing number of studies suggest that NME is a promising target for treatment of various deseases. Nevertheless, molecular mechanisms making NME an essential process is poorly understood in particular in higher eukaryote cytoplasms.Using a dedicated inducible system in the model organism Arabidopsis thaliana and multiple approaches, including proteomics and metabolomics, I examined the earliest molecular events associated with the inhibition of this process and the contribution of both METAP to NME process. In this context, I demonstrated that cytoplasmic NME in A. thaliana orchestrates a cross-talk between two fundamental signaling pathways frequently deregulated in pathological conditions: thiol status and proteolysis. In these studies, we demonstrated that developmental defects induced by cytoplasmic NME inhibition are associated with an increase of the proteolytic activity due to an increase of the proteins available for rapid degradation. Thus, NME activity that modifies the availability of several proteins for degradation is an integral and fundamental element protein turnover regulation. Finally my preliminary results obtained in Archea, Fungi and human cells seem to suggest the existence of a ubiquitous mechanism associated with NME process.; Le premier acide aminé incorporé dans une chaîne polypeptidique naissante est toujours la méthionine. On identifie donc toujours ce premier résidu à la méthionine N-terminale. Cependant, les deux tiers des protéines accumulées à l’état stationnaire ne présentent plus leur méthionine initiatrice. Cet enlèvement résulte essentiellement d’une maturation protéolytique affectant chaque protéine. Ainsi, l’Excision de la Méthionine N-terminale (NME) concerne la majorité des protéines et ce dès que les premiers résidus émergent du ribosome. Ce mécanisme est retrouvé dans tous les compartiments cellulaires où une synthèse protéique a lieu : le cytoplasme, les plastes et les mitochondries. Les enzymes responsables du clivage de la méthionine initiatrice sont les METhionine AminoPeptidases (METAPs) ; les METAPs sont conservées dans le Règne vivant. Des études fonctionnelles de délétions géniques ont montré le caractère létal du maintien de la première méthionine dans tous les organismes. Il y a plus de dix ans, les METAPs ont été identifiées comme étant la cible de composés naturels ayant des effets anticellulaires. Aujourd’hui un nombre croissant d’études rapportent que la NME est une cible prometteuse pour le traitement de nombreuses pathologies. Néanmoins, les bases moléculaires qui expliquent le caractère essentiel de la NME restent très peu comprises, en particulier dans le cytoplasme des eucaryotes supérieurs. Grâce à un système inductible permettant de moduler finement la NME cytoplasmique dans la plante modèle Arabidopsis thaliana et différentes approches incluant des analyses protéomiques et métabolomiques, j’ai pu étudier les événements moléculaires précoces associés à l’inhibition de la NME cytoplasmique. J’ai également caractérisé la contribution relative des deux types de METAP cytoplasmiques au processus. Dans ce contexte, j’ai pu démontrer chez A. thaliana que la NME cytoplasmique agit sur deux voies de signalisation fréquemment dérégulées lors de conditions pathologiques : le statut des composés thiolés et la protéolyse. La diminution de la NME cytoplasmique induit une protéolyse accrue principalement via une augmentation du nombre de protéines destinées à une dégradation rapide. Ainsi, l’activité de la NME, en modulant la sensibilité de nombreuses protéines à subir la protéolyse, est un élément fondamental de la régulation de la demi-vie protéique. Finalement, mes résultats simialires obtenus également chez les Archées, levures et les lignées de cellules humaines suggèrent l’existence d’un mécanisme ubiquitaire associé à la NME.

The first amino acid incorporated in nascent polypeptide chain is always methionine so called N-terminale methionine. However, in a given proteome, more than fifty percent of proteins have not this first methionine. Indeed, the early proteolytic event affecting a majority of proteins is N-terminal Methionine Excision (NME) as soon as few residues exit from the ribosome. Enzymes ensuring NME process are conserved along species. This mechanism takes place in all compartments where protein synthesis occurs including cytoplasm, plastids and mitochondria and the enzymes responsible of N-methionine excision are METhionine AminoPeptidases (METAP). Early functional studies of gene deletion has quickly showed that NME is an essential process. Ten years ago, METAPs have been identified as the molecular target of natural compounds with anticancer activities. Now, a growing number of studies suggest that NME is a promising target for treatment of various deseases. Nevertheless, molecular mechanisms making NME an essential process is poorly understood in particular in higher eukaryote cytoplasms.Using a dedicated inducible system in the model organism Arabidopsis thaliana and multiple approaches, including proteomics and metabolomics, I examined the earliest molecular events associated with the inhibition of this process and the contribution of both METAP to NME process. In this context, I demonstrated that cytoplasmic NME in A. thaliana orchestrates a cross-talk between two fundamental signaling pathways frequently deregulated in pathological conditions: thiol status and proteolysis. In these studies, we demonstrated that developmental defects induced by cytoplasmic NME inhibition are associated with an increase of the proteolytic activity due to an increase of the proteins available for rapid degradation. Thus, NME activity that modifies the availability of several proteins for degradation is an integral and fundamental element protein turnover regulation. Finally my preliminary results obtained in Archea, Fungi and human cells seem to suggest the existence of a ubiquitous mechanism associated with NME process.; Le premier acide aminé incorporé dans une chaîne polypeptidique naissante est toujours la méthionine. On identifie donc toujours ce premier résidu à la méthionine N-terminale. Cependant, les deux tiers des protéines accumulées à l’état stationnaire ne présentent plus leur méthionine initiatrice. Cet enlèvement résulte essentiellement d’une maturation protéolytique affectant chaque protéine. Ainsi, l’Excision de la Méthionine N-terminale (NME) concerne la majorité des protéines et ce dès que les premiers résidus émergent du ribosome. Ce mécanisme est retrouvé dans tous les compartiments cellulaires où une synthèse protéique a lieu : le cytoplasme, les plastes et les mitochondries. Les enzymes responsables du clivage de la méthionine initiatrice sont les METhionine AminoPeptidases (METAPs) ; les METAPs sont conservées dans le Règne vivant. Des études fonctionnelles de délétions géniques ont montré le caractère létal du maintien de la première méthionine dans tous les organismes. Il y a plus de dix ans, les METAPs ont été identifiées comme étant la cible de composés naturels ayant des effets anticellulaires. Aujourd’hui un nombre croissant d’études rapportent que la NME est une cible prometteuse pour le traitement de nombreuses pathologies. Néanmoins, les bases moléculaires qui expliquent le caractère essentiel de la NME restent très peu comprises, en particulier dans le cytoplasme des eucaryotes supérieurs. Grâce à un système inductible permettant de moduler finement la NME cytoplasmique dans la plante modèle Arabidopsis thaliana et différentes approches incluant des analyses protéomiques et métabolomiques, j’ai pu étudier les événements moléculaires précoces associés à l’inhibition de la NME cytoplasmique. J’ai également caractérisé la contribution relative des deux types de METAP cytoplasmiques au processus. Dans ce contexte, j’ai pu démontrer chez A. thaliana que la NME cytoplasmique agit sur deux voies de signalisation fréquemment dérégulées lors de conditions pathologiques : le statut des composés thiolés et la protéolyse. La diminution de la NME cytoplasmique induit une protéolyse accrue principalement via une augmentation du nombre de protéines destinées à une dégradation rapide. Ainsi, l’activité de la NME, en modulant la sensibilité de nombreuses protéines à subir la protéolyse, est un élément fondamental de la régulation de la demi-vie protéique. Finalement, mes résultats simialires obtenus également chez les Archées, levures et les lignées de cellules humaines suggèrent l’existence d’un mécanisme ubiquitaire associé à la NME.

Problem: uPA und PAI-1 werden als neue prognostische Faktoren beim nodal-neg. Mammakarzinom diskutiert. Hohe Konzentrationen korrelieren mit einem erhöhten Metastasierungsrisiko und einem kürzeren Gesamtüberleben bei nodal-neg. Tumoren. Methode: Bei 309 Patienten mit nodal-neg. Mamma-Ca wurde durch den Femtelle uPA/PAI-1-Test die Konzentrationen von uPA und PAI-1 im Tumorzytosol bestimmt. Die Einteilung erfolgte nach TNM-Klassifikation. Ergebnis: 19,74 % der Patienten hatten Messwerte unter dem cut-off.:33,33 % der G1-Tumoren sowie bei G2 22,04 % und bei G3 5,41%. 34,1 % der Tumoren pT 1a oder pT 1b, 17,87 % pT 1c sind unter den cut-offs. Zwischen 60 bis 69 Jahren sind 22,33 % der Patientinnen unter den cut-offs. Diskussion: Mit 19,74% ist die uPA/PAI-1-low-risk-Gruppe des gesamten Kollektivs kleiner als in anderen Kollektiven. Die uPA- und PAI-1-Messwerte korrelieren mit der Tumorgröße und dem Grading. Es zeigte sich keine signifikante Korrelation zum Patientenalter.

Kallikrein-related peptidases (KLKs) are an emerging group of secreted serine proteases involved in several physiological and pathological processes. We used a degradomic approach to identify potential substrates of KLK12. MDA-MB-231 cells were treated either with KLK12 or vehicle control, and the proteome of the overlying medium was analyzed by mass spectrometry. CCN1 (cyr61, ctgf, nov) was among the proteins released by the KLK12-treated cells, suggesting that KLK12 might be responsible for the shedding of this protein from the cell surface. Fragmentation of CCN1 by KLK12 was further confirmed in vitro, and the main cleavage site was localized in the hinge region between the first and second half of the recombinant protein. KLK12 can target all six members of the CCN family at different proteolytic sites. Limited proteolysis of CCNs (cyr61, ctgf, nov) was also observed in the presence of other members of the KLK family, such as KLK1, KLK5, and KLK14, whereas KLK6, KLK11, and KLK13 were unable to fragment CCNs. Because KLK12 seems to have a role in angiogenesis, we investigated the relations between KLK12, CCNs, and several factors known to be involved in angiogenesis. Solid phase binding assays showed that fragmentation of CCN1 or CCN5 by KLK12 prevents VEGF(165) binding, whereas it also triggers the release of intact VEGF and BMP2 from the CCN complexes. The KLK12-mediated release of TGF-β1 and FGF-2, either as intact or truncated forms, was found to be concentration-dependent. These findings suggest that KLK12 may indirectly regulate the bioavailability and activity of several growth factors through processing of their CCN binding partners.

Ragusano is a pasta filata cheese produced from raw milk in Sicily. The proteolysis was extensively analyzed after stretching (day 0), at 4 and 7 months of ripening through soluble nitrogen, urea-PAGE, and peptide identification by tandem mass spectrometry. After stretching, 123 peptides were identified: 72 arising from β-casein, 34 from α(s1)-casein, and 17 from α(s2)-casein. The main protein splitting corresponded to the action of plasmin, chymosin, cathepsin D, cell envelope proteinase, and peptidase activities of lactic acid bacteria. Unlike other types of cheeses

Nutritional recommendations concern the reduction of the consumption of certain saturated fatty acids (SFA), which are associated with the risk of cardio-vascular diseases, in favour of increased amounts of unsaturated fatty acids (UFA) in the human diet. In this context, adapting the FA profile of high-fat content dairy products such as cheeses is of considerable interest for industrials and consumers. The objectives of this study were i) to produce an experimental UFA-enriched milk by adapting the cows diet (corn silage + grass silage + rapeseed) and to collect control milk in a local dairy plant during winter season (corn silage based diet), ii) to evaluate the possibility of manufacturing mould-ripened soft cheeses, iii) to characterize the physico-chemical and sensory properties of the UFA-enriched and control cheeses. Camembert-type cheeses have been chosen since they are highly appreciated by French consumers and about 108.000 tons are produced each year (CNIEL 2009).These experiments have been performed in the project “AGILAIT” (ANR 06-PNRA-012).

Die asexuellen Sporen von Aspergillus fumigatus sind ubiquitär verbreitete Luftkeime. Als Saprophyt ist dieser opportunistisch humanpathogene Pilz darauf spezialisiert, polymere Substanzen aus dem umgebenden Milieu zu zersetzen, um daraus die von ihm benötigten Nährstoffe zu generieren und aufzunehmen. Die Fähigkeit, verschiedene Stickstoff- und Kohlenstoffquellen zu verwerten, trägt dabei zu seiner Virulenz bei und hierbei scheint die extrazelluläre Proteolyse eine wichtige Rolle zu spielen. Sekretierte Proteasen, die das umgebende Gewebe während einer Infektion mit A. fumigatus erschließen, könnten somit zu dessen Pathogenität beitragen. Dementsprechend sollte im Rahmen dieser Arbeit die Bedeutung einer Regulation der extrazellulären proteolytischen Aktivität von A. fumigatus für dessen Virulenz untersucht werden. Dies geschah durch Untersuchungen eines konservierten Transkriptionsfaktors, PrtT. Dabei stellte sich heraus, dass PrtT die Expression der drei Hauptproteasen von A. fumigatus, Alp, Mep und Pep stark beeinflusst, in einem murinen Tiermodell der pulmonaren Aspergillose scheint dieser Regulator jedoch keine Rolle für die Pathogenität von A. fumigatus zu spielen. Um einen weiteren Aspekt des pilzlichen Aminosäurestoffwechsels zu beleuchten, wurde die Biosynthese der aromatischen Aminosäuren als mögliche Virulenzdeterminate untersucht. Für den Menschen sind diese Aminosäuren essentiell, weshalb dieser Syntheseweg ein mögliches Ziel für antimykotische Substanzen darstellen könnte. Es konnten mehrere für A. fumigatus essentielle Komponenten des Shikimatweges identifiziert werden, des Weiteren wurden Deletionsmutanten in den Genen aroC und trpA, die für die Chorismatmutase bzw. Anthranilatsynthase der Biosynthese von Phenylalanin und Tyrosin bzw. Tryptophan kodieren, erzeugt und phänotypisch charakterisiert. Deren Untersuchung in einem alternativen Tiermodell der Aspergillose zeigte eine deutlich attenuierte Virulenz. Diese Ergebnisse verdeutlichen, wie wichtig die Biosynthese der aromatischen Aminosäuren für das Wachstum von A. fumigatus ist, und dass ein Eingriff in diesen Syntheseweg eine lohnende Strategie zur Entwicklung neuer Antimykotika sein könnte. Die hier präsentierten Ergebnisse unterstreichen die für den Schimmelpilz A. fumigatus typische Redundanz bezüglich extrazellulärer proteolytischer Enzyme und dass diese nur bedingt hinsichtlich ihres Virulenzbeitrags untersucht werden können. Im Gegensatz hierzu lassen sich bestimmte Stoffwechselwege, die oftmals durch einzigartige Genprodukte katalysiert werden, unter Umständen besser als unspezifische aber vielversprechende Virulenzdeterminanten identifizieren., The air-borne spores of Aspergillus fumigatus are ubiquitously distributed. As a saprophyte, this fungus is well adapted to feed from the environment by degradation of polymeric substances and uptake of breakdown products. The nutritional versatility has to be regarded as virulence determinant in the development of pulmonary aspergillosis. Secreted proteolytic activities that degrade the surrounding lung tissue during infection may contribute to pathogenicity. Until now, knowledge on the regulation of the expression and secretion of proteases by A. fumigatus is scarce. Therefore, the role of extracellular proteolytic activity for pathogenicity of A. fumigatus was examined by characterisation of a global regulatory factor, PrtT, that acts on expression of secreted proteases. It could be shown that PrtT regulates the transcription of the major secreted proteases Alp, Mep and Pep. When tested in a leukopenic mouse model, the deletant strain is not attenuated in virulence, suggesting that the PrtT transcription factor - and accordingly extracellular proteolysis - supports virulence of this opportunistic pathogen only to a limited extent. To gain insight into the fungal biosynthesis pathway of amino acids, the aromatic amino acid biosynthesis was investigated concerning the aspect of a virulence determinant. In contrast to mammals, fungi are able for de novo synthesis of the aromatic amino acids. Therefore it might be a usable target for antifungal therapy since such pathway does not exist in humans. Some genes of the shikimate pathway could be shown to be essential for the survival of A. fumigatus. Virulence tests of strains with deletion of the genes aroC or trpA which encodes for the chorismate mutase and anthranilate synthase respectively, showed attenuated virulence of both strains. These results clarify the stringent necessity of the aromatic amino acid biosynthesis for the survival of A. fumigatus, concluding this biosynthesis pathway as a usable target for antimycotic substances. The results of this work emphasise the redundancy of extracellular proteolytic activities. In contrast specific pathways which are mostly catalysed by unique gene products may be identified as virulence determinant rather than unspecific factors.

Le contrôle de la masse musculaire est sous la dépendance d'un équilibre entre les processus de synthèse et de dégradation. Sur le plan cellulaire, deux voies signalétiques majeures sont impliquées dans cet équilibre : la voie des facteurs de transcription de la famille FoxO qui contrôle l'expression des gènes impliqués dans les processus atrophiques (système ubiquitine-protéasome et autophagie), et la voie IGF-1/AKT/mTOR qui représente la voie majeure de lřhypertrophie du muscle squelettique. Nos travaux mettent en évidence, sur des cellules musculaires différenciées, que l'AMPK, inhibe la voie canonique de synthèse protéique et régule, par le biais du facteur de transcription FoxO3, le système ubiquitine-protéasome ainsi que l'autophagie. Une nouvelle cible de l'AMPK a également été identifiée: la protéine ULK1, protéine clé dans l'activation de l'autophagie.

Myxococcus xanthus ist ein Bakterium, das ein außergewöhnliches Verhalten bei Nährstoffmangel zeigt. Im Zuge eines Entwicklungszyklus bilden diese Bakterien Fruchtkörper, die mit Dauerformen, den sogenannten Myxosporen gefüllt sind, um die lebensbedrohlichen Umweltbedingungen zu überstehen. Sechs Stunden nach Eintritt des Hungerzustandes koordiniert und reguliert das C Signal die Aggregation der Zellen zur Fruchtkörperbildung, die Sporulation der Zellen zu Myxosporen und eine spezifische Genexpression. Beim C Signal handelt es sich um das 17 kDa große Protein p17, welches nach der Prozessierung des C Signalvorläuferproteins p25 durch die Subtilisin-ähnliche Serinprotease PopC entsteht. In dieser Arbeit sollte zum einen die Orientierung von p25 in der äußeren Membran untersucht und zum anderen die PopC-Spaltstelle in p25 identifiziert werden. Um die subzelluläre Lokalisation von p25 zu untersuchen, wurden intakte Zellen mit einer unspezifischen Protease behandelt. Anschließend wurde in Immunoblot Analysen geprüft, ob p25 im Vergleich zu Kontrollproteinen degradiert wird. p25 zeigte ein identisches Verhalten wie das Kontrollprotein PilQ, ein Protein der äußeren Membran, welches auf der Zelloberfläche exponiert ist. Als weitere Kontroll-proteine dienten Tgl, ein Protein der äußeren Membran, das ins Periplasma ragt, und PilC, ein Protein der inneren Membran. Tgl und PilC wurden im Gegensatz zu PilQ und p25 weniger stark degradiert. Daher deuten die Ergebnisse darauf hin, dass p25 auf der Zelloberfläche exponiert ist. Um die PopC-Spaltstelle zu identifizieren, wurden biochemische und genetische Strategien verfolgt. Synthetische Peptide wurden herangezogen, um die PopC-Spaltung zu analysieren. Der N-Terminus von p17 sollte mittels Massenspektrometrie bestimmt werden. Außerdem wurde die Spaltung von verkürzten MalE-p25 Deletionsderivaten und Alaninsubstitutionsmutanten durch gereinigtes PopC Protein in vitro untersucht. Damit wurde das Spaltmotiv in p25 auf die Aminosäuren 56LDV58 eingegrenzt. Die Untersuchungen von Alanin-substitutionen in vitro und in vivo lassen schlussfolgern, dass Aspartat 57 essentiell für die PopC-Spaltung in M. xanthus ist. Daher deuten die Daten darauf hin, dass PopC p25 im Spaltmotiv 56LDV58 nach Aspartat 57 spaltet., Myxococcus xanthus is a Gram-negative, rod-shaped δ-proteobacterium, which shows a complex developmental program. This program is initiated under starvation conditions and results in the formation of multicellular, spore-filled fruiting bodies. After six hours of starvation the C-signal coordinates and regulates the aggregation of cells into fruiting bodies, sporulation of cells into myxospores and a specific gene expression. The C-signal is a 17 kDa protein p17, which is generated by proteolytic cleavage of a 25 kDa precursor p25 by the subtilisin-like serine-protease PopC. The aim of this study was to investigate the subcellular localization of p25 in the outer membrane and to identify the PopC cleavage site in p25. To analyze the localization of p25, intact cells were treated with an unspecific protease. Immunoblot analysis with antibodies against p25 and against different control proteins were used to detect protein degradation. p25 was degraded like the outer membrane protein PilQ, which is exposed to the cell surface. Additionally, the outer membrane protein Tgl, which is exposed into the periplasmic space, and the inner membrane protein PilC were employed as controls. Tgl and PilC were degraded less drastically than PilQ and p25. These data suggest that p25 is exposed on the cell surface. To identify the PopC cleavage site, biochemical and genetic approaches were used. Synthetic peptides were explored to map the PopC cleavage site and the N-terminus of p17 was analyzed by mass-spectrometry. Truncated MalE-p25 derivatives as well as mutants containing alanine substitutions at certain amino acid positions were investigated after cleavage by purified PopC protein in vitro. With these experiments the PopC cleavage site was narrowed down to the amino acid motif 56LDV58 in p25. Furthermore, analysis of different alanine substitution mutants in vitro and in vivo revealed that aspartate in the position 57 of p25 is essential for PopC cleavage in M. xanthus. These data strongly suggest that PopC cleaves p25 after aspartate 57 in the cleavage motif 56LDV58.

Problem: uPA und PAI-1 werden als neue prognostische Faktoren beim nodal-neg. Mammakarzinom diskutiert. Hohe Konzentrationen korrelieren mit einem erhöhten Metastasierungsrisiko und einem kürzeren Gesamtüberleben bei nodal- neg. Tumoren. Methode: Bei 309 Patienten mit nodal-neg. Mamma-Ca wurde durch den Femtelle uPA/PAI-1-Test die Konzentrationen von uPA und PAI-1 im Tumorzytosol bestimmt. Die Einteilung erfolgte nach TNM-Klassifikation. Ergebnis: 19,74 % der Patienten hatten Messwerte unter dem cut-off.:33,33 % der G1-Tumoren sowie bei G2 22,04 % und bei G3 5,41%. 34,1 % der Tumoren pT 1a oder pT 1b, 17,87 % pT 1c sind unter den cut-offs. Zwischen 60 bis 69 Jahren sind 22,33 % der Patientinnen unter den cut-offs. Diskussion: Mit 19,74% ist die uPA/PAI-1-low-risk-Gruppe des gesamten Kollektivs kleiner als in anderen Kollektiven. Die uPA- und PAI-1-Messwerte korrelieren mit der Tumorgröße und dem Grading. Es zeigte sich keine signifikante Korrelation zum Patientenalter.

Le GABA est le principal neurotransmetteur inhibiteur du SNC et est impliqué dans le développement du cerveau, la plasticité synaptique et la pathogénèse de maladies telles que l’épilepsie, les troubles de l’anxiété et la douleur chronique. Le modèle actuel de fonctionnement du récepteur GABA-B implique l’hétérodimérisation GABA-B1/B2, laquelle est requise au ciblage à la surface membranaire et au couplage des effecteurs. Il y est cependant des régions du cerveau, des types cellulaires et des périodes du développement cérébral où la sous-unité GABA-B1 est exprimée en plus grande quantité que GABA-B2, ce qui suggère qu’elle puisse être fonctionnelle seule ou en association avec des partenaires inconnus, à la surface cellulaire ou sur la membrane réticulaire. Dans le cadre de cette thèse, nous montrons la capacité des récepteurs GABA-B1 endogènes à activer la voie MAPK-ERK1/2 dans la lignée dérivée de la glie DI-TNC1, qui n’exprime pas GABA-B2. Les mécanismes qui sous-tendent ce couplage demeurent mal définis mais dépendent de Gi/o et PKC. L’immunohistochimie de récepteurs endogènes montre par ailleurs que des anticorps GABA-B1 dirigés contre la partie N-terminale reconnaissent des protéines localisées au RE tandis des anticorps C-terminaux (CT) marquent une protéine intranucléaire. Ces données suggèrent que le domaine CT de GABA-B1 pourrait être relâché par protéolyse. L’intensité des fragments potentiels est affectée par le traitement agoniste tant en immunohistochimie qu’en immunobuvardage de type western. Nous avons ensuite examiné la régulation du clivage par le protéasome en traitant les cellules avec l’inhibiteur epoxomicine pendant 12 h. Cela a résulté en l’augmentation du marquage intranucléaire de GABA-B1-CT et d’un interacteur connu, le facteur de transcription pro-survie ATF-4. Dans des cellules surexprimant GABA-B1-CT, l’induction et la translocation nucléaire d’ATF-4, qui suit le traitement epoxomicine, a complètement été abolie. Cette observation est associée à une forte diminution du décompte cellulaire. Étant donné que les trois derniers résidus de GABA-B1-CT (LYK) codent un ligand pseudo-PDZ et que les protéines à domaines PDZ sont impliquées dans la régulation du ciblage nucléaire et de la stabilité de protéines, en complément de leur rôle d’échaffaud à la surface cellulaire, nous avons muté les trois derniers résidus de GABA-B1-CT en alanines. Cette mutation a complètement annulé les effets de GABA-B1-CT sur l’induction d’ATF-4 et le décompte cellulaire. Cette deuxième série d’expériences suggère l’existence possible de fragments GABA-B1 intranucléaires régulés par le traitement agoniste et le protéasome dans les cellules DI-TNC1. Cette régulation d’ATF-4 dépend des résidus LYK de GABA-B1-CT, qui modulent la stabilité de GABA-B1-CT et favorisent peut-être la formation d’un complexe multiprotéique incluant GABA-B1-CT, ATF-4, de même qu’une protéine d’échaffaudage inconnue. En somme, nous démontrons que les sous-unités GABA-B1 localisées au RE, lorsque non-hétérodimérisées avec GABA-B2, demeurent capables de moduler les voies de signalisation de la prolifération, la différentiation et de la survie cellulaire, via le couplage de protéines G et possiblement la protéolyse régulée. Les mécanismes de signalisation proposés pourraient servir de nouvelle plate-forme dans la compréhension des actions retardées résultant de l’activation des récepteurs 7-TMs., GABA is the principal inhibitory neurotransmitter in the CNS and is implicated in brain development, synaptic plasticity and the pathogenesis of diseases such as epilepsy, anxiety disorders and chronic pain. In the current model of GABA-B function, there is a requirement for GABA-B1/B2 dimerization for targetting to the cell surface and effector coupling. However, there are certain brain regions (putamen), cell types (glial cells) and times during brain development where GABA-B1 is expressed in higher amounts than GABA-B2, suggesting that GABA-B1 might be functional alone or in association with unidentified partners, either at the cell surface or on the ER membranes. In this thesis, we first show the capacity of endogenous GABA-B1 receptors to activate the MAPK-ERK1/2 pathway in the DI-TNC1 glial-derived cell line which does not express GABA-B2. The underlying mechanisms remain incompletely defined but depend on Gi/o and PKC. Immunohistochemistry of endogenous receptors shows that GABA-B1 N-terminal antibodies recognize ER-localized proteins and that C-terminal (CT) antibody shows intranuclear distribution. This data suggests that fragments of the GABA-B1 receptor are generated by proteolysis and indeed we show that agonist treatment affects the intensity of certain C-terminal GABA-B1 fragments both in immunohistochemistry and western blots suggesting that the GABA-B1 receptor is subjected to regulated proteolysis. Since a 13-residue potential PEST sequence was localized immediately distal to the ER retention motif in the GABA-B1 CT, we examined proteasome regulation of the cleavage event. Following a 12h treatment with the proteasome inhibitor, epoxomicin, we detected increases in intranuclear staining for both GABA-B1 and a known interactor, the pro-survival transcription factor ATF-4, using confocal microscopy and by western blotting of nuclear extracts. These increases are due either to proteasome inhibition or activation of the ER stress pathway. In cells overexpressing GABA-B1-CT, ATF-4 induction and nuclear translocation, which normally follows epoxomicin treatment, was completely abolished. This observation was associated to a strong decrease in cell number. Since the last three residues of GABA-B1-CT (LYK) encode a pseudo-PDZ ligand and that PDZ domain protein regulate nuclear targeting and protein stability, in complement to their role in scaffolding at the cell surface, we mutated the last three residues of GABA-B1-CT to alanines. This mutation completely reversed the effect of GABA-B1-CT on ATF-4 induction and on cell number. This second set of data suggests the existence of agonist and proteasome-regulated intranuclear GABA-B1 fragments in DI-TNC1 cells. Further, the GABA-B1-CT pseudo-PDZ ligand appears to be critically important in regulating ATF-4 induction by modulating GABA-B1-CT stability and perhaps by favoring the formation of a multiprotein complex with ATF-4, ATF-4 interactors and an unknown scaffolding protein. Overall, we show that ER-localised GABA-B1 subunits, when not dimerized with GABA-B2, can still modulate proliferation, differentiation and survival pathways, both through G-protein coupling and regulated proteolysis. The signalling mechanisms which we propose could serve as a new platform in understanding the long term effects of 7-TM receptor activation.

Une fois ingérées par un insecte sensible, les toxines insecticides du bacille de Thuringe doivent être activées par les protéases intestinales de cet insecte. Leur premier domaine, un ensemble de sept hélices-α amphipathiques, est responsable de leur insertion dans la membrane luminale de certaines cellules de l’intestin médian, ce qui crée des pores peu sélectifs. La toxicité et la capacité à former des pores d’une telle toxine, la Cry9Ca, de ses mutants simples R164A et R164K et d’un fragment de 55 kDa résultant d’un clivage protéolytique au niveau de son résidu 164 ont été étudiées à l’aide d’une combinaison de modélisation par homologie, de bioessais, d’expériences de gonflement osmotique avec des vésicules de membrane en bordure en brosse de larves de sphinx du tabac et de mesures électrophysiologiques sur des intestins isolés. Ni les mutations simples ni le clivage protéolytique n’ont altéré la toxicité de la Cry9Ca. Dans une solution à faible force ionique, toutefois, la formation des pores dépend fortement du pH : une augmentation de celui-ci de 6,5 à 10,5 a entraîné une baisse irrégulière et par étapes successives de la perméabilité membranaire. Les quatre préparations de toxine ont néanmoins dépolarisé la membrane apicale d’intestins médians fraîchement isolés baignant dans une solution contenant 122 mM de KCl à pH 10,5. L’activité de la Cry9Ca, et des mutants R164A et R164K, a été grandement stimulée lorsque les expériences ont été effectuées en présence de suc intestinal, de lipides extraits d’un volume équivalent de suc intestinal ou d’un cocktail d’inhibiteurs de protéases solubles dans l’eau. De plus, le rôle des boucles inter-hélicales du Domaine I lors de l’insertion dans la membrane a été étudié avec des mutants doubles de la Cry9Ca dont les mutations introduisaient, neutralisaient ou renversaient une charge électrique. À l’exception de trois d’entres eux, tous ces mutants ont conservé une toxicité et une capacité à former des pores comparables à celles de la toxine parentale. L’ensemble de ces résultats suggère que le micro-environnement de l’intestin médian contribue à minimiser l’influence des charges de surface portées par les résidus des boucles inter-hélicales du Domaine I sur la capacité des toxines du bacille de Thuringe à former des pores. Il indique aussi que, d’une part, selon le site de clivage et les conditions expérimentales utilisées, des protéolyses supplémentaires de la toxine Cry9Ca activée peuvent soit stimuler, soit nuire à son activité et que, d’autre part, le suc intestinal du sphinx du tabac contient probablement un inhibiteur de protéases qui pourrait jouer un rôle important dans l’activité des toxines du bacille de Thuringe., Once ingested by susceptible insects, Bacillus thuringiensis insecticidal toxins must be activated by the insect’s intestinal proteases. Their first domain, a bundle of seven amphipathic -helices, is responsible for their insertion into the luminal membrane of midgut cells, thereby creating poorly selective pores. The toxicity and pore-forming ability of one such toxin, Cry9Ca, its single-site mutants, R164A and R164K, and of the 55-kDa fragment resulting from its proteolytic cleavage at residue 164 were investigated using a combination of homology modeling, bioassays, osmotic swelling experiments with Manduca sexta larval midgut brush border membrane vesicles and electrophysiological measurements on isolated midguts. Neither the single mutations nor the proteolytic cleavage altered Cry9Ca toxicity. In low ionic strength solutions however, pore formation was highly dependent on pH: increasing pH from 6.5 to 10.5 resulted in an irregular step-wise decrease in membrane permeabilization. All four toxin preparations nevertheless depolarized the apical membrane of freshly isolated midguts bathing in a solution containing 122 mM KCl at pH 10.5. The activity of Cry9Ca, R164A and R164K was greatly enhanced when the experiments were conducted in the presence of midgut juice, the lipids extracted from an equivalent volume of midgut juice or a cocktail of water-soluble protease inhibitors. Additionally, the role of the interhelical loops of Domain I in membrane insertion was investigated with Cry9Ca double mutants with mutations that either introduced, neutralized or reversed an electrical charge. All but three mutants retained a toxicity and a pore-forming ability that were comparable to those of their parental toxin. Overall, the results suggest that the midgut microenvironment contributes to minimizing the influence of surface charges carried by Domain I interhelical loop residues on B. thuringiensis toxins pore-forming ability. They also indicate that, depending on the cleavage site and on the experimental conditions used, further proteolysis of the activated Cry9Ca toxin can either stimulate or be detrimental to its activity and that M. sexta midgut juice probably contains protease inhibitors that could play a major role in the activity of B. thuringiensis toxins in the insect midgut.

Diese Dissertation befasst sich mit der massenspektrometrischen Analytik von Membranproteinen. Diese gestaltet sich aufgrund der hydrophoben Natur der Proteine und der damit verbundenen schlechten Löslichkeit in wässrigen Puffersystemen als deutlich schwieriger als die Untersuchung löslicher Proteine. Einige weitere Probleme entstehen durch die konsequente Verwendung der Referenzprotease Trypsin zur Hydrolyse der Proteine. Sie spaltet ausschließlich Peptidbindungen nach basischen Aminosäuren, die naturgemäß in den unpolaren Helixbereichen der Membranproteine nur vereinzelt anzutreffen sind. Im Rahmen dieser Arbeit wurden auf weniger spezifischen Proteasen basierende Protokolle zur Analyse von ganzen Membranproteomen entwickelt, welche einige der ursprünglichen Probleme umgehen oder zumindest vermindern. Die Proteolysereaktion fand in Anwesenheit von Methanol statt, welcher die Membranstruktur destabilisiert und so die Zugänglichkeit der in die Membran eingebetteten Proteinteile für das Enzym erhöht. Zusätzlich erhöhte sich dadurch die Löslichkeit gebildeter hydrophober Peptide im Puffer. Das neue Protokoll wurde an Bacteriorhodopsin, einem geläufigen Modellsystem für α helikale Membranproteine, erfolgreich etabliert. Bei Verwendung der Proteasen Elastase und Pepsin konnten nach nLC-Trennung und MALDI-MS/MS deutlich mehr Peptide des Membranproteins signifikant identifiziert werden, als es mit Trypsin möglich gewesen ist. Auch qualitativ ergaben sich Unterschiede zwischen beiden Enzymen. Mit den alternativen Enzymen ließen sich nicht nur die hydrophilen peripheren Proteinabschnitte nachweisen, sondern auch zahlreiche Peptide aus den hydrophoben Transmembranbereichen. Das am Modellprotein etablierte Elastase-Protokoll konnte problemlos auf die Analyse des komplexeren Membranproteoms von Corynebacterium glutamicum transferiert werden. So konnten ca. 150 verschiedene Proteine identifiziert werden, darunter auch zahlreiche Membranproteine. Die erzeugten Peptidmischungen wurden nicht nur mittels nLC-MALDI-TOF/TOF sondern auch mit einer nLC-ESI-Orbitrap-Plattform analysiert. Anhand einer detaillierten Analyse der physikochemischen Eigenschaften der entstandenen Peptide konnte gezeigt werden, dass der dabei beobachtete Vorteil des ESI-Instrumentes zu großen Teilen auf die bessere Detektion aliphatischer Neutralpeptide zurückzuführen war. Diese werden bei der MALDI vornehmlich aufgrund der schlechteren Ionisation bei Verwendung der Standardmatrix α-Cyano-4-Hydroxyzimtsäure diskriminiert. Ein weiterer Vorteil des verwendeten ESI-Gerätes ist seine bessere Massengenauigkeit durch den hochauflösenden Orbitrap-Massenanlysator. Wurden die MALDI-TOF/TOF-Fragmentierungsdaten durch, auf einem zweiten Instrument gemessene, genaue MALDI-Orbitrap-Vorläufermassen supplementiert, konnten über 30% mehr Peptide signifikant identifiziert werden. Die gesammelten Daten konnten zur Erhebung einiger Statistiken über Elastase und Pepsin herangezogen werden. Erstmals wurde eine umfassende Untersuchung der Spaltspezifität von Elastase vorgenommen. Das Enzym hydrolysiert in ca. 82% der Fälle nach den kleinen hydrophoben Aminosäuren Ala, Val, Ile, Leu, Ser und Thr. Diese Spezifität ist für proteolytische Schnitte innerhalb der hydrophoben Helixbereiche von Membranproteinen äußerst vorteilhaft. Sie reicht aus, um Peptide Mass Fingerprinting an Einzelproteinen durchzuführen, wie exemplarisch am Modellprotein Bacteriorhodopsin gezeigt wurde. Die für Pepsin erhaltene Spezifität ist hingegen zu undifferenziert für solche Experimente, weshalb hier MS/MS-basierte Strategien vorzuziehen sind. Weitergehende Verbesserungen für Datenbanksuchen mit weniger spezifischen Proteasen wurden vorgeschlagen. Hierzu wurde erstmals eine größere Fragmentierungsstatistik eines nichttryptischen Datensatzes auf einem MALDI-Instrument erstellt, deren Aussage zur Verifizierung von Suchergebnissen in die Algorithmen implementiert werden kann. Beim Einsatz weniger spezifischer Proteasen erhöht sich im Vergleich zu Trypsin die entstehende Peptidkomplexität. Zur Kompensation dessen wurde eine Fraktionierung mittels Off-gel IEF vor der nLC-MALDI-Analyse etabliert. Zwecks direkter Kompatibilität zur nLC wurde ein Off-gel IEF-Protokoll ohne die Probeninjektion störendes Glycerol entwickelt. So ließ sich die dreifache Menge an Peptiden nachweisen, als mit ausschließlich eindimensionaler nLC-Trennung. In Verbindung mit den durch Trypsin erzielbaren Resultaten lassen sich mit den weniger spezifischen Enzymen viele Membranproteine umfassender charakterisieren, da zusätzlich die hydrophoben Transmembranbereiche und somit mehr Informationen für die Analytik zugänglich sind. Der gezielte Einsatz von alternativen Enzymen verbessert die momentane Situation in der Membranproteom-Analytik deutlich und führt diese einen weiteren Schritt an die Analytik löslicher Proteine heran. This PhD thesis focused on the mass spectrometric analysis of membrane proteins. Due to their poor solubility in aqueous solvents and their general hydrophobic nature, proteomic efforts to identify or characterize such proteins tend to be difficult. Further problems arise through the consequent application of the reference protease trypsin. This enzyme cleaves peptide bonds after the basic side chains of arginine and lysine, occurring only sporadically within the hydrophobic helical regions of membrane proteins. In this work, modified digestion protocols employing less-specific proteases were developed, to avoid or reduce at least some of the initial difficulties. Proteolysis was carried out in the presence of methanol, destabilizing the membrane integrity and facilitating the access of the protease towards the membrane-embedded protein regions. Additionally, the organic solvent increases the solubility of liberated hydrophobic peptides in the buffer medium. The novel protocol was successfully tested on bacteriorhodopsin, a common model system for α helical membrane proteins. By hydrolysis using the proteases elastase and pepsin, significantly more peptides of the membrane protein could be identified after nLC/MALDI-MS/MS analysis than with trypsin. In addition to peptides from the soluble protein parts, ample peptides were identified from the transmembrane regions, if the alternate enzymes were used. The established elastase protocol was transferred for the analysis of the more complex membrane proteome of Corynebacterium glutamicum, identifying more than 150 different proteins including various membrane proteins. The generated peptide mixtures were analyzed on MALDI-TOF/TOF and ESI-Orbitrap platforms, respectively. A detailed look on the peptide’s physicochemical properties revealed, that an obvious margin in favor of the ESI instrument could mainly be attributed to a better detection of aliphatic neutral peptides. These are heavily discriminated using MALDI due to their inefficient ionization, if the standard matrix α-cyano-4-hydroxycinnamic acid is used. An increased mass accuracy offered by the high-resolution Orbitrap mass analyzer is another advantage of the ESI instrument. If MALDI-TOF/TOF fragment data was supplemented by accurate MALDI-Orbitrap precursor masses measured on a second instrument, up to 30% more peptides were identified. All collected data was used to raise specificity definitions of elastase and pepsin. For the first time ever, a comprehensive large-scale analysis of the elastatic specificity was performed. The enzyme hydrolyzes to an extent of 82% after the small hydrophobic amino acids Ala, Val, Ile, Leu, Ser and Thr. This specificity is extremely useful to target the helical regions of membrane proteins. It is sufficient to perform peptide mass fingerprinting on single proteins, as was shown on bacteriorhodopsin. However, the specificity of pepsin is too undifferentiated for such experiments, so MS/MS-based strategies are suggested with this protease. Further improvements for less-specific database searches were discussed. For that reason, comprehensive fragmentation statistics were generated from the non-tryptic MALDI datasets. Their results could be used to verify search results, if implemented in the current algorithms. Application of less-specific enzymes always increases the generated peptide complexity compared to tryptic digests. To compensate this, pre-fractionation by means of off-gel IEF prior to nLC/MALDI analysis was performed. The additive glycerol was omitted from the protocol to allow the direct injection of the off-gel fractions into the nLC. The additional pre-fractionation step increased the number of identified peptides by a factor of 3. By employing less-specific enzymes membrane proteins can be analyzed more efficiently especially in combination with tryptic results. This can be mainly attributed to the access of the transmembrane regions, yielding additional information about the proteins. The targeted application of less-specific enzymes alleviates the current situation and closes the gap between membrane protein analysis and the soluble proteins.