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Rotavirus es el principal agente causante de gastroenteritis viral en niños y animales jóvenes en todo el mundo. Una de las principales proteínas de rotavirus es la glicoproteína no estructural 4 (NSP4) que juega un papel crucial tanto en el ciclo replicativo de rotavirus, actuando como receptor de partículas inmaduras en el retículo endoplasmático, como en la fisiopatología de rotavirus, siendo la primera enterotoxina de origen vírico descrita hasta el momento. El objetivo de la presente tesis fue clonar y producir la glicoproteína NSP4 de diferentes cepas humanas y animales de rotavirus para así poder realizar estudios inmunogénicos tales como la caracterización de epitopos presentes en la proteína y la respuesta inmune que esta proteína despierta tras la infección por rotavirus. Así mismo nos planteábamos estudiar la capacidad que poseen tanto la infección por rotavirus como la proteína NSP4 de producir óxido nítrico (ON) tanto "in vivo" como "in vitro" y la posible implicación del ON en la fisiopatología de rotavirus. Se utilizó el sistema de expresión de baculovirus en células de insecto para la producción y purificación de la proteína NSP4 de diferentes cepas de rotavirus humanas y de animales en forma biológicamente activa. Experimentos de inmunización de ratones demostraron que los anticuerpos producidos frente a la proteína NSP4 reconocen principalmente el fragmento carboxi-terminal de la proteína (aminoácidos 114 a 175), por lo que esta región es inmunodominante. En la presente tesis se utilizó la tecnología de "phage display" para producir anticuerpos monoclonales de simple cadena (scFv) frente a la proteína NSP4. Esta técnica nos permitió aislar scFvs frente a regiones no inmunodominantes de la proteína NSP4.Los estudios realizados con sueros de niños convalecientes de una infección por rotavirus muestran que la proteína NSP4 provoca una respuesta inmune humoral tras la infección natural por rotavirus en niños, constituída por anticuerpos séricos de clase IgG y que esta respuesta no parece ser de larga duración, según los resultados obtenidos con sueros de niños y adultos sanos. Proteínas NSP4 procedentes de dos diferentes genotipos (A y B) fueron utilizadas para estudiar la reactividad cruzada de los anticuerpos frente a NSP4. Los resultados obtenidos muestran que los anticuerpos IgG séricos desarrollados frente a NSP4 en niños con gastroenteritis aguda por rotavirus presentan en el 40% de los casos estudiados reactividad cruzada frente a más de un genotipo de dicha proteína, por lo que este reconocimento de los genotipos A y B de NSP4 no es siempre heterotípico. Los experimentos realizados con células epiteliales humanas HT-29 "in vitro" muestran que la proteína NSP4 provoca un incremento de la secreción de ON en este tipo celular. Este incremento ocurre de forma paralela al incremento de calcio intracelular observado en la misma línea celular en respuesta a NSP4, indicando una posible participación de la enzima óxido nítrico sintasa constitutiva (cNOS). Por último los experimentos realizados "in vivo" en el modelo murino, así como en muestras de orina procedentes de niños con gastroenteritis por rotavirus muestran que las infecciones por rotavirus en ratones Balb/c provocan un aumento en la concentración de los productos derivados del ON en la orina de los animales infectados, con la participación de la enzima óxido nítrico sintasa inducible (iNOS) en el modelo murino y que este incremento se observa también en la orina de niños con gastroenteritis por rotavirus., The baculovirus expression system in insect cells was utilized to produce and purify the biologically active form of the NSP4 protein from rotavirus strains isolated from different animal and human strains. After the immunization of mice with the different ourified NSP4 proteins the super-immune sera obtained from NSP4 immunized mice, strongly recognize the carboxi-end of the protein (aminoacids 114 to 175), being indicative of the immunodominance of this region.One of the objebtives of this thesis was to obtain monoclonal antibodies, using the phage display technique that showed to be a useful tool in producing antibodies that recognize different epitopes in the NSP4 protein, thus being able to conduct inhibitory studies to identify biological activity. One interesting result when using this technique was that the phage display technique allowed us for the isolation of single chain monoclonal antibodies against non-immunodominant regions of NSP4.We also present data on the immunogenicity of the NSP4 protein in natural rotavirus infections in humans. Our results show that the NSP4 protein elicits a humoral immune response in children that had been naturally infected by rotavirus. The IgG serical antibodies developed against the NSP4 in children suffering acute rotavirus gastroenteritis, present cross reactivity against more than one genotype of the protein in 40% of the studied cases, indicating that the recognition of A and B NSP4 genotypes is not always heterotypic.Finally we studied the possible role of the nitric oxide (NO) in rotavirus pathophysiology. The NSP4 protein produced an increase in NO secretion in cultured HT-29 human epithelial cells. This increase occurred in parallel to the intracellular calcium increase previously observed in the same cell line in response to the NSP4.The rotaviral infections in Blab/c mice produced an increase in the concentration of the nitric oxide derived products in the urine of the infected animals, through the induction of the inducible nitric oxide enzyme (iNOS) in the murine model. This increase was also observed in the urine of children suffering acute rotaviral gastroenteritis.

Los norovirus humanos son los principales agentes etiológicos de gastroenteritis aguda en todo el mundo. Aunque los norovirus son muy diversos (se han detectado más de 30 genotipos en humanos), durante los últimos 40 años la mayoría de los brotes y epidemias han sido causados por cepas del genotipo GII.4, lo que plantea interrogantes sobre su persistencia en la población. Entre otras posibles explicaciones, se considera que la evasión inmunológica es la principal causa de su éxito. Para estudiar en detalle el reconocimiento y la evasión de anticuerpos, analizamos un epítopo conformacional reconocido por un anticuerpo monoclonal (3C3G3) mediante mutagénesis dirigida y resonancia superficial de plasmón (SPR, por sus siglas en inglés). Los resultados muestran que el epítopo predicho está compuesto por 11 aminoácidos dentro del dominio P de la cápside vírica. Sólo dos de ellos difieren de la variante homóloga (GII.4 Den-Haag_2006b) y de la variante pre- epidémica (GII.4 VA387_1996) que no es reconocida por el anticuerpo. Además, un solo cambio de aminoácido es capaz de modificar el patrón de reconocimiento de los antígenos histo-sanguíneos (HBGA). Estos resultados proporcionan evidencia de que el epítopo reconocido por el anticuerpo 3C3G3 está involucrado en las interacciones virus-huésped, tanto a nivel inmunológico como en el reconocimiento de los receptores celulares. Los rotavirus humanos son los principales agentes causantes de gastroenteritis aguda en niños pequeños, y además el genotipo P[8] representa más del 80% de las infecciones en humanos. Se han determinado las bases moleculares de la unión del dominio VP8* de la proteína VP4 del genotipo P[8] asu receptor celular, el antígeno H tipo 1 (Fuc- " 1,2-Gal- # 1,3-GlcNAc; H1) y a su precursor lacto-N-biosa (Gal- # 1,3-GlcNAc; LNB). La resolución de las estructuras cristalinas de P[8] en complejos con el antígeno H1 y LNB y los experimentos de mutagénesis dirigida revelaron que ambos glicanos se unen a la proteína P[8] VP8* a través de un sitio de unión compartido con otros miembros del genogrupo P[II], es decir; P[4], P[6] y P[19]. Los resultados muestran que la fracción L-fucosa de H1 sólo muestra contactos indirectos con P[8] VP8*. Sin embargo, los cambios conformacionales inducidos en la fracción de la LNB duplican la afinidad del ligando, según las medidas por SPR lo que proporciona una explicación molecular a la diferente susceptibilidad a la infección por rotavirus entre individuos secretores y no secretores. La inesperada interacción de P[8] VP8* con la LNB, un componente básico de los oligosacáridos de la leche humana de tipo 1, dio lugar a la inhibición de la infección por rotavirus, lo que pone de manifiesto el papel y la posible aplicación de este disacárido como antiviral. A pesar de que los aminoácidos clave en el sitio de unión H1/LNB están altamente conservados en los miembros del genogrupo P[II], se han encontrado diferencias en las afinidades de ligandos entre los distintos linajes de P[8]. La variación en las afinidades se explica por sutiles diferencias estructurales inducidas por cambios en los aminoácidos de las proximidades al sitio de unión, que proporcionan un mecanismo de ajuste para la unión del glicano en el bolsillo de unión a la VP8* de los rotavirus del genotipo P[8]. Un último objetivo del presente trabajo fue determinar la prevalencia y el título de los anticuerpos séricos frente a varios genotipos de la proteína VP8* de rotavirus en niños y adultos en Valencia, España, y determinar el papel del estado secretor (polimorfismo FUT2G428A) en la respuesta serológica. Se utilizaron las proteína VP8* de los genotipos P[4], P[6], P[8], P[9], P[11], P[14] y P[25] que fueron analizadas por ELISA con 88 muestras de sueros de niños (n=41, 3.5 años de edad en promedio) y de adultos (n=47, 58 años de edad en promedio). El conjunto de 55 muestras fueron genotipadas para el polimorfismo FUT2G428A y se compararon los títulos de anticuerpos. Se encontraron diferencias en la seroprevalencia entre niños y adultos para los genotipos P[4], P[8] y P[11]. De manera similar, se encontraron diferencias significativas entre adultos y niños en los títulos de anticuerpos contra los genotipos P[4], P[8] y P[11], teniendo los niños títulos de anticuerpos más altos que los adultos. Curiosamente, se encontraron muestras positivas para genotipos raros como P[11] (sólo en niños), P[14] y P[25]. Aunque no se encontraron diferencias estadísticas en los títulos de anticuerpos entre secretores y no secretores para ninguno de los genotipos P estudiados, se encontró una prevalencia estadísticamente significativa más alta para el genotipo P[25] en los individuos secretores en comparación con los no secretores. Finalmente, para profundizar en el estudio de la susceptibilidad entre secretores y no secretores se estudió el titulo de anticuerpos frente al rotavirus completo de la cepa Wa G1P[8], encontrándose diferencias estadísticamente significativas en este caso.

El síndrome de Goodpasture (GP) es un desorden autoinmune que cursa con glomerulonefritis rápidamente progresiva y hemorragia pulmonar. El ataque inmunológico se lleva a cabo mediante (auto)-anticuerpos (anticuerpos GP) dirigidos contra el dominio C terminal, no colagenoso (NC1), de la cadena α3 del colágeno IV, presente en la membrana basal glomerular (GBM), así como en la membrana basal alveolar. Tres cadenas α se asocian para construir una molécula de colágeno IV, que recibe el nombre de protómero, dos protómeros de colágeno IV se unen a través de sus extremos NC1 para formar una estructura cuaternaria de naturaleza hexamérica (hexámero) en la red de colágeno IV. Estudios cristalográficos han mostrado que en la estabilización del hexámero participan tanto interacciones hidrofóbicas, como interacciones hidrofílicas que junto con enlaces covalentes tipo sulfilimina entre protómeros opuestos sellan el hexámero. Lo que se conoce del epítopo GP son dos regiones, llamadas EA y EB, en las que se identificaron los residuos Ala18, Ile19, Val27 y Pro28 conformando parte del epítopo patogénico. Así, éste parece ubicarse en la interfaz de los dominio NC1 que forman el hexámero de la red de colágeno de la GBM, resultando en un epítopo críptico e inaccesible para los anticuerpos GP. Cuando se disocia el hexámero, estos aminoácidos se tornan accesibles a los anticuerpos GP. En contraste, otros residuos que forman parte del epítopo, como los residuos hidrofílicos Ser21 y Ser 31, así como la Pro28, son accesibles a los anticuerpos GP tanto si el dominio NC1 se encuentra en forma hexamérica como monomérica. Un aspecto relevante en la enfermedad GP, es el mecanismo mediante el cual los autoanticuerpos tienen acceso al epítopo. En este sentido, la proteína de unión al antígeno GP (GPBP) podría jugar un papel clave en el plegamiento de las cadenas de colágeno IV condicionando la diferente accesibilidad del antígeno GP. Objetivos El objetivo general de este trabajo persigue esclarecer la etiología de la enfermedad Goodpasture y profundizar en el conocimiento del epítopo de los autoanticuerpos y en la estructura 3D y ensamblaje de los componentes proteicos que forman el heterohexámero (α3,4,5)2(IV)NC1 y albergan el epítopo. 1 Caracterización mediante tecnología phage display y bioinformática del epítopo de los autoanticuerpos GP, ya localizado en el dominio α3(IV)NC1 del colágeno tipo IV. Mientras el estudio del epítopo GP se había abordado clásicamente a partir del análisis del antígeno, aquí obtenemos información del epítopo GP a partir del análisis de los autoanticuerpos GP patogénicos. Para ello, (1) ponemos a punto un sistema de expresión que usa células de insecto y baculovirus que permite la producción recombinante de α3(IV)NC1 y del resto de cadenas proteicas del colágeno tipo IV humano en forma abundante, funcional y estructuralmente competente; y (2) aplicamos la tecnología phage display y procedimientos bioinformáticos para cartografiar el epítopo para los anticuerpos circulantes de un paciente Goodpasture sobre un modelo de la estructura 3D del heterohexámero (α3,4,5)2(IV)NC1. 2 Establecer las bases estructurales de los dominios NC1 del colágeno IV para comprender la biología y patología asociadas al colágeno IV en las membranas basales. Cristalizamos los seis α(IV)NC1 y varias asociaciones de ellos para, mediante la resolución de sus respectivas estructuras a nivel atómico, entender el proceso de ensamblaje y formación del protómero en el colágeno IV, así como de las interacciones que lo mantienen y que lo preservan del ataque de los anticuerpos GP. 3 Implicación de GPBP-1 en el ensamblaje del colágeno tipo IV y consecuencias inmunopatogénicas. Mostramos mediante la coexpresión simultánea de α3(IV)NC1 y GPBP-1 y estudios de resonancia de plasmón de superficie, de estructura de proteínas por cristalografía de rayos X y de caracterización inmunoquímica y de mutagénesis dirigida, que GPBP-1 modifica el plegamiento de α3(IV)NC1 y la exposición del epítopo de anticuerpos patogénicos. Resultados y conclusiones. Objetivo 1. Hemos aplicado la tecnología phage display por primera vez en la caracterización del epítopo de los anticuerpos GP. Hemos seleccionado péptidos específicos (fagotopos) para los autoanticuerpos GP a partir de dos librerías phage display-M13 de péptidos combinatoriales comerciales que hipotéticamente mimetizan las propiedades físico-químicas y la organización espacial de los auto-epítopos. En base a esta información, hemos generado quimeras, preparadas a partir de la proteína α2(IV)NC1, que son reconocidas por los anticuerpos GP con similar intensidad a como lo hacen con la diana natural α3(IV)NC1. Nuestros resultados, no sólo corroboraron hallazgos previos en la definición del epítopo sino que identificaron nuevos residuos (Thr26, Tyr30, Thr127, Pro131, His134, Lys141, Thr99 y Ala196) involucrados en la unión de los autoanticuerpos GP. Además de proporcionar nueva información estructural sobre los epítopos GP, proponemos el uso de nuevos compuestos (péptidos) con capacidad de bloquear la unión de los autoanticuerpos GP a su autoantígeno “in vivo” y aportamos datos cinéticos de la interacción antígeno-anticuerpo que, eventualmente, podrían resultar críticos en la generación de agentes bloqueantes terapéuticos. Objetivo 2. Pretendíamos establecer la estructura del heterohexámero (α3,4,5)2(IV)NC1, que es la diana de los autoanticuerpos en el síndrome de Goodpasture, y trasladar los hallazgos sobre el epítopo obtenidos en el objetivo 1 a una estructura hasta entonces desconocida. No tuvimos éxito en cristalizar tal heterohexámero probablemente por la asombrosa facilidad de uno de sus componentes (α5(IV)NC1) para cristalizar de forma aislada. Sí resolvimos, sin embargo, la estructura atómica, mediante cristalografía de rayos X, de homohexámeros de (α1(IV)NC1), (α3(IV)NC1), (α4(IV)NC1) y α5(IV)NC1, así como de heterohexámeros de ((α1)2(α2))2(IV)NC1 y de (α5,6,6)2(IV)NC1. La estructura de cada uno de los homohexámeros, excepto el de (α4(IV)NC1), junto con aquella de ambos heterohexámeros, resultó ser extremadamente similar, con un valor RMSD de superposición inferior a 0,8 Å. Todas tienen una estructura hexamérica cuaternaria típica para los α(IV)NC1, ya observada en el heterohexámero ((α1)2(α2))2(IV)NC1 encontrado en la placenta humana (PDB id:1LI1) y bovina (PDB id:1T61) y en la cápsula de cristalino bovino (PDB id:1M3D, 1T60). Esto demostraba que las nuevas estructuras aquí obtenidas poseen estructura cuaternaria fisiológica, validando, por tanto, el sistema de expresión que hemos usado, así como la idoneidad de los procesos de purificación y cristalización seguidos. El cristal del heterohexámero (α5,6,6)2(IV)NC1 reveló que este protómero no está constituido por dos moléculas de α5(IV)NC1 y una de α6(IV)NC1, como se creía, sino por dos moléculas de α6(IV)NC1 y una de α5(IV)NC1. La estructura de α4(IV)NC1 mostró claras diferencias respecto al resto de homohexámeros, evidenciando que las proteínas α(IV)NC1 pares exhiben menor plasticidad, lo que probablemente sea la causa de y limite su tendencia a la autoasociación. Las diferencias estructurales en α4(IV)NC1 impiden la formación del protómero y del hexámero al cambiar y limitar las interacciones que se establecen entre diferentes regiones en el resto de proteínas α(IV)NC1. El análisis de los heterohexámeros ((α1)2(α2))2(IV)NC1 y (α5,6,6)2(IV)NC1 reveló unas estructuras muy similares al resto de monómeros α(IV)NC1 permitiendo comprender que, una vez los α(IV)NC1 pares interaccionan con α(IV)NC1 impares, modifican su conformación para favorecer la formación del protómero, así como para proveerle estabilidad. La información estructural nos permitió concluir que los anticuerpos patogénicos GP se dirigen a dos regiones en α3(IV)NC1 que comprenden los residuos 15-TAIPSCPEGTVPLYS-29 (región EA) y 125-TDIPPCPHGWISLWK-139 (región EB), dos regiones estructuralmente rígidas situadas en el ápice de los dos dominios estructurales C4. Objetivo 3. Presentamos evidencias de que GPBP-1 influencia la estructura de α3(IV)NC1, como se observa, tras la co-expresión de ambas proteínas, en la estructura cristalina a nivel atómico de α3(IV)NC1, en la caracterización termodinámica de la interacción de α3(IV)NC1 con anticuerpos conformacionales y en su reconocimiento inmunoquímico. Mientras que los resultados inmunoquímicos y mediante SPR son indicativos de que GPBP-1 influencia la conformación de α3(IV)NC1, el estudio estructural de la proteína α3(IV)NC1 expresada y no expresada junto a GPBP-1, claramente revela la naturaleza de los cambios mediados por la presencia de la cinasa. GPBP-1 promueve la generación de cristales diferentes (en términos de grupo espacial y moléculas en la unidad asimétrica) a aquellos constituidos por un solo tipo de moléculas de α3(IV)NC1 (obtenidas en ausencia de GPBP-1 y que son competentes para ensamblarse en hexámeros) por contener también un segundo tipo de molécula de α3(IV)NC1 modificada (α3(IV)NC1c), sólo encontrada cuando su expresión ocurre junto a GPBP-1, y cuya capacidad de interacción se restringe a trímeros. Los cambios estructurales observados se localizan esencialmente en dos lazos de las regiones I y VI del dominio C4 condicionando la capacidad de ensamblaje de los trímeros en hexámeros. Este hecho se evidencia mejor en el ensanchamiento general de los trímeros originados por α3(IV)NC1c que impide el ensamblaje con el trímero vecino para formar el hexámero. Además, uno de estos lazos alberga la Lys211 involucrada en un enlace sulfilimina que da estabilidad al hexámero y restringe la accesibilidad de los autoanticuerpos GP por lo que se le atribuye un papel substancial en la patogenia del síndrome GP. La predicción para un heterohexámero (α3,4,5)2(IV)NC1 que contuviese una molécula de α3(IV)NC1c apuntaría a que se produjese una perturbación de las interacciones con las moléculas de α4(IV)NC1 y α5(IV)NC1 vecinas dentro del heterohexámero y una abolición de los enlaces sulfilimina, convirtiéndolo, de este modo, más susceptible al acceso de los anticuerpos GPc. La observación de que la reactividad de los autoanticuerpos GP sea mucho mayor hacia homohexámeros de α3(IV)NC1 que se han expresado simultáneamente con GPBP-1 que frente a homohexámeros de α3(IV)NC1 preparados en ausencia de GPBP o frente a formas monoméricas de α3(IV)NC1 bajo cualquier circunstancia, es consistente con el conocimiento presente del autoepítopo y refuerza la propuesta del papel de la cinasa en la etiología de la enfermedad Goodpasture, quizás facilitando la exposición del epítopo, la activación del sistema inmune y la producción de autoanticuerpos patogénicos. Los resultados de mutagénesis dirigida tanto en α3(IV)NC1 como en GPBP-1 se complementan y confirman que las modificaciones estructurales observadas en α3(IV)NC1 cuando se co-expresa junto a GPBP-1 se deben a la presencia de la cinasa. Estos resultados son consistentes con la observación de que la expresión elevada de GPBP-1 in vivo desorganiza la MBG, lo que podría permitir la exposición de epítopos crípticos y desencadenar un proceso autoinmune en el síndrome de Goodpasture y/o un proceso inflamatorio que culminaría en una Glomerulonefritis.

Noroviruses (NoVs) are the main cause of sporadic cases and outbreaks of acute gastroenteritis (Tam et al., 2012; Gastanaduy et al., 2013) and are globally associated with a large burden of disease (Patel et al., 2008). NoVs are a highly diverse group of viruses, although over the past two decades most reported NoV outbreaks and epidemics have been caused by NoV GII.4 genotype. Phylogenetic analyses of the GII.4 strains circulating in the last 20 years have shown that this genotype can be divided into distinct variants, which peak and wane over time in a similar pattern to that described for influenza viruses (Buesa et al., 2008; Siebenga et al., 2009; Koelle et al., 2006). In recent years different susceptibilities to NoV infection, depending on their HBGA phenotypes have been reported (Hutson et al., 2004). NoVs belong to the Caliciviridae family and are classified in 5 genogroups (GI-GV), although genogroup I (GI) and GII cause most human NoV infections. The genome is organized in three open reading frames (ORFs): ORF1, ORF2 and ORF3. The VP1, encoded by ORF2, is the major capsid protein, which is further organized into the N-terminal (N), the shell (S), and the protruding (P) domains. The P domain can be further divided into two subdomains: P1 and P2 (Prasad et al., 1999). The P1 subdomain forms the anchoring portion of the P dimer connecting it to the S domain, while the P2 subdomain is exposed on the surface of the capsid protein and is the most variable region of the virus. The main epitopes for immunorecognition and the histo-blood group antigen (HBGA) binding domains reside within this P2 subdomain. The emergence and accumulation of mutations along the P2 subdomain is the main driver of evolution for GII.4 strains, and results in new epidemic strains with altered antigenicity and HBGA binding properties (Allen et al., 2008, 2009; Shanker et al., 2011; Debbink et al., 2012). The cellular receptors that lead to norovirus infections have not been completely characterized yet, but it has been proposed that NoVs are likely to attach to either HBGA expressed on the gastroduodenal epithelial cells of secretor-positive individuals (Marionneau et al., 2002). However, a recent study has shown that NoV could bind to enterocytes independently of HBGAs (Murakami et al., 2013). To date no cell culture system has shown evidence of supporting norovirus propagation, Caco-2 cells, originally derived from human colorectal carcinoma expressing carbohydrates of the histo-blood group family on their surface, allow significant attachment of norovirus VLPs but only when these cells are differentiated. The C-terminal of the VP1 (P domain) of NoVs has the ability to auto-assemble into subviral particles, termed P particles (Tan & Jiang, 2005). Previous work showed that P particles retain the capacity to bind to saliva samples and to synthetic HBGA and that are also immunogenic, making them a valuable tool for the study of viral attachment and for the development of vaccines (Tan et al., 2008, 2011). In this study, the baculovirus expression system in insect cells was used to produce and purify the biologically active form of NoV VLPs from GII.4-1999 (GII.4-v0), GII.4-Hunter_2004 (GII.4-v2) and GII.4-Den Haag_2006b (GII.4-2006b) NoV strains. On the other hand, P particles (P-GI.1, P-GII.4-VA387, and P-GII.9) and the P domain (P-GII.4-2007_Apeldoorn) were produced in bacteria (E. coli) as recombinant proteins tagged with histidines (6xHis), and purified by FPLC in Ni-NTA columns. After the immunization of mice with the different purified NoV VLPs, the mAbs obtained by limiting dilution strongly recognized the P domain of the homologous variant, being indicative of the immunodominance of this region and corroborating the importance of the epitopes previously described in this domain (Zakikhany et al., 2012). Moreover, the av0 mAb also recognized the homologous P particle (P-GII.4-VA387 with a 97’88% of identity), indicating that P particles are antigenically comparable with the entire VLPs. Polyclonal antiserum were obtained from VLPs mix (GII.4-v0, GII.4-v2 and GII.3) immunized rabbit and recognized all of the variants used, both VLPs and P particles, with the exception of the P particle derived from a GI.1 strain. Therefore P particles contain variant-specific epitopes within genotypes but not between genogroups. Another objective of this thesis was to determine the epitope recognized by the anti-2006b mAb (3C3G3) which was performed by phage display technique. This mAb recognizes an epitope formed by 11 residues located into the P2 subdomain of NoV VP1 capsid protein, close to the blockade epitopes described. Thus being able to conduct inhibitory studies to identify biological activity. The binding properties to D-Caco-2 cells of virus-like particles (VLPs) of the different variants of NoV GII.4 and of P particles have been assessed by immunofluorescence, as well as inhibition of binding by: a) saliva; b) porcine gastric mucin (PGM); c) the monoclonal antibodies (mAbs) produced against NoV VLPs; and d) anti-Lewis antigens (Lea, Leb, Lex and Ley) or anti-H antigens (H1 and H2). These assays were performed in order to further investigate the interactions between NoVs and the cellular surface. The results were also compared with binding and blocking salivary assays by ELISA. All VLPs, but not P particles in the same conditions, were able to bind to saliva and D-Caco-2 cells. The different mAbs anti-NoV used blocked the VLP binding to saliva as well as PGM and D-Caco-2 cells, in a dose-dependent manner. But one interesting result when comparing blocking assays in both saliva and D-Caco-2 cells was that while in salivary assays the anti-Lewis or anti-H antigens used blocked the VLP binding, the HBGA blocking on the surface of D-Caco-2 cells did not affect NoV VLP binding. Furthermore, no co-localisation of HBGA and NoV VLPs was observed by immunofluorescence. These results suggest that binding to Caco-2 cells could be mediated by other receptors different from HBGAs, in addition to these. It was also studied the IgG antibody prevalence against NoV GII.4 in a Spanish population using the recombinant P domain of the NoV GII.4-Apeldoorn_2007 variant as the coating antigen in ELISA. Baculovirus-expressed virus-like particles (VLPs) of NoV GII.4-Den Haag_2006b variant were also used as antigen to compare seroreactivity. Of the 434 serum specimens analyzed, 429 (98.6 %) had antibodies against the P domain. The comparison of reactivities of 30 serum samples to the NoV GII.4 P polypeptide and VLP showed reproducible results with a correlation coefficient of r = 0.607. Titers of antibodies to the P domain increased gradually and significantly with age, reaching the highest levels at the age group of 41-50 years. These results confirm the high prevalence of NoV GII.4 infections in our community from early childhood. Finally, it is also presented the data on the immunogenicity of the NoV in natural NoV infections in humans. The results showed that the NoV elicits a humoral immune response in people that had been naturally infected by NoV. The IgG serical antibodies developed against the NoV in individuals suffering acute NoV gastroenteritis, present cross-reactivity against more than one genotype, but not against different genogroups, and are capable of blocking the NoV VLPs binding to saliva. Noroviruses (NoVs) are the main cause of sporadic cases and outbreaks of acute gastroenteritis (Tam et al., 2012; Gastanaduy et al., 2013) and are globally associated with a large burden of disease (Patel et al., 2008). NoVs are a highly diverse group of viruses, although over the past two decades most reported NoV outbreaks and epidemics have been caused by NoV GII.4 genotype. Phylogenetic analyses of the GII.4 strains circulating in the last 20 years have shown that this genotype can be divided into distinct variants, which peak and wane over time in a similar pattern to that described for influenza viruses (Buesa et al., 2008; Siebenga et al., 2009; Koelle et al., 2006). In recent years different susceptibilities to NoV infection, depending on their HBGA phenotypes have been reported (Hutson et al., 2004). NoVs belong to the Caliciviridae family and are classified in 5 genogroups (GI-GV), although genogroup I (GI) and GII cause most human NoV infections. The genome is organized in three open reading frames (ORFs): ORF1, ORF2 and ORF3. The VP1, encoded by ORF2, is the major capsid protein, which is further organized into the N-terminal (N), the shell (S), and the protruding (P) domains. The P domain can be further divided into two subdomains: P1 and P2 (Prasad et al., 1999). The P1 subdomain forms the anchoring portion of the P dimer connecting it to the S domain, while the P2 subdomain is exposed on the surface of the capsid protein and is the most variable region of the virus. The main epitopes for immunorecognition and the histo-blood group antigen (HBGA) binding domains reside within this P2 subdomain. The emergence and accumulation of mutations along the P2 subdomain is the main driver of evolution for GII.4 strains, and results in new epidemic strains with altered antigenicity and HBGA binding properties (Allen et al., 2008, 2009; Shanker et al., 2011; Debbink et al., 2012). The cellular receptors that lead to norovirus infections have not been completely characterized yet, but it has been proposed that NoVs are likely to attach to either HBGA expressed on the gastroduodenal epithelial cells of secretor-positive individuals (Marionneau et al., 2002). However, a recent study has shown that NoV could bind to enterocytes independently of HBGAs (Murakami et al., 2013). To date no cell culture system has shown evidence of supporting norovirus propagation, Caco-2 cells, originally derived from human colorectal carcinoma expressing carbohydrates of the histo-blood group family on their surface, allow significant attachment of norovirus VLPs but only when these cells are differentiated. The C-terminal of the VP1 (P domain) of NoVs has the ability to auto-assemble into subviral particles, termed P particles (Tan & Jiang, 2005). Previous work showed that P particles retain the capacity to bind to saliva samples and to synthetic HBGA and that are also immunogenic, making them a valuable tool for the study of viral attachment and for the development of vaccines (Tan et al., 2008, 2011). In this study, the baculovirus expression system in insect cells was used to produce and purify the biologically active form of NoV VLPs from GII.4-1999 (GII.4-v0), GII.4-Hunter_2004 (GII.4-v2) and GII.4-Den Haag_2006b (GII.4-2006b) NoV strains. On the other hand, P particles (P-GI.1, P-GII.4-VA387, and P-GII.9) and the P domain (P-GII.4-2007_Apeldoorn) were produced in bacteria (E. coli) as recombinant proteins tagged with histidines (6xHis), and purified by FPLC in Ni-NTA columns. After the immunization of mice with the different purified NoV VLPs, the mAbs obtained by limiting dilution strongly recognized the P domain of the homologous variant, being indicative of the immunodominance of this region and corroborating the importance of the epitopes previously described in this domain (Zakikhany et al., 2012). Moreover, the av0 mAb also recognized the homologous P particle (P-GII.4-VA387 with a 97’88% of identity), indicating that P particles are antigenically comparable with the entire VLPs. Polyclonal antiserum were obtained from VLPs mix (GII.4-v0, GII.4-v2 and GII.3) immunized rabbit and recognized all of the variants used, both VLPs and P particles, with the exception of the P particle derived from a GI.1 strain. Therefore P particles contain variant-specific epitopes within genotypes but not between genogroups. Another objective of this thesis was to determine the epitope recognized by the anti-2006b mAb (3C3G3) which was performed by phage display technique. This mAb recognizes an epitope formed by 11 residues located into the P2 subdomain of NoV VP1 capsid protein, close to the blockade epitopes described. Thus being able to conduct inhibitory studies to identify biological activity. The binding properties to D-Caco-2 cells of virus-like particles (VLPs) of the different variants of NoV GII.4 and of P particles have been assessed by immunofluorescence, as well as inhibition of binding by: a) saliva; b) porcine gastric mucin (PGM); c) the monoclonal antibodies (mAbs) produced against NoV VLPs; and d) anti-Lewis antigens (Lea, Leb, Lex and Ley) or anti-H antigens (H1 and H2). These assays were performed in order to further investigate the interactions between NoVs and the cellular surface. The results were also compared with binding and blocking salivary assays by ELISA. All VLPs, but not P particles in the same conditions, were able to bind to saliva and D-Caco-2 cells. The different mAbs anti-NoV used blocked the VLP binding to saliva as well as PGM and D-Caco-2 cells, in a dose-dependent manner. But one interesting result when comparing blocking assays in both saliva and D-Caco-2 cells was that while in salivary assays the anti-Lewis or anti-H antigens used blocked the VLP binding, the HBGA blocking on the surface of D-Caco-2 cells did not affect NoV VLP binding. Furthermore, no co-localisation of HBGA and NoV VLPs was observed by immunofluorescence. These results suggest that binding to Caco-2 cells could be mediated by other receptors different from HBGAs, in addition to these. It was also studied the IgG antibody prevalence against NoV GII.4 in a Spanish population using the recombinant P domain of the NoV GII.4-Apeldoorn_2007 variant as the coating antigen in ELISA. Baculovirus-expressed virus-like particles (VLPs) of NoV GII.4-Den Haag_2006b variant were also used as antigen to compare seroreactivity. Of the 434 serum specimens analyzed, 429 (98.6 %) had antibodies against the P domain. The comparison of reactivities of 30 serum samples to the NoV GII.4 P polypeptide and VLP showed reproducible results with a correlation coefficient of r = 0.607. Titers of antibodies to the P domain increased gradually and significantly with age, reaching the highest levels at the age group of 41-50 years. These results confirm the high prevalence of NoV GII.4 infections in our community from early childhood. Finally, it is also presented the data on the immunogenicity of the NoV in natural NoV infections in humans. The results showed that the NoV elicits a humoral immune response in people that had been naturally infected by NoV. The IgG serical antibodies developed against the NoV in individuals suffering acute NoV gastroenteritis, present cross-reactivity against more than one genotype, but not against different genogroups, and are capable of blocking the NoV VLPs binding to saliva.

[This corrects the article DOI: 10.1107/S2052252518012459.]., (© Patricia Casino et al. 2020.)