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Dissertação de Mestrado em Biotecnologia para as Ciências da Saúde A indústria cosmética está em constante crescimento, com produtos aliados a propriedades farmacêuticas, que surgem rapidamente. O Celuvein® é uma loção cosmética com propriedades farmacêuticas (cosmecêutico) para o tratamento e melhoramento da celulite e varizes, dois dos problemas mais preocupantes principalmente para mulheres. Os seus ingredientes incluem o Liporeductyl® (uma formulação com cafeína), Algisium® (silanol, sílica orgânica) e dióxido de titânio (TiO2), um pigmento branco com efeito protetor de raios ultravioleta (UV), sendo um dos mais usados. O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos destes três componentes do Celuvein®, tanto in vivo como in vitro, principalmente o seu potencial citotóxico e genotóxico. Para os estudos in vivo foi usado como modelo animal a Drosophila melanogaster, uma vez que tem várias vantagens para estudos de toxicidade. Foram testados os efeitos na longevidade e prolificidade da Drosophila, bem como o potencial genotóxico, com o teste de mutação e recombinação somática (SMART). Para os estudos in vitro, os efeitos foram estudados em quatro linhas celulares: Caco-2, HaCaT, HepG2 e Raw264.7. A citotoxicidade foi avaliada com base no teste de viabilidade com Alamar Blue, e as células foram expostas durante 24 e 48 h aos compostos. Para determinar a genotoxicidade, foi realizado o ensaio de cometa em ambos os estudos, com neuroblastos de Drosophila nos estudos in vivo, e nas células HepG2 (com e sem FPG) para os estudos in vitro. Os resultados in vivo mostraram que o Liporeductyl® (acima de 1%) é tóxico para as Drosophila, diminuindo o seu tempo de vida e prolificidade, e os resultados do SMART também sugerem que este composto tem efeitos mutagénicos neste modelo animal. No entanto, não foram observados danos no DNA. No geral, o Algisium® e o TiO2 parecem melhorar a longevidade e prolificidade da Drosophila, contudo os resultados da mutagenicidade foram inconclusivos. Os resultados in vitro, semelhante ao observado in vivo, sugerem que o Liporeductyl® é citotóxico em todas as linhas celulares estudadas de um modo dependente da dose, no entanto, nas concentrações testadas no ensaio do cometa em HepG2, não houve qualquer aumento significativo de danos no DNA ou danos oxidativos. O Algisium® foi citotóxico nas células HaCaT, HepG2 e Raw264.7, com recuperação da viabilidade celular quando a exposição por 24 h foi comparada com as 48 h. Os resultados do ensaio do cometa sugerem que a diminuição de viabilidade às 24 h de exposição está relacionada com danos de DNA e danos oxidativos, uma vez que houve um aumento significativo de ambos. O TiO2 foi citotóxico nas células HaCaT e Raw264.7 de um modo dependente da dose. Não houve qualquer dano oxidativo, mas houve um aumento de dano no DNA na concentração mais elevada. Estes resultados demonstram a importância dos testes de cosméticos e cosmecêuticos, não só para comprovar a sua eficácia, mas para o seu potencial citotóxico e genotóxico. É importante considerar que as concentrações testadas não refletem as concentrações dos componentes no Celuvein®, logo não se devem fazer extrapolações diretas. São necessários mais testes para determinar os potenciais efeitos destes componentes no corpo humano. The cosmetic industry is a growing field, with cosmetics starting to emerge with pharmaceutical properties at a fast rate. Celuvein® is a cosmetic lotion with pharmaceutical properties (cosmeceutical) for the treatment and improvement of cellulite and varicose veins, two of the most concerning problems especially for women. Its ingredients include Liporeductyl® (a formulation with caffeine), Algisium® (an organic silicium) and titanium dioxide (TiO2), one of the most vastly used white pigments and UV protectors. The aim of this study was to evaluate the in vivo and in vitro effects of these three components of Celuvein®, especially their cytotoxic and genotoxic potential. For the in vivo studies the Drosophila melanogaster animal model was used, as it has a lot of advantages for toxicity studies. Effects on longevity and prolificacy of Drosophila were tested, as well as the mutagenic potential, with the Somatic Mutation and Recombination Test (SMART). For the in vitro studies, the effects were studied in four different cell lines: Caco-2, HaCaT, HepG2 and Raw264.7. Cytotoxicity was evaluated based on the Alamar Blue viability assay, and cells were exposed to the components for 24 and 48 h. To assess the genotoxic potential of the components, the comet assay was performed in both studies, with Drosophila neuroblasts for the in vivo effects and with HepG2 cells (with and without FPG) for the in vitro effects. The in vivo results showed that Liporeductyl® was toxic for Drosophila, decreasing its lifespan and prolificacy (concentrations above 1%), and the SMART results also suggest that this component has mutagenic effects in this animal model. However, no DNA damage was observed. Algisium® and TiO2, generally, seemed to improve the longevity and prolificacy of Drosophila, and the results of the mutagenicity tested were mainly inconclusive. The in vitro results, similarly to what was observed in vivo, suggest that Liporeductyl® is cytotoxic in all tested cell lines in a dose-dependent mode, though, in the tested concentrations in the HepG2 comet assay, there wasn’t a statistically significant increase in DNA or oxidative damage. Algisium® was cytotoxic in HaCaT, HepG2 and Raw264.7 cells, with a recovery in cell viability when the 24 h of exposure were compared with the 48 h. The comet assay results suggest that the decrease in cell viability at the 24 h of exposure are related to DNA and oxidative damage, being that there was a statistically significant increase in both. TiO2 was cytotoxic to HaCaT and Raw264.7 cells in a dose-dependent way. No significant oxidative damage was present, but there was an increase in DNA damage at the highest tested concentration. These results show the importance of testing cosmetics and cosmeceuticals, not only for their efficacy but also for their cytotoxic and genotoxic potential. It’s important to consider that the tested concentrations don’t reflect the concentrations of the components in Celuvein®, so no direct extrapolation should be done. More tests are necessary to fully assess the potential effects of these components on the human body.

Dissertação de Mestrado em Biotecnologia para as Ciências da Saúde A hipertensão arterial pulmonar (HAP) é uma doença progressiva, caraterizada pela elevação da pressão arterial pulmonar e pela remodelação vascular pulmonar, conduzindo à hipertrofia do ventrículo direito (VD), insuficiência cardíaca e morte. Apesar da disfunção do VD estar intimamente relacionada com a sobrevida, pouco se sabe acerca da adaptação e insuficiência do VD no contexto da HAP. A adenosina é um importante modulador da função cardiovascular, atuando através da ativação dos seus recetores, A1, A2A, A2B e A3. Estudos recentes sugerem o envolvimento da adenosina na HAP, devido ao seu papel na regulação do tónus vascular pulmonar. Contudo, desconhece-se o papel que este nucleósido desempenha na disfunção do VD que ocorre nesta doença. Neste contexto, o principal objetivo deste estudo foi investigar o papel da sinalização da adenosina na disfunção ventricular associada à HAP. Para tal, usou-se um modelo animal de HAP induzida pela monocrotalina. Ratazanas Wistar machos receberam aleatoriamente uma injeção subcutânea de monocrotalina (grupo MCT) ou veículo (grupo CTRL). Os estudos hemodinâmicos, miográficos e a colheita de amostras para análise morfométrica, histológica e para os estudos de imunofluorescência e moleculares foram realizados 21 a 25 dias após a indução do modelo. A avaliação hemodinâmica confirmou a presença de HAP nos animais MCT, traduzida no aumento da pressão sistólica do VD. Além disso, a morfometria cardíaca e pulmonar, bem como a presença de hipertrofia dos cardiomiócitos ventriculares e da camada média das arteríolas pulmonares nestes animais permitiram a validação do modelo. Os estudos funcionais in vitro foram realizados em aurículas a contrair espontaneamente e em tiras de ventrículo direito estimuladas eletricamente, de modo a avaliar o papel dos recetores A1 e A2 da adenosina na função cardíaca. Os resultados obtidos com a R-PIA (0,001-1 μM) agonista seletivo dos recetores A1, e com a NECA (0,01-100 μM), agonista não seletivo, mostraram que os recetores A1 diminuem a frequência (cronotropismo negativo) e a força de contração (inotropismo negativo) auricular, tanto em animais CTRL como MCT. Tanto a ativação dos recetores A2A com o CGS 21680 (0,003-1 μM), como dos recetores A2AB com o BAY 60-6583 (0,01-10 μM) não alteraram a função auricular. No tecido ventricular a ativação dos recetores A1 pela R-PIA e pela NECA não modificou a contratilidade ventricular, apesar de se ter comprovado a presença destes recetores no miocárdio ventricular por experiências de imunofluorescência analisadas por microscopia confocal. De igual forma, a ativação dos recetores A2A pelo CGS 21680 também não alterou a contratilidade ventricular. Por outro lado, o bloqueio dos recetores A2B com o PSB 603 (100 nM) evidenciou um efeito inotrópico positivo da NECA nos animais MCT, sugerindo nestes animais o envolvimento destes recetores num efeito inotrópico negativo. As experiências de imunofluorescência analisadas por microscopia confocal permitiram verificar uma presença ligeira dos recetores A2B no miocárdio de animais CTRL e MCT. Contudo, nos animais com HAP, verificou-se uma presença marcada do recetor A2B em agrupamentos de células existentes no espaço intersticial do VD. Em conclusão, a adenosina parece modular a atividade cardíaca na HAP por intermédio dos seus recetores A1 e A2B, sendo que no futuro importa avaliar a relevância funcional das células intersticiais que expressam recetores A2B. Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a progressive disease characterized by increases in pulmonary arterial pressure and pulmonary vascular remodelling, leading to right ventricle (RV) hypertrophy, heart failure and death. Despite RV dysfunction is closely tied to survival in PAH, little is known about RV adaptation and failure within the context of PAH. Adenosine is an important modulator of cardiovascular function, via the activation of A1, A2A, A2B and A3 receptors. Recent studies have implicated adenosine in PAH, due to its role on the regulation of pulmonary vascular tonus. Nevertheless, the role of this nucleoside in RV dysfunction secondary to this pathology is still unknown. In this context, our main goal was to study the role of adenosine in ventricular dysfunction associated to PAH. To carry out the study, an animal model of monocrotaline-induced PAH was used. Male Wistar rats randomly received monocrotaline (MCT group) or vehicle (CTRL group). Hemodynamic, myographic and sample collection for morphometric, histological, immunofluorescence, and molecular studies were performed 21 to 25 days after monocrotaline administration. Hemodynamic evaluation confirmed the presence of PAH in MCT animals, as demonstrated by the elevation of systolic pressure of RV. Also, cardiac and pulmonary morphometric, and the presence of cardiomyocytes hypertrophy and pulmonary media hypertrophy allowed the validation of the PAH model. In vitro functional studies were performed in spontaneously beating atria and RV strips electrically stimulated to evaluate the role of adenosine A1 and A2 receptors on cardiac function. The results obtained with R-PIA (0,001-1 μM), a selective A1 receptor agonist, and NECA (0,01-100 μM), a non-selective agonist, demonstrated that A1 receptors decrease auricular frequency (negative chronotropic effect) and force of contraction (negative inotropic effect) in both groups. The activation of A2A receptors with CGS 21680 (0,003-1 μM), and A2AB receptors with BAY 60-6583 (0,01-10 μM) did not change the auricular function. At the ventricular level, the activation of A1 receptors with R-PIA and NECA did not change ventricular contractility, in spite of the presence of these receptors in RV myocardium as demonstrated by confocal microscopy. Likewise, the activation of A2A receptors with CGS 21680 had no effect on ventricular contractility. On the other hand, in MCT animals, A2B receptor blockade with PSB 603 (100 nM) resulted in a positive inotropic effect promoted by NECA, suggesting that these receptors could be involved in a negative inotropic effect. Immunolocalization studies confirmed the presence of small amounts of A2B receptors staining in the RV myocardium of both CTRL and MCT animals. However, we only observed in PAH rats a marked expression of this receptor in cells present in the interstitial spaces of RV. In conclusion, adenosine seems to modulate cardiac function in PAH through the activation of A1 and A2B receptors. The functional significance of A2B positive interstitial cells should be evaluated in the near future. Fundação para a Ciência e Tecnologia, e da Unidade Multidisciplinar de Investigação Biomédica - UMIB

Dissertação de Mestrado em Bioquímica O cancro é uma doença que afeta milhares de pessoas em todo o mundo. O papilomavírus humano (HPV) é uma das etiologias de cancro. Muitos pacientes de cancro apresentam inflamação sistémica para o qual existem reduzidas opções terapêuticas. Os polifenóis da dieta têm sido propostos para o seu tratamento, mas o seu potencial contra inflamação sistémica associada com o HPV é desconhecido. Assim, este trabalho tem como principal objetivo avaliar a eficácia a longo-prazo da suplementação oral da curcumina e da rutina em animais transgénicos para o HPV16 (K14HPV16). Neste estudo foram usados 50 murganhos fêmea, dos quais 38 transgénicos (K14HPV16) e 12 wild-type. Às 6 semanas de idade, iniciou-se a administração oral na comida dos compostos, curcumina e rutina Os animais foram sacrificados às 30 semanas, sendo recolhido o sangue, órgãos, e pele. Foram avaliadas as alterações inflamatórias nas lesões cutâneas induzidas pelos transgenes víricos, no sangue, fígado e baço através de análises hematológicas e histopatológicas. Foi também avaliado o stresse oxidativo a nível hepático. A carcinogénese cutânea induzida pelos transgenes do HPV16 esteve associada a progressiva, severa, inflamação sistémica (leucocitose, hepatite e esplenite) e mortalidade significativa. A administração oral de curcumina e rutina suprimiram totalmente a mortalidade enquanto reduziam os leucócitos e a incidência de esplenite e hepatite. Estes resultados levam-nos a concluir que os animais K14HPV16 são um modelo animal útil para estudar a inflamação sistémica associada a cancros induzidos pelo HPV. A administração de polifenóis na dieta podem ser uteis para o tratamento, com a consequente diminuição da inflamação sistémica. Cancer is a disease that affects millions of people worldwide. Human papillomavirus (HPV) is a possible cause of cancer. Many cancer patients have systemic inflammation for which therapeutic options are reduced. The dietary polyphenols have been proposed for its treatment, but its potential against systemic inflammation associated with HPV is unknown. Curcumin and rutin are compounds that are thought to have therapeutic capabilities against HPV. However, there are few studies where the role of these compounds in HPV-associated tumors is shown. The main objective of this work is to study the human papilloma virus type 16 (HPV16), in transgenic animals (K14HPV16), specifically, a study of systemic inflammation induced by HPV 16, and its effects in the liver, as well as the effects of two compounds with potential therapeutic effects, curcumin and rutin. In this study were used 50 female mice, of which 38 are transgenic (K14HPV16) and 12 wild-type. After 6 weeks, it began the study with the compounds, curcumin and rutin which were added to the food. The animals were sacrificed at 30 weeks, the blood, the organs, and the skin tissue, were collected, to evaluate the activity of the compounds, as well as to proceed to the histopathological and biochemical analysis. The skin carcinogenesis induced by transgenes of HPV16 was associated with progressive, severe, systemic inflammation (leukocytosis, hepatitis and splenitis) and significant mortality. Oral administration of curcumin and rutin totally suppressed while reducing the mortality and incidence of leukocytes splenitis and hepatitis. These results lead us to conclude that the K14HPV16 Animals are a useful animal model to study the systemic inflammation associated with cancers induced by HPV. The administration of polyphenols in the diet may be useful for the treatment, with the consequent reduction of systemic inflammation.

Dissertação de Mestrado em Bioquímica A diabetes mellitus é uma doença complexa e potencialmente debilitante, que afeta milhões de indivíduos em todo o mundo e é já considerada um problema de saúde pública pela Organização Mundial de Saúde (OMS). A diabetes tipo 1 é caraterizada pela destruição autoimune das células β pancreáticas dos ilhéus de Langerhans e a diabetes tipo 2 pela resistência periférica à insulina levando ao desenvolvimento da hiperglicemia. A hiperglicemia crónica afeta negativamente a regeneração e remodelação óssea, atrasando assim, a cicatrização óssea e aumentando a suscetibilidade de doenças periodontais. Deste modo, na regeneração guiada de tecidos, é necessária a utilização de um biomaterial adequado que promova a regeneração tecidular em condições diabéticas. Neste estudo, avaliou-se a biocompatibilidade in vivo de uma membrana de colagénio num modelo animal diabético, particularmente, a reação inflamatória aguda (48 h) e crónica (3 semanas) após implantação subcutânea. Neste trabalho foram utilizados 14 ratos machos da estirpe Wistar, divididos em 4 grupos: Controlo (n=3) e Diabetes (n=3) 48h e Controlo (n=3) e Diabetes (n=5) 3 semanas. A condição diabética foi introduzida através da administração intraperitoneal de 50 mg/kg de estreptozotocina (STZ). Foi realizada uma cirurgia no dorso dos animais onde foi efetuada a implantação subcutânea de membranas de colagénio. Um grupo controlo e um grupo com animais diabéticos foram sacrificados 48 horas após a implantação do biomaterial, e os animais dos restantes grupos foram sacrificados 3 semanas após a implantação. Foram recolhidas amostras de pele dos locais de implantação que foram avaliadas por histopatologia, com contagem total e diferencial das células inflamatórias, através da coloração de hematoxilina e eosina (H&E). Para caracterizar o infiltrado inflamatório linfocitário, foi efetuada a técnica de imunohistoquímica (IHQ) com os anticorpos CD3, BLA e CD79. Observamos que o número total de células inflamatórias foi superior nos animais controlo, sendo esta diferença mais acentuada às 48h após implantação. Relativamente à contagem diferencial, verificou-se que às 48h se observa uma maior percentagem de neutrófilos, enquanto nos grupos sacrificados às 3 semanas se obteve uma percentagem superior de linfócitos e macrófagos. Relativamente aos resultados obtidos na IHQ, os animais controlo apresentaram maior percentagem de linfócitos marcados com CD3 (linfócitos T) e menor percentagem de linfócitos marcados com BLA e CD79 (linfócitos B), do que os animais diabéticos. A membrana de colagénio demonstrou ser bastante biocompatível, apresentando uma resposta inflamatória moderada às 3 semanas. Os grupos diabéticos (48h e 3 semanas) apresentaram diferenças na resposta inflamatória em relação aos grupos controlo, nomeadamente no que se refere ao número de células e à sua tipologia. O STZ administrado para induzir a diabetes possui um efeito imunossupressor que pode estar na origem do menor número de células inflamatórias nos animais diabéticos. Ainda não são claros os mecanismos subjacentes ao tipo celular presente no infiltrado inflamatório após implantação da membrana de colagénio em condições diabéticas. No entanto, é possível que a hiperglicemia possa estar na origem do menor número de linfócitos T observado na condição diabética, não afetando a presença de linfócitos B. Deste modo, a diminuição da resposta imune em condições diabéticas pode estar associada fundamentalmente a uma diminuição dos linfócitos T. Diabetes mellitus is a complex and potentially debilitating disease that affects millions of individuals worldwide and it is considered a public health problem by the World Health Organization (WHO). Type 1 diabetes is characterized by autoimmune destruction of pancreatic β cells of the islets of Langerhans, and type 2 diabetes by peripheral insulin resistance leading to the development of hyperglycemia. Chronic hyperglycemia negatively affects bone remodeling and regeneration, delaying bone healing and increasing the susceptibility of periodontal diseases. Therefore, in guided tissue regeneration, the use of a suitable material that promotes tissue regeneration in diabetic conditions is required. In this study, we evaluated the in vivo biocompatibility of a collagen membrane in a diabetic animal model, particularly the acute (48 hours) and chronic (3 weeks) inflammatory reaction after subcutaneous implantation. In this study, 14 male Wistar rats were used, divided into four groups: Control (n=3) and Diabetes (n=3) 48h and Control (n=3) and Diabetes (n=5) 3 weeks. The diabetic condition was introduced via intraperitoneal administration of 50 mg/kg of streptozotocin (STZ). A surgery was performed on the back of the animals, where the implantation of collagen membranes was subcutaneously performed. A control group and one group of diabetic animals were sacrificed 48 hours after the implantation of the biomaterial and the other two groups were sacrificed 3 weeks after implantation. Skin samples of the implantation sites were collected and evaluated by histopathology, with total and differential counts of inflammatory cells, after staining with hematoxylin and eosin (H&E). To characterize the lymphocytic inflammatory infiltrate, immunohistochemistry (IHC) was performed with CD3, CD79 and BLA antibodies. The total number of inflammatory cells was higher in the control animals, with a more evident difference at 48h after implantation. Regarding the differential counts, it was found that at 48h a higher percentage of neutrophils was present, while in the animals sacrificed at 3 weeks, a higher percentage of lymphocytes and macrophages was observed. Regarding the results obtained in IHC, control animals showed a higher percentage of CD3-positive lymphocytes (T lymphocytes) and a lower percentage of BLA and CD79-positive lymphocytes (B lymphocytes) than diabetic animals. The collagen membrane was shown to be highly biocompatible, having a moderate inflammatory response at 3 weeks post implantation. The diabetic groups (48 hours and 3 weeks) showed differences in the inflammatory response compared to control groups, in particular regarding the number of inflammatory cells and their type. STZ has an immunosuppressive effect that may be associated with fewer inflammatory cells in the diabetic animals. The mechanisms underlying cell type presence in the inflammatory infiltrate in diabetic conditions are not yet clear. However, it is possible that hyperglycemia can cause the smaller number of T lymphocytes observed in the diabetic condition, without affecting the presence of B lymphocytes. Therefore, the decrease of the immune response in diabetic conditions might be mainly associated with a decrease in T lymphocytes.

Tese de Doutoramento em Ciências Veterinárias O periodonto é o órgão que envolve e sustenta o dente, sendo constituído pelo osso alveolar que forma o alvéolo dentário, o cemento que envolve a raiz do dente, o ligamento periodontal que estabelece a ligação entre os dois tecidos anteriores formando uma articulação e a gengiva. A periodontite é uma doença inflamatória de elevada prevalência em cães e seres humanos e que, quando não tratada, pode conduzir à esfoliação dentária e colocar em risco a vida do doente devido às manifestações sistémicas decorrentes pela dispersão sanguínea de mediadores inflamatórios e microrganismos patogénicos. Os tratamentos que atualmente se usam para tratar esta patologia revelam-se muitas vezes ineficazes. A Engenharia de Tecidos emergiu, recentemente, como uma potencial terapia alternativa. Esta abordagem consiste no fornecimento de um biomaterial de suporte semeado com células estaminais que visa a regeneração ad integrum da arquitetura e da função biológica do tecido afetado. As células estaminais mesenquimatosas de origem oral e dentária têm a capacidade de regenerar os tecidos periodontais. No entanto, as células provenientes destes locais pressupõem uma morbilidade significativa associada ao local da colheita e possuem um baixo rendimento celular em comparação com fontes não-orais, como por exemplo o tecido adiposo. As células estaminais derivadas do tecido adiposo (ASCs) possuem um grande potencial de aplicação em terapias celulares devido à sua facilidade de colheita e baixa morbidade associada, ao alto rendimento de células isoladas e à capacidade demonstrada para se diferenciarem em inúmeras linhagens celulares. O principal objetivo da presente Tese consistiu no desenvolvimento de uma nova abordagem de Engenharia de Tecidos para o tratamento de defeitos periodontais com base numa matriz biodegradável combinada com ASCs. Partindo do conhecimento de que o cão é o modelo animal mais relevante para estudar a doença periodontal em humanos, pretende validar-se esta estratégia de Engenharia de Tecidos em modelo canino antes da aplicação translacional para a Medicina Humana, sem descuidar nunca que esta doença assume também grande importância na Medicina Veterinária. Tendo isto em consideração, o trabalho desenvolvido nesta Tese teve como principais objetivos:  Otimizar a colheita e o isolamento de ASCs caninas (cASCs) provenientes de diferentes regiões anatómicas e caracterizar a sua estaminalidade e o seu potencial osteogénico em diferentes passagens;  Avaliar a resposta à implantação de cASCs em modelo subcutâneo de murganho saudável;  Desenvolver e caracterizar um material de suporte (scaffold) biodegradável de dupla camada que vise a regeneração de defeitos periodontais;  Avaliar o potencial in vitro do scaffold de dupla camada desenvolvido para uso em Engenharia de Tecidos através da sua cultura com cASCs;  Avaliar a funcionalidade in vivo do scaffold para a regeneração óssea, utilizando um modelo de defeito mandibular em rato. A fim de alcançar os objetivos propostos, numa primeira etapa, as amostras de tecido adiposo canino foram colhidas a partir de duas localizações anatómicas diferentes, a saber, tecido subcutâneo e tecido omental, e o isolamento das cASCs foi posteriormente otimizado. A estaminalidade destas células e o potencial de diferenciação osteogénica foram analisadas ao longo das diferentes passagens através de RT-PCR em tempo real e histologia. Posteriormente, as mesmas cASCs foram xenotransplantadas em murganho, a fim de avaliar a resposta xenogénica do hospedeiro contra as mesmas. Concomitantemente, desenvolveu-se um scaffold composto por uma mistura de amido e poli-ε-caprolactona e compreendendo duas camadas: uma malha tridimensional de fibras (“fiber mesh”) funcionalizadas com grupos silanol para promover a osteogénese ao nível do osso alveolar, e uma membrana obtida por evaporação de solvente com o intuito de atuar como barreira contra a migração de epitélio gengival para o interior do defeito periodontal. Os scaffolds obtidos foram extensivamente caracterizados quanto às suas propriedades mecânicas, ao comportamento de degradação e à eficácia da técnica de funcionalização. De seguida, os scaffolds foram semeados com cASCs a fim de avaliar a funcionalidade in vitro das construções obtidas. Como forma de avaliar a capacidade dos scaffolds desenvolvidos para promover a regeneração óssea, estes foram implantados num defeito circular de tamanho crítico induzido na mandíbula do rato, e a formação de novo osso foi determinada após oito semanas de implantação. Em geral, a estaminalidade e o potencial de diferenciação osteogénica das cASCs decresceu ao longo de passagens. Além disso, demonstrou-se também que a origem anatómica do tecido adiposo tem um efeito significativo nas duas características analisadas. Após a injeção de cASCs num hospedeiro xenogénico (murganho), não foi observada nenhuma resposta inflamatória local exuberante contra as mesmas. A caracterização físico-química do scaffold desenvolvido demostrou que esta matriz apresenta uma morfologia, composição da superfície, comportamento de degradação e propriedades mecânicas adequadas para auxiliar a regeneração periodontal. Os estudos biológicos com cASCs revelaram o potencial que ambas as camadas têm de permitir a adesão e proliferação celular, bem como de promover a diferenciação osteogénica na malha funcionalizada. Nos defeitos mandibulares experimentais, o scaffold funcionalizado com grupos silanol induziu uma maior formação de osso novo em comparação com a membrana comercial de colagénio e com os defeitos vazios. Além disso, a face composta pela membrana evitou o crescimento do tecido epitelial e conjuntivo para o interior do defeito, o qual é um dos requisitos para o sucesso da regeneração guiada de tecidos. Em resumo, este trabalho demonstrou que o tecido adiposo canino fornece uma fonte alternativa de células estaminais com capacidade de diferenciação osteogénica e que estas não induzem uma resposta inflamatória exuberante no hospedeiro xenogénico. Estes resultados, juntamente com o potencial observado do scaffold desenvolvido para acomodar a proliferação e diferenciação das cASCs cultivadas e para promover a regeneração de osso in vivo, permite propor esta construção como uma alternativa às técnicas atualmente utilizadas na regeneração periodontal, tanto no homem como no cão. Periodontium is the organ which involves and sustains the tooth and it is constituted by the alveolar bone which forms the dental alveolus, the cementum which surrounds the tooth root, the periodontal ligament, which connects them and form a joint, and the gingiva. Periodontitis is an inflammatory pathology highly prevalent in both dogs and humans that, when not treated, can lead to tooth exfoliation and also to life threatening systemic implications due to the blood dispersion of inflammatory mediators and pathogenic microorganisms. The routine clinical therapies currently used to treat periodontal defects are often ineffective. Tissue Engineering has emerged as a valuable alternative approach aiming to regenerate ad integrum the architecture and the biological function of the damaged tissue by providing the repair site with a suitable supportive biomaterial seeded with stem cells. Mesenchymal stem cells from oral and dental origin have the ability to regenerate the periodontium; however, harvesting cells from these sites implies significant local tissue morbidity and low cell yield, as compared to non-oral sources, such as the adipose tissue. Adipose-derived stem cells (ASCs) hold a great potential in cell based therapies for their easiness of harvesting with low morbidity, generating high yields of cells with capacity to differentiate into several lineages. The main goal of this Thesis was to develop a new Tissue Engineering approach for the treatment of periodontal defects, based on an innovative biodegradable supportive matrix combined with ASCs. As the dog is the most relevant animal model to study human periodontal disease and, simultaneously, an important subject in Veterinary Medicine, we envisioned to validate this Tissue Engineering strategy in a canine model prior to the translation of this strategy for human application. With this in mind, the work aimed to achieve the following distinct objectives:  Optimize harvesting and isolation of canine ASCs (cASCs) from different anatomical regions and characterize their stemness and osteogenic potential at different passages;  Evaluate the response to the implantation of cASCs in a healthy mice subcutaneous model;  Develop and characterize a double layer biodegradable scaffold meeting the requirements to achieve different functionalities, targeting regeneration of periodontal defects;  Evaluate the potential of the developed double layer scaffold for Tissue Engineering by culturing it with cASCs,  Assess the in vivo functionality of the scaffold for bone regeneration, using a rat mandibular defect model. In order to achieve the proposed objectives, in a first stage, canine adipose tissue samples were harvested from two different anatomical sites, namely subcutaneous and omental adipose tissue, and the isolation of cASCs was optimized. The stemness and the osteogenic differentiation potential of these cells were analyzed along passages using real time RT-PCR and staining procedures. Subsequently, the same stem cells were xenotransplanted (into a mouse model) in order to evaluate the response of the xenogenic host against the cASCs. Concomitantly, a double layer scaffold made of a blend of starch and poly (ε-caprolactone) was designed, comprising a 3D fiber mesh functionalized with silanol groups to promote osteogenesis and a solvent casting membrane aiming to act as a barrier against the migration of gingival epithelium into the periodontal defect. The obtained scaffolds were extensively characterized regarding their mechanical properties, degradation behaviour and effectiveness of the functionalization. Ultimately, the scaffolds were seeded/cultured with cASCs to assess the in vitro functionality of the obtained constructs. Finally, to assess the ability of the developed scaffold to promote bone regeneration, these were implanted in a circular critical size defected induced in rat mandible, and the formation of new bone was quantified after 8 weeks of implantation. In general, the stemness and osteogenic differentiation potential of the cASCs was found to decrease along increasing passages. Additionally, it was shown that the anatomical origin of the adipose tissue has a significant effect in the osteogenic differentiation ability of these cells. After the injection of cASCs in a xenogenic host (mouse), it was proved that no significant local immunogenic response was detected against them. The physicochemical characterization of the newly developed double layer scaffold showed that this matrix presents a morphology, surface composition, degradation behaviour and mechanical properties suitable for assisting periodontal regeneration. The biological studies with cASCs revealed the potential of both layers to allow cellular adhesion and proliferation, and also to promote the osteogenic differentiation on the functionalized fiber mesh. In the induced mandibular defect, the functionalized scaffold with silanol groups was shown to enhance higher new bone formation in comparison to a collagen commercial membrane and to empty defects. Moreover, the membrane layer was observed to avoid the epithelial and connective tissue ingrowth, which is one of the main requirements for guided tissue regeneration. In summary, this work demonstrated that the canine adipose tissue provides an alternative source of stem cells with the ability to differentiate into different cellular lineages and which do not induce an in vivo inflammatory response in the xenogeneic host. These findings together with the observed potential of the developed scaffold to accommodate the proliferation and differentiation of the cultured cASCs and to enhance in vivo bone regeneration allows to propose this tissue-engineered matrix for periodontal regeneration as an alternative to the techniques currently used in the dentistry field, both in human and in veterinary medical practice.

Dissertação de Mestrado em Biologia Clínica Laboratorial Patologias do tecido ósseo, originárias de várias causas, nomeadamente traumas, infeções ou doenças ósseas, são muito comuns na nossa sociedade. Na situação de diabetes mellitus, estes defeitos ósseo estão agravados e o seu tratamento apresenta uma maior dificuldade para os clínicos. Nos últimos anos a nanotecnologia tem fornecido variadíssimos benefícios no campo da engenharia do tecido ósseo, no entanto nenhuma das soluções tem resolvido totalmente os diversos desafios que pressupõem a reparação óssea. Desta forma, têm sido estudadas novas soluções terapêuticas para resolver este problema, e o desenvolvimento de novos biomateriais fabricados com nanopartículas que simulem a estrutura e composição do osso, favorecendo a sua regeneração, têm sido equacionados. Assim este trabalho tem como principal objetivo o estudo da biocompatibilidade de uma preparação de nanopartículas de hidroxiapatite (NanoXIM•HAp102®) na condição de diabetes, usando para tal um modelo de implante subcutâneo em ratos Wistar. Neste estudo foram usados 16 ratos machos da estirpe Wistar, dos quais 10 foram submetidos à indução da diabetes, por via intraperitonial, com uma única administração de 55 mg/Kg de estreptozotocina (STZ), sendo os restantes injetados com soro tampão citrato (grupo controlo). Duas semanas após a indução da diabetes, implantou-se subcutaneamente em todos os animais 0,5 ml de suspensão de nanopartículas de hidroxiapatite (nano-HAp). Os animais foram sacrificados às 48h e 3 semanas, sendo recolhido o sangue, órgãos, e tecido subcutâneo com a nano-HAp, para avaliar a atividade e expressão de variados marcadores séricos, assim como proceder à análise histopatológica. Os animais diabéticos apresentaram uma diminuição do peso corporal e um aumento do peso relativo dos rins e do fígado quando comparado com os respetivos grupos controlo. Os valores dos marcadores de função renal, ureia e creatinina, e das enzimas hepáticas ALT e FA, encontraram-se elevados nos animais diabéticos comparativamente com os controlos. Às 48h, verificou-se a existência de uma resposta inflamatória aguda, com presença de neutrófilos e linfócitos, e uma resposta inflamatória crónica caracterizada pela presença de macrófagos e células gigantes, às 3 semanas. Tanto a resposta inflamatória, como a reabsorção das nanopartículas encontraram-se diminuídas nos grupos diabéticos comparativamente com o respetivo grupo controlo. Constatou-se a presença de uma cápsula fibrosa nos grupos experimentais das 3 semanas, sendo que esta foi menor no grupo diabético comparativamente com o respetivo grupo controlo. Observou-se ainda alguma agregação de nano-HAp, tendo esta sido mais intensa em ambos os grupos diabéticos, e dentro destes maior às 3 semanas. Uma vez que não se verificou uma reação exacerbada e que ocorreu reabsorção do biomaterial, sem sinal de toxicidade hepática ou renal, na quantidade testada, podemos concluir que as nano-HAp não apresentam toxicidade. Embora se tenha observado reabsorção das nano-HAp ao longo do período experimental, constatou-se que este processo era bastante mais lento nas condições diabéticas. Pathologies of bone tissue, that are provided from different causes, including trauma, infections or bone diseases, are very common in our society. In the specific case of diabetes mellitus, the bone defects are intensified and its treatment presents a major difficulty for clinicians. Actually, nanotechnology provides many different benefits in the field of bone tissue engineering, however, any solutions have completely solved the challenges that require bone repair. In this way, it has been studied new therapeutic solutions to solve this problem, the development of new biomaterials made from nanoparticles that acquire a similar structure and composition of the original bone, promoting regeneration, have been solved. The main objective of this work is the study of the biocompatibility, of hydroxyapatite nanoparticles (NanoXIM • HAp102 ®) in diabetic conditions, using for such a model of subcutaneous implantation in Wistar rats. This study used 16 male rats of the Wistar strain, 10 of which were subjected to induction of diabetes with single intraperitoneally administration of 55 mg / kg streptozotocin (STZ), and the remaining were injected with physiological serum (the control group). After the induction of diabetes, was subcutaneously implanted 0,5 ml hydroxyapatite nanoparticles (nano-HAp). The animals were sacrificed at 48 hours and 3 weeks, being collected the blood, organs, and subcutaneous tissue, with nano-Hap, to evaluate the expression and the activity of various serum markers, as well as the histopathology. Diabetic animals showed a decrease in body weight and an increase in the relative weight of the liver and kidneys when compared with the respective control groups. The values of markers of renal function, urea and creatinine, and liver enzymes ALT and FA, were also higher in diabetic animals compared with control. At 48 h, it was found a several inflammatory response with neutrophils and lymphocytes, and a chronic inflammatory response characterized by the presence of macrophages and giant cells, at 3 weeks. The inflammatory response and the reabsorption of the nanoparticles were found decreased in diabetic group compared with the respective control group. It was observed the presence of a fibrous capsule in the experimental groups of the 3 weeks, but it was lower in the diabetic group as compared to the respective control group. There was also some aggregation of nano-Hap, that was more intense in both diabetic groups, and within these higher at 3 weeks. With the quantity tested, there has not been observed an overreaction and the biomaterial reabsorption occurred without signs of hepatic or renal toxicity. Although we observed a progressive reabsorption of nano-HAp throughout the experimental period, this process was significantly slower in diabetic conditions.

Dissertação de Mestrado em Biotecnologia para as Ciências da Saúde A diabetes mellitus é uma patologia heterogénea, caracterizada por alterações endócrino-metabólicas da homeostasia da glicose plasmática. A associação entre esta doença metabólica e a afeção do metabolismo do tecido ósseo tem sido alvo de estudo aprofundado na literatura científica. Apesar das evidências obtidas em diversos estudos experimentais e clínicos, o conhecimento da influência desta condição no processo de regeneração óssea é ainda escasso. Este trabalho teve como objetivo avaliar a influência da diabetes mellitus experimental, induzida pela estreptozotocina, no processo de regeneração de defeitos ósseos subcríticos, na tíbia de rato. Simultaneamente avaliou-se o efeito da implantação de uma membrana de colagénio tipo I, reabsorvível, no processo de regeneração óssea guiada. Foram utilizados 34 Rattus norvegicus, os quais foram divididos em quatro grupos: Diabetes 2 semanas (D2S), Controlo 2 semanas (C2S), Diabetes 6 semanas (D6S) e Controlo 6 semanas (C6S), de acordo com o tempo de regeneração do defeito criado cirurgicamente. A condição diabética foi induzida pela administração intraperitonial de estreptozotocina (STZ), na dose de 60mg/Kg. Duas semanas após a indução da diabetes experimental, e confirmação do estado diabético, foi efetuado um defeito ósseo monocortical subcrítico de 1,4mm de diâmetro nas tíbias de todos os animais. Nas tíbias esquerdas foi aplicada uma membrana reabsorvível de colagénio tipo I, de forma a avaliar o processo de regeneração óssea guiada. Durante toda a atividade experimental foram avaliados o consumo de água e alimento, bem como os pesos corporais dos animais de todos os grupos. No final de cada período experimental, 2 e 6 semanas após a realização dos defeitos ósseos, os animais foram sacrificados, os órgãos internos foram pesados e as tíbias foram recolhidas para análise radiográfica, microtomográfica e histológica. Neste trabalho verificou-se que a administração de STZ induziu a condição diabética em todos os animais dos grupos D6S e D2S. Estes grupos consumiram muito mais água e alimento, relativamente aos seus controlos. Observou-se também que estes grupos apresentaram uma perda de peso estatisticamente significativa. Relativamente aos pesos dos órgãos, verificou-se que, nos grupos diabéticos, o fígado, coração e baço apresentaram peso inferior e os rins um peso superior aos controlos respetivos. Os animais diabéticos manifestaram também alterações da microestrutura óssea: redução de densidade e volume ósseo e maior separação entre trabéculas, ao nível do osso trabeculado da tíbia. Relativamente à avaliação do processo de regeneração óssea verificou-se que, ao longo do tempo, o defeito foi progressivamente regenerado em ambos os grupos experimentais – atingindo a regeneração completa às 6 semanas. No entanto, os animais diabéticos apresentaram um processo regenerativo mais lento que o verificado nos animais controlo, mesmo com a aplicação de técnicas de regeneração óssea guiada – implantação cirúrgica da membrana. Nos locais em que a membranas foi implantada verificou-se um crescimento exofítico de tecido ósseo, não só na região do defeito mas também na superfície do osso adjacente, nos animais do grupo controlo e do grupo diabético. Este tecido apresentava características morfológicas de osso imaturo, com elevada densidade de trabéculas e porosidade. A condição diabética parece afetar significativamente o processo de regeneração óssea, mesmo na presença de técnicas de regeneração óssea guiada, atrasando a regeneração do defeito criado. Diabetes mellitus is a heterogeneous disorder characterized by endocrine-metabolic changes of the homeostasis of plasma glucose. The association between this metabolic disease and the metabolic condition of the osseous tissue has been the subject of extensive scientific studies. Despite evidence obtained in several experimental and clinical studies, knowledge of the influence of this condition in the process of bone regeneration is still scarce. This study had the objective of evaluate the influence of experimental diabetes induced by streptozotocin (STZ) in the process of regeneration of subcritical bone defects of the tibiae in rats. Simultaneously, the effect of the implantation of type I collagen reabsorbable membrane, in the process of guided bone regeneration, has been evaluated. In this study, 34 Rattus norvegicus were used, which were divided into four groups: Diabetes 2 Weeks (D2W), Control 2 Weeks (C2W), Diabetes 6 Weeks (D6W) and Control 6 Weeks (C6W) according with the regeneration time of the surgically created defect. The diabetic state was induced by the intraperitoneal administration of STZ at a 60mg/kg dose. Two weeks after the induction of experimental diabetes and diabetic status confirmation, a subcritical monocortical bone defect of 1.4 mm of diameter was made on the tibiae of all animals. In the left tibiae a reabsorbable type I collagen membrane was applied, in order to evaluate the process of guided bone regeneration. Throughout the experiment the consumption of food and water and the body weights of the animals of all groups were assessed. At the end of each experimental period, 2 and 6 weeks after the execution of bone defects, the animals were sacrificed, the internal organs were weighed and the tibiae were harvested for radiographic, histological and micro tomographic studies. In this study it was verified that the administration of STZ induced the diabetic condition in all animals from groups D2W and D6W. The animals from these groups consumed more food and water than the animals from their control groups. It was also observed that the animals from these groups showed a statistically significant weight loss. With regard to the weights of the organs it was found that, in animals from diabetic groups, liver, heart and spleen showed a lower weight than the ones from control animals and kidneys showed a higher weight than the ones from respective control animals. Diabetic animals also showed bone microstructure changes: decrease of the density and bone volume and a higher separation between trabeculae at the level of the trabecular bone of the tibia. Regarding the evaluation of the process of bone regeneration was found that, over time, the defect was gradually regenerated in both experimental groups - achieving complete regeneration at 6 weeks. However, diabetic animals showed a regenerative process slower than the observed in control animals, even with the application of guided bone regeneration techniques - surgical implantation of the membrane. In places where the membrane has been deployed, an exophytic growth of bone tissue was observed, not only at the region of the defect but also on the surface of the adjacent bone on both control and diabetic animals groups. This tissue showed morphological characteristics of immature bone, with high density of trabeculae and porosity. The diabetic condition seems to affect significantly the process of bone regeneration, even in the presence of techniques for guided bone regeneration, delaying the regeneration of the created defect.

Dissertação de Mestrado em Biologia Clínica Laboratorial A glândula tiróide produz as hormonas tiroxina (T4) e triiodotironina (T3) sob estimulação pela hormona tirotropina (TSH). Existem situações de disfunção tiroideia (hipotiroidismo e hipertiroidismo) cujo diagnóstico e monitorização dependem dos exames laboratoriais efetuados, além da avaliação clínica. O objetivo deste estudo foi proceder ao doseamento das hormonas TSH e T4 livre (FT4) em 111 doentes com patologia tiroideia já diagnosticada, utilizando dois equipamentos com metodologias semelhantes (Abbott ARCHITECT® i2000 - Quimioluminescência e Roche Cobas® 6000 – Eletroquimioluminescência) baseadas respetivamente, em reações químicas e reações elétricas, ambas geradoras de luminescência. Obteve-se concordância para as duas metodologias no doseamento da hormona TSH e inexistência de concordância para o doseamento de FT4. Thyroid gland produces thyroxine (T4) and triiodothyronine (T3) hormones upon stimulation by thyrotropin (TSH) hormone. There are situations of thyroid dysfunction (hypothyroidism and hyperthyroidism) which diagnosis and monitoring rely on laboratory tests performed beyond clinic evaluation. The objective of this study was to proceed to the measurement of TSH and free T4 (FT4) hormones in 111 patients with thyroid disease already diagnosed, using two equipments with similar methodologies (Abbott ARCHITECT® i2000 - Chemiluminescence and Roche Cobas® 6000 - Electrochemiluminescence) based respectively, in chemical reactions and electrical reactions, both giving rise to luminescence. It was obtained agreement for the two methodologies in the determination of TSH hormone and no agreement for the determination of FT4.

Tese de Doutoramento em Ciências Veterinárias O cancro é uma doença que afeta milhões de pessoas em todo mundo. De acordo com a Organização Mundial de Saúde uma em cada oito mortes é provocada por cancro. Numa escala global, esta doença provoca mais mortes do que a combinação de doenças como a síndrome de imunodeficiência adquirida, a tuberculose e a malária. O cancro da bexiga é o sétimo tumor mais comum no homem e o segundo quando nos concentramos no trato urogenital, sendo precedido apenas pelo cancro da próstata. Exibe predisposição sexual, sendo o homem cerca de quatro vezes mais afetado do que a mulher. Em termos histológicos, a maioria dos tumores da bexiga são superficiais, limitados à mucosa, submucosa ou lâmina própria. O carcinoma invasivo é menos frequente, no entanto assume uma grande importância clínica, dado o seu difícil tratamento, a elevada possibilidade de metastização e em consequência, ter um prognóstico reservado. O modelo animal de carcinoma invasivo da bexiga induzido pela administração prolongada na água de bebida da N-butil-N-(4-hidroxibutil)nitrosamina (BBN) a murganhos é excelente para a investigação em oncologia urológica, porque permite avaliar a ação de novos agentes terapêuticos ou profiláticos e estudar os mecanismos biopatológicos associados ao crescimento, invasão e metastização dos tumores. Foram objetivos desta tese de doutoramento avaliar o efeito terapêutico de alguns fármacos, isolados ou combinados (gencitabina, sirolimus, everolimus), no modelo invasivo do cancro da bexiga em murganhos; avaliar a ação in vitro do everolimus em linhas celulares humanas de tumores de bexiga (T24; HT1376; 5637); avaliar o stresse oxidativo hepático e mitocondrial induzido pela BBN e ainda estudar a expressão da caderina E e da β catenina nas lesões uroteliais induzidas pela BBN. Para a realização da componente prática foram utilizados 106 murganhos macho da estirpe ICR, 86 dos quais foram expostos à BBN durante 12 semanas. Destes, 60 foram divididos em 4 grupos de 15 animais, para avaliar o efeito terapêutico dos fármacos acima mencionados. Os restantes 26 animais fizeram parte do grupo controlo. A gencitabina e o sirolimus foram administrados por via intraperitoneal e o everolimus foi administrado por via oral. Todos os animais foram sacrificados no final do trabalho experimental e submetidos a necrópsia. Os resultados obtidos permitem-nos afirmar que o uso isolado da gencitabina e do sirolimus diminui a incidência das lesões uroteliais quimicamente induzidas, no entanto, a sua associação, no mesmo modelo, não teve qualquer efeito. O everolimus não teve efeito significativo na diminuição da incidência das lesões uroteliais quimicamente induzidas pela BBN. Os resultados do ensaio in vitro obtidos com o everolimus foram variáveis, havendo resultados promissores apenas na linha celular 5637. No que diz respeito às alterações hepáticas induzidas pela BBN podemos afirmar que histologicamente não foram observadas lesões, no entanto, foi detetado um aumento do stresse oxidativo mitocondrial que poderá favorecer a hepatotoxicidade quando a BBN é associada a fármacos sujeitos a biotransformação hepática. Neste modelo, as informações relativas à expressividade da caderina E e β catenina, moléculas de adesão celular, são escassas. Nesse sentido, ambas as moléculas foram avaliadas em cortes histológicos do urotélio normal, de lesões préneoplásicas e neoplásicas. Na hiperplasia simples e nodular, predominou o padrão identificado no urotélio normal (marcação membranar). Nas lesões displásicas predominou o padrão citoplasmático. Nos carcinomas invasivos observámos um padrão heterogéneo, com a coexistência de marcação citoplasmática e nuclear e por vezes também membranar. A análise da expressividade destas moléculas permitiunos concluir que, à semelhança do que está descrito no Homem, também em murganhos estas podem ser consideradas como indicadoras do grau de agressividade e da evolução do tumor. Cancer is a devastating disease affecting millions of people all over the world. According with World Health Association, worldwide one in eight deaths is due to cancer. In a global scale, cancer causes more deaths than acquired immunodeficiency syndrome, tuberculosis, and malaria combined. Bladder cancer is the seventh most common tumour in man, and the second most common tumour of the genitourinary system, being preceded only for prostate cancer. It has sexual predisposition, with males being up to four times more affected than females. Histologically, the majority of bladder tumours are superficial, confined to mucosa, submucosa or lamina propria. Invasive carcinoma is less frequent, however it assumes great clinical importance, since it is difficult to treat, metastasis is a strong possibility and the prognosis is less favourable. Mice model of invasive bladder cancer, induced by oral administration of Nbutyl- N-(4-hydroxybutyl)nitrosamine (BBN) in drinking water, is a good and widely used research model for urologic oncology. It allows the evaluation of new therapeutic or prophylactic agents and also to study the basic mechanisms of tumour growth, invasion and metastasis. In this thesis we evaluate the therapeutic efficiency of several drugs (gemcitabine, sirolimus, everolimus) alone or in combination in chemically induced bladder cancer in male mice. Everolimus was also analysed in vitro, in three different bladder cancer cell lines, two invasive (T24; HT1376) and one superficial (5637). Hepatic and mitochondrial oxidative stress induced by BBN and the analysis of Ecadherin and β-catenin were also executed. 106 male ICR mice were used during experimental work. 86 of them were exposed to BBN for 12 weeks, and from these, 60 were divided into four groups of 15 animals each, to analyse the therapeutic effects of drugs. The remaining 26 mice were used as control animals. Gemcitabine and sirolimus were administered by intraperitoneal route. Everolimus was administered by gavage. All animals were euthanized at the end of the experimental work and submitted to a complete necropsy. According to our results, gemcitabine and sirolimus used as single agents, reduce the incidence of chemically induced urothelial lesions in mice. However, their combination did not add any improvement regarding urothelial incidence. Everolimus showed no significant effect in decreasing urothelial lesions incidence. In vitro, its effect on proliferation and apoptosis across different bladder cancer cell lines was heterogeneous. Promissory results were seen only in cell-line 5637. BBN is metabolized mainly in liver. Regarding hepatic changes induced by BBN, we can say that liver histological evaluation did not show any microscopic changes compatible with liver stress, however mitochondrial oxidative stress was detected. This can lead to hepatotoxicity, when BBN is combined with drugs with liver biotransformation. E-cadherin and β–catenin are adhesion molecules that were evaluated in control mice and in mice exposed to BBN. In simple and nodular hyperplasia, membrane staining was dominant. In dysplasia, cytoplasmic pattern was prevalent and in invasive carcinomas a heterogeneous staining was observed (cytoplasmic, nuclear and membrane staining). Like in man, also in mice these adhesion molecules can be considered as indicators of tumour aggressiveness and evolution.

Tese de Doutoramento em Ciências Veterinárias, Biomedicina O cancro da bexiga é um problema de saúde pública mundial extremamente relevante. Apesar dos avanços registados no seu tratamento, as taxas de morbilidade e mortalidade continuam elevadas, tornando premente a necessidade de novas abordagens terapêuticas. O mammalian target of rapamycin (mTOR) é considerado uma nova e promissora terapia alvo essencialmente devido à sua interferência no desenvolvimento do cancro. O objetivo deste estudo foi analisar a atividade antineoplásica de três inibidores do mTOR (sirolimus, everolimus e temsirolimus), assim como a sua capacidade em aumentar a ação da gemcitabina e da cisplatina, em três linhas celulares tumorais da bexiga humana: 5637(não invasiva), T24 e HT1376 (invasivas). Para atingir os objetivos propostos foi fundamental proceder a uma caracterização mais completa destas linhas celulares por citogenética convencional, hibridação in situ fluorescente, hibridação genómica comparativa por array e multiplex ligation-dependent probe amplification. O efeito do fármaco sirolimus foi testado na linha celular T24; o efeito dos fármacos everolimus, temsirolimus, gemcitabina e cisplatina, isolados e combinados, foram avaliados nas três linhas celulares. Após 72 horas de exposição aos fármacos a proliferação celular, a morfologia celular, os danos no DNA, a distribuição das células pelo ciclo celular, a apoptose e a autofagia foram analisados utilizando o 3-(4,5-dimetiltiazol- 2-il)-2,5 difenil-tetrazólio e a expressão do Ki-67, a coloração Leishman, o terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling e a técnica dos cometas, a citometria de fluxo, o M30CytoDEATH anticorpo e a monodansilcadaverina, respetivamente. Além disso, a expressão do mTOR, do AKT e das suas formas fosforiladas foram analisadas por western blot nas três linhas celulares, após o tratamento com o everolimus e o temsirolimus. In vivo as investigações preliminares com everolimus foram realizadas utilizando o modelo de cancro da bexiga de murganho quimicamente induzido pela N-butil-N-(4-hidroxibutil) nitrosamina. As linhas celulares utilizadas neste estudo representam os dois subtipos mais comuns de cancro da bexiga: a linha celular T24 representa um subtipo FGFR3/CCND1, enquanto as linhas celulares 5637 e HT1376 representam o outro subtipo com o perfil mutacional E2F3/RB1. A linha celular 5637 tem um fenótipo menos agressivo enquanto a HT1376 é ilustrativa de um perfil mais invasivo. No que concerne ao efeito dos fármacos testados, o sirolimus foi eficaz em reduzir a proliferação celular da linha T24. O everolimus induziu uma inibição ligeira da proliferação celular apenas na linha 5637, bem como uma moderada indução de apoptose, danos no DNA e acumulação na fase G0/G1 do ciclo celular. No modelo in vivo o everolimus não interferiu no desenvolvimento das lesões uroteliais. O temsirolimus isolado reduziu significativamente a proliferação celular, provocou uma acumulação das células na fase G0/G1 do ciclo celular, aumentou a apoptose e a autofagia. Estes efeitos ocorreram nas três linhas celulares. Não houve diferenças significativas na expressão do mTOR, AKT e nas suas formas fosforiladas em todas as linhas celulares após a exposição ao everolimus e ao temsirolimus. Em relação à associação de fármacos, o everolimus melhorou significativamente os efeitos da gemcitabina e da cisplatina. Nas três linhas a proliferação celular foi reduzida, ocorrendo a paragem do ciclo celular na fase G0/G1 e o aumento da apoptose e danos no DNA. As linhas celulares 5637 e T24 foram as mais sensíveis à combinação do everolimus e da gemcitabina. Por sua vez, no tratamento combinado do everolimus e da cisplatina, as linhas celulares 5637 e a HT1376 apresentaram os melhores resultados. A resposta foi mais evidente na combinação do temsirolimus, quer com a gemcitabina quer com a cisplatina, do que com o temsirolimus isolado. Ocorreu uma menor proliferação celular, uma paragem do ciclo celular na fase G0/G1 mais evidente e um aumento da apoptose e da autofagia. Observou-se um padrão semelhante ao obtido na conjugação da gemcitabina e da cisplatina com o everolimus, sendo a 5637 e a T24 as linhas celulares mais sensíveis à conjugação do temsirolimus com gemcitabina e as linhas 5637 e HT1376 as que melhor responderam à conjugação do temsirolimus com cisplatina. Verificou-se que a linha celular não invasiva 5637 foi sempre a mais sensível a todos os fármacos. Observou-se igualmente que as combinações com a cisplatina (everolimus mais cisplatina ou temsirolimus mais cisplatina) foram sempre mais eficazes. Em conclusão, demonstrou-se que as linhas celulares utilizadas neste estudo são representativas do cancro da bexiga humana, sendo, portanto, uma ferramenta importante e muito útil na investigação terapêutica destes tumores. O uso individual dos inibidores do mTOR revelou-se pouco eficaz, particularmente nas linhas celulares invasivas T24 e HT1376. Os resultados obtidos na linha não invasiva 5637 sugerem o everolimus e o temsirolimus como terapias alternativas a estudar, em particular nos tumores não invasivos que não respondem às terapêuticas disponíveis. Quando usados em combinação com os fármacos atualmente utilizados (cisplatina e gemcitabina) no tratamento do carcinoma da bexiga, o resultado obtido nas três linhas tumorais foi nitidamente superior. O presente estudo mostra que, dependendo do perfil genético do tumor, as conjugações dos inibidores do mTOR (everolimus e temsirolimus) com a gemcitabina e com a cisplatina podem no futuro ser potenciais regimes terapêuticos no carcinoma da bexiga. Urinary bladder cancer is a relevant worldwide public health problem. Despite treatment advances, morbidity and mortality rates remain high and new approaches are needed. The mammalian target of rapamycin (mTOR) is considered a new promising targeted therapy primarily due to its interference in the development of cancer. The aim of this study was to analyze the antineoplastic effect of three mTOR inhibitors (sirolimus, everolimus and temsirolimus), and their ability to enhance gemcitabine and cisplatin activity, on three human urinary bladder cancer cell lines: 5637 (non-muscle-invasive), T24 and HT1376 (muscle-invasive). To achieve the proposed objectives it was essential to further characterize these cell lines by conventional cytogenetic, fluorescence in situ hybridization, array comparative genomic hybridization and multiplex ligation-dependent probe amplification. The effect of the sirolimus drug was tested on the T24 cell line; the effect of the everolimus, temsirolimus, gemcitabine and cisplatin drugs, alone and in combination, were evaluated in all three cell lines. After 72 hours of drug exposure cell proliferation, cell morphology, DNA damage, cell cycle distribution, apoptosis and autophagy were analysed using the 3-[4,5- dimethyl-2-thiazolyl]-2,5-diphenyltetrazolium and Ki-67 expression, Leishman staining, terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling and comet assay, flow cytometry, M30CytoDEATH antibody and monodansylcadaverine, respectively. Furthermore, the expression of mTOR, AKT and their phosphorylated forms were investigated by western blot on the three cell lines, after everolimus and temsirolimus treatment. In vivo, preliminary investigations with everolimus were also performed using the urinary bladder mouse cancer of chemically induced by N-butyl-N-(4-hydroxybutyl) nitrosamine model. We found that the cell lines used in this study cover the two most common subtypes of urinary bladder cancer: the T24 cell line represents a FGFR3/CCND1 subtype, while the 5637 and the HT1376 represents the E2F3/RB1 pathway mutational profile. The 5637 cell line is representative of a less aggressive phenotype, whereas the HT1376 is illustrative of a more invasive profile. Regarding the effect of the drugs tested, sirolimus was effective in reducing cell proliferation on the T24 cell line. Everolimus induced a slight inhibition of cell proliferation only on the 5637 cell line, and a moderate induction of apoptosis, DNA damage and accumulation in the G0/G1 phase of the cell cycle. In in vivo experiment everolimus did not interfered with the development of urothelial lesions. Temsirolimus, isolated, induced a significant decrease of cell proliferation, caused an accumulation of cells in G0/G1 phase, increased apoptosis and autophagy. These effects occurred on the three cell lines. No significant differences in the expression of mTOR, AKT and their phosphorylated forms were found in all cell lines after everolimus and temsirolimus exposure. Regarding the association of drugs, everolimus significantly improved the effects of gemcitabine and cisplatin: in all cell lines a reduced cell proliferation was observed, with arrest of cell cycle at G0/G1 phase with increased apoptosis and DNA damage. The 5637 and the T24 cell lines were more sensitive to the combination of everolimus and gemcitabine. In turn, for the combined treatment of cisplatin and everolimus, the 5637 and the HT1376 cell lines showed the best results. A more evident response was obtained with temsirolimus in combination with either gemcitabine or cisplatin than with temsirolimus isolated. There was less cell proliferation, a more apparent cell cycle arrest in G0/G1 phase and an increase in apoptosis and autophagy. We observed a pattern similar to that obtained on the combination of everolimus with gemcitabine and cisplatin: the 5637 and the T24 cell lines were more sensitive to the combination temsirolimus with gemcitabine and the cell lines 5637 and HT1376 presented a better response to temsirolimus combination with cisplatin. It was found that the non-muscle-invasive 5637 cell line was always the most susceptible to all drugs. Furthermore, it was also observed that the combined treatments that used cisplatin (everolimus plus cisplatin, or temsirolimus plus cisplatin), were always more effective. In conclusion, it was demonstrated that the cell lines used in this study are representative of human bladder cancer and are therefore an important and useful tool in the research therapy of such tumours. On these cell lines, the mTOR inhibitors used isolated were not highly effective drugs, especially on the muscle-invasive T24 and HT1376. The results obtained on the 5637 non-muscle-invasive cell line suggest everolimus and temsirolimus as alternative therapies to study, particularly in non-invasive tumours that do not respond to available therapies. When used in combination with drugs currently used (cisplatin and gemcitabine) on the treatment of urinary bladder cancer, the results obtained on the three tumour cell lines were clearly superior. The present study shows that, depending on the tumour’s genetic profile, the combinations of mTOR inhibitors (everolimus and temsirolimus) with gemcitabine and cisplatin may be in the future potential therapeutic regimens in bladder carcinoma.

Tese de Doutoramento em Ciências Veterinárias, Ramo Biomedicina O carcinoma da bexiga constitui uma doença frequente com elevado impacto sócioeconómico em todo o mundo, pelo que o uso de modelos pré-clínicos é fundamental na pesquisa de novos tratamentos mais eficazes. Através da utilização de três linhas celulares comerciais humanas (T24, 5637, HT1376) de carcinoma da bexiga e do modelo animal de indução química de lesões uroteliais com recurso à exposição de murganhos ICR à N-butil-N-(4-hidroxibutil) nitrosamina (BBN), foram estabelecidos como objetivos para esta tese: estudar os efeitos in vitro de várias concentrações de cisplatina, malato de sunitinibe e meloxicam; analisar in vitro os efeitos da associação de várias concentrações de malato de sunitinibe com a cisplatina e com o meloxicam; estudar in vivo os efeitos do meloxicam e da infusão do chá verde nas lesões uroteliais do murganho induzidos pela administração da BBN; caracterizar citogeneticamente um carcinoma papilar urotelial de baixo grau de murganho induzido pela BBN. As linhas celulares T24, 5637 e HT1376 foram expostas à cisplatina, ao malato de sunitinibe e ao meloxicam, como drogas isoladas e em diferentes combinações. A proliferação celular, o ciclo celular, a apoptose, os danos no DNA e a autofagia foram avaliados pelos seguintes métodos: 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio, citometria de fluxo, anticorpo M30 CytoDEATH, ensaio do cometa, e colorações monodansilcadaverina e laranja de acridina. Para o estudo da associação de dois fármacos foi calculado o índice de combinação com recurso ao método de Chou e Talalay. No estudo in vivo para a avaliação do efeito do meloxicam, murganhos machos foram expostos à BBN na água de bebida durante 12 semanas, sendo depois administrado durante 6 semanas por via intraperitoneal este fármaco. As lesões uroteliais foram avaliadas pela coloração convencional de hematoxilina e eosina (H&E). Foi estudado o efeito do meloxicam sobre a função hepática e renal. No estudo in vivo do efeito da exposição contínua ao chá verde durante 20 semanas, a administração da BBN foi feita por entubação gástrica durante 10 semanas, sendo caracterizadas, após sacrifício dos animais, as lesões uroteliais por H&E. A constituição cromossómica do carcinoma papilar urotelial de baixo grau do murganho, foi analisada por citogenética convencional e por hibridização in situ por fluorescência. Isoladamente, a exposição aos três fármacos diminuiu significativamente a proliferação celular das linhas celulares de carcinoma da bexiga (p

Dissertação de Mestrado em Biotecnologia para as Ciências da Saúde A medula óssea é um tecido de consistência gelatinosa que preenche a cavidade interna de vários ossos do esqueleto, podendo ser classificada em dois tipos principais: medula óssea vermelha (também designada medula óssea ativa) e medula óssea amarela. Vários estudos têm sugerido a subdivisão da medula óssea em nichos com microambientes específicos. Microscopicamente, a medula óssea é constituída, em proporções diferentes, por células hematopoiéticas e suas correspondentes células tronco hematopoiéticas e células progenitoras, células tronco mesenquimais, células do estroma, adipócitos, mastócitos (células do tecido conjuntivo) e células plasmáticas. As células tronco hematopoiéticas têm a capacidade de se diferenciarem em linfócitos (células hematopoiéticas envolvidas na resposta imune), em granulócitos (células hematopoiéticas que defendem o organismo contra bactérias), em trombócitos ou plaquetas (células hematopoiéticas responsáveis pela prevenção da hemorragia) e em eritrócitos (células hematopoiéticas vulgarmente conhecidas como glóbulos vermelhos ou hemácias, que são responsáveis pelo transporte de gases pelo sangue). Atualmente sabe-se que as células hematopoiéticas são positivas para os seguintes marcadores celulares de superfície: CD45, CD14 e CD34, os quais foram utilizados no presente estudo. As células tronco mesenquimais constituem o maior tipo de células tronco mesenquimais multipotentes, as quais podem provir de várias fontes: medula óssea, tecido adiposo, sangue periférico, pulmão ou coração. Estas células tronco são capazes de se diferenciar em várias linhagens celulares in vitro: osteoblastos, condrócitos, adipócitos, mioblastos, hepatócitos e possivelmente em células do tecido neural. As células tronco mesenquimais da medula óssea expressam os marcadores celulares de superfície CD29, CD73, CD90, CD105, CD106, CD140b e CD166, mas não expressam os marcadores CD31, CD45, CD34 e CD133. A citometria de fluxo tem vindo a tornar-se a maior ferramenta para a caracterização fenotípica de células. Como ferramenta analítica, a sua capacidade única para discriminar, quantificar e classificar um elevado número de células é incomparável. Esta tecnologia quantifica e analisa em simultâneo características físicas de partículas únicas, tais como o tamanho relativo das partículas, a granularidade relativa ou complexidade interna, e a intensidade relativa de fluorescência emitida por anticorpos ou corantes, permitindo a distinção das células e o seu agrupamento em populações com características semelhantes. Nas últimas décadas, os pequenos ruminantes (ovelha e cabra) têm sido amplamente utilizados como modelos animais reconhecidos em vários projetos de investigação biomédicos, destacando-se na investigação em ortopedia. No presente estudo foram utilizadas seis cabras autóctones de raça Serrana (Capra aegagrus hircus), devidamente identificadas. Foram realizados aspirados de medula óssea e colheitas de sangue aos referidos animais, e as amostras seguiram para a realização de hemogramas, esfregaços, cultura de células, imunocitoquímica e citometrias de fluxo. Para a realização das técnicas de imunocitoquímica e citometria de fluxo foram utilizados os seguintes marcadores celulares de superfície: CD14, CD45 e CD34. Os resultados obtidos na técnica de imunocitoquímica vieram confirmar a marcação positiva dos marcadores utilizados neste estudo nas células da medula óssea da cabra. Os resultados obtidos nas citometrias de fluxo de medula óssea de cabra estavam em concordância com o descrito na literatura existente para o Homem e para a ovelha, no entanto, surgiram algumas dúvidas na interpretação dos resultados e a marcação com CD34 não foi validada para cinco dos animais em estudo. Deste estudo pudemos concluir que a cabra deverá ser um bom modelo animal para estudos de medula óssea pela técnica de citometria de fluxo, visto que houve uma boa correlação dos resultados obtidos com os resultados da citometria de fluxo de medula óssea humana. Assim, será de todo o interesse prolongar os estudos de caracterização da medula óssea da cabra com vista a aumentar o seu conhecimento para que num futuro próximo possam ser estudadas várias doenças e distúrbios, nomeadamente do sistema esquelético, e os seus resultados extrapolados para o Homem. The bone marrow is a tissue with gelatinous consistency that fills the internal cavity of several bones throughout the skeleton. Bone marrow is classified into two basic types: red bone marrow (also called active bone marrow) and yellow bone marrow. Many studies have suggested the subdivision of bone marrow in niches with specific microenvironments. Microscopically, bone marrow is formed, in different proportions, by hematopoietic cells, and their stem cells and progenitor cells, mesenchymal stem cells, stromal cells, adipocytes, mast cells (conjunctive tissue cells) and plasma cells. Hematopoietic stem cells have the capacity to differentiate into lymphocytes (hematopoietic cells involved in immune response), in granulocytes (hematopoietic cells that defend the body against bacteria), in platelets (hematopoietic cells responsible for preventing the bleeding) and erythrocytes (hematopoietic cells commonly known as red blood cells that are responsible for transporting gases through the blood). Currently it is known that hematopoietic cells are positive for the following cell surface markers: CD45, CD14 and CD34, which have been used in this research study. Mesenchymal stem cells are the largest type of multipotent mesenchymal stem cells, which may come from several sources: bone marrow, adipose tissue, peripheral blood, lung or heart. These stem cells are able to differentiate into several cell lines in vitro: osteoblasts, chondrocytes, adipocytes, myoblasts, hepatocytes and possibly in neural tissue. The bone marrow MSCs express cell surface markers CD29, CD73, CD90, CD105, CD106, CD166 and CD140b, but do not express the markers CD31, CD45, CD34 and CD133. Flow cytometry has become a major tool for phenotypic characterization of cells. As an analytical tool, its unique ability to discriminate, quantify and classify a large number of cells is incomparable. This technology simultaneously analyzes and quantifies the physical characteristics of single particles, such as the relative size of the particles, relative granularity or internal complexity, and the relative intensity of fluorescence emitted by antibodies or dyes, and allowing the differentiation of the cells in clustered populations with similar characteristics. In recent decades, small ruminants (sheep and goat) have been widely used as animal models for various experimental biomedical research projects, in particular in orthopedic studies. In the present study we used six Portuguese Serrana goats (Capra hircus aegagrus), properly identified. We performed bone marrow aspirates and blood samples to these animals, the samples followed for conducting blood counts, smears, cell culture, immunocytochemistry and flow cytometry. For flow cytometry and immunocytochemistry, the following cell surface markers have been used: CD14, CD45 and CD34. The results from the immunocytochemistry confirmed the positive staining of markers used in this study on goat bone marrow cells. The results obtained in flow cytometry of goat bone marrow cells match those reported in literature for humans and sheep, however the interpretation of the final results raised a few reservations and the staining with CD34 could not be validated for five of the animals in study. From this study we conclude that goat could represent a good animal model for bone marrow studies using flow cytometry technique, since there was a good correlation of our results with the results of flow cytometry of human bone marrow. Therefore, it would be interesting to extend the studies on goat bone marrow to increase the knowledge so that in the near future some pathologies can be studied and the results extrapolated to humans.