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En la presente investigación se logró el establecimiento de una línea celular fotoautotrófica, a partir de la adaptación de células altamente clorofílicas de Bouteloua gracilis, cultivadas en medio MS con vitaminas suplementado con 2,4-D (1 mg L-1), BA (2 mg L-1) y adenina (40 mg L-1), a condiciones en las cuales se omitió la adición de azúcares al medio. Las células crecieron a una velocidad de agitación de 100 rpm, irradiancia de 100 µmoles fotón m-2 s-1 y 3% de CO2 en la atmósfera del cultivo. Se obtuvo un tiempo de duplicación de 9,38 días en términos de peso fresco y el contenido de pigmentos en este cultivo celular fue de 489 µg de clorofila total g-1 PF y 228 µg de carotenoides g-1 PF al día 14 del cultivo. Posteriormente, las células de Bouteloua gracilis fueron cultivadas en un biorreactor de tanque agitado (volumen de trabajo, 2 L). Se definieron las condiciones de aireación y agitación, tales como el tipo de agitador (turbina Rushton), velocidad de agitación (100 rpm), velocidad de aireación (0,5 vvm), e irradiancia (250 µmol fotón m-2 s-1) para lograr el crecimiento celular. Bajo estas condiciones, las células heterotróficas de Bouteloua gracilis incrementaron su peso fresco cerca de 5,38 veces después de 13 d de cultivo. En el cultivo fotomixotrófico (5% de CO2 en aire y 0,1% de sacarosa en el medio de cultivo) la masa de las células se incrementó 2,35 veces en los 38 días del cultivo, mientras que en el caso de las células fotoautotróficas que crecieron con la misma concentración de CO2 en aire, pero sin azúcar en el medio de cultivo, el incremento en peso fresco de las células fue de 2,04 para este mismo periodo de tiempo. Aunque diferentes sistemas de cultivos celulares en suspensión han sido establecidos para cereales y pastos, este es el primer reporte de un cultivo celular fotoautotrófico en Poaceae. Se analizaron las células heterotróficas, fotomixotróficas y fotoautotróficas de Bouteloua gracilis, obtenidas en el biorreactor, en cuanto a su contenido de azúcares estructurales y lignina, encontrándose concentraciones entre 10,78 y 14,34% para celulosa, entre 4,46 y 9,13% para hemicelulosa y entre 8,84 y 11,2% para lignina. Abstract. In this reasearch a new photoautotrophic cell line was developed by adapting highly chlorophyllic Bouteloua gracilis cells, cultured in basal medium MS supplemented with 2,4-D (1mg/L), BA (2 mg/L) and adenine (40 mg/L), to sugar-free growth conditions . The cells grew at a stirring speed of 100 rpm, an irradiance of 150 µmol photons m-2 s-1 and 3% of CO2 in the culture atmosphere. A doubling time of 9,38 days was obtained in terms of fresh weight, while the pigments contents were 489 µg total chlorophyll g-1 FW and 228 µg carotenes g-1 FW culture. Bouteloua gracilis cells were subsequently cultured in a stirred tank bioreactor (2 L of effective volume), with defined operation conditions such as type of stirrer (Rushton turbine), stirring speed (100 rpm), aeration rate (0,5 vvm), and irradiance (250 μmol photon m-2 s-1). Under these conditions, heterotrophic cells of Bouteloua gracilis increased about 5,4 times its fresh weight after 13 days of culture. Additionally, photomixotrophic cells were grown with 5% CO2 in air, and 0,1 % sucrose in the culture medium. A cell mass increase of 2,3 times was obtained at day 38 day of the growth kinetics, while for those cells grown with the same concentration of CO2 in air, but without sugar in the medium the fresh weight increase was 2,04 for this date. Although different systems of plant cell cultures in suspension have been described for cereals and grasses, this is the first report for photoautotrophic cell suspension culture in Poaceae. Finally, the content of structural sugars and lignin concentration were also determined for the heterotrophic, photomixotrophic and photoautotrophic cells from Bouteloua gracilis obtained in the bioreactor, with values ranging between 10,8 and 14,3% for cellulose, 4,4 to 9,1% and hemicellulose and 8,8 and 11,2% lignin. Doctorado

Tesis (Maestría en Ciencias en Biología Molecular) "La sequía es el principal factor de estrés abiótico que afecta el desarrollo y la productividad de los cultivos económicamente importantes. Las respuestas a nivel celular y molecular que se manifiestan cuando una planta se encuentra en sequía son cambios morfológicos, ajuste en el transporte de iones y cambios metabólicos, entre otros. Todos estos cambios están regidos por la expresión de diversos grupos de genes que ayudan a las plantas a tolerar cambios ambientales externos. El uso de herramientas moleculares ha permitido la identificación de genes asociados con la tolerancia a la sequía. Por lo que el emplear plantas que sean tolerantes a factores ambientales extremos, puede contribuir a aumentar nuestro entendimiento en los mecanismos moleculares que confieren la tolerancia a diferentes tipos de estrés abiótico. Debido a que Bouteloua gracilis es una gramínea originaría de México que se caracteriza por ser una planta altamente tolerante a la sequía, la hace un modelo muy atractivo para el estudio del estrés generado por sequía, por ello se desarrollo una genoteca substractiva a partir de esta especie, empleando el cDNA de plantas crecidas bajo condiciones de déficit hídrico (muestra problema) y plantas mantenidas en riego (muestra control). Se aislaron 131 clonas potencialmente diferenciales las cuales fueron secuenciadas, analizadas y agrupadas en contigs, obteniéndose un total de 47 unigenes. Del total de las clonas 25 son secuencias de genes conocidos, mientras que 22 unigenes son secuencias no reportadas en las bases de datos. La secuencias aisladas codifican para proteínas que participan en procesos de señalización (4%), metabolismo (4%), fotosíntesis (4%), transporte (13%), respuesta a estrés (11%) y síntesis de proteínas (4%). La expresión diferencial de nueve de estos genes incluyendo una pirofostasa translocadora de protones, un factor de ribosilación de ADP, un factor de splicing, una cistín proteinasa, una proteína NFU, una subunidad del proteosoma, una chaperona DnaJ y una ATPasa fueron confirmadas por RT-PCR. Además, se evaluó la expresión de estos genes en respuesta a diferentes estímulos, como estrés por frío, calor, salinidad, estrés osmótico y a la aplicación exógena de ácido abscísico. De manera interesante la mayoría de los genes analizados muestran diferentes patrones de expresión en respuesta a los tratamientos empelados." "Drought, constitutes the main abiotic stress affecting growth and productivity of economically important crops. Osmotically stressed plants display different cellular and molecular responses including morphological and metabolic changes, and ion transport adjustment. All this changes are governed by the expression of several genes involved in plant tolerance to environmental stresses. The usage of molecular tools has allowed the identification of some genes involved in drought tolerance. The understanding of the molecular mechanisms by which plants acquire tolerance to abiotic stresses, can be approached using naturally tolerant plants such as Bouteloua gracilis, which has been characterized as drought tolerant. In present work we developed a subtractive library of B. gracilis leafs from drought stressed seedlings, using the cDNA from plants grown under stress as tester and the cDNA of plants maintained at field capacity as driver. We isolated and sequenced 131 clones, which were analyzed and grouped into contigs representing 47 unigenes. From these genes, 25 belonged to known sequences while the other 22 were new sequences not reported in the GenBank. The isolated genes encode for proteins involved in signaling, metabolism, photosynthesis, transport, stress responses and protein biosynthesis. The differential expression of nine of these genes including a proton translocating pyrophosphatase, ADPribosylation factor, splicing factor 3B subunit 2, cysteine proteinase, NFU protein, proteasome subunit alpha type 2, chaperone protein dnaJ and an ATPase subunit beta was assessed by RT-PCR. In addition, we evaluated the expression of these genes in response to different stimuli such as cold, heat, salinity, osmotic stress and in response to abscisic acid. Interestingly, most of the analyzed genes display diverse expression patterns in response to the applied treatments."