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RNA-binding proteins (RBPs) establish the cellular fate of a transcript, but an understanding of these processes has been limited by a lack of identified specific interactions between RNA and protein molecules. Using MS2 RNA tagging, we have purified proteins associated with individual mRNA species induced by osmotic stress, STL1 and GPD1. We found members of the Lsm1-7/Pat1 RBP complex to preferentially bind these mRNAs, relative to the non-stress induced mRNAs, HYP2 and ASH1. To assess the functional importance, we mutated components of the Lsm1-7/Pat1 RBP complex and analyzed the impact on expression of osmostress gene products. We observed a defect in global translation inhibition under osmotic stress in pat1 and lsm1 mutants, which correlated with an abnormally high association of both non-stress and stress-induced mRNAs to translationally active polysomes. Additionally, for stress-induced proteins normally triggered only by moderate or high osmostress, in the mutants the protein levels rose high already at weak hyperosmosis. Analysis of ribosome passage on mRNAs through co-translational decay from the 5' end (5P-Seq) showed increased ribosome accumulation in lsm1 and pat1 mutants upstream of the start codon. This effect was particularly strong for mRNAs induced under osmostress. Thus, our results indicate that, in addition to its role in degradation, the Lsm1-7/Pat1 complex acts as a selective translational repressor, having stronger effect over the translation initiation of heavily expressed mRNAs. Binding of the Lsm1-7/Pat1p complex to osmostress-induced mRNAs mitigates their translation, suppressing it in conditions of weak or no stress, and avoiding a hyperresponse when triggered.

El factor de inicio de traducción de eucariotas 5A (eIF5A) es una proteína esencial y conservada con funciones en las tres fases de la traducción. eIF5A está codificado por dos genes parálogos, TIF51A/TIF51B y EIF5A1/EIF5A2 en levadura y humanos respectivamente. eIF5A es la única proteína que contiene hipusina, una modificación esencial para su actividad, y se une a los ribosomas para facilitar la traducción de motivos con prolinas consecutivas o combinaciones de prolina con glicina y aminoácidos cargados. eIF5A participa en otras funciones y procesos como exporte de mRNAs nucleares, proliferación y apoptosis. Su asociación con enfermades como el cáncer es de interés. En esta tesis se han utilizado los organismos modelo Saccharomyces cerevisiae y Mus Musculus para adquirir conocimiento fundamental de las funciones de eIF5A. Se han identificado dos nuevas dianas de eIF5A para la traducción, una función básica nueva del factor y las bases moleculares de la regulación transcripcional de los dos genes de eIF5A. Nuestros resultados con levadura y células de mamífero demostraron que eIF5A hipusinado es necesario para la síntesis de colágeno I ya que la traducción se para en motivos colagénicos, enriquecidos en prolina y glicina, en deficiencia de eIF5A. Su inactivación redujo el contenido en colágeno I y produjo la retención de colágeno parcialmente sintetizado en el retículo endoplásmico y estrés. La sobreproducción de colágeno I células humanas hepáticas estrelladas tratadas con la citoquina profibrótica TGF-β1 dependía de eIF5A también. En cuanto a la regulación transcripcional de eIF5A, se determinó que la expresión génica de las dos isoformas respondía a las demandas energéticas y dependía de TORC1 y Hap1. En condiciones de respiración, Hap1 activaba TIF51A por unión directa y reprimía TIF51B indirectamente. Por el contrario, cuando la respiración era comprometida, Hap1 se convertía en un represor para inhibir la expresión de TIF51A e inducir TIF51B. Nuestros resultados demostraron el papel esencial de la isoforma Tif51A en la respiración mitocondrial. Se descubrió un nuevo mecanismo que conecta la actividad de eIF5A con las funciones mitocondriales. Se observó que eIF5A es necesario para la traducción de la región de prolinas de Tim50, una proteína esencial que reconoce proteínas mitocondriales y media su importe a la mitocondria. La inactivación de eIF5A inhibía el importe de proteínas y generaba la agregación de precursores y estrés. Finalmente, se reveló una nueva función de eIF5A en la regulación transcripcional de genes cuyos mRNAs lo requieren para la traducción. Nuestros resultados demostraron su unión a la cromatina y su inactivación aumentaba la transcripción de genes que codifican proteínas con motivos dependientes de eIF5A, sugiriendo un efecto transcripcional represor sobre sus dianas. Así, eIF5A no solo funciona en traducción sino también en el control de la síntesis de mRNA para mantener la homeostasis de proteína de sus dianas. The eukaryotic translation initiation factor 5A (eIF5A) is an essential, evolutionarily conserved protein with functions in the three stages of translation. eIF5A is codified by two paralog genes, TIF51A/TIF51B and EIF5A1/EIF5A2 in yeast and human respectively. eIF5A is the only known protein containing hypusine, an essential modification for its activity. eIF5A binds ribosomes to facilitate translation of motifs with consecutive prolines or combinations of proline with glycine and charged amino acids. eIF5A has been linked to other molecular functions and cellular processes such as nuclear mRNA export, proliferation and apoptosis. Its association with the pathogenesis of several diseases including cancer is of interest. In this thesis we have used Saccharomyces cerevisiae and Mus Musculus to gain fundamental knowledge on the functions of eIF5A. Here, we identified and characterized two novel targets requiring eIF5A for translation, a new basic function for the factor and the molecular bases of the transcriptional regulation of the two eIF5A genes. Our results in yeast and mammalian cells proved that hypusinated eIF5A is needed for synthesis of mammalian collagen I as translation stalls at collagenic motifs, enriched in proline and glycine, under eIF5A deficiency. eIF5A inactivation reduced collagen I and led to the retention of partially synthesized collagen I in the endoplasmic reticulum and to stress. The collagen I overproduction in human hepatic stellate cells treated with the profibrotic cytokine TGF-β1 was also dependent on eIF5A. The gene expression regulation of the two isoforms responded to the cellular energy demands and was found to be dependent on TORC1 and Hap1. Under respiratory conditions, Hap1 induced TIF51A through direct binding while indirectly repressed TIF51B. Conversely, when the respiration was compromised, Hap1 became a repressor to down-regulate TIF51A expression and up-regulate TIF51B. Our results demonstrated the essential role of the Tif51A isoform in the mitochondrial respiration. A novel mechanism connecting eIF5A activity with mitochondria functions was revealed. We showed that eIF5A is required for the translation of the proline-rich region of Tim50, an essential protein that specifically recognizes mitochondrial proteins and mediates their import into mitochondria. eIF5A inactivation inhibited mitochondrial protein import and caused precursors to aggregate and stress. Finally, a novel function of eIF5A was uncovered. eIF5A was found to participate in the transcriptional regulation of genes whose mRNAs require eIF5A for translation. Our findings proved the eIF5A binding to chromatin and its absence increases the transcription of specific genes encoding proteins with eIF5A-dependent motifs, suggesting a transcriptional repressor effect on its targets. Thus, our results indicated that eIF5A functions not only in translation but also in the control of mRNA synthesis to maintain protein homeostasis of its targets.

En esta tesis, se utilizó como organismo modelo la levadura Saccharomyces cerevisiae para obtener conocimiento fundamental sobre una variedad de mecanismos moleculares utilizados por la célula para responder y adaptarse a los estímulos externos. En respuesta al aumento de la osmolaridad externa, la ruta de señalización MAPK High Osmolarity Glycerol (HOG) se activa para mediar cambios en diversas funciones celulares, incluyendo la reprogramación global de la transcripción y traducción, con el fin último de lograr la adaptación. Tras la detección de alta osmolaridad externa, la señal se transduce a través de dos ramas funcionalmente redundantes pero mecanísticamente distintas, SLN1 y SHO1, para finalmente activar el efector MAPK Hog1. Aunque múltiples interacciones entre sensores, proteínas adaptadoras y los componentes de señalización de la rama SHO1 se han descrito anteriormente, esta tesis caracteriza aún más la complejidad de los perfiles de las interacciones para dilucidar cómo se propaga la señal con eficacia y cómo se logra la fidelidad de la señal. En este sentido, hemos utilizado el nuevo método M-track que detecta tanto las interacciones entre proteínas de corta duración como las estables y hemos realizado varias observaciones interesantes. Una vez que se transduce la señal de respuesta a estrés, Hog1 activado entra en el núcleo de la célula y, entre sus más destacados funciones aguas abajo, modula los cambios de expresión génica global. El complejo de unión a la caperuza CBC (por cap-binding complex), que está formado por las proteínas de unión a RNA Cbc1 y Cbc2, se asocia con la caperuza en 5' del mensajero co-transcripcionalmente y se ha descrito su función en diversos aspectos de la vida de mensajero, incluyendo la transcripción. Utilizando técnicas de biología molecular y genómica, describimos Cbc1 como regulador de la transcripción global, tanto en condiciones de estrés y no estrés, para mediar la expresión génica de manera que se consigan niveles altos de una forma rápida. En respuesta a feromonas del tipo sexual contrario, la ruta de MAPK de feromonas de células de levadura haploides se activa para mediar una serie de cambios fisiológicos en preparación para el apareamiento, que incluyen la reprogramación de la expresión génica, la parada del ciclo celular, la formación de una proyección sexual denomina ¨shmoo¨, y en última instancia la fusión celular de los tipos de células de apareamiento contrario. El factor de traducción eIF5A, esencial y conservado evolutivamente, se ha descrito recientemente que funciona en la traducción de proteínas que contienen tres o más residuos de prolina consecutivos (polyPro), a través de su unión a ribosomas para aliviar el estancamiento del ribosoma durante la formación del enlace péptidico entre prolinas. La activación de eIF5A requiere una modificación post-traduccional única, la hipusinación, donde el residuo de hipusina se deriva de la espermidina, un factor esencial para la fertilidad de los mamíferos y que se requiere para el apareamiento de la levadura. Aquí se investigó eIF5A como regulador de la respuesta a feromonas a través de la traducción de proteínas polyPro con funciones en el apareamiento. In this thesis, we utilised the model organism the budding yeast Saccharomyces cerevisiae to gain fundamental knowledge on a variety of molecular mechanisms employed by the cell to respond and adapt to external stimuli. In response to increased external osmolarity, the yeast high osmolarity glycerol (HOG) MAPK pathway becomes activated to mediate changes to various cellular functions, including changes in glycerol accumulation, cell-cycle arrest, re-establishment of ion homeostasis and global reprogrammation of transcription and translation of the whole genome, in order to achieve adaptation. Upon detection of high external osmolarity, signal is transduced via two functionally redundant but mechanistically distinct branches, SLN1 and SHO1, to finally activate the effector MAPK Hog1. Although multiple interactions between osmosensors, adaptor proteins and signalling components of the SHO1 branch have been previously described, this thesis further characterises the complexity of their interaction profiles to elucidate how signal is effectively propagated and how signal fidelity is achieved. Here, we utilised the novel M-track method, which detects both short-lived and stable protein interactions, and made several interesting observations. Once the osmostress signal is transduced, activated Hog1 enters the cell nucleus and, amongst its most prominent downstream functions, modulates global gene expression changes. Within minutes of shock, global transcription rate rapidly decreases by 50 %, however the transcription machinery is reallocated to specific genes implicated in osmostress cellular protection and their transcription is strongly and rapidly induced. The cap-binding complex (CBC), consisting of mRNA-binding proteins Cbc1 and Cbc2, associates with the 5´ mRNA cap co-transcriptionally and has been described to function in various aspects of the mRNA life, including transcription. Utilising both genomic and molecular biology techniques, we describe Cbc1 as a global transcription regulator, both under stress and non-stress conditions, to mediate high and timely gene expression. In response to pheromones of the opposite mating type, the yeast pheromone MAPK pathway is activated to mediate a series of physiological changes in preparation for mating; including reprogrammation of gene expression, cell-cycle arrest, formation of a sexual projection termed ¨shmoo¨, and ultimately cell fusion of mating partners. The evolutionarily conserved and essential translation factor eIF5A has recently been described to promote translation of proteins containing three or more consecutive proline residues (polyPro) by binding to ribosomes and alleviating ribosome stalling during the formation of the Pro-Pro peptide bond. The activation of eIF5A requires the addition of a unique post-translational modification, a hypusine residue, which is derived from spermidine, an essential factor for mammalian fertility and required for yeast mating. Here we investigated eIF5A as a regulator of the pheromone response through the translation of polyPro proteins with roles in mating.