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Introduction: Current diagnostic methods are not very sensitive to detect the initial stages diabetic nephropathy of type 2. In this work, a review of metabolomic approximation studies for the identification of biomarkers of this disease with potential to differentiate between early stages, evaluate and direct treatment and help slow kidney damage. Methods: Using public (Pubmed, and Google Scholar) and private (Scopus and Web of Knowledge) databases, a systematic search of the information published related to metabolomics of diabetic nephropathy in different biospecimens (urine, serum, plasma and blood) was made. Later, the MetaboAnalyst 4.0 software was used to identify the metabolic pathways associated with these metabolites. Results: Groups of potential metabolites were identified for monitoring diabetic nephropathy with the available literature data. In the urine, oxide-3-hydroxyisovalerate, TMAO, aconite and citrate and hydroxypropionate derivatives are highlighted; meanwhile, in the serum: citrate, creatinine, arginine and its derivatives; and in the plasma: amino acids such as histidine, methionine and arginine has a potential contribution. Using MetaboAnalyst 4.0 the metabolic pathways related to these metabolites were related. Conclusions: The search for biomarkers to measure the progression of diabetic nephropathy, together with analytical strategies for their detection and quantification, are the starting point for designing new methods of clinical chemistry analysis. The association between the metabolic pathway dysfunction could be useful for the overall assessment of the treatment and clinical follow-up of this disease. Resumen: Introducción: Los métodos de diagnóstico actuales son poco sensibles para detectar las etapas iniciales de la nefropatía diabética tipo 2. En este trabajo se hace una revisión de estudios de aproximación metabolómica para la identificación de biomarcadores de esta enfermedad con potencialidad para diferenciar entre etapas tempranas, evaluar y direccionar el tratamiento y coadyuvar a ralentizar el daño renal. Métodos: Utilizando bases de datos públicas (Pubmed,y Google Scholar) y privadas (Scopus y Web of Knowledge), se realizó una búsqueda sistemática de la información que se ha publicado de metabolómica de la nefropatía diabética en distintos bioespecímenes (orina, suero, plasma y sangre). Posteriormente, se utilizó el programa MetaboAnalyst 4.0 para evidenciar las vías metabólicas que están asociadas con estos metabolitos. Resultados: Con los datos de la literatura se identificaron grupos de metabolitos potenciales para el monitoreo de la nefropatía diabética. Destacan en la orina: el óxido-3-hidroxiisovalerato, TMAO, aconitato y citrato y derivados del hidroxipropionato; en el suero: el citrato, la creatinina, la arginina y sus derivados; y en el plasma: aminoácidos como histidina, metionina y arginina. Utilizando el programa MetaboAnalyst 4.0 se detectaron las rutas metabólicas que están relacionadas con estos metabolitos. Conclusiones: La búsqueda de biomarcadores relacionados con la progresión de la nefropatía diabética junto con estrategias analíticas para su detección y cuantificación son el punto de partida para el diseño de nuevos métodos de análisis químico-clínico. La correlación con la disfunción de vías metabólicas podría ser utilizada para la evaluación integral del tratamiento y seguimiento clínico de este padecimiento.

Introducción: La principal motivación que dio lugar a esta Memoria de Tesis fue optimizar, validar y aplicar un método para la determinación de vitamina D y sus metabolitos en sangre (suero y plasma). Los analitos a estudiar abarcaron la propia vitamina D (en las formas D2 y D3) y sus principales metabolitos mono y dihidroxilados. Se pretendió soportar el método en: (i) la completa automatización del proceso analítico (para un funcionamiento ininterrumpido y sin atención del operador durante 24 h/día, evitando o minimizando así la sobrecarga de muestras en el laboratorio), además de una adecuada validación. (ii) La multideterminación, que abarcara tantos analitos como fuera posible para obtener información cuantitativa del metabolismo de la vitamina D. (iii) El estudio en profundidad de la información básica sobre las primeras etapas del método para la cuantificación de la vitamina D y sus metabolitos y su impacto en las propiedades analíticas del mismo: la selección del tipo de muestra derivada de la sangre total (suero o plasma) y del contenedor de muestra y, especialmente, el procedimiento óptimo de preparación de la muestra. (iv) La suficiente información sobre la estabilidad de la muestra durante un periodo establecido de dos meses para evaluar el efecto de la temperatura de almacenamiento en las propiedades analíticas del método en función del/los analito/s a determinar. (v) La aplicación masiva a muestras procedentes de diferentes centros de investigación y de pacientes con diferentes enfermedades, para poner así de manifiesto las fortalezas y debilidades del método y ayudar a conocer los cambios que se producen en los metabolitos a causa de enfermedades concretas. Contenido de la investigación: Durante el desarrollo de esta Tesis Doctoral se consiguieron los siguientes objetivos: (i) Automatizar y validar un método basado en el acoplamiento en línea de una estación de extracción en fase sólida (SPE) a un cromatógrafo de líquidos conectado a un espectrómetro de masas en tándem (LC–MS/MS) para la determinación en suero de vitamina D (en las formas D2 y D3) y sus principales metabolitos monohidroxilados (25-hidroxivitamina D2 [25(OH)D2] y 25-hidroxivitamina D3 [25(OH)D3]) y dihidroxilados (1,25-dihidroxivitamina D2 [1,25(OH)2D2], 1,25-dihidroxivitamina D3 [1,25(OH)2D3] y 24,25-dihidroxivitamina D3 [24,25(OH)2D3]) constituyó un objetivo específico clave. El uso de estándares internos marcados isotópicamente (SIL-ISs) y la validación externa de acuerdo con el programa de validación “vitamin D External Quality Assurance Scheme (DEQAS)” contribuyeron a dar un soporte sólido al método. (ii) Ampliar el número de metabolitos determinados fue el objetivo específico del que resultó la discriminación de los epímeros 25(OH)D3, además de mantener el resto de los hidroximetabolitos. La cromatografía de líquidos bidimensional (LC×LC) con una etapa previa de SPE y la subsiguiente detección mediante MS/MS hicieron posible la consecución de este objetivo: un método ampliado y validado mediante aplicación a muestras del programa DEQAS y a un material de referencia certificado (CRM) del NIST. (iii) Conocer la mejor muestra derivada de sangre total (suero o plasma) y el mejor procedimiento de preparación de la muestra fue el tercer objetivo específico. Se utilizaron diferentes tubos de recogida, con y sin recubrimiento interno por gel, para obtener el suero y el plasma. Por otra parte, la información necesaria sobre la etapa de preparación de la muestra se obtuvo comparando cómo afecta a cada uno de los analitos la desproteinización o la SPE previas al análisis mediante LC–MS/MS. (iv) Estudiar la estabilidad de los analitos de las muestras de suero sometidas a diferentes condiciones de conservación durante dos meses fue otro de los objetivos específicos. El estudio estadístico de los datos obtenidos en el seguimiento mediante LC–MS/MS permitió conocer la magnitud de los cambios experimentados por cada uno de los compuestos en estudio, con especial énfasis en los metabolitos. Un logro interesante de este estudio fue la comprobación de que la estabilidad de los analitos se mantiene de forma general cuando las muestras se liofilizan. (v) Validar el excelente comportamiento del método fue el último de los objetivos específicos de la Tesis, al cual el estudiante le dedicó un largo periodo de tiempo. Algunos de los ejemplos de aplicación del método por el doctorando son los siguientes: análisis de 546 muestras de suero de una cohorte de mujeres con cáncer de mama y 558 mujeres control (del proyecto MCC del Instituto de Salud Carlos III, Madrid); 1472 muestras de suero de una cohorte de mujeres pre- y postmenopáusicas (proyecto del mismo instituto); 314 muestras de suero de pacientes con esclerosis múltiple (proyecto sobre vitamina D y esclerosis múltiple en pacientes con síndromes clínicamente aislados, del Hospital San Rafaelle de Milán, Italia). Los datos analíticos han sido y están siendo en la actualidad usados con éxito por los participantes en los proyectos para la obtención de resultados que soporten o destruyan las hipótesis propuestas. Algunos de los datos obtenidos en los análisis realizados se han tratado desde el punto de vista analítico–quimiométrico. 3. Conclusión: Se han desarrollado dos métodos automatizados para el análisis cuantitativo de la vitamina D y sus principales metabolitos proporcionando una rápida separación cromatográfica de las vitaminas D3 y D2 y los metabolitos 1,25(OH)2D3, 24,25(OH)2D3, 1,25(OH)2D2, 25(OH)D3, 25(OH)D2 y 3-epi-C3-25(OH)D3 en muestras de suero (a nivel de nmol/L o pmol/L). Ambas plataformas se han caracterizado y validado mediante programas externos utilizando muestras proporcionadas por DEQAS, para la determinación del total de 25(OH)D y 1,25(OH)2D, y un material de referencia certificado por el NIST para validar la determinación individual de los epímeros del 25(OH)D3. Se han establecido unas recomendaciones en lo que se refiere a la conservación de la muestra (referidas tanto al tiempo de almacenamiento como a los ciclos de congelación/descongelación) deben mantenerse para la medición de todos los metabolitos de la vitamina D3 en estudios clínicos, donde la sensibilidad es un parámetro crítico. Por otro lado, la liofilización y posterior almacenamiento a temperatura ambiente son una estrategia fácil, rápida y robusta para conservar las muestras que se utilizarán en los estudios clínicos. Finalmente, tres centros de investigación nacionales e internacionales han solicitado el análisis de la vitamina D y sus metabolitos en 2890 muestras de suero para determinar el metabolismo de la vitamina D en diferentes estudios clínicos realizados a lo largo del desarrollo de la Tesis.

La investigación desarrollada en esta Tesis Doctoral se centró en realizar contribuciones en el ámbito del análisis clínico a través de estrategias metabolómicas tanto orientadas como globales en diferentes tipos de muestras biológicas mediante cromatografía de líquidos (LC) y espectrometría de masas (MS). Para ello primeramente se revisó exhaustiva y críticamente la bibliografía para conocer el estado del tratamiento de la orina como muestra y de los métodos de análisis de aire exhalado condensado, dos de los biofluidos utilizados en el desarrollo de esta Tesis. Además, se optimizaron métodos de análisis orientado para mejorar la cuantificación tanto de compuestos con potencial biomarcador como de fármacos y sus metabolitos para su aplicación en el diagnóstico y seguimiento de enfermedades o tratamientos. También se analizaron de forma global biofluidos para, (a) estudiar y optimizar el tratamiento de una muestra escasamente utilizada en el área clínica (el aire exhalado condensado –EBC), (b) identificar metabolitos con potencial predictivo para ayudar en el diagnóstico del cáncer de próstata utilizando la orina como muestra, y (c) mejorar y acelerar el tratamiento de datos a través de herramientas quimiométricas desarrolladas para combinar en una única matriz los datos obtenidos mediante ionización positiva y negativa en espectrometría de masas.

La investigación desarrollada en esta Tesis Doctoral se centró en realizar contribuciones en el ámbito del análisis clínico a través de estrategias metabolómicas tanto orientadas como globales en diferentes tipos de muestras biológicas mediante cromatografía de líquidos (LC) y espectrometría de masas (MS). Para ello primeramente se revisó exhaustiva y críticamente la bibliografía para conocer el estado del tratamiento de la orina como muestra y de los métodos de análisis de aire exhalado condensado, dos de los biofluidos utilizados en el desarrollo de esta Tesis. Además, se optimizaron métodos de análisis orientado para mejorar la cuantificación tanto de compuestos con potencial biomarcador como de fármacos y sus metabolitos para su aplicación en el diagnóstico y seguimiento de enfermedades o tratamientos. También se analizaron de forma global biofluidos para, (a) estudiar y optimizar el tratamiento de una muestra escasamente utilizada en el área clínica (el aire exhalado condensado –EBC), (b) identificar metabolitos con potencial predictivo para ayudar en el diagnóstico del cáncer de próstata utilizando la orina como muestra, y (c) mejorar y acelerar el tratamiento de datos a través de herramientas quimiométricas desarrolladas para combinar en una única matriz los datos obtenidos mediante ionización positiva y negativa en espectrometría de masas.

Treball Fi de Master: Màster Universitari en Tècniques Cromatogràfiques Aplicades. Curs 2012/2013

En la presente Memoria de Tesis se ha pretendido diseñar plataformas, tanto para análisis metabolómico orientado como global, que tuvieran una manifiesta utilidad en Nutrimetabolómica y en Metabolómica clínica, de forma que supusieran una contribución a la eliminación de las lagunas existentes en estas áreas de la Metabolómica, incrementando así la posibilidad de resolución de problemas por ella misma o integrada con otras ómicas (biología de sistemas). Con este propósito, se desarrollaron tres métodos de multideterminación, como forma de obtención de datos globales de la fracción insaponificable del olivo (en hojas y frutos) junto con su aplicación, recogidos en la Parte I. Seguidamente se desarrollaron cinco nuevos métodos que fueron aplicados en el área de la Nutrimetabolómica, con la finalidad de comprobar el efecto de la ingestión por individuos obesos de distintos tipos de aceites de fritura en función de los antioxidantes empleados en su enriquecimiento, reunidos en la Parte II. Tras lo recogido en estas dos primeras partes se desarrollaron nuevas plataformas orientadas a la Metabolómica clínica, en las que la automatización y miniaturización fuesen la clave para su aplicación al análisis sistemático con un consumo mínimo de muestra de distintos fluidos biológicos. En la Parte IV, se diseñaron y aplicaron plataformas globales con las que se obtuvieron el perfil metabolómico del plasma obtenido de individuos con síndrome metabólico sometidos a una alimentación con contenido lipídico diferente en cantidad y en calidad. Por último en el Anexo se muestra la divulgación de esta investigación en congresos y reuniones científicas.

En este trabajo se ha desarrollado una plataforma de análisis metabolómico para abordar estudios sobre los cambios en el metabolismo secundario vegetal en respuesta a condiciones medioambientales adversas de dos modelos vegetales que implican tanto a plantas modelo como a cultivos de interés comercial. Los resultados indican que la plataforma ha quedado validada para distinguir extractos vegetales procedentes de distintas fuentes y para averiguar qué señales son responsables de tales diferencias. Además, puede ser aplicada a estudios dinámicos dónde también existe la variable tiempo. Los datos también indican que Thellungiella halophila muestra un metabolismo basal mejor preparado para tolerar las condiciones adversas que Arabidopsis thaliana. En raíces de cítricos, el SA parece estar asociado con la inducción del daño y el IAA se propone como pieza importante en la señalización de las respuestas al estrés. En general, las respuestas se pueden diferenciar entre las que van dirigidas a combatir el estrés manteniendo el metabolismo basal, y aquellas en las que se produce una inducción del metabolismo secundario. El tipo de respuesta es inherente al estrés impuesto y a la relativa tolerancia y/o sensibilidad de la especie considerada.