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In the last decade, the utilization of waste by-product apple pomace has been extensively researched (due to its difficult disposal) and currently finds beneficial usage in various industries; as substrate for microbial growth or recovery of pectin, xyloglucan and polyphenols. In this research apple juice was produced at pilot scale. Furthermore, apple pomace was employed as substrate for the production of pectin, biofuel (pellets) and concentrated apple pomace extract. Extensive mass and heat balances were conducted to evaluate the feasibility of this approach on industrial scale. The produced pellets had very similar characteristics to wood pellets (net calorific value of 20.3 MJ/kg). Dried apple pomace contained 11.9% of pectin. Fed-batch cultivation of baker´s yeast with apple pomace extract demonstrated a potential for partial substitution of molasses in industrial bioprocesses. This concept shows how a zero discharge biorefinery process converts waste from apple juice production into three valuable products enabling connections between different industries. Graphic Abstract

Die Bevölkerung wird in den Industriestaaten immer älter, was Veränderungen in vielen Lebensbereichen nach sich zieht. Für die Lebensmittelindustrie ergeben sich daraus für die Entwicklung und Gestaltung von bedarfs- und bedürfnisgerechten Lebensmittelangeboten neue Herausforderungen. Am Institut für Lebensmittel- und Getränkeinnovation (ILGI) der Zürcher Hochschule für Angewandte Wissenschaften (ZHAW) werden im Rahmen einer mehrjährigen Studie die Zusammenhänge zwischen Alter, Ernährungs- und Gesundheitsstatus, sowie der sensorischen Wahrnehmung von Lebensmitteln untersucht.

Neben dem Verzehr von Obst und Gemüse wird auch Fruchtsäften eine Bedeutung für die Prävention chronisch entzündlicher Darmerkrankungen und Dickdarmkrebs beigemessen. Neben der direkten antioxidativen Kapazität polyphenolischer Inhaltstoffe spielt vermutlich auch deren Einfluss auf die Expression redoxsensitiver Gene, wie z.B. der gamma-Glutamylcystein-Ligase (g-GCL) eine protektive Rolle. Die in-vitro Arbeiten an den Kolontumorzelllinien verfolgten das Ziel die antioxidative Wirksamkeit verschiedener Apfelsaftextrakte zu charakterisieren. Hierbei wurde der Einfluss der Aglyka Quercetin und Phloretin, der Inhaltsstoffe Chlorogensäure und Kaffeesäure, sowie der Apfelsaftextrakte AE02 /03 und AE05 auf die Transkription redoxsensitiver Zielgene in HT-29 und Caco-2 Zellen nach 6- und 24h-Inkubation mittels Real Time TaqMan PCR untersucht. Als Referenzverbindungen wurden Sulforaphan und Menadion eingesetzt. Die für den Glutathion-Redoxstatus relevanten ARE-abhängigen Gene GPX2 und GSR, sowie die Nrf2 Genexpression wurden in die Untersuchungen miteinbezogen. Die Ergebnisse zeigen u.a. charakteristische, zellspezifische Unterschiede in der Modulation der antioxidativen Genexpression, bei der sich die HT-29 Zellen vor allem im Hinblick auf die gewählte Inkubationszeit und Konzentration der untersuchten Testmaterialien als sensitiver erwiesen. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war die Charakterisierung eines polyphenolreichen Smoothies im Hinblick auf Bioverfügbarkeit und antioxidative Wirksamkeit im menschlichen Darm. Die Interventionsstudie mit Ileostoma-Patienten ermöglichte es, Saftinhaltstoffe und Metabolite eines Smoothiees der Apfelsorte Winesap unmittelbar vor der Dickdarmpassage aus den Inhalten der Ileostomabeutel zu gewinnen und in-vitro auf antioxidative Wirksamkeit hin zu überprüfen. Hierbei konnten sowohl zellfrei (TEAC und ORAC Assay) als auch mit der humanen Kolonkarzinomzellinie HT29 ein antioxidatives Potenzial der Ileostoma-Beutelinhalte nachgewiesen werden. Die TEAC- und ORAC-Werte der Ileostoma-Proben zeigten einen deutlichen Anstieg mit einem Maximum bei 4h nach Saftverzehr. Im Vergleich zu den 0h- Ileostombeutel-Inhalten bewirkten die 2h- und 4h-Ileostoma-Beutelinhalte eine signifikanten Reduktion des TBH-induzierten ROS-Levels (DCF-Assay) nach 24h Inkubation in HT29-Zellen. Die Identifizierung als auch die quantitative Erfassung der in den Ileostoma-Proben enthaltenen polyphenolischen Inhaltsstoffe, sowie deren Abbauprodukte könnte Hinweise auf aktivitätsgeleitete Strukturen einzelner polyphenolischer Verbindungen geben. In einer Interventionsstudie an Ratten wurde der Einfluss unterschiedlich hergestellter Apfelsäfte (klarer/ trüber AS, Smoothie, im Vergleich zu einem polyphenolfreien Kontrollsaft) auf die Modulation ARE abhängiger Genexpression in Kolon und Leber männlicher SD-Ratten mittels duplex RT-PCR untersucht. Die aus der vorliegenden Interventionsstudie an Ratten gewonnen Ergebnisse, weisen auf eine Erhöhung der antioxidativen Abwehr durch polyphenolische Apfelsäfte hin. Die Induktion der redoxsensitiven Genexpression variierte hierbei in ihrer Stärke je nach Zielgewebe (Kolon > Leber) und Art des Saftes (trüber > klarer ~ Smoothie). Ergänzend zu den von Spormann et al. untersuchten Biomarkern wurden Genexpressionsuntersuchungen aus PBMCs von Hämodialyse-Patienten mittels Real Time TaqMan PCR durchgeführt. Hierbei wurde neben der Expression ausgewählter glutathionbezogener Gene (g-GCL, GPX1, GSR) auch die Nrf2 Transkription, sowie die Genexpression des inflammatorischen Enzyms COX-2 erfasst. Im Vergleich zur Woche 1 der run-in Phase zeigt sich nach Intervention mit rotem Mehrfruchtsaft ein deutlicher Anstieg der mRNA Expression in den meisten antioxidativen Zielgenen, die COX-2 Genexpression wurde dagegen während der Saftaufnahme leicht herunterreguliert. The risk of cancer and other degenerative diseases is inversely correlated with consumption of fruits and vegetables. This beneficial effect is mainly attributed to secondary plant constituents such as polyphenols, supposed to play a major role in protection against ROS (reactive oxygen species) associated toxicity. In addition to the direct antioxidative capacity of polyphenols, modulation of redox-sensitive gene expression, such as of gamma-glutamate-cysteine ligase (g-GCL), which catalyzes the rate-limiting step of glutathione synthesis, is of particular interest. Inter alia we investigated the modulation of antioxidant response element (ARE)- dependent genes (g-GCL: catalytic and modulatory subunits, glutathione peroxidase 2: GPX2, glutathione reductase: GSR and erythroid-derived 2-like 2: Nrf2) by phenolic juice extracts from table and cider apple varieties (AE02, AE03), known to elevate the glutathione level in HT-29 and Caco-2 cells. The aglyca quercetin (Qu) and phloretin (Ph), the constituents rutin (Ru), chlorogenic acid (ChA), caffeic acid (CA) and two known inducers of g-GCL (menadione, Mn; sulforaphane, Sul), were also studied. mRNA levels were quantified by Real Time TaqMan PCR after 6 and 24h incubation. In conclusion, modulation of gene expression by aglyca, rutin and AEs varied with cell type and structure of the compounds: Qu and AE03 (rich in quercetin glycosides) are most effective, elevating g-GCL transcription. A relation between g-GCL transcription and glutathione level was partially observed, e.g. with Qu and AE03 (both effective in Caco-2 cells) and AE02 (not effective in HT-29 cells). The results obtained with Su and Mn in HT-29 cells showed similar patterns for the ARE- dependent genes g-GCL, GPX2 and GSR. In an intervention study, 10 healthy probands with terminal ileostomy consumed 0.7L of a pulp enriched apple juice (Smoothie) and the ileostomy bags were collected at different time points (before juice consumption (0h) and after intervention: 1h, 2h, 4h, 6h and 8h). The aim of the study was to characterize the antioxidative effectiveness of the lyophilized ileostomy bag contents in-vitro after fermentation of the polyphenol-rich Smoothie in-vivo. The results show a distinct cell free antioxidant activity (TEAC and ORAC Assay) of the lyophilized samples, exhibiting a maximum by the samples at 4h after juice intervention. The tert-butyl hydroperoxide (TBH) induced reactive oxygen (ROS)-level (DCF-Assay) was significantly decreased in the HT-29 cell line by the 2h and 4h lyophilisate samples. Further, we studied the potential of differently manufactured apple juices (clear AJ/ cloudy AJ/ smoothie, in comparison to a polyphenol free control juice) to modulate expression of antioxidant response element (ARE)-dependent genes in male Sprague-Dawley rats. Expression of target genes (superoxide dismutase, SOD1/ SOD2; GPX1/ GPX2; g-GCL; GSR; catalase, CAT; NAD(P)H quinone oxidoreductase 1, NQO1 and transcription factor Nrf2, was quantified with duplex RT-PCR, using glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) as endogenous control. In colon and liver of rats consuming polyphenol-free control juice, rather similar basic expressions were observed (relative GAPDH ratios ranging from 2 - 0.7 and 2.5 - 0.3, respectively). In the distal colon, apple juice intervention slightly but significantly induced most genes (e.g. GPX2, GSR, CAT, Nrf2; p clear AJ ~ smoothie). Taken together, the results underline the potential of polyphenol rich apple juice to increase the expression of ARE dependent antioxidant genes. Uptake of fruit juice with especially high flavonoid/polyphenol content has been shown to reduce oxidative cell damage in healthy probands (Weisel et al. 2006) and might also be utilized as preventive measure in hemodialysis (HD)-patients. An intervention study with patients on hemodialysis was performed by Spormann et al. with mixed fruit juice (Spormann et al. 2008) and from blood samples of 10 HD-patients of the aforementioned study we investigated the modulation of ARE dependent (g-GCL, GPX1, GSR, Nrf2), as well as inflammatory (Cyclooxygenase-2, Cox-2) gene expression in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). During the juice intervention phase a distinct increase in expression of most antioxidant genes was observed, whereas expression of the inflammatory Cox-2 gene was moderately down regulated. In conclusion, the red fruit juice clearly shows a marked potential to elevate antioxidant gene expression in HD-patients.

Neben dem Verzehr von Obst und Gemüse wird auch Fruchtsäften eine Bedeutung für die Prävention chronisch entzündlicher Darmerkrankungen und Dickdarmkrebs beigemessen. Neben der direkten antioxidativen Kapazität polyphenolischer Inhaltstoffe spielt vermutlich auch deren Einfluss auf die Expression redoxsensitiver Gene, wie z.B. der gamma-Glutamylcystein-Ligase (g-GCL) eine protektive Rolle. Die in-vitro Arbeiten an den Kolontumorzelllinien verfolgten das Ziel die antioxidative Wirksamkeit verschiedener Apfelsaftextrakte zu charakterisieren. Hierbei wurde der Einfluss der Aglyka Quercetin und Phloretin, der Inhaltsstoffe Chlorogensäure und Kaffeesäure, sowie der Apfelsaftextrakte AE02 /03 und AE05 auf die Transkription redoxsensitiver Zielgene in HT-29 und Caco-2 Zellen nach 6- und 24h-Inkubation mittels Real Time TaqMan PCR untersucht. Als Referenzverbindungen wurden Sulforaphan und Menadion eingesetzt. Die für den Glutathion-Redoxstatus relevanten ARE-abhängigen Gene GPX2 und GSR, sowie die Nrf2 Genexpression wurden in die Untersuchungen miteinbezogen. Die Ergebnisse zeigen u.a. charakteristische, zellspezifische Unterschiede in der Modulation der antioxidativen Genexpression, bei der sich die HT-29 Zellen vor allem im Hinblick auf die gewählte Inkubationszeit und Konzentration der untersuchten Testmaterialien als sensitiver erwiesen. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war die Charakterisierung eines polyphenolreichen Smoothies im Hinblick auf Bioverfügbarkeit und antioxidative Wirksamkeit im menschlichen Darm. Die Interventionsstudie mit Ileostoma-Patienten ermöglichte es, Saftinhaltstoffe und Metabolite eines Smoothiees der Apfelsorte Winesap unmittelbar vor der Dickdarmpassage aus den Inhalten der Ileostomabeutel zu gewinnen und in-vitro auf antioxidative Wirksamkeit hin zu überprüfen. Hierbei konnten sowohl zellfrei (TEAC und ORAC Assay) als auch mit der humanen Kolonkarzinomzellinie HT29 ein antioxidatives Potenzial der Ileostoma-Beutelinhalte nachgewiesen werden. Die TEAC- und ORAC-Werte der Ileostoma-Proben zeigten einen deutlichen Anstieg mit einem Maximum bei 4h nach Saftverzehr. Im Vergleich zu den 0h- Ileostombeutel-Inhalten bewirkten die 2h- und 4h-Ileostoma-Beutelinhalte eine signifikanten Reduktion des TBH-induzierten ROS-Levels (DCF-Assay) nach 24h Inkubation in HT29-Zellen. Die Identifizierung als auch die quantitative Erfassung der in den Ileostoma-Proben enthaltenen polyphenolischen Inhaltsstoffe, sowie deren Abbauprodukte könnte Hinweise auf aktivitätsgeleitete Strukturen einzelner polyphenolischer Verbindungen geben. In einer Interventionsstudie an Ratten wurde der Einfluss unterschiedlich hergestellter Apfelsäfte (klarer/ trüber AS, Smoothie, im Vergleich zu einem polyphenolfreien Kontrollsaft) auf die Modulation ARE abhängiger Genexpression in Kolon und Leber männlicher SD-Ratten mittels duplex RT-PCR untersucht. Die aus der vorliegenden Interventionsstudie an Ratten gewonnen Ergebnisse, weisen auf eine Erhöhung der antioxidativen Abwehr durch polyphenolische Apfelsäfte hin. Die Induktion der redoxsensitiven Genexpression variierte hierbei in ihrer Stärke je nach Zielgewebe (Kolon > Leber) und Art des Saftes (trüber > klarer ~ Smoothie). Ergänzend zu den von Spormann et al. untersuchten Biomarkern wurden Genexpressionsuntersuchungen aus PBMCs von Hämodialyse-Patienten mittels Real Time TaqMan PCR durchgeführt. Hierbei wurde neben der Expression ausgewählter glutathionbezogener Gene (g-GCL, GPX1, GSR) auch die Nrf2 Transkription, sowie die Genexpression des inflammatorischen Enzyms COX-2 erfasst. Im Vergleich zur Woche 1 der run-in Phase zeigt sich nach Intervention mit rotem Mehrfruchtsaft ein deutlicher Anstieg der mRNA Expression in den meisten antioxidativen Zielgenen, die COX-2 Genexpression wurde dagegen während der Saftaufnahme leicht herunterreguliert. The risk of cancer and other degenerative diseases is inversely correlated with consumption of fruits and vegetables. This beneficial effect is mainly attributed to secondary plant constituents such as polyphenols, supposed to play a major role in protection against ROS (reactive oxygen species) associated toxicity. In addition to the direct antioxidative capacity of polyphenols, modulation of redox-sensitive gene expression, such as of gamma-glutamate-cysteine ligase (g-GCL), which catalyzes the rate-limiting step of glutathione synthesis, is of particular interest. Inter alia we investigated the modulation of antioxidant response element (ARE)- dependent genes (g-GCL: catalytic and modulatory subunits, glutathione peroxidase 2: GPX2, glutathione reductase: GSR and erythroid-derived 2-like 2: Nrf2) by phenolic juice extracts from table and cider apple varieties (AE02, AE03), known to elevate the glutathione level in HT-29 and Caco-2 cells. The aglyca quercetin (Qu) and phloretin (Ph), the constituents rutin (Ru), chlorogenic acid (ChA), caffeic acid (CA) and two known inducers of g-GCL (menadione, Mn; sulforaphane, Sul), were also studied. mRNA levels were quantified by Real Time TaqMan PCR after 6 and 24h incubation. In conclusion, modulation of gene expression by aglyca, rutin and AEs varied with cell type and structure of the compounds: Qu and AE03 (rich in quercetin glycosides) are most effective, elevating g-GCL transcription. A relation between g-GCL transcription and glutathione level was partially observed, e.g. with Qu and AE03 (both effective in Caco-2 cells) and AE02 (not effective in HT-29 cells). The results obtained with Su and Mn in HT-29 cells showed similar patterns for the ARE- dependent genes g-GCL, GPX2 and GSR. In an intervention study, 10 healthy probands with terminal ileostomy consumed 0.7L of a pulp enriched apple juice (Smoothie) and the ileostomy bags were collected at different time points (before juice consumption (0h) and after intervention: 1h, 2h, 4h, 6h and 8h). The aim of the study was to characterize the antioxidative effectiveness of the lyophilized ileostomy bag contents in-vitro after fermentation of the polyphenol-rich Smoothie in-vivo. The results show a distinct cell free antioxidant activity (TEAC and ORAC Assay) of the lyophilized samples, exhibiting a maximum by the samples at 4h after juice intervention. The tert-butyl hydroperoxide (TBH) induced reactive oxygen (ROS)-level (DCF-Assay) was significantly decreased in the HT-29 cell line by the 2h and 4h lyophilisate samples. Further, we studied the potential of differently manufactured apple juices (clear AJ/ cloudy AJ/ smoothie, in comparison to a polyphenol free control juice) to modulate expression of antioxidant response element (ARE)-dependent genes in male Sprague-Dawley rats. Expression of target genes (superoxide dismutase, SOD1/ SOD2; GPX1/ GPX2; g-GCL; GSR; catalase, CAT; NAD(P)H quinone oxidoreductase 1, NQO1 and transcription factor Nrf2, was quantified with duplex RT-PCR, using glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) as endogenous control. In colon and liver of rats consuming polyphenol-free control juice, rather similar basic expressions were observed (relative GAPDH ratios ranging from 2 - 0.7 and 2.5 - 0.3, respectively). In the distal colon, apple juice intervention slightly but significantly induced most genes (e.g. GPX2, GSR, CAT, Nrf2; p clear AJ ~ smoothie). Taken together, the results underline the potential of polyphenol rich apple juice to increase the expression of ARE dependent antioxidant genes. Uptake of fruit juice with especially high flavonoid/polyphenol content has been shown to reduce oxidative cell damage in healthy probands (Weisel et al. 2006) and might also be utilized as preventive measure in hemodialysis (HD)-patients. An intervention study with patients on hemodialysis was performed by Spormann et al. with mixed fruit juice (Spormann et al. 2008) and from blood samples of 10 HD-patients of the aforementioned study we investigated the modulation of ARE dependent (g-GCL, GPX1, GSR, Nrf2), as well as inflammatory (Cyclooxygenase-2, Cox-2) gene expression in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). During the juice intervention phase a distinct increase in expression of most antioxidant genes was observed, whereas expression of the inflammatory Cox-2 gene was moderately down regulated. In conclusion, the red fruit juice clearly shows a marked potential to elevate antioxidant gene expression in HD-patients.

Es ist bekannt, dass die Genese von Darmerkrankungen von der aufgenommenen Nahrung beeinflusst wird. Der Genuss von Apfelprodukten mit hoher antioxidativer Wirksamkeit könnte daher zur Prävention ROS-assoziierter Erkrankungen beitragen. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung von polyphenolreichen Extrakte aus Apfelsaft (AE01–AE07), Tresterextraktionssaft (AE03B, AE06B) und Apfelschalen (GS, PE) sowie von Polyphenolen auf ihr Potenzial zur Verringerung oxidativer Zellschäden in Caco-2 Zellen. Zur Annäherung an die in vivo-Situation wurden mit Darmbakterien fermentierte Apfelsaftextrakte/Trub in die Untersuchungen einbezogen, dabei entstehende Abbauprodukte wurden charakterisiert und ebenfalls geprüft. Untersuchte Parameter waren (oxidative) DNA-Schädigung, zellulärer ROS-Level, GSH-Spiegel und SOD1-Expression. Zusätzlich wurde die zellfreie antioxidative Kapazität (ORAC/TEAC) erfasst. Die antioxidative Kapazität aller Extrakte war hoch und korrelierte mit dem Gehalt an Polyphenolen bzw. Procyanidinen. Der zelluläre ROS-Level wurde am effektivsten durch AE07 und GS reduziert, während AE05, AE06B und GS den besten Schutz vor oxidativen DNA-Schäden boten. Eine Erhöhung des tGSH-Spiegels konnte durch Inkubation mit AE06, AE07, GS und PE erreicht werden. Die Ergebnisse legen nahe, dass vor allem Flavonol/Procyanidin-reiche Extrakte eine gute protektive Wirksamkeit aufweisen. Die fermentierten Extrakte zeigten eine deutliche antioxidative Wirksamkeit, was vor allem den identifizierten phenolischen Abbauprodukten zugeschrieben werden konnte, die fast alle eine ausgeprägte Wirksamkeit im zellfreien und zellulären System zeigten. Es ist nicht auszuschließen, dass auch andere Komponenten (wie z.B. SCFA) zur protektiven Wirksamkeit fermentierter Extrakte beitragen könnten. Der fermentierte Trub erwies sich in den Untersuchungen als unwirksam, da in ihm keine Polyphenole identifiziert werden konnten. Weiterhin wurden auch Polyphenol-vermittelte prooxidative Effekte untersucht, für die sich neben einer starken Strukturabhängigkeit die Wahl des verwendeten Mediums als entscheidender Faktor für die beobachtete H2O2-Bildung erwies. Es wurden keine adversen Effekte auf zelluläre Marker beobachtet, vielmehr könnte die Wirksamkeit der Polyphenole durch geringe Mengen an ROS unterstützt werden, da diese die antioxidative Abwehr der Zellen aktivieren. Insgesamt erwiesen sich phenolische Extrakte aus Apfelbestandteilen als wirksame Antioxidanzien mit hohem Potenzial zur Verringerung oxidativer Zellschäden in humanen Kolonzellen. In begleitenden Untersuchungen mit Einzelstoffen wurden Polyphenole identifiziert, die wesentlich zur protektiven Wirkung der Extrakte beitragen. Es konnte gezeigt werden, dass die protektive Wirksamkeit von Extrakten und Inhaltsstoffen trotz intestinalen Abbaus persistiert und dass eine moderate prooxidative Wirksamkeit der Polyphenole in Zellen einen günstigen Einfluss auf deren antioxidative Abwehr ausüben kann. Pathogenesis of colon cancer and other diseases are markedly influenced by nutrition. Uptake of apple products with a high antioxidant capacity could therefore exhibit a beneficial effect regarding their prevention, as they are mainly correlated with increased oxidative stress. In this work the capacity of polyphenol-enriched extracts derived from apple juices (AE01-AE07), apple pomace extraction juices (AE03B, AE06B) and apple peels (GS, PE) as well as from single phenolic constituents on reduction of oxidative cell damage in the human colon cancer cell line Caco-2 was studied. To approach the in vivo-situation, phenolic apple extracts / apple lees were anaerobically fermented using human fecal microbiota; emerging degradation products were identified and also tested on antioxidant behaviour. The endpoints assessed included modulation of DNA (oxidation) damage and cellular redox-status, glutathione (GSH) level, expression of antioxidant enzyme SOD1 (superoxide dismutase, isoform 1). Additionally, cell free antioxidant capacity of the extracts/compounds was measured by ORAC and TEAC assay. Cell free antioxidant capacity of all extracts was distinct and correlated with their amount of polyphenols and procyanidins, respectively. Modulation of cellular redox-status was most effective by incubation with AE07 and GS, while AE05, AE06B, and GS were the most effective reducers of DNA (oxidation) damage. Cellular GSH-level was increased by AE06, AE07, GS, and PE in higher concentrations. The results suggest that particularly flavonol-/procyanidin-rich extracts exhibit a distinct antioxidant effectiveness. Fermented extracts also show antioxidant behaviour, which is mainly due to their amount of phenolic degradation products. These were found to be effective antioxidants in both cell free and cellular systems. We cannot exclude that also other, non-phenolic degradation products (e.g. short chain fatty acids, SCFA) account for the protective efficacy of the fermented apple juice extracts. The fermented apple lees exhibited no antioxidant effectiveness at all, potentially due to the absence of any phenolic constituents. Furthermore, polyphenol-mediated prooxidative effects (generation of hydrogen peroxide, H2O2, by polyphenol incubation) were studied, showing a strong dependence on polyphenol structure and cell culture medium type. No adverse effects of extracellularly generated H2O2 were observed with cellular markers; in fact, cellular antioxidant defense could be induced by small amounts of reactive oxygen species. Phenolic extracts from apple were identified as antioxidants with a high potency to reduce oxidative cell damage in human colon cells. Accompanying studies with apple constituents could identify polyphenols that contribute to the effects observed in apple juice extracts. We were also able to show that protective efficacy of the extracts and constituents persists intestinal degradation and that a moderate prooxidative efficacy of polyphenols can induce cellular defense. Taken together, phenolic extracts from apple products show distinct antioxidant effectiveness against oxidative cell damage, especially when rich in flavonols or procyanidins, also persisting during intestinal degradation.

graph. Darst.

Es ist bekannt, dass die Genese von Darmerkrankungen von der aufgenommenen Nahrung beeinflusst wird. Der Genuss von Apfelprodukten mit hoher antioxidativer Wirksamkeit könnte daher zur Prävention ROS-assoziierter Erkrankungen beitragen. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung von polyphenolreichen Extrakte aus Apfelsaft (AE01–AE07), Tresterextraktionssaft (AE03B, AE06B) und Apfelschalen (GS, PE) sowie von Polyphenolen auf ihr Potenzial zur Verringerung oxidativer Zellschäden in Caco-2 Zellen. Zur Annäherung an die in vivo-Situation wurden mit Darmbakterien fermentierte Apfelsaftextrakte/Trub in die Untersuchungen einbezogen, dabei entstehende Abbauprodukte wurden charakterisiert und ebenfalls geprüft. Untersuchte Parameter waren (oxidative) DNA-Schädigung, zellulärer ROS-Level, GSH-Spiegel und SOD1-Expression. Zusätzlich wurde die zellfreie antioxidative Kapazität (ORAC/TEAC) erfasst. Die antioxidative Kapazität aller Extrakte war hoch und korrelierte mit dem Gehalt an Polyphenolen bzw. Procyanidinen. Der zelluläre ROS-Level wurde am effektivsten durch AE07 und GS reduziert, während AE05, AE06B und GS den besten Schutz vor oxidativen DNA-Schäden boten. Eine Erhöhung des tGSH-Spiegels konnte durch Inkubation mit AE06, AE07, GS und PE erreicht werden. Die Ergebnisse legen nahe, dass vor allem Flavonol/Procyanidin-reiche Extrakte eine gute protektive Wirksamkeit aufweisen. Die fermentierten Extrakte zeigten eine deutliche antioxidative Wirksamkeit, was vor allem den identifizierten phenolischen Abbauprodukten zugeschrieben werden konnte, die fast alle eine ausgeprägte Wirksamkeit im zellfreien und zellulären System zeigten. Es ist nicht auszuschließen, dass auch andere Komponenten (wie z.B. SCFA) zur protektiven Wirksamkeit fermentierter Extrakte beitragen könnten. Der fermentierte Trub erwies sich in den Untersuchungen als unwirksam, da in ihm keine Polyphenole identifiziert werden konnten. Weiterhin wurden auch Polyphenol-vermittelte prooxidative Effekte untersucht, für die sich neben einer starken Strukturabhängigkeit die Wahl des verwendeten Mediums als entscheidender Faktor für die beobachtete H2O2-Bildung erwies. Es wurden keine adversen Effekte auf zelluläre Marker beobachtet, vielmehr könnte die Wirksamkeit der Polyphenole durch geringe Mengen an ROS unterstützt werden, da diese die antioxidative Abwehr der Zellen aktivieren. Insgesamt erwiesen sich phenolische Extrakte aus Apfelbestandteilen als wirksame Antioxidanzien mit hohem Potenzial zur Verringerung oxidativer Zellschäden in humanen Kolonzellen. In begleitenden Untersuchungen mit Einzelstoffen wurden Polyphenole identifiziert, die wesentlich zur protektiven Wirkung der Extrakte beitragen. Es konnte gezeigt werden, dass die protektive Wirksamkeit von Extrakten und Inhaltsstoffen trotz intestinalen Abbaus persistiert und dass eine moderate prooxidative Wirksamkeit der Polyphenole in Zellen einen günstigen Einfluss auf deren antioxidative Abwehr ausüben kann. Pathogenesis of colon cancer and other diseases are markedly influenced by nutrition. Uptake of apple products with a high antioxidant capacity could therefore exhibit a beneficial effect regarding their prevention, as they are mainly correlated with increased oxidative stress. In this work the capacity of polyphenol-enriched extracts derived from apple juices (AE01-AE07), apple pomace extraction juices (AE03B, AE06B) and apple peels (GS, PE) as well as from single phenolic constituents on reduction of oxidative cell damage in the human colon cancer cell line Caco-2 was studied. To approach the in vivo-situation, phenolic apple extracts / apple lees were anaerobically fermented using human fecal microbiota; emerging degradation products were identified and also tested on antioxidant behaviour. The endpoints assessed included modulation of DNA (oxidation) damage and cellular redox-status, glutathione (GSH) level, expression of antioxidant enzyme SOD1 (superoxide dismutase, isoform 1). Additionally, cell free antioxidant capacity of the extracts/compounds was measured by ORAC and TEAC assay. Cell free antioxidant capacity of all extracts was distinct and correlated with their amount of polyphenols and procyanidins, respectively. Modulation of cellular redox-status was most effective by incubation with AE07 and GS, while AE05, AE06B, and GS were the most effective reducers of DNA (oxidation) damage. Cellular GSH-level was increased by AE06, AE07, GS, and PE in higher concentrations. The results suggest that particularly flavonol-/procyanidin-rich extracts exhibit a distinct antioxidant effectiveness. Fermented extracts also show antioxidant behaviour, which is mainly due to their amount of phenolic degradation products. These were found to be effective antioxidants in both cell free and cellular systems. We cannot exclude that also other, non-phenolic degradation products (e.g. short chain fatty acids, SCFA) account for the protective efficacy of the fermented apple juice extracts. The fermented apple lees exhibited no antioxidant effectiveness at all, potentially due to the absence of any phenolic constituents. Furthermore, polyphenol-mediated prooxidative effects (generation of hydrogen peroxide, H2O2, by polyphenol incubation) were studied, showing a strong dependence on polyphenol structure and cell culture medium type. No adverse effects of extracellularly generated H2O2 were observed with cellular markers; in fact, cellular antioxidant defense could be induced by small amounts of reactive oxygen species. Phenolic extracts from apple were identified as antioxidants with a high potency to reduce oxidative cell damage in human colon cells. Accompanying studies with apple constituents could identify polyphenols that contribute to the effects observed in apple juice extracts. We were also able to show that protective efficacy of the extracts and constituents persists intestinal degradation and that a moderate prooxidative efficacy of polyphenols can induce cellular defense. Taken together, phenolic extracts from apple products show distinct antioxidant effectiveness against oxidative cell damage, especially when rich in flavonols or procyanidins, also persisting during intestinal degradation.

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, den Umfang der gastrointestinalen Absorption und Metabolisierung von mit der Nahrung aufgenommenen Polyphenolen in vivo zu ermitteln. Darüber hinaus sollte deren systemische Verfügbarkeit anhand von humanen Serum- und Urinproben bestimmt werden. Lebensmittel der Wahl war dabei Apfelsaft. Die Identifizierung und Strukturaufklärung der Polyphenole und ihrer Metabolite erfolgte mittels Hochleistungsflüssigchromatographie-Diodenarray-Detektion (HPLC-DAD), HPLC-Elektrospray-Tandemmassenspektrometrie (HPLC-ESI-MS/MS) sowie Kapillargaschromatographie-Massenspektrometrie (HRGC-MS). Quantitative Analysen wurden mittels HPLC-DAD durchgeführt; für die Bestimmung der Polyphenolgehalte in Urinproben sowie von D-(-)-Chinasäure wurde die HPLC-ESI-MS/MS im Single Reaction Monitoring (SRM) Modus eingesetzt. Zur Etablierung der Polyphenolanalytik und zur Auswahl eines für die Studien geeigneten Saftes wurden die Polyphenolprofile verschiedener Presssäfte aus Most- und Tafeläpfeln sowie kommerziell erhältlicher Apfelsäfte ausgewertet. Für die Säfte aus Tafeläpfeln wurden Polyphenolmengen zwischen 154 und 178 mg/L bestimmt, wohingegen die Säfte aus Mostäpfeln Gehalte zwischen 261 und 970 mg/L aufwiesen. Bei den Säften des Handels wiesen die naturtrüben Apfelsäfte mit 182 bis 459 mg/L höhere Polyphenolgehalte auf als die klaren Produkte (120 - 173 mg/L). Bei oraler Aufnahme kommen die Polyphenole zuerst mit Speichel in Kontakt. Umsetzungen mit zentrifugiertem Speichel führten zu keiner Modifikation der Substanzen. In Gegenwart von nativem Speichel wurden für die ß-glycosidisch gebundenen Flavonoidglycoside hydrolytische Abbaureaktionen in Abhängigkeit der Struktur ihres Zuckerrestes beobachtet. Nach Antibiotikumzugabe wurden deutlich geringere Abbauraten ermittelt. Die Hydrolyse erfolgt demnach hauptsächlich durch Enzyme der bakteriellen Mundflora. Im Weiteren gelangen die Polyphenole über die Speiseröhre in den stark sauren Magen. Zur Überprüfung ihrer Stabilität wurden die Apfelpolyphenole mit künstlichem Magensaft (pH 1,81) über vier Stunden inkubiert. Einzig für Procyanidin B2 wurde ein nahezu vollständiger Abbau nachgewiesen. Nach Passage des Magens erreichen die Polyphenole das neutrale bis leicht alkalische Duodenum. Die Inkubation erfolgte mit simuliertem Duodenalsekret (pH 7,2) über einen Zeitraum von 24 Stunden. Für 5-Kaffeoylchinasäure wurde eine 37%ige Abnahme beobachtet. Dabei wurden 3- und 4-Kaffeolychinasäure, Kaffeesäure, D-(-)-Chinasäure sowie Kaffeesäuremethylester generiert. Vergleichbare Ergebnisse wurden bei der Inkubation von 4-p-Cumaroylchinasäure erhalten. Kaffeesäure unterlag einer 26,3%igen Umsetzung zu Ferulasäure, Dihydrokaffeesäure und Kaffeesäuremethylester. Bei den monomeren Flavan-3-olen wurden mittels HPLC-Analytik an chiraler Phase Epimerisierungen nachgewiesen. Procyanidin B2 war nach vier Stunden nur noch in Spuren erfassbar. Quercetin wurde vollständig in Phloroglucin, 3,4-Dihydroxybenzoesäure und 2,4,6-Trihydroxybenzoesäure gespalten. Um die Verfügbarkeit der Polyphenole im Dickdarm zu untersuchen, wurde eine Interventionsstudie mit naturtrübem Apfelsaft bei Probanden mit einem Stoma des terminalen Ileums durchgeführt. Nach oraler Aufnahme von einem Liter Saft wurde der Ileostomaausfluss über einen Zeitraum von acht Stunden gesammelt. In den Ileostomabeuteln wurden zwischen Null und 33,1% der einzelnen aus dem Apfelsaft aufgenommenen phenolischen Substanzen wiedergefunden. Der ausgeschiedene Anteil der Flavonoidglycoside war dabei abhängig von der Struktur des jeweiligen Zuckerrestes. Als Metabolite waren D-(-)-Chinasäure, 1- und 3-Kaffeoylchinasäure, Phloretin und dessen 2´-O-Glucuronid sowie die Methylester der Kaffee- und p-Cumarsäure nachweisbar. Für die höhermolekularen Procyanidine wurden Wiederfindungen von 90,3% sowie deren partieller Abbau ermittelt. Die systemische Verfügbarkeit der Polyphenole sowie ihre renale Ausscheidung wurden in zwei weiteren Humanstudien mit gesunden Probanden untersucht. Nach Konsum von einem Liter naturtrüben Apfelsaft erfolgten Blutabnahmen über einen Zeitraum von acht Stunden; Urin wurde über einen Zeitraum von 24 Stunden untersucht. Die Bilanzierung der Apfelpolyphenole erfolgte sowohl vor als auch nach enzymatischer Hydrolyse. Kaffeesäure, 5-Kaffeoylchinasäure, 4-p-Cumaroylchinasäure, (-)-Epicatechin, Phloretin und Quercetin waren sowohl im Serum als auch im Urin detektierbar. Insgesamt wurden 5,3% (Serum) bzw. 23% (Urin) der mit dem Saft aufgenommenen phenolischen Verbindungen wiedergefunden. Davon waren im Urin 19,5% in Form hydroxylierter phenolischer Säuren nachweisbar., The objective of the present work was to determine the amount of gastrointestinal absorption and metabolism of polyphenols after food consumption in vivo. Furthermore, their systemic availability should be determined by serum and urine samples.. The food under study was apple juice. Identification and structural elucidation of polyphenols and their metabolites were performed by high-performance liquid chromatography diode-array detection (HPLC-DAD), HPLC electrospray ionization tandem mass spectrometry (HPLC-ESI-MS/MS) as well as high-resolution gas chromatography mass spectrometry (HRGC-MS). Quantitative analyses were performed by HPLC-DAD; for the quantitation of polyphenol contents in the urine samples under study as well as the D-(-)-quinic acid, HPLC-ESI-MS/MS in the single reaction monitoring (SRM) mode was used. For the establishment of polyphenol analysis and for the selection of a suitable juice for the studies, the polyphenol profiles of different pressed juices of cider and dessert apples as well as commercially available apple juices were analysed first of all. For the juices from dessert apples polyphenol amounts ranged between 154 and 178 mg/l, whereas the juices from cider apples showed contents between 261 and 970 mg/l. Among commercially available juices, with 182 to 459 mg/l cloudy apple juices showed higher contents than the clear products (120 - 173 mg/l). By oral consumption, polyphenols come first into contact with saliva. Conversions with centrifuged saliva led to no modification of the substances. In the presence of whole saliva in ß-glycosidic bound flavonoid glycosides hydrolytic decomposition reactions in dependence of their sugar moiety were observed. After the addition of antibiotic, smaller degradation rates were clearly determined. Thus, hydrolysis resulted mainly from the enzymes of the oral bacterial flora. Afterwards, the polyphenols reach the highly acid stomach via the oesophagus. For examination of their stability the apple polyphenols were incubated with artificial gastric juice (pH 1.81) for four hours. Only for procyanidin B2 an almost complete decomposition was demonstrated. Following the passage of the stomach the polyphenols reach the neutral to slightly alkaline duodenum. Incubations were performed with simulated duodenal secretion (pH 7.2) over a period of 24 hours. For 5-caffeoylquinic acid, a decomposition of 37% was observed. Thereby,3- and 4-caffeoylquinic acid, caffeic acid, D-(-)-quinic acid as well as caffeic acid methyl ester were generated. Comparable results were received with the incubation of 4-p-coumaroylquinic acid. 26.3% of the caffeic acid underwent a conversion to ferulic acid, dihydrocaffeic acid and caffeic acid methyl ester. For monomeric flavan-3-ols epimerisation was demonstrated by HPLC analytics using a chiral phase. Only traces of procyanidin B2 were detectable after four hours. Quercetin was split completely into phloroglucinol, 3,4-dihydroxybenzoic acid and 2,4,6-trihydroxybenzoic acid. In order to investigate the availability of polyphenols in the large intestine, an intervention study with cloudy apple juice was accomplished by volunteers with a terminal ileostomy. After oral intake of one litre of juice the ileostomy discharge was collected over a period of eight hours. Between zero and 33.1% of the particular phenolic substances absorbed from the apple juice were recovered in the ileostomy bags. The excreted amount of the flavonoid glycosides depended thereby on the structure of the respective sugar moiety. As metabolites, D-(-)-quinic acid, 1- and 3-caffeoylquinic acid, phloretin and its 2´-O-glucuronide as well as the methyl ester of the caffeic and p-coumaric acid were detectable. For the high-molecular procyanidins recoveries of 90.3% as well as their partial decomposition were detected. The systemic availability of polyphenols as well as their renal elimination was investigated in two further human studies with healthy volunteers, respectively. After consumption of one litre of cloudy apple juice blood samples were taken over a period of eight hours; urine was analysed over a period of 24 hours. The measurement of the apple polyphenols was carried out both before and after enzymatic hydrolysis. Caffeic acid, 5-caffeoylquinic acid, 4-p-coumaroylquinic acid, (-)-epicatechin, phloretin and quercetin were detectable both in serum and urine. Alltogether 5.3% (serum) and 23.0% (urine) of the phenolic compounds consumed with the juice were recovered. In the urine, 19.5% of that was determined in form of hydroxylated phenolic acids.

Das Ziel dieser Arbeit lag in der Aufklärung zellulärer Wirkmechanismen von Apfelpolyphenolen und deren möglicher Relevanz im Hinblick auf die Chemoprävention, insbesondere des kolorektalen Karzinoms. Die Untersuchungen haben gezeigt, dass polyphenolreiche Apfelextrakte in vitro das Wachstum der humanen Kolonkarzinomzelllinie HT29 hemmen, wobei die Induktion von Apoptose eine Rolle zu spielen scheint. Die Ergebnisse dieser Arbeit deuten darauf hin, dass polyphenolreiche Apfelsaftextrakte modulierend in Signalübertragungswege eingreifen, die wesentlich sind für die Regulation von Zellwachstum und Differenzierung. In erster Linie zeichnen sich dabei Effekte auf wachstumsfaktorvermittelte Signalwege ab. Als herausragende Wirkqualität des polyphenolreichen Apfelsaftextraktes AE02 bzw. des Apfeltresterextraktes AE03B ist ihre hocheffektive Hemmung der Proteintyrosinkinase (PTK)-Aktivität des epidermalen Wachstumsfaktorrezeptors (EGFR) zu nennen. Anhand von Untersuchungen zur Modulation des Phosphorylierungsstatus (als ein Maß für die Aktivität des EGFR) konnte gezeigt werden, dass die Hemmwirkung des AE02 nicht limitiert ist auf den isolierten EGFR, sondern auch in intakten Zellen zum Tragen kommt. Insgesamt zeigte sich allerdings, dass die bislang in Apfelextrakten identifizierten Inhaltsstoffe alleine bzw. in der Summe nur marginal sowohl zur Wachstumshemmung als auch zur Hemmung des EGFR beitragen. Oligomere Procyanidine dagegen erwiesen sich als hoch potente Hemmstoffe der PTK-Aktivität des isolierten EGFR. Die Proteinkinase C (PKC)-Isoenzymfamilie spielt ebenfalls eine Schlüsselrolle bei der Regulation von Wachstumsprozessen. In dieser Arbeit wurde der Frage nachgegangen, ob Apfelpolyphenole die PKC-Aktivität im Kolon beeinflussen. Dafür wurden humane Kolonkarzinomzellen im Vergleich zu primären humanen Enterozyten (Biopsie) untersucht. Die Ergebnisse zeigen, dass sowohl die PKC-Aktivität nicht transformierter humaner Enterozyten als auch humaner Kolonkarzinomzellen durch Apfelpolyphenole gehemmt wird. Der Apfelsaftextrakt AE02 konnte als Hemmstoff der isolierten zytosolischen PKC-Aktivität von HT29-Zellen charakterisiert werden. Eine 24-stündige serumfreie Inkubation von HT29-Zellen mit AE02 führt zu einer Hemmung der zytosolischen PKC-Aktivität; sogar in geringeren Konzentrationen im Vergleich zur Hemmwirkung an isolierter PKC. Dies könnte auf einer Hemmung PKC-vorgeschalteter Signalelemente beruhen, die so den hemmenden Effekt von AE02 auf die PKC-Aktivität verstärken könnten. Jedoch zeigte sich nach 24-stündiger Inkubation von HT29-Zellen ein U-förmiger Kurvenverlauf mit einem Anstieg der PKC-Aktivität in hohen Konzentrationen. Nachdem keine PKC-Aktivierung bei Zugabe von Apfelpolyphenolen zu isolierten Enzympräparationen zu beobachten war, kann eine direkte substanzvermittelte Aktivierung ausgeschlossen werden. Die Caspase-3-Aktivierung und die DNA-Fragmentierung, als Merkmale apoptotischer Prozesse; sowie der gezeigte Wiederanstieg des Gesamtproteingehaltes an proapoptotischer PKCdelta nach 24-stündiger Zellinkubation mit AE02 deuten darauf hin, dass die PKC-Aktivierung intermediär als Teil des apoptotischen Prozesses auftritt. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass der polyphenolreiche Apfelsaftextrakt AE02 potent die isolierte, aus humanen Kolonkarzinomzellen immunopräzipitierte, GSK3beta, einem Schlüsselenzym des Wnt-Signalweges, in seiner Aktivität hemmt. Auch in intakten Zellen führt die Inkubation (24 h) von HT29-Zellen mit Apfelpolyphenolen zu einer signifikanten konzentrationsabhängigen Hemmung der zellulären GSK3beta-Aktivität. Damit einher geht die signifikante Abnahme an phosphoryliertem beta-Catenin. Gleichzeitig nimmt unerwarteterweise der Gehalt an Gesamt-beta-Catenin ebenfalls ab. Die Ergebnisse weisen somit darauf hin, dass der polyphenolreiche Apfelsaftextrakt AE02 in humanen Kolonkarzinomzellen keinen Wachstumsstimulus über den Wnt-Signalweg induziert und aufgrund der Reduktion der Expression von beta-Catenin eher antiproliferative Effekte des AE02 zu erwarten sind. Zusammenfassend ist festzustellen, dass Apfelpolyphenole in/unterhalb von Polyphenolkonzentrationen polyphenolreicher Apfelsäfte (z. B. 500 mg/l im Projektsaft AS02), in vitro in Signaltransduktionskaskaden eingreifen, die mit der Entstehung kolorektaler Karzinome assoziiert werden.

Epidemiologische Studien geben Hinweise, dass eine obst- und gemüsereiche Kost präventiv gegen verschiedene ROS-assoziierte Krankheiten wirksam ist. Aufgrund der komplexen Zusammensetzung von Nahrungsmitteln ist schwer zu erfassen, welche Inhaltsstoffe für die Wirksamkeit maßgeblich sind. Phenolische Apfelsaftextrakte (AEs) aus Säften unterschiedlicher Apfelsorten und ein Tresterextrakt (APE03) wurden auf ihr Potenzial zur Verringerung oxidativer Zellschäden in Darmzellen untersucht. Ein zweistufiges Inkubationsprotokoll kam in humanen Kolonzelllinien (Caco-2, HT29) zur Anwendung: basierend auf einer 24 h Behandlung mit phenolischem Antioxidans, gefolgt von einer Induktion von oxidativem Stress (durch Menadion, 1 h bzw. tert-Butylhydroperoxid, 40 min), um eine pathologische in vivo Situation nachzustellen. Die Apfelsaftextrakte wurden im Vergleich zu als Antioxidanzien beschriebenen Saftinhaltsstoffen (Rutin, Phloridzin, Epicatechin, Kaffeesäure, Chlorogensäure) und zu entsprechenden rekonstituierten Mischungen (rAEs) geprüft. Untersuchte Parameter waren (oxidative) DNA-Schädigung, zellulärer ROS-Level und Glutathionspiegel. Zusätzlich wurden antioxidative Kapazität und die Stabilität der Einzelstoffe unter Inkubationsbedingungen erfasst. Die Apfelsaftextrakte zeigten eine ausgeprägte antioxidative Kapazität (3.6-4.2 mM Trolox), der Tresterextrakt APE03 war dabei wirksamer als die drei Saftextrakte. Die höheren TEAC-Werte der entsprechenden rAEs (4.7-7.3 mM Trolox) deuten auf eine zentrale Rolle der Einzelstoffe in der Mischung hin. Der zelluläre ROS-Level wurde durch die Extrakte AE01, AE02 und APE03 (1-100 µg/mL) und rAEs (0.5-50 µg/mL) in beiden Zelllinien signifikant verringert. AE04 war nur in HT29 Zellen wirksam. Oxidative DNA-Schäden in Caco-2 Zellen wurden durch die Extrakte (50-100 µg/mL) und deutlicher durch die rekonstituierten Mischungen (1 µg/mL) von AE01 und APE03 verringert. Von den Saftinhaltsstoffen zeigten Kaffeesäure und Rutin das höchste Potenzial zur Verringerung von DNA-Schäden; der zelluläre ROS-Level wurde am effektivsten durch Kaffeesäure und Chlorogensäure verringert. Der Glutathionspiegel von Caco-2 Zellen wurde durch AE02 und APE03 sowie durch Kaffeesäure, nicht jedoch durch andere Einzelstoffe oder Mischungen erhöht. Die Aglyka Quercetin und Phloretin, die aus Glykosiden im Intestinaltrakt freigesetzt werden können, wiesen in allen Endpunkten die höchste Wirksamkeit auf. Humane primäre Kolonzellen erwiesen sich in den Untersuchungen als ein weniger geeignetes Modellsystem, möglicherweise aufgrund der Art der gewählten Inkubation. Insgesamt erwiesen sich die phenolischen Apfelsaftextrakte als wirksame Antioxidanzien mit hohem Potenzial zur Verringerung oxidativer Zellschäden in humanen Kolonzelllinien. Mit den begleitenden Untersuchungen von Mischungen und Einzelstoffen wurden Polyphenole (Kaffeesäure, Rutin, Chlorogensäure) identifiziert, die wesentlich zur protektiven Wirkung der Saftextrakte beitragen. Der gewählte in vitro-Prüfansatz erwies sich dabei als geeignet zur Charakterisierung der antioxidativen Wirksamkeit von Apfelsaftinhaltsstoffen in Darmzellen. Die antioxidative Wirksamkeit kann nicht alleine auf die untersuchten Hauptkomponenten zurückgeführt werden. Es liegt nahe, dass auch bisher nicht charakterisierte Substanzen/ Substanzgruppen ebenfalls einen Beitrag an der antioxidativen Wirksamkeit leisten. Eine möglichst umfassende Charaktersisierung von Apfelsaftinhaltsstoffen ist notwendig, gerade im Hinblick auf eine mögliche Prävention von Darmerkrankungen durch die Aufnahme von Apfelsaft.

Das Ziel dieser Arbeit lag in der Aufklärung zellulärer Wirkmechanismen von Apfelpolyphenolen und deren möglicher Relevanz im Hinblick auf die Chemoprävention, insbesondere des kolorektalen Karzinoms. Die Untersuchungen haben gezeigt, dass polyphenolreiche Apfelextrakte in vitro das Wachstum der humanen Kolonkarzinomzelllinie HT29 hemmen, wobei die Induktion von Apoptose eine Rolle zu spielen scheint. Die Ergebnisse dieser Arbeit deuten darauf hin, dass polyphenolreiche Apfelsaftextrakte modulierend in Signalübertragungswege eingreifen, die wesentlich sind für die Regulation von Zellwachstum und Differenzierung. In erster Linie zeichnen sich dabei Effekte auf wachstumsfaktorvermittelte Signalwege ab. Als herausragende Wirkqualität des polyphenolreichen Apfelsaftextraktes AE02 bzw. des Apfeltresterextraktes AE03B ist ihre hocheffektive Hemmung der Proteintyrosinkinase (PTK)-Aktivität des epidermalen Wachstumsfaktorrezeptors (EGFR) zu nennen. Anhand von Untersuchungen zur Modulation des Phosphorylierungsstatus (als ein Maß für die Aktivität des EGFR) konnte gezeigt werden, dass die Hemmwirkung des AE02 nicht limitiert ist auf den isolierten EGFR, sondern auch in intakten Zellen zum Tragen kommt. Insgesamt zeigte sich allerdings, dass die bislang in Apfelextrakten identifizierten Inhaltsstoffe alleine bzw. in der Summe nur marginal sowohl zur Wachstumshemmung als auch zur Hemmung des EGFR beitragen. Oligomere Procyanidine dagegen erwiesen sich als hoch potente Hemmstoffe der PTK-Aktivität des isolierten EGFR. Die Proteinkinase C (PKC)-Isoenzymfamilie spielt ebenfalls eine Schlüsselrolle bei der Regulation von Wachstumsprozessen. In dieser Arbeit wurde der Frage nachgegangen, ob Apfelpolyphenole die PKC-Aktivität im Kolon beeinflussen. Dafür wurden humane Kolonkarzinomzellen im Vergleich zu primären humanen Enterozyten (Biopsie) untersucht. Die Ergebnisse zeigen, dass sowohl die PKC-Aktivität nicht transformierter humaner Enterozyten als auch humaner Kolonkarzinomzellen durch Apfelpolyphenole gehemmt wird. Der Apfelsaftextrakt AE02 konnte als Hemmstoff der isolierten zytosolischen PKC-Aktivität von HT29-Zellen charakterisiert werden. Eine 24-stündige serumfreie Inkubation von HT29-Zellen mit AE02 führt zu einer Hemmung der zytosolischen PKC-Aktivität; sogar in geringeren Konzentrationen im Vergleich zur Hemmwirkung an isolierter PKC. Dies könnte auf einer Hemmung PKC-vorgeschalteter Signalelemente beruhen, die so den hemmenden Effekt von AE02 auf die PKC-Aktivität verstärken könnten. Jedoch zeigte sich nach 24-stündiger Inkubation von HT29-Zellen ein U-förmiger Kurvenverlauf mit einem Anstieg der PKC-Aktivität in hohen Konzentrationen. Nachdem keine PKC-Aktivierung bei Zugabe von Apfelpolyphenolen zu isolierten Enzympräparationen zu beobachten war, kann eine direkte substanzvermittelte Aktivierung ausgeschlossen werden. Die Caspase-3-Aktivierung und die DNA-Fragmentierung, als Merkmale apoptotischer Prozesse; sowie der gezeigte Wiederanstieg des Gesamtproteingehaltes an proapoptotischer PKCdelta nach 24-stündiger Zellinkubation mit AE02 deuten darauf hin, dass die PKC-Aktivierung intermediär als Teil des apoptotischen Prozesses auftritt. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass der polyphenolreiche Apfelsaftextrakt AE02 potent die isolierte, aus humanen Kolonkarzinomzellen immunopräzipitierte, GSK3beta, einem Schlüsselenzym des Wnt-Signalweges, in seiner Aktivität hemmt. Auch in intakten Zellen führt die Inkubation (24 h) von HT29-Zellen mit Apfelpolyphenolen zu einer signifikanten konzentrationsabhängigen Hemmung der zellulären GSK3beta-Aktivität. Damit einher geht die signifikante Abnahme an phosphoryliertem beta-Catenin. Gleichzeitig nimmt unerwarteterweise der Gehalt an Gesamt-beta-Catenin ebenfalls ab. Die Ergebnisse weisen somit darauf hin, dass der polyphenolreiche Apfelsaftextrakt AE02 in humanen Kolonkarzinomzellen keinen Wachstumsstimulus über den Wnt-Signalweg induziert und aufgrund der Reduktion der Expression von beta-Catenin eher antiproliferative Effekte des AE02 zu erwarten sind. Zusammenfassend ist festzustellen, dass Apfelpolyphenole in/unterhalb von Polyphenolkonzentrationen polyphenolreicher Apfelsäfte (z. B. 500 mg/l im Projektsaft AS02), in vitro in Signaltransduktionskaskaden eingreifen, die mit der Entstehung kolorektaler Karzinome assoziiert werden.

In der vorliegenden Arbeit wird durch Stufenkontrollen bei der Herstellung von Fruchtsäften geklärt, welchen Einfluss klassische undmoderne Verfahrenstechnologien auf die antioxidativ wirksamen Inhaltsstoffe von Apfel- und Beerensäften haben. Ziel ist es, Fruchtsäftemit hohen, optimierten Gehalten antioxidativ wirksamen Inhaltsstoffe (Polyphenolen, antioxidative Vitamine) bei hoher Stabilität undsensorischer Qualität herzustellen. Dabei müssen in der Fruchtsaftherstellung speziell die Polyphenole auf eine neue Art betrachtet werden.Es wurde hauptsächlich Apfel- und schwarzer Johannisbeersaft untersucht. Weiterhin wurde die Herstellung von Holunder-, Brombeer-,Stachelbeer- und Sauerkirschsaft sowie die Herstellung von Fruchtweinen und die Veränderung von antioxidativ wirksamen Inhaltsstoffenbei der Reifung von Erdbeeren untersucht. Zur Bestimmung der antioxidativen Kapazität in wässrigen Proben wurde der ABTS+.-Radikalkationen-Test (TEAC assay) verwendet undden Anforderungen entsprechend modifiziert. Eine neue Methode zur Analytik der Polyphenole mittels HPLC an einer fluorierten RP-Phaseund einer Detektion mittels DAD und ECD wurde entwickelt. Es zeigt sich grundsätzlich, dass Beerensäfte aufgrund der hohenPolyphenolgehalte eine deutlich bessere Quelle für Antioxidantien für die menschliche Ernährung sind, als Apfelsäfte mit vergleichsweiseeher geringen Polyphenolgehalten. Als wichtigste Einflussgröße zum Erreichen einer hohen antioxidativen Kapazität im Endprodukt zeigte sich die Wahl der Rohware, da sichverschiedene untersuchten Apfel- bzw. schwarze Johannisbeersorten teilweise erheblich in ihren Gehalten an antioxidativ wirksamenInhaltsstoffen unterscheiden. Die Wahl der richtigen, polyphenolreichen Rohware stellt die Grundlage für eine hohe antioxidative Kapazitätim späteren Produkt dar. Bei der Herstellung von Apfelsaft wurden die Einflüsse auf die antioxidative Kapazität und die Polyphenole von Entsaftung,Maischestandzeit, fruchteigener Polyphenoloxidasen, industriellen Entsaftungssystemen, Separation, thermischer Belastung, Lagerung,Schönung mit Gelatine, Ultrafiltration, der Stabilisierung von ultrafiltriertem Saft mit PVPP oder Adsorberharz und Laccase/O2-Behandlungmit anschließender Ultrafiltration untersucht und bewertet. Bezogen auf den frischen Presssaft wurden bei der Herstellung von naturtrübemApfelsaft ein Verlust an antioxidativer Kapazität durch Separation und Oxidation von 20 - 40% festgestellt. Oxidationsprozesse konntendurch eine KZE des frischen Presssaftes unterbunden werden. Die drei Verfahren in Verbindung mit der Ultrafiltration zur Herstellung vonklarem Apfelsaft zeigte hohe Verluste an antioxidativer Kapazität von 45 - 75% und waren der klassischen Gelatine-Schönung mitVerlusten von 25 - 40% unterlegen. Bei der Herstellung von schwarzem Johannisbeersaft wurden die Einflüsse auf die antioxidative Kapazität von Separation, thermischerBelastung, Schönung mit Gelatine, Behandlung mit PVPP oder Bentonit und Konzentratherstellung untersucht und bewertet. Bei allenuntersuchten Verarbeitungsschritten zur Herstellung von schwarzem Johannisbeersaft war die prozentuale Abnahme der antioxidativenKapazität um 10 - 15% und damit geringer als beim Apfelsaft. Die Maischeerwärmung und -enzymierung erweist sich als günstig, da dieExtraktion der Polyphenole verbessert wird und durch die Temperatur fruchteigene Polyphenoloxidasen inaktiviert werden. Holunder-,Brombeer- und Sauerkirschsaft zeigt sich während der Herstellung ähnlich stabil (prozentuale Abnahmen < 20%). Auch bei diesen stark rotgefärbten Säften ist die Schönung mit Gelatine die günstigste Methode zur Klärung des Saftes. Thermische Belastung verändert dieantioxidative Kapazität zwar nicht, ist aber wegen der hohen Verluste in den Gehalten an monomeren Polyphenolen möglichst gering zuhalten. Generell sollte ein zügiger und logistisch gut durchdachter Herstellungsprozess ohne lange Standzeit angestrebt werden und aufProzessschritten und Behandlungsmaßnahmen, die eine starke Abnahme der antioxidativen Kapazität und der Polyphenole verursachen,verzichtet werden. Die Lagerung verringert die antioxidative Kapazität von trübem Apfelsaft und trübem Holundersaft vor allem durch dasAusfallen des Trubes, verändert sich bei klarem Apfelsaft aber nicht, obwohl deutlich Veränderungen bei den Polyphenolen festgestelltwerden. Die Ergebnisse können der Fruchtsaftindustrie zur Hinterfragung von Herstellungsprozessen im Hinblick auf die antioxidative Kapazität undPolyphenole dienen wie auch als Grundlage zur Entwicklung neuartiger Produkte auf Basis von hochwertigen Fruchtsäften verwendetwerden., The objective of the work is the determination of the influence of modern and classic processing techniques on the antioxidant constituentsin apple and berry juices by stepwise control during the production process of the fruit juices. Those antioxidant constituents in fruit juicesare mainly represented by a group of compounds called polyphenols, which meant to have many positive effect on human health. Furtherdeterminations are performed about the influence of the variety, the ripeness and juice storage on the antioxidative capacity of the fruitjuices. The most important antioxidative compounds in apple and berry juices are the polyphenols and in some berry juices L-ascorbic acidespecially in blackcurrant. Apple and blackcurrant juice were chosen because of their great differences in amount and spectra ofpolyphenols, the amount of L-ascorbic acid and the production process. Stepwise control in the production of elderberry, blackberry,gooseberry and sour cherry juice are also carried out. The changes in antioxidative capacity and the contents of antioxidative compoundsare also determined during fruit wine production and the ripening of strawberry. The antioxidative capacity was performed by the ABTS+.-radicalcation-assay which was modified to meet the present demands.Methodological sources of error could be detected and were eliminated. The used principle of measurement for evaluating the antioxidativecapacity is fast and effective. A new method for the analysis of polyphenols by HPLC was developed using a fluorinated RP-phase and Diode-Array-Detection (DAD)and Electrochemical-Detection (ECD). A good separation of the single polyphenols, simultaneous analysis of colourless polyphenols andanthocyanins and a sensitive and informative detection using two detection systems were achieved. Three anthocyanins from blackcurrant juice and two polyphenols from apple juice, all commercially not available, could be isolated. Due to their high polyphenol contents, most berry juices are generally a better source of antioxidants in human nutrition than apple juice,which contains lower amounts of polyphenols. The variety has the greatest influence on the antioxidative capacity of apple and blackcurrantjuice. The amounts of antioxidative components differ widely in different apple as well as blackcurrant varieties. Choosing a polyphenol-richvariety appeared to be the basis for a high antioxidative capacity in the juice. The influence of mash treatment, mash extraction, apple polyphenol oxidase, industrial extraction system, separation, thermal treatment,storage, fining with gelatine, ultrafiltration with following stabilisation by PVPP or adsorber resin and laccase/O2 treatment followed byultrafiltration on apple juice during processing were studied and discussed. The extraction of the mash transfers only 32% of the potentialantioxidative capacity and 43% of the polyphenols into the juice and could be considered as the processing step causing the greatest lossduring juice production. Mash treatment, e.g. a hold for one hour or heating to 60°C, improves the yield of antioxidants after extraction.Different extraction systems such as horizontal press and decanter yield the same antioxidative capacity but different amounts of individualpolyphenols, even though the total polyphenols (measured by the Folin-Ciocalteu method) are similar. Oxidation processes duringproduction and separation decrease the antioxidative capacity and the polyphenols of freshly pressed apple juice 20 to 40%, which couldbe inhibited by heating of the freshly pressed juice to 55....C. All modern processing techniques for the production of a clear juice usingultrafiltration strongly reduce antioxidative capacity as well as the polyphenols (40 - 75%), while fining with gelatine is more gentle (25 -40% decrease). Therefore, fining with gelatine is the favoured method for apple juice clarification. Generally, under the here applied criteriacloudy apple juice could considered to be superior to its clear counterpart. The influence of mash extraction, separation, thermal treatment, fining with gelatine, treatment with PVPP and bentonite and concentrationprocess on blackcurrant juice during processing were studied and discussed. Decrease of antioxidative capacity and polyphenols duringblackcurrant juice processing (extraction, separation, pasteurisation) is 10 to 15%, which is reasonably lower than observed decrease inapple juice processing. Mash heating and depectinisation is recommended due to a better extraction of polyphenols from the mash (59%antioxidative capacity, 64% polyphenols) and inhibition of polyphenoloxidase activity via temperature induced protein denaturation. Thermaltreatment during the concentration process hardly reduces the antioxidative capacity and total polyphenols (Folin-Ciocalteu) but causes amassive decrease in the amounts of individual polyphenols, especially the anthocyanins. Therefore, the concentration process could not berecommended when refering to recent data on the bioavailability of anthocyanins. Elderberry, blackberry and sour cherry show comparable stability during processing (decrease < 20%). As the generally recommendedmethod for the clarification of berry juices occurs the fining with gelatine. The higher amounts of antioxidants and a lower activity of polyphenol oxidases are most likely responsible for the difference in stabilityduring processing of high coloured berry juice and apple juice. Storage of clear juices, apple and elderberry juice, reduces the totalpolphenols as well as the indiviual polyphenols while the antioxidative capacity remains constant. Formation of new antioxidativecompounds, polymeric phenols, maillard product etc., during storage is suggested as a possible reason for the constant antioxidativecapacity. Fermentation during fruit wine processing hardly effects the antioxidative capacity while the amounts of individual polyphenols aredrastically reduced. Taking this observation into account condensation and polymerisation products formed during fermentation shouldposses a similar antioxidative capacity as their basic molecules. Based on the results, clear recommendations for fruit juice production can be confirmed in order to achieve the highest possibleantioxidative capacity and an optimised amount of polyphenols: 1.The choice of polyphenol-rich fruits is the basis for high antioxidative capacity in the juice. 2.Heating of mash or freshly pressed juice to inactivate polyphenol oxidases. 3.A minimisation of processing steps during fruit juice production to avoid unnecessary reductionsof antioxidative capacity and polyphenols. 4.Fast and effective processing lines to avoid unnecessary hold time. 5.Avoiding all processing steps and juice treatments causing a high reduction of antioxidative capacity and individual polyphenols. The possibility of the development of an antioxidant-rich beverage based on various berry juices could be demonstrated. Polyphenols as fruit juice ingredients were considered from a new point of view and their changes during fruit juice processing were newlyvalued. The results represent a useful tool for the fruit juice industry to evaluate fruit juice processing with the focus on antioxidative capacity andindividual polyphenols and provide information for the development of new products with a high antioxidative capacity.