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Burkitt's lymphoma is a B cell non-Hodgkin's lymphoma characterized in 80% of cases by a chromosomal translocation involving the MYC oncogene on chromosome 8 and the immunoglobulin heavy chain gene IGH on chromosome 14. The development of this lymphoma is intricately linked to the EBV virus, almost always present in endemic forms, and to HIV, which defines a clinical entity. However, little is known about the role played by these viruses in translocation formation. Simultaneous double-strand breaks, non-homologous repair of these breaks, and spatial proximity are the conditions necessary for two loci to form a translocation. We thus investigated the effect of EBV viruses on these three conditions in B lymphocytes. Our results show that EBV reactivation in latently infected B lymphocytes increases the spatial proximity between MYC and IGH, normally located in different compartments. Specific DNA damage on MYC locus seems to induce this relocation of MYC next to IGH in a MRE11-dependant mechanism. We also show that the HIV1-Tat protein can enter B cells and induce an aberrant expression of the AICDA gene increasing the risk of simultaneous DNA double strand breaks on MYC and IGH loci. This work provides evidence for the direct involvement of the EBV lytic cycle in t (8; 14) formation and strengthens previously described data on of HIV1-Tat’s role in this translocation.; Le Lymphome de Burkitt est un lymphome non hodgkinien de type B caractérisé dans 80% des cas par une translocation chromosomique impliquant l’oncogène MYC sur le chromosome 8 et le gène des chaines lourdes d’immunoglobuline IGH sur le chromosome 14. Le développement de ce lymphome est étroitement lié au virus EBV, systématiquement présent dans les formes endémiques et au VIH qui lui définit une entité clinique à part. Cependant, le rôle joué par ces virus dans la formation de la translocation est peu connu. Des cassures double brins simultanées, une réparation non-homologue de ces cassures et une proximité spatiale sont les conditions nécessaires pour que deux loci forment une translocation. Nous avons ainsi investigué l’effet des virus EBV sur ces trois conditions dans les lymphocytes B. Nos résultats montrent que la réactivation du virus EBV dans les lymphocytes B infectées de façon latente augmente la proximité spatiale entre MYC et IGH, normalement situés dans des compartiments différents. Cette relocalisation semble être secondaire à l’induction de dommages d’ADN spécifiques sur MYC et serait médiée par la protéine de réparation de l’ADN MRE11. Nous montrons aussi que la protéine Tat du VIH-1 peut pénétrer dans les cellules B et y induire une expression aberrante du gène AICDA qui peut secondairement introduire des cassures doubles brins simultanées sur MYC et IGH. Ce travail fournit une preuve de l’implication directe du cycle lytique d’EBV dans la formation de la t(8;14) et renforce les données existantes sur le rôle de Tat dans cette translocation.

During my career, my research initially focused on comparing chromosomes from different mammalian species using banding and fluorescence hybridization techniques. This information allowed me to clarify the phylogenetic relationships between these taxa and to discuss the species barrier. Then, still by classical and molecular cytogenetics methods, I studied the impact of the presence of a balanced chromosomal abnormality on the segregation of chromosomes during male or female meiosis. In particular, I was able to assess the percentage of aneuploid spermatozoa and oocytes in cattle carrier of the 1/29 translocation. My current research aims to understand the epigenetic and molecular mechanisms involved in two essential steps of early embryonic development: embryonic genome activation and the transition from totipotency to pluripotency in mammals (mouse, rabbit, cattle). In this context, I am interested in the links between the organization of chromatin and the regulation of the transcription of sequences that compose it. To this end, I directed the development of approaches that allow single-cell analyzes of the organization of chromatin (DNA and histones) and the localization of transcripts (RNA) while maintaining the three-dimensional structure of the nucleus of embryos (protein immunolabeling combined with fluorescence in situ hybridization). The major satellite sequences specific of pericentromeric heterochromatin have a relaxed spatial organization and are strongly transcribed before the embryonic genome activation and then aggregate and are transcribed very little thereafter. Conversely, I was able to show that ribosomal gene sequences are in an aggregated state and are not transcribed before genome activation, and are in more and more dispersed state when they are transcribed. So, the spatial organization (relaxed - aggregated) seems correlated with the (active - inactive) transcription state of these sequences between the 1-cell stage and the morula stage in mice.; Au cours de mon parcours, mes recherches ont dans un premier temps eu pour objectif de comparer les chromosomes de différentes espèces de mammifères par des techniques de marquages en bandes et d'hybridation en fluorescence. Ces informations m'ont permis de clarifier les relations phylogénétiques entre certains taxons et de discuter de la barrière d'espèces. Ensuite, toujours par des méthodes de cytogénétique classique et moléculaire, j'ai étudié l'impact de la présence d'une anomalie chromosomique équilibrée sur la ségrégation des chromosomes lors de la méiose mâle ou femelle. J'ai notamment pu estimer le pourcentage de spermatozoïdes et d'ovocytes aneuploïdes chez les bovins porteurs de la translocation 1/29. Mes recherches actuelles visent à comprendre les mécanismes épigénétiques et moléculaires intervenant lors de deux étapes essentielles du développement embryonnaire précoce : l'activation du génome embryonnaire et le passage de l'état totipotent à pluripotent, chez les mammifères (souris, lapin, bovin). Dans ce cadre, je m'intéresse aux liens entre l'organisation de la chromatine et la régulation de la transcription de séquences qui la composent. A cette fin, j'ai conduit la mise au point d'approches qui permettent des analyses en cellule unique de l'organisation de la chromatine (ADN et histones) et de la localisation des transcrits (ARN) tout en conservant la structure tridimensionnelle du noyau des embryons (immunomarquage de protéines et hybridation in situ en fluorescence). Les séquences satellites majeures, spécifiques de l'hétérochromatine péricentromérique, ont une organisation spatiale relâchée et transcrivent fortement avant la mise en route du génome puis s'agrègent et transcrivent très peu par la suite. A l'inverse, j'ai pu montré que les séquences des gènes ribosomiques sont dans un état agrégé et ne sont pas transcrites avant la mise en route du génome puis sont de plus en plus dispersées quand elles sont transcrites. Ainsi l'organisation spatiale (relâchée - agrégée) semble corrélée avec l'état de transcription (actif - inactif) de ces séquences entre le stade 1-cellule et le stade morula chez la souris.

Eukaryotic cell nuclei contain distinct functionally or structurally defined compartments at multiple scale that present a highly ordered spatial arrangement. Several studies in plants and animals have pointed out to links between nuclear organization and genome functions. A key challenge is to identify rules according to which nuclear compartments are organized in space and to describe how these rules may vary according to physiological or experimental conditions. Spatial statistics have been rarely used for this purpose, and were generally limited to the evaluation of complete spatial randomness. In this Thesis, we develop a spatial statistical approach, which combines cytology, image analysis and spatial modeling to better understand spatial configurations inside the nucleus. Our first contribution is a methodological framework that allows to test models of spatial organization at the population level. Several spatial models have been developed and implemented, including randomness, orbital randomness, maximum regularity, territorial randomness or orbital territorial randomness of biological objects within finite 3D domains of arbitrary shape. New spatial descriptors, in combination with classical ones, are used to compare observed patterns to expected configurations under the tested models. An unbiased version of a previously published statistical test is proposed to evaluate the goodness-of-fit of spatial models over populations of observed patterns. In the second part of this Thesis, we investigate the properties of the proposed approach using simulated and real data. The robustness of the proposed approach to segmentation errors and the reliability of the spatial evaluations are examined. Besides, the basis for a method to compare spatial distributions between different experimental groups is proposed. In the last part of this work, the proposed approach is applied on A. thaliana leaf cell nuclei images to analyze the spatial distribution of chromocenters, which are dynamic and plastic heterochromatic compartments that have an important structural role in the genome. A first application was to analyze isolated and cryo-section nuclei from wild type plants. We show that chromocenters present a highly regular distribution, confirming previously published results. Using new spatial statistical descriptors, we then demonstrate objectively and quantitatively, for the first time, that chromocenters exhibit a preferentially peripheral localization. Employing a new spatial model, we then reject the hypothesis that the regular organization is explained solely by the peripheral positioning. We further demonstrate that chromocenters organization displays a close-to-maximum spatial regularity at the global scale, but not at the local one. Lastly, we use simulations to examine a model according to which chromocenters positioning is constrained by chromosome territories and by interactions with the nuclear boundary. The second application was to elucidate whether chromocenters distribution could be altered under different mutations. We analyze nuclei data from crwn and kaku mutants, which are known to affect nuclear morphology. The results suggest that these mutations impact on nuclear morphology and on heterochromatin features but do not alter the regularity of chromocenters distribution even when the relative distance to the border is affected. The genericity of the proposed framework to analyze object distributions in finite 3D domains and its expandability to add more spatial models and spatial descriptors should be of interest to decipher spatial organizations within biological systems at various scales.; Les noyaux des cellules eucaryotes contiennent différents compartiments définis fonctionnellement ou structurellement et à multiples échelles qui présentent une distribution spatiale très ordonnée. Un défi majeur est alors d'identifier les règles selon lesquelles les compartiments nucléaires sont organisés dans l'espace et de décrire comment ces règles peuvent varier en fonction des conditions physiologiques ou expérimentales. Les statistiques spatiales ont rarement été utilisées à cette fin et se sont généralement limitées à l'évaluation de l'aléatoire complet. Ici, nous développons une approche de statistiques spatiales qui combine la cytologie, l'analyse d'image et la modélisation spatiale pour mieux comprendre les configurations spatiales à l'intérieur du noyau. Notre première contribution est un cadre méthodologique qui permet de tester des modèles d'organisation spatiale au niveau de la population. Plusieurs modèles spatiaux ont été proposés et mis en œuvre, en particulier l'aléatoire, l'aléatoire orbitale, la régularité maximale, l'aléatoire territoriale et l'aléatoire territoriale orbitale, pour analyser la distribution d'objets biologiques dans des domaines 3D finis et de formes arbitraires. De nouveaux descripteurs spatiaux, combinés aux descripteurs classiques, sont utilisés pour comparer les motifs observés à des configurations attendues sous les modèles testés. Une version non biaisée d'un test statistique publié précédemment est proposé pour évaluer la qualité de l'ajustement des modèles spatiaux sur les distributions observées. Après, nous étudions les propriétés de l'approche proposée à partir de données réelles et simulées. La robustesse de l'approche proposée aux erreurs de segmentation et la fiabilité des évaluations spatiales sont examinées. En outre, la base d'une méthode pour comparer les distributions spatiales entre différents groupes expérimentaux est proposée. Dans la dernière partie de ce travail, notre approche est appliquée à des images de noyaux cellulaires de la feuille chez A. thaliana, pour analyser la distribution spatiale de compartiments dynamiques et plastiques d'hétérochromatine, les chromocentres, qui ont un rôle important dans la structure du génome. Des noyaux isolés et des cryo-sections provenant de plantes de type sauvage ont été analysés. Nous montrons que les chromocentres présentent une distribution très régulière, ce qui confirme les résultats publiés précédemment. En utilisant nos nouveaux descripteurs, nous démontrons pour la première fois, objectivement et quantitativement, que les chromocentres présentent une localisation préférentielle périphérique. En employant un nouveau modèle spatial, nous rejetons l'hypothèse selon laquelle l'organisation régulière observée est uniquement expliquée par un positionnement périphérique. Nous démontrons en outre que les chromocentres affichent une régularité spatiale proche de la régularité maximale à l'échelle globale, mais pas à l'échelle locale. Enfin, nous utilisons des simulations pour tester un modèle selon lequel le positionnement des chromocentres est déterminé par les territoires chromosomiques et par des interactions avec l'enveloppe nucléaire. Nous avons ensuite vérifié s'il la distribution des chromocentres pouvait être modifiée par différentes mutations. Nous avons analysé les données de noyaux des mutants crwn et kaku, qui sont connus pour influencer la morphologie nucléaire. Les résultats suggèrent que ces mutations impactent en effet la morphologie nucléaire et les caractéristiques de l'hétérochromatine, mais ne modifient pas la régularité de la distribution des chromocentres même si la distance à la frontière du noyau est affectée. La généricité du cadre proposé pour analyser les distributions d'objets dans des domaines 3D finis et la possibilité d'ajouter de nouveaux modèles et descripteurs spatiaux devrait permettre d'analyser des organisations spatiales au sein de différents systèmes biologiques et à différentes échelles.

International audience; Compartmentalization is one of the fundamental principles which underly nuclear function. Numerous studies describe complex and sometimes conflicting relationships between nuclear gene positioning and transcription regulation. Therefore the question is whether topological landmarks and/or organization principles exist to describe the nuclear architecture and, if existing, whether these principles are identical in the animal and plant kingdoms. In the frame of an agroBI-INRA program on nuclear architecture, we set up a multidisciplinary approach combining biological studies, spatial statistics and 3D modeling to investigate spatial organization of a nuclear compartment in both plant and animal cells in their physiological contexts. In this article, we review the questions addressed in this program and the methodology of our work.; Modéliser l'architecture tri-dimensionnelle du noyau dans des cellules animales et végétales. L'organisation en comparti-ments est un des principes fondamentaux qui gouverne le fonctionnement du noyau. De nombreuses études montrent des relations complexes et parfois contradictoires entre la position d'un gène dans le noyau et son état transcriptionnel. Deux questions se posent : existe-t-il des principes généraux gouvernant l'organisation nucléaire, et, si oui, ces principes sont-ils analogues dans les règnes animal et végétal ? Dans le cadre d'un programme agroBI-INRA sur l'architecture nucléaire, nous avons développé une ap-proche multidisciplinaire combinant expériences biologiques, statistiques spatiales et modélisation en 3 dimensions pour analyser l'organisation spatiale d'un compartiment nucléaire dans des cellules animales et végétales, dans leur environnement physiolo-gique. Dans cet article, nous faisons une revue autour des questions posées dans ce programme et présentons la méthodologie de ce travail

National audience

Background: Embryonic development proceeds through finely tuned reprogramming of the parental genomes to form a totipotent embryo. Celis within this embryo will then differentiate and give rise to ali the tissues of a new individual. Early embryonic development thus offers a particularly interesting system in which to analyze functional nuclear organization. When the organization of higher-order chromatin structures, such as pericentromeric heterochromatin, was first analyzed in mouse emb1yos, specifie nuclear rearrangements were observed that correlated with embryonic genome activation at the 2-cell stage. However, most existing analyses have been conducted by visuai observation of fluorescent images, in two dimensions or on z-stack sections/projections, but only rarely in three dimensions (3D). Results: ln the p1*esent study, we used DNA fluorescent in situ hybridization (FISH) to localize centromeric (minor satellites), pericentromelic (major satellites), and telomeric genomic sequences throughout the preimplantation pe1iod in naturally fertilized mouse embryos (from the 1-cell to blastocyst stage). Their distribution was then analyzed in 3D on confocal image stacks, focusing on the nucleolar precursor bodies and nucleoli known to evolve rapidly throughout the first developmental stages. We used computational imaging to quantify various nuelear parameters in the 3D-F ISH images, to analyze the organization of compa1tments of intNest, and to measure physical distances between these compartments. Conclusions: The results highlight differences in nuclear organization between the two parental inherited genomes at the 1-cell stage, i.e. just after fertilization. We aIso found that the reprog1*amming of the embryonic genome, which starts at the 2-cell stage, undergoes other remarkable changes during preimplantation development, particularly at the 4-cell stage.

Early development of female mammals is accompanied by transcriptional inactivation of one of their two X chromosomes. This event is initiated following mono-allelic expression of the Xist non-coding RNA – what is achieved by the interplay of numerous cis-regulatory elements present within the X inactivation center (Xic), such as its repressive antisense Tsix. Our work aimed at throwing light on the structural landscape that underlies such long-range regulation. Characterization of the three-dimensional architecture of the Xic, by the means of Chromosome Conformation Capture (3C)-based techniques and in situ fluorescence hybridization (FISH), revealed that the respective promoters of Xist and Tsix contact many distal genomic elements within the Xic, and that at least one of such interacting region exerts long-range cis-transcriptional control. Noticeably, Xist and Tsix promoters associate with different sets of elements in their respective 5’ direction that are spread out over several hundreds of kilobases These experiments also revealed unforeseen properties of chromatin architecture. Indeed, the Xic appears to be partitioned in several sub-regions, each spanning between 200kb and 1Mb, inside which chromosomal interactions are preferentially established. The existence of these interaction domains integrates with other structural features of the genome, such as underlying chromatin composition and association with the nuclear lamina, but does not seem to directly depend on them. By analyzing chromosome conformation of the Xic during cell differentiation we document the robustness of this organizational principle, with the noticeable exception of the inactive X chromosome that assumes a folding pattern that is more random than its active homolog. Finally we also bring evidence that variability in the folding pattern of the two X chromosomes in the same cell brings each Tsix allele in association with different sets of chromosomal partners at a given moment, suggesting that the instantaneous structural environment of each allele at the onset of mono-allelic Xist up-regulation is different.By combining approaches at the scale of cell populations on the one hand, and at the single chromatin fiber level on the other, this study provides a first vision of the structural landscape in which Xist regulation takes place, and brings new insights concerning fundamental properties of chromosome organization in mammals.; Le développement embryonnaire précoce des mammifères femelles s’accompagne de l’inactivation transcriptionnelle d’un de leurs deux chromosomes X. Cet évènement est initié suite à l’expression mono-allélique de l’ARN non codant Xist, qui est contrôlée par de nombreux éléments cis-régulateurs présents dans le centre d’inactivation du chromosome X (Xic) – tel son anti-sens répresseur Tsix. Mon travail de thèse a consisté à développer des approches permettant d’appréhender le paysage structural dans lequel s’exerce cette régulation. La caractérisation de l’architecture tridimensionnelle du Xic, par des techniques basées sur la capture de conformation chromosomique (3C) et l’hybridation in situ en fluorescence (FISH), m’a permis de mettre en évidence que les promoteurs respectifs de Xist et Tsix sont engagés dans des interactions physiques intimes avec des loci distaux, localisés au sein du Xic, et de montrer qu’au moins certaines de ces régions exercent un effets régulateurs à longue-distance. Les éléments du Xic contactés par les régions promotrices de Xist et de Tsix sont en outre fondamentalement différents, chacune engageant des associations chromosomiques sur plusieurs centaines de kilobases dans leur direction 5’ respective.Ce travail a également permis de révéler des propriétés insoupçonnées de l’architecture chromosomiques. En effet, le Xic apparaît scindé en plusieurs sous-régions, couvrant chacune entre 200kb et 1Mb, à l’intérieur desquelles les interactions chromosomiques sont préférentiellement établies. L’existence de ces domaines d’interaction s’intègre avec d’autres propriétés structurales du génome, tels la composition de la chromatine sous-jacente et l’association à la lamine nucléaire, mais n’apparaît pas en dépendre directement. En étudiant la dynamique de la conformation chromosomique du Xic au cours de la différenciation cellulaire, j’ai pu constater la robustesse de cette organisation, sauf sur le chromosome X inactif, qui se distingue par la perte des contacts chromosomiques préférentiels détectables sur son homologue actif.Enfin, j’ai pu mettre en évidence que la variabilité du repliement général du chromosome X amène à un instant donné chaque allèle de Tsix à contacter physiquement des jeux de séquences distales différents, suggérant que l’environnement structural instantané de chacun de ces allèles à l’orée de l’activation mono-allélique de Xist est différent. Ce travail, combinant des approches à l’échelle de la population cellulaire d’une part et de la fibre de chromatine unique d’autre part, apporte une nouvelle vision du paysage structural et régulateur dans lequel s’inscrit le contrôle de l’activité transcriptionnelle de Xist, et fourni de nouvelles perspectives concernant les principes fondamentaux de l’organisation topologique des chromosomes chez les mammifères.

Depuis les 15 dernières années, de nombreuses études ont mis en évidence le rôle majeur de l’architecture nucléaire dans la régulation de l’expression des gènes et ceci dans une grande diversité de processus biologiques. Bien que la réponse immunitaire soit un de ces processus, peu de données existent sur l’organisation spatiale du génome dans les cellules immunitaires et son impact sur la régulation des gènes dans le contexte d’une réponse à l’infection bactérienne. En utilisant le porc comme organisme modèle, nous avons concentré notre étude sur les macrophages dérivés de monocytes, premières lignes de défense contre les pathogènes. Les cellules immunitaires étant les cibles des mycotoxines, nous nous sommes également intéressés aux effets de la toxine T-2 sur les macrophages et leur réponse induite par les récepteurs TLR. Un effet cytotoxique de la T-2 à une dose de 10 nM, ainsi que des effets inhibiteurs sur certaines réponses liées aux récepteurs TLR ont été mis en évidence. Nous avons ensuite examiné si les changements dans l'expression des gènes dus à l'activation impliquent un repositionnement dans l'espace nucléaire. Une analyse du transcriptome a permis d’identifier les gènes différentiellement exprimés dans les macrophages activés par le mélange LPS-IFNγ et de mettre en évidence des réseaux de gènes impliqués lors de l’activation. Les 4 gènes les plus sur-exprimés (IL1β, IL8, CXCL10 et TNFα) et les 4 gènes les plus sous-exprimés (VIM, LGALS3, TUBA3 et IGF2) ont été sélectionnés pour analyser leur comportement dans l'espace nucléaire au cours de l’activation des macrophages en utilisant la technique FISH 3D. Parmi les 4 gènes sur-exprimés, 3 présentent des modifications de leur position durant le processus d'activation alors que les 4 gènes sous-exprimés ne montent pas de variation de leur position. L'analyse de la position des gènes par rapport à leurs territoires chromosomiques (TC) a été étendue à un second type de cellules immunitaires : les neutrophiles. Des résultats similaires ont été obtenus. Les analyses ont été ensuite complétées par l'étude des 4 gènes sur-exprimés dans un type cellulaire indépendant de la réponse immunitaire (fibroblastes). Nos données suggèrent que les relocalisations dans l'espace nucléaire des gènes différentiellement exprimés dans les cellules immunitaires activées sont gène spécifique, type cellulaire spécifique et concernent essentiellement ceux qui sont sur-exprimés.

Early development of female mammals is accompanied by transcriptional inactivation of one of their two X chromosomes. This event is initiated following mono-allelic expression of the Xist non-coding RNA – what is achieved by the interplay of numerous cis-regulatory elements present within the X inactivation center (Xic), such as its repressive antisense Tsix. Our work aimed at throwing light on the structural landscape that underlies such long-range regulation. Characterization of the three-dimensional architecture of the Xic, by the means of Chromosome Conformation Capture (3C)-based techniques and in situ fluorescence hybridization (FISH), revealed that the respective promoters of Xist and Tsix contact many distal genomic elements within the Xic, and that at least one of such interacting region exerts long-range cis-transcriptional control. Noticeably, Xist and Tsix promoters associate with different sets of elements in their respective 5’ direction that are spread out over several hundreds of kilobases These experiments also revealed unforeseen properties of chromatin architecture. Indeed, the Xic appears to be partitioned in several sub-regions, each spanning between 200kb and 1Mb, inside which chromosomal interactions are preferentially established. The existence of these interaction domains integrates with other structural features of the genome, such as underlying chromatin composition and association with the nuclear lamina, but does not seem to directly depend on them. By analyzing chromosome conformation of the Xic during cell differentiation we document the robustness of this organizational principle, with the noticeable exception of the inactive X chromosome that assumes a folding pattern that is more random than its active homolog. Finally we also bring evidence that variability in the folding pattern of the two X chromosomes in the same cell brings each Tsix allele in association with different sets of chromosomal partners at a given moment, suggesting that the instantaneous structural environment of each allele at the onset of mono-allelic Xist up-regulation is different.By combining approaches at the scale of cell populations on the one hand, and at the single chromatin fiber level on the other, this study provides a first vision of the structural landscape in which Xist regulation takes place, and brings new insights concerning fundamental properties of chromosome organization in mammals., Le développement embryonnaire précoce des mammifères femelles s’accompagne de l’inactivation transcriptionnelle d’un de leurs deux chromosomes X. Cet évènement est initié suite à l’expression mono-allélique de l’ARN non codant Xist, qui est contrôlée par de nombreux éléments cis-régulateurs présents dans le centre d’inactivation du chromosome X (Xic) – tel son anti-sens répresseur Tsix. Mon travail de thèse a consisté à développer des approches permettant d’appréhender le paysage structural dans lequel s’exerce cette régulation. La caractérisation de l’architecture tridimensionnelle du Xic, par des techniques basées sur la capture de conformation chromosomique (3C) et l’hybridation in situ en fluorescence (FISH), m’a permis de mettre en évidence que les promoteurs respectifs de Xist et Tsix sont engagés dans des interactions physiques intimes avec des loci distaux, localisés au sein du Xic, et de montrer qu’au moins certaines de ces régions exercent un effets régulateurs à longue-distance. Les éléments du Xic contactés par les régions promotrices de Xist et de Tsix sont en outre fondamentalement différents, chacune engageant des associations chromosomiques sur plusieurs centaines de kilobases dans leur direction 5’ respective.Ce travail a également permis de révéler des propriétés insoupçonnées de l’architecture chromosomiques. En effet, le Xic apparaît scindé en plusieurs sous-régions, couvrant chacune entre 200kb et 1Mb, à l’intérieur desquelles les interactions chromosomiques sont préférentiellement établies. L’existence de ces domaines d’interaction s’intègre avec d’autres propriétés structurales du génome, tels la composition de la chromatine sous-jacente et l’association à la lamine nucléaire, mais n’apparaît pas en dépendre directement. En étudiant la dynamique de la conformation chromosomique du Xic au cours de la différenciation cellulaire, j’ai pu constater la robustesse de cette organisation, sauf sur le chromosome X inactif, qui se distingue par la perte des contacts chromosomiques préférentiels détectables sur son homologue actif.Enfin, j’ai pu mettre en évidence que la variabilité du repliement général du chromosome X amène à un instant donné chaque allèle de Tsix à contacter physiquement des jeux de séquences distales différents, suggérant que l’environnement structural instantané de chacun de ces allèles à l’orée de l’activation mono-allélique de Xist est différent. Ce travail, combinant des approches à l’échelle de la population cellulaire d’une part et de la fibre de chromatine unique d’autre part, apporte une nouvelle vision du paysage structural et régulateur dans lequel s’inscrit le contrôle de l’activité transcriptionnelle de Xist, et fourni de nouvelles perspectives concernant les principes fondamentaux de l’organisation topologique des chromosomes chez les mammifères.

International audience; Specific nuclear domains are nonrandomly positioned within the nuclear space, and this preferential positioning has been shown to play an important role in genome activity and stability. Well-known examples include the organization of repetitive DNA in telomere clusters or in the chromocenter of Drosophila and mammalian cells, which may provide a means to control the availability of general repressors, such as the heterochromatin protein 1 (HP1). We have specifically characterized the intranuclear positioning of in vivo fluorescence of the Caenorhabditis elegans HP1 homologue HPL-2 as a marker for heterochromatin domains in developing embryos. For this purpose, the wavelet transform modulus maxima (WTMM) segmentation method was generalized and adapted to segment the small embryonic cell nuclei in three dimensions. The implementation of a radial distribution algorithm revealed a preferential perinuclear positioning of HPL-2 fluorescence in wild-type embryos compared with the diffuse and homogeneous nuclear fluorescence observed in the lin-13 mutants. For all other genotypes analyzed, the quantitative analysis highlighted various degrees of preferential HPL-2 positioning at the nuclear periphery, which directly correlates with the number of HPL-2 foci previously counted on 2D projections. Using a probabilistic 3D cell nuclear model, we found that any two nuclei having the same number of foci, but with a different 3D probabilistic positioning scheme, can have significantly different counts in the 2D maximum projection, thus showing the deceptive limitations of using techniques of 2D maximum projection foci counts. By this approach, a strong perinuclear positioning of HPL-2 foci was brought into light upon inactivation of conserved chromatin-associated proteins, including the HAT cofactor TRAPP.

Ecole Doctorale: Des génomes aux organismes Diplôme : Dr. d'Université; La reprogrammation au cours de la fécondation et du développement pré-implantatoire de l’embryon fécondé in vitro (IVF) chez les mammifères est un processus complexe qui permet le retour à un état indifférencié des cellules hautement spécialisées que sont les gamètes lors de la syngamie, puis leur différenciation progressive en différent lignages cellulaires dans l’embryon. Ces processus comprennent des changements dans la structure de la chromatine, dans les modifications épigénétiques et dans l’architecture nucléaire des noyaux embryonnaires. L’objectif de cette étude était de mettre en place des approches pour la compréhension de ces processus dans les embryons précoces. Nous avons tiré parti de la comparaison entre embryons normaux (IVF) et issus de transfert de noyau ( NT) dans l’espèce bovine où le développement pré-implantatoire s’étant sur une période suffisamment longue pour caractériser la dynamique des événements de reprogrammation nucléaire avant la mise en route de l’activation majeure du génome embryonnaire. Dans une première approche, nous avons étudié la mise en place de l’hétérochromatine spécifique à l’embryon au cours de la période de reprogrammation dans les embryons bovins issus de fécondation et de NT. Nous avons utilisé deux marqueurs de l’hétérochromatine péricentrique : la protéine hétérochromatine 1(HP1-beta) et l’histone H3 tri-méthylée (H3K9me3) ; et un marqueur des centromètres (CENP A/B), de façon à caractériser les paramètres structuraux de l’hétérochromatine constitutive dans les premiers stades de développement embryonnaire. En utilisant des techniques d’immunofluorescence, nous avons pu observer les changements dynamiques dans l’organisation de l’hétérochromatine en relation avec l’origine des embryons. Dans les embryons IVF et une partie des embryons NT, l’hétérochromatine apparaît dans un état dispersé, et ceci jusqu’au stade 8-cellule ; puis sous une forme condensée qui correspond à l’association bien caractéristique de blocs d’hétérochromatine et d’H3K9me3 avec les centromètres, connues sous le nom de chromocentres. Cependant, une partie significative des embryons NT montrent une altération de la dynamique d’hétérochromatinisation révélée par une condensation précoce, dès le stade 2-cellule, de HP1 et H3K9me3. Dans une seconde approche, nous avons utilisé des cellules somatiques au stade de la sénescence comme cellules donneuses de noyau de façon à tester l’influence de l’organisation structurale du noyau donneur sur l’organisation structurale des noyaux dans les embryons clonés. Les arrangements tridimensionnels à large échelle de l’hétérochromatine dans les noyaux sénescents NT récapitulent la dynamique observée sans les embryons IVf ou NT issus de noyau de cellules non sénescentes. Notamment, les pourcentages d’embryons avec une hétérochromatine dispersée ou condensée prématurément sont comparables avec les études précédentes. Ces résultats suggèrent l’existence d’un processus de reprogrammation épigénétique robuste piloté par l’ovocyte dans les embryons précoces de bovins. Les cinétiques de restructuration du génome altérées dans une partie des embryons NT pourraient être liées à l’activation précoce de la transcription et l’augmentation du taux de méthylation qui ont été rapportées dans d’autres études. Le présent travail nous a permis de mettre en évidence une distinction entre des embryons NT avec une reprogrammation normale et des embryons NT avec une anomalie, au moins temporelle, de la reprogrammation épigénétique. Egalement, nous avons démontré que l’impact de l’organisation nucléaire de la cellule donneuse au niveau de l’hétérochromatine sur l’organisation structurale du noyau dans l’embryon NT est relativement modéré.