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Das Forschungsvorhaben “Entwicklung eines Stoffflussmodells und Leitfadens zur Emis-sionsminderung von Mikroschadstoffen im Hinblick auf die Wasserqualität“ (MikroModell) wurde im Zeitraum von Oktober 2015 bis Juni 2020 von der Deutschen Bundesstiftung Umwelt, dem Sächsischen Staatsministerium für Umwelt und Landwirtschaft (heute Sächsisches Staatsministerium für Energie, Klimaschutz, Umwelt und Landwirtschaft) sowie der Gelsenwasser AG gefördert. An dem interdisziplinären Projektkonsortium waren ne-ben den Betreibern der Abwassersysteme und -anlagen in Dresden, Chemnitz und Plauen Wissenschaftler:innen aus den Bereichen der Siedlungswasserwirtschaft, Hydrobiologie, Ökotoxikologie, Wasserchemie, Umweltökonomie, Pharmakologie an der Technischen Universität Dresden sowie des Wirtschafts- und Regulierungsrechts an der Technischen Univer-sität Bergakademie Freiberg beteiligt. In MikroModell wurde anhand unterschiedlich dicht besiedelter sächsischer Regionen untersucht, welche Verbesserungen der Gewässerqualität durch technologische Maßnahmen im Abwassersystem, durch Reduktionsmaßnahmen an der Quelle und in der Anwendung, durch rechtliche Steuerungsmaßnahmen auf EU-, Bundes- und Landesebene sowie durch Aktivitäten im Rahmen einer regional fokussierten Öffentlichkeitsarbeit erzielt werden können, um so eine effiziente und nachhaltige Entwicklung zu befördern. Dazu wurden sowohl Substanzen der Liste prioritärer Stoffe als auch weitere Spurenstoffe an Hand verfügbarer Umweltqualitätsnormen (UQN) bewertet. Der Bericht ist in zwei Teilen organisiert. Teil A beinhaltet den Handlungsleitfaden und richtet sich an Entscheidungsträger und Betreiberorganisationen, beschreibt also die praxisrelevanten Folgerungen aus den Untersuchungen. In Teil B werden die wissenschaftlichen Grundlagen und die Untersuchungsmethoden detailliert erläutert sowie ausgewählte Ergebnisse diskutiert. In Teil A wird eine systematische Vorgehensweise zur Bewertung der Relevanz von ab-wasserbürtigen Mikroschadstoffen und zur Entscheidungsfindung bzgl. Optionen zur Reduktion der Gewässerbelastung mit Mikroschadstoffen vorgestellt (Kapitel A-2). Die Durchführungsempfehlung ist in einem Prozessschema zusammengefasst, das die Maß-nahmenfindung als gemeinsamen Weg von Aufgabenträgern und Behörden beschreibt. Grundlage für die Bewertung der aktuellen Situation bildet die Auswertung der Gewäs-sergütedaten des LfULG (2009 – 2018) und zweier 21-Tage Monitoringkampagnen an den Kläranlagen-Standorten Dresden, Chemnitz und Plauen. IX Die Auswirkungen von Maßnahmen im technologischen Bereich und an der Quelle werden mittels Stoffflussmodellierung aufgezeigt. In Teil A werden dazu Simulationsergebnisse für Dresden, Chemnitz und Plauen herangezogen, die zeigen, dass sich für unter-schiedliche Einzugsgebiete und Stoffe unterschiedliche Maßnahmen als effektiv erweisen (Kapitel A-3). Darüber hinaus erweist sich auch die Definition der Zielgrößen als maßge-bend für die Priorisierung von Maßnahmen. Es gilt den Diskurs dazu anzustoßen. Neben konkreten technologischen Handlungsoptionen und Bewirtschaftungsansätzen an der Quelle werden auch rechtliche Handlungsoptionen in die Betrachtung miteinbezogen (Kapitel A-4). Um die Verwendungen und den Eintrag von Mikroschadstoffen aus Pflan-zenschutzmitteln, Arzneimitteln sowie Industrie- und Haushaltschemikalien mittel- und langfristig zu vermindern, wurden konkrete Empfehlungen zur Anwendung bzw. zu Anpassungen in den Bereichen des Wasser-, Arzneimittel- (Human- & Tierarzneimittelrecht), Chemikalien-, Düngemittel-, Pflanzenschutz- und Biozidrechts herausgearbeitet. Schließlich werden flankierende Aktivitäten zur Information ausgewählter Multiplikatoren und zur Aufklärung der Öffentlichkeit als unerlässlich erkannt und beschrieben (Kapitel A-5). Neben Maßnahmen zur Sensibilisierung der Bürger wurden insbesondere Kommunikationsveranstaltungen mit Ärzten und Apothekern durchgeführt. Dabei wurde zielgerichtet ein Verständnis für den nachhaltigen Einsatz und die gesicherte Entsorgung von Arzneimitteln vermittelt und allgemein das Bewusstsein geschärft, dass verschriebene Wirksubstanzen als solche oder metabolisiert/transformiert im Abwasser und ggf. im Gewässer wiederzufinden sind. Die Zusammenarbeit mit der Ärzteschaft erscheint nicht nur als zentraler Baustein zukunftsgerichteten Handelns wichtig, sondern wird auch als erfolgsversprechend angesehen. Der in Teil A vorgestellte Handlungsleitfaden vermittelt letztlich keine absolute Priorisierung von Handlungsoptionen, da sich für unterschiedliche Zielsetzungen und unter-schiedliche Bedingungen eine veränderte Priorisierung ergibt. Es wird aber der Weg hin zur Identifikation der unter den gegebenen Bedingungen besten Handlungsoption bzw. einer erfolgsversprechenden Kombination von Handlungsoptionen aufgezeigt. Dieses systematische Vorgehen wurde zwar am Beispiel von drei Pilotgebieten durchgespielt und für Sachsen flächendeckend aufbereitet, ist aber letztlich übertragbar auf andere Gebiete Deutschlands oder Europas. In Teil B werden die wissenschaftlichen Grundlagen sowie ausgewählte Ergebnisse des Projektes erläutert – sofern sie nicht schon in Teil A, den Handlungsleitfaden, eingeflossen sind (siehe den rechtlichen Handlungsrahmen sowie die Empfehlungen für die Öffentlich-keitsarbeit). Teil B ist in drei Kapitel unterteilt: Monitoring und Untersuchungen vor Ort (Kapitel B-1), Reduktionsmaßnahmen im Umgang mit Mikroschadstoffen (Kapitel B-2), Er-stellung und Kalibrierung des Stoffflussmodells sowie die Entwicklungsszenarien zur exemplarischen Anwendung des Modells (Kapitel B-3). X Kapitel B-1 umfasst das methodische Vorgehen zur Auswahl der Substanzen mit erhöhter Priorität an allen drei Standorten sowie eine Bewertung der Entwicklungstrends der Verschreibungsmengen für verschiedene Arzneistoffgruppen. Die Ergebnisse der vier Moni-toringkampagnen, die mit kombinierten chemischen und ökotoxikologischen Analysen verbunden waren, werden zusammengefasst und ergänzende Untersuchungen zur Bewertung der Mischwasserentlastungen erläutert. Die in Kapitel B-2 beschriebenen Untersuchungen zu Reduktionsmaßnahmen im Umgang mit Mikroschadstoffen beinhalten neben einer Übersicht zu den Kosten einer 4. Reinigungs-stufe die Bewertung verschiedener Verfahren zur Elimination von Spurenstoffen (Pulverak-tivkohle, Ozonierung und Sandfiltration) auf Grundlage von Laborversuchen. Zudem werden die Einträge industrieller und gewerblicher Einleiter in die Kanalnetze der Modellre-gionen und schließlich die Möglichkeiten von Reduktions- und Vermeidungsmaßnahmen auf Grundlage einer Literaturrecherche sowie von Experteninterviews mit verschiedenen Akteuren und Multiplikatoren bewertet. In Kapitel B-3 werden die Methoden zur Verschneidung der verschiedensten verfügbaren Informationen zur Stoffflussmodellierung beschrieben. Die verfügbaren, auf 186 vierstellige Postleitzahlbereiche bezogenen Daten zur Medikamentenverschreibung werden mit den 429 Gemeinden verschnitten, die Bevölkerung wird den Kläranlagen zugeordnet, die Kläranlagenabläufe müssen an den Fließgewässern verortet werden und sämtliche vom Land verfügbaren Informationen von Abfluss- und Qualitätsmessstellen müssen derart prozessiert werden, dass sie mit den modellierten Kläranlagenablaufwerten sinnvoll kombiniert werden können. Schließlich erfolgt die Kalibrierung und Validierung sowie die Anwendung des Stoffflussmodells zur Untersuchung von Entwicklungsszenarien und Handlungsoptionen. Die methodischen Grundlagen sind damit für eine erweiterte Anwendung und eine Übertragung auf andere Gebiete gegeben.:Inhaltsverzeichnis Teil A 1. Einführung 1.1 Motivation und Problemstellung 1.2 Zielstellung 1.3 Untersuchungsstandorte und –regionen 1.4 Betrachtete Substanzgruppen und Substanzen 1.5 Struktur des Projektes und des Schlussberichtes 2. Durchführungsempfehlung zur Bewertung von Mikroschadstoffen und Maßnahmen zur Reduktion 2.1 Einführung 2.2 Methode und Zielgruppen 2.3 Übersicht des Prozessschemas 2.4 Erläuterungen zur Vorgehensweise und Anwendung 2.4.1 Erarbeitung der Entscheidungsgrundlagen 2.4.1.1Politik/Gesetzgebung 2.4.1.2 Beschreibung des Ist-Zustandes des Umfelds 2.4.1.3 Methoden und Werkzeuge zur Entscheidungsfindung 2.4.2 Prüfungen zur Entscheidungsfindung 2.4.2.1 Voraussetzungen für die Bedarfsprüfung 2.4.2.2 Bedarfsprüfung (Defizitanalyse) 2.4.2.3 Ursachenfindung 2.4.2.4 Prozessabschluss 2.4.3 Umsetzung 2.4.3.1 Maßnahmenprüfung 2.4.3.2 Bewertung der Planungsgrundlage 2.4.3.3 Maßnahmenplanung und –umsetzung 2.4.4 Detailschema zur Umsetzung – Auswahl von Maßnahmen 2.5 Anpassungen und Ausblick 2.5.1 Überarbeitungen des Leitfadens 2.5.2 Offene Fragestellungen und Forschungsbedarf 2.6 Zusammenfassende Empfehlungen 2.7 Anwendung des Prozessschemas auf die drei Untersuchungsgebiete 2.7.1 Einführende Erläuterungen 2.7.2 Lage der ausgewerteten Chemikalien-Messdaten 2.7.3 Ist-Zustand als Entscheidungsgrundlage (Datenauswertung) 2.7.3.1 Auswertungen der UQN-Überschreitungen von LfULG-Daten 2.7.3.2 Fazit aus den Daten des LfULG 2.7.3.3 Auswertungen der UQN-Überschreitungen aus dem 3. und 4. Monitoring 2.7.3.4 Fazit aus der Auswertung der Daten aus dem Projekt MikroModell 2.7.3.5 Verwendung der ökotoxikologischen Informationen 2.7.4 Weitere Abarbeitung des Schemas 2.7.5 Ergebnis der Bearbeitung 3 Bewertung von Maßnahmen zur Belastungsminderung mit dem Stoffflussmodell für Sachsen 3.1 Einleitung 3.2 Methode und Zielgruppen 3.3 Ergebnisse 3.3.1 Dresden 3.3.2 Chemnitz 3.3.3 Plauen 3.4 Schlussfolgerungen und Ausblick 4 Rechtliche Handlungsrahmen und -empfehlungen 4.1 Methode und Zielgruppen 4.2 Wasserrecht 4.3 Arzneimittelrecht 4.3.1 Humanarzneimittelrecht 4.3.1.1 Derzeitiges Recht 4.3.1.2 Veränderungsvorschläge 4.3.2 Tierarzneimittelrecht 4.4 Chemikalienrecht 4.5 Düngemittelrecht 4.6 Pflanzenschutzrecht 4.7 Biozidrecht 5 Öffentlichkeitsarbeit 5.1 Einführung 5.2 Methode und Zielgruppen 5.2.1 Allgemeine Öffentlichkeit 5.2.2 Bürger im Einzugsgebiet der Betreiber 5.2.3 Kommunalpolitiker und lokale Entsorgungsunternehmen 5.2.4 Institutionen im Gesundheitsbereich wie Krankenhäuser, Pflegeeinrichtungen sowie die Anwendergruppen Ärzte und Apotheker 5.2.5 Landwirte, Tierärzte 5.2.6 Schulen und Kindereinrichtungen, Lehrer 5.3 Zusammenfassung und Empfehlungen 6 Literatur – Teil A 7 Anhang – Teil A Inhaltsverzeichnis Teil B 8 Monitoring und Untersuchungen vor Ort 8.1 Bewertung von Entwicklungstrends der Verschreibungsmengen für verschiedene Arzneistoffgruppen 8.1.1 Trendanalyse 8.1.2 Regionale Analyse 8.1.3 Zeitliche und räumliche Muster der Verschreibungsmengen 8.1.3.1 Carbamazepin und Gabapentin 8.1.3.2 Ciprofloxacin und Sulfamethoxazol 8.1.3.3 Erythromycin und Clarithromycin 8.2 Auswahl der Substanzen mit erhöhter Priorität an den drei Standorten 8.3 Zusammenfassung und Bewertung der Monitoringergebnisse einschließlich Charakterisierung der drei Modellanlagen bzw. Kläranlagenabläufe 8.3.1 Methode der Probenahmekampagnen 8.3.2 Einordnung der Kläranlagen und ihrer Gewässer 8.3.3 Durchführung und Auswertung der chemischen und biologischen Analysen 8.3.4 Einordnung der Spurenstoffelimination der Kläranlagen 8.3.5 Bewertung hinsichtlich der Einhaltung der Umweltqualitätsnormen 8.3.6 Ökotoxikologische Bewertung: effektbasiertes Monitoring der Kläranlagen 8.4 Ergänzende Untersuchung und Bewertung von Mischwasserentlastungen 8.4.1 Hintergrund und Zielstellung 8.4.2 Charakterisierung der Einzugsgebiete und Untersuchungsobjekte 8.4.3 Durchgeführte Untersuchungen 8.4.4 Ausgewählte Ergebnisse der Mischwasserbeprobungen 8.4.4.1 Hydraulische Ereigniskennwerte 8.4.4.2 Stoffliche Ereigniskennwerte (Spurenstoffe) 8.4.4.3 Ökotoxikologische Ereigniskennwerte 8.4.5 Einordnung der erzielten Ergebnisse 9 Reduktionsmaßnahmen 9.1 Literaturrecherche und Umfrage zu Kosten einer 4. Reinigungsstufe 9.1.1 Einführung und Zielstellung 9.1.2 Methodisches Vorgehen 9.1.3 Inhalte der Literatur 9.2 Interviews zu Erfahrungen kommunaler Kläranlagen mit einer vierten Reinigungsstufe 9.2.1 Methode der Datenerhebung und Ergebnisse der Befragungen 9.2.2 Erfahrungen/Hemmnisse bei Planung, Bau Betrieb einer 4. Reinigungsstufe 9.2.3 Kosten einer 4. Reinigungsstufe 9.2.3.1 Gebührenveränderung als Folge des Baus einer 4. Reinigungsstufe in Kläranlagen 9.2.3.2 Zahlungsbereitschaft der Bevölkerung 9.2.4 Fazit 9.3 Laborversuche zur 4. Reinigungsstufe 9.3.1 Einführung 9.3.2 Versuchsaufbau und Durchführung 9.3.2.1 Pulveraktivkohleversuche 9.3.2.2 Versuche zur Ozonbehandlung und Sandfiltration 9.3.3 Angewendete analytische Verfahren 9.3.3.1 Summenparameter – DOC und CSB 9.3.3.2 Spurenstoffanalytik 9.3.3.3 Ökotoxikologische Analyse 9.3.4 Übersicht des durchgeführten Versuchsprogrammes 9.3.5 Ergebnisse der Versuche 9.3.5.1 Eliminationsleistung hinsichtlich der organischen Belastung 9.3.5.2 Eliminationsleistung der verschiedenen Verfahren bezüglich der untersuchten Mikroschadstoffe 9.3.6 Ergebnisse der ökotoxikologischen Biotests (effektbasierte Methoden) nach den verschiedenen Abwasserbehandlungen 9.3.6.1 Ökotoxikologische Untersuchung der nativen Abwasserproben 9.3.6.2 Ökotoxikologische Untersuchung der angereicherten Abwasserproben (Extrakte) 9.3.7 Einordnung und Bewertung der Ergebnisse 9.3.7.1 Betriebsparameter (Summenparameter der organischen Belastung) 9.3.7.2 Spurenstoffelimination 9.3.7.3 Ökotoxikologische Untersuchungen . 9.3.8 „Scale-up“ für die betrachteten Standorte (Dimensionierung) 9.3.9 Dimensionierung 9.3.10 Einordung der angesetzten hydraulischen Verweilzeit und Bewertung der zu behandelnden Wassermenge 9.4 Eintragspfade der betrachteten Substanzen in die Kanalnetze der Modellregionen 9.4.1 Einführung 9.4.2 Bewertung von industriellen und gewerblichen Einleitungen anhand des Indirekteinleiterkatasters 9.4.2.1 Datengrundlage 9.4.2.2 Auswertung 9.4.2.3 Fazit 9.4.3 Bewertung von industriellen Indirekteinleitungen durch Messkampagnen 9.4.3.1 Veranlassung und orientierende Untersuchungen 9.4.3.2 Messkampagne 9.4.3.3 Fazit der Messkampagne . 9.4.4 Minderungsstrategien für Medikamentenwirkstoffe – Zusammenfassung des Projektes SAUBER+ 9.4.5 Zusammenfassung 9.5 Bewertung von Reduktions- und Vermeidungsmaßnahmen 9.5.1 Einführung 9.5.2 Datengrundlage – Literaturrecherche, Identifikation relevanter Akteure und Experteninterviews 9.5.3 Ergebnisse der empirischen Datenerhebung 9.5.4 Ausblick 10 Stoffflussmodellierung 10.1 Erstellung und Kalibrierung des Stoffflussmodells 10.1.1 Herangehensweise 10.1.2 Untersuchungsgebiet 10.1.3 Geodaten 10.1.4Durchflussdaten 10.1.5 Wasserqualitätsdaten und Mikroschadstoffauswahl zum Aufbau des Stoffflussmodells 10.1.6 Charakterisierung der ausgewählten Arzneistoffe 10.1.7 Bevölkerung und Verschreibungsmengen 10.1.8 Kläranlagen 10.1.8.1 Kläranlagen-spezifische Arzneistofffrachten 10.1.8.2 Arzneimittelfrachten aus Konzentrationsmessungen als Randbedingungen 10.1.9 Modellansatz 10.1.10 Datenaufbereitung bezüglich des Gewässernetzes 10.1.11 Interpolation von Durchflussprofilen 10.1.12 Stoffflussmodell 10.1.13 Kalibrierung und Validierung 10.1.13.1 Durchfluss Q . 10.1.13.2 Arzneistofffrachten – Stoffflussmodell 10.1.14 Plausibilisierung von Durchflusswerten 10.1.14.1 Frachtkalibrierung und -validierung des Stoffflussmodells 10.1.15 Ciprofloxacin als zusätzliches Arzneimittel 10.1.16 Ausblick 10.2 Erstellung von Entwicklungsszenarien zur exemplarischen Anwendung des Stoffflussmodells 10.2.1 Gebietsbeschreibung 10.2.2 Datengrundlage und weitere Datenaufbereitung 10.2.2.1 MNQ-Durchflussdaten 10.2.2.2 Eintragsverminderung bei Arzneistoffen 10.2.3 Bewertung des Gewässerzustands und der Entwicklungsszenarien 10.2.3.1 Ergebnisse für den Ist-Zustand 10.2.3.2 Szenarienanalyse 10.2.4 Ausblick 11 Literatur – Teil B 12 Anhang – Teil B

Dissolved organic carbon (DOC) is a sum parameter that is frequently used in water analytics. Highly resolved and accurate DOC data are necessary, for instance, for water quality monitoring and for the evaluation of the efficiency of treatment processes. The conventional DOC determination methods consist of on-site sampling and subsequent analysis in a stationary device in a laboratory. However, especially in regions where no or only poorly equipped laboratories are available, this method bears the risk of getting erroneous results. For this reason, the objective of the present study was to set up a reliable and portable DOC analyzer for on-site analysis. The presented DOC system is equipped with an electrolysis-based decomposition cell with boron-doped diamond electrodes (BDD) that oxidizes the organic compounds to carbon dioxide. Within this study, the influence of different electrode materials and the composition of the applied electrolytes on the DOC decomposition in an undivided electrolytic cell were systematically investigated. Furthermore, some technical aspects of the portable prototype are discussed. After a detailed validation, the prototype was used in an ongoing monitoring program in Northern India. The limit of detection is 0.1 mg L&minus, 1 C with a relative standard deviation of 2.3% in a linear range up to 1000 mg L C&minus, 1. The key features of the portable DOC analyzer are: No need for ultra-pure gases, catalysts or burning technology, an analyzing time per sample below 5 min, and a reliable on-site DOC determination.

Antibiotika sind für die Behandlung von bakteriellen Infektionskrankheiten in der Human- und Veterinärmedizin von immenser Bedeutung. Angesichts der Korrelation zwischen Antibiotika-Einsatzmengen und der Häufigkeit resistenter Organismen ist eine unsachgemäße bzw. übermäßige Verwendung dieser antibakteriellen Wirkstoffe sowie deren Eintrag über die Kläranlagen in die Umwelt äußerst problematisch. Neben Vermeidungs- und Verminderungsstrategien besteht ein Ansatz zur Problemlösung in der Entwicklung innovativer Technologien zur Entfernung von Antibiotikarückständen aus Wässern, da konventionelle Kläranlagen dieser Anforderung nicht vollständig genügen. Das im Rahmen dieser Arbeit entwickelte und charakterisierte biologische Verfahren basiert auf genetisch modifizierten Saccharomyces cerevisiae-Zellen, welche spezielle Enzyme sezernieren, die zur Umsetzung von Antibiotika herangezogen werden können. Als Modellsystem diente die enzymatische Hydrolyse des β-Lactam-Antibiotikums Ampicillin mit der β-Lactamase TEM-1. Unter Verwendung von enzymhaltigen Hefe-Kulturüberständen gelang es, die grundsätzliche Eignung des Systems zur Entfernung dieses Antibiotikums nachzuweisen. Untersuchungen mit weiteren β-Lactam-Antibiotika zeigten in Übereinstimmung mit der Literatur, dass TEM-1 Penicilline und Cephalosporine der 1. Generation hydrolysieren kann. Am Beispiel der TEM-8 wurde die Übertragbarkeit des Expressionssystems auf andere Lactamase-Varianten erfolgreich demonstriert. Das erweiterte Wirkspektrum dieses Enzyms, welches neben Penicillinen auch Monobactame und Cephalosporine bis zur 4. Generation umfasst, konnte bestätigt werden. Eine mittels Histidin-tag gereinigte TEM-1-His wurde eingesetzt, um systematisch den Einfluss verschiedener Faktoren, wie Temperatur, Substratkonzentration oder pH-Wert, unbeeinflusst von der Matrix der Hefe-Kulturüberstände untersuchen zu können. In diesem Zusammenhang wurde auch die Übertragbarkeit der Ergebnisse von Modell- auf Realwässer, wie Kläranlagenzu- und -ablauf, untersucht, mit dem Ergebnis, dass zumindest die TEM-1 temporär in allen getesteten Matrices aktiv ist. Mit dem Ziel, auch weitere Antibiotikaklassen transformieren zu können, wurden Esterase Ere-A-produzierende Zellen zur Umsetzung von Makrolid-Antibiotika, wie Erythromycin, herangezogen. Die Analyse der gebildeten Transformationsprodukte ergab, dass die antibakterielle Wirkung jeweils durch hydrolytische Spaltung des β-Lactam- bzw. des Makrolid-Ringes irreversibel verloren geht. Somit kann dieses biologische Verfahren prinzipiell zur gezielten Inaktivierung von Antibiotika eingesetzt werden, wobei der größte Vorteil in der erheblichen Beschleunigung der natürlicherweise ablaufenden Umsetzungsprozesse besteht. Diese Methode kann als ergänzende Technologie bei der Aufbereitung von Konzentraten und Wässern aus Spezialanwendungen angewendet werden.:Glossar Abkürzungsverzeichnis Symbolverzeichnis Kurzfassung Abstract 1 Einleitung 1.1 Motivation 1.2 Zielstellung 2 Theoretische Grundlagen 2.1 Antibiotika und Antibiotikaresistenzen 2.1.1 Antibiotika: Definition, Bedeutung, Einsatzmengen, Klassifikation 2.1.2 Wirkmechanismen: Antibiotika versus Antibiotikaresistenzen 2.1.3 Antibiotika und antibiotikaresistente Organismen in der Umwelt 2.1.4 β-Lactam-Antibiotika 2.1.5 Resistenzen gegenüber β-Lactam-Antibiotika 2.1.6 Makrolid-Antibiotika 2.1.7 Resistenzen gegenüber Makrolid-Antibiotika 2.2 Gentechnische Methoden zur gezielten Proteinbiosynthese 2.3 Der eukaryotische Modellorganismus Saccharomyces cerevisiae 2.4 Enzymkinetik 2.5 Spurenstoffanalytik mittels LC-MS/MS-Technik 2.5.1 Einleitung, Entwicklung und Bedeutung 2.5.2 Elektrospray-Ionisation 2.5.3 Der Quadrupol als Massenanalysator 2.5.4 Analysenmodi bei der Tandem-Massenspektrometrie 3 Material und Methoden 3.1 Verwendete Geräte und Chemikalien 3.2 Arbeiten mit gentechnisch veränderte S. cerevisiae-Zellen 3.2.1 Eingesetzte S. cerevisiae-Stämme 3.2.2 Nährmedien und Kultivierung 3.3 Gewinnung von rekombinanten, in S. cerevisiae exprimierten Enzymen 3.3.1 Gewinnung von β-Lactamase-haltigen Kulturüberständen und gereinigter MFα-TEM-1-His 3.3.2 Zellaufschluss zur Gewinnung der intrazellulären Enzyme 3.4 Einsatz der rekombinanten Enzyme zur Umsetzung von β-Lactam- und Makrolid-Antibiotika 3.4.1 Herstellung und Lagerung von Antibiotika-Stammlösungen, internen Standards und Pufferlösungen 3.4.1.1 Antibiotika-Stammlösungen 3.4.1.2 Interne Standards 3.4.1.3 Herstellung von Kaliumphosphatpuffer 3.4.2 Einsatz von enzymhaltigen Kulturüberstand 3.4.2.1 Nitrocefin-Assay 3.4.2.2 Allgemeine Vorgehensweise und Standardversuchsbedingungen 3.4.2.3 Variation der Antibiotika Konzentration 3.4.2.4 Untersuchungen mit TEM-8-haltigen Kulturüberständen 3.4.3 Einsatz von gereinigter TEM-1 β-Lactamase 3.4.3.1 Proteinbestimmung 3.4.3.2 Allgemeine Vorgehensweise und Standardversuchsbedingungen 3.4.3.3 Variation der Enzymkonzentration 3.4.3.4 Einfluss der Art des Puffers 3.4.3.5 Pufferkonzentration und Leitfähigkeit 3.4.3.6 Variation des pH Wertes 3.4.3.7 Einfluss der Temperatur 3.4.3.8 Variation des eingesetzten β-Lactam-Antibiotikums (Substrat) 3.4.3.9 Variation der AMP-Konzentration 3.4.3.10 Bestimmung der Michaelis-Menten-Konstante Km bei der AMP-Umsetzung mittels TEM-1-His 3.4.3.11 Aktivität und Stabilität der TEM-1-His in Realwässern 3.4.3.12 Bestimmung der spezifischen Enzymaktivität 3.4.4 Einsatz von zellfreien Rohextrakten 3.4.4.1 Allgemeine Versuchsbedingungen 3.4.4.2 Untersuchungen zur Esterase Ere-A 3.5 LC-MS/MS-Analytik 3.5.1 Probenvorbereitung und Herstellung von Kalibrierstandards 3.5.2 HPLC-Parameter 3.5.2.1 Zusammensetzung der Eluenten 3.5.2.2 HPLC-Methoden 3.5.3 Massenspektrometrische Parameter 3.5.4 Auswertung mittels Analyst 3.5.5 Leistungsgrenzen für die qualitative und quantitative AMP Bestimmung 3.5.6 Charakterisierung von Transformationsprodukten 4 Ergebnisse und Diskussion 4.1 Einsatz von TEM-1-haltigem Kulturüberstand zur Transformation von β-Lactam-Antibiotika 4.1.1 Entwicklung einer Versuchsvorschrift zum Nachweis der Enzymaktivität gegenüber β-Lactam-Antibiotika im Kulturüberstand 4.1.1.1 Nachweis der enzymatischen Aktivität mittels Nitrocefin-Assay 4.1.1.2 Versuche mit β-Lactam-Antibiotika 4.1.1.3 Probenvorbereitung 4.1.2 Optimierung einer HPLC-MS/MS-Methode zur Quantifizierung von β-Lactam-Antibiotika unter Berücksichtigung der Probenmatrix 4.1.3 Nachweis der Antibiotika Umsetzung mit TEM-1-haltigen Kulturüberständen 4.1.4 Wirksamkeit der TEM-1-haltigen Kulturüberstände in Abhängigkeit von ausgewählten Randbedingungen 4.1.4.1 Einfluss der Enzymkonzentration 4.1.4.2 Einfluss der Leadersequenz 4.1.4.3 Einfluss des pH-Wertes 4.1.4.4 Einflüsse auf die Enzymkonzentration im Kulturüberstand 4.1.4.5 Enzymatische Stabilität bei Lagerung 4.1.4.6 Variation der Substratkonzentration 4.1.4.7 Substratspezifität 4.1.5 Zwischenfazit 4.2 Einsatz von TEM-8-haltigem-Kulturüberstand zur Transformation von β-Lactam-Antibiotika 4.2.1 Nachweis der enzymatischen Aktivität von TEM-8 4.2.1.1 Auswahl der Modellsubstanzen AMP und CEF 4.2.1.2 Versuche zum Nachweis der TEM-8-Aktivität in nicht-gepuffertem Kulturüberstand 4.2.1.3 Nachweis der TEM-8-Aktivität unter Verwendung von MES-gepuffertem Kulturmedium 4.2.2 Wirksamkeit der TEM-8-haltigen Kulturüberständen in Abhängigkeit von ausgewählten Randbedingungen 4.2.2.1 Einfluss der Leadersequenz 4.2.2.2 Einfluss des Polyhistidin-tags 4.2.2.3 Substratspezifität 4.2.3 Vergleich TEM-1 und TEM-8 4.2.3.1 Prinzipielle Unterschiede in der Kultivierung zur Gewinnung von TEM-8 4.2.3.2 Versuche zur AMP-Umsetzung 4.2.3.3 Abnahme der AMP-Konzentration in den Kontrollproben 4.2.3.4 Versuche zur CEF-Umsetzung 4.2.4 Zwischenfazit 4.3 Einsatz von isolierter TEM-1-His zur Transformation von β-Lactam-Antibiotika 4.3.1 Nachweis der Enzymaktivität 4.3.2 Wirksamkeit des Enzyms TEM-1-His in Abhängigkeit von ausgewählten Randbedingungen 4.3.2.1 Variation der Enzymkonzentration 4.3.2.2 Variation der Pufferkonzentration und Pufferart 4.3.2.3 Variation des pH-Wertes 4.3.2.4 Variation der Temperatur 4.3.2.5 Variation des Substrates 4.3.2.6 Variation der Substratkonzentration 4.3.2.7 Kinetik der enzymatischen Reaktion mit TEM-1-His 4.3.2.8 Untersuchungen zur Umsetzung in Realwässern 4.3.2.9 Langzeitstabilität der isolierten TEM-1-His 4.3.3 Zwischenfazit: spezifische enzymatische Aktivität der TEM-1-His in Abhängigkeit von verschiedenen Versuchsparametern 4.4 Einsatz von Esterase Ere-A-haltigen Rohextrakten 4.4.1 Nachweis der Enzymaktivität im Rohextrakt 4.4.2 Wirksamkeit der Esterase Ere-A in Abhängigkeit von ausgewählten Randbedingungen 4.4.2.1 Einfluss verschiedener Puffer 4.4.2.2 Einfluss von C- und N-terminal angefügten Sequenzen 4.4.2.3 Substratspezifität 4.4.3 Zwischenfazit 4.5 Charakterisierung von Transformationsprodukten 4.5.1 Vorbemerkungen 4.5.2 Transformationsprodukte bei der Umsetzung von β-Lactam-Antibiotika 4.5.3 Einsatz der Esterase Ere A zur Transformation von Makrolid-Antibiotika 4.5.3.1 Transformationsprodukte von Erythromycin 4.5.3.2 Transformationsprodukte von Clarithromycin 4.5.3.3 Transformationsprodukte von Roxithromycin 4.5.4 Zwischenfazit 5 Zusammenfassung 6 Ausblick Literaturverzeichnis Abbildungsverzeichnis Tabellenverzeichnis Anhang A-1 Weitere Analysenmodi bei der Tandem-Massenspektrometrie A-2 Verwendete Geräte und Chemikalien A-3 HPLC-Methoden A-4 Massenspektrometrische Parameter A-5 Erster Versuch zum Nachweis der enzymatischen Aktivität von TEM-1-haltigen Kulturüberstand A-6 Nachweis der Inhibitorwirkung von Sulbactam in Kombination mit TEM-1-His A-7 TEM-1: Variation der Substratkonzentration A-8 TEM-8: Substratspezifität A-9 Vergleich der AMP-Umsetzung mit TEM-1- und TEM-8-haltigen Kulturüberständen sowie den Rohextrakten A-10 TEM-1-His: Variation des pH-Wertes A-11 TEM-1-His: Substratspezifität A-12 Ere-A: Variation der Puffer A-13 Ere-A: Substratspezifität Selbstständigkeitserklärung Antibiotics play an important role in human and veterinary medicine for the treatment of bacterial infectious diseases. However, regarding the known correlation between the quantities of antibiotics applied and the frequency of resistant organisms, the improper and excessive use of these antibacterial agents leads to serious problems. Their presence in the environment is largely caused by sewage systems due to their incomplete removal in conventional wastewater treatment plants. Therefore, besides avoidance and reduction strategies, one approach to address this issue is to develop innovative technologies for the removal of antibiotic residues from water. The biological method developed and characterized within this work is based on genetically modified Saccharomyces cerevisiae cells, which secrete special enzymes that can be used for the transformation of antibiotics. The enzymatic hydrolysis of the β-lactam-antibiotic ampicillin by the β-lactamase TEM-1 was employed as a model system. By using enzyme-containing yeast culture supernatants, it was possible to prove the suitability of the developed system for the removal of the mentioned antibiotic. The obtained results with other β-lactam-antibiotics showed in accordance with the literature, that TEM-1 was able to hydrolyse penicillins and the cephalosporins of the first-generation. Taking TEM-8 as an example, the transferability of this expression system to alternative lactamase was successfully demonstrated. The activity of this enzyme toward an extended substrate spectrum, which includes not only penicillins but also monobactams and cephalosporins up to the fourth-generation, could be confirmed. The histidine-tagged purified TEM-1-His was used to systematically investigate the influence of various factors, such as temperature, substrate concentration or pH value, independently from the matrix of the yeast culture supernatants. Furthermore, the transferability of the results from model to real water (e. g. influent and effluent from a sewage treatment plant) was investigated with the result that TEM-1 was at least temporarily active in all tested matrices. In order to be able to transform other classes of antibiotics, esterase Ere-A-producing cells were employed to transform macrolide antibiotics, such as erythromycin. The analysis of the formed transformation products revealed that the antibacterial activity is irreversibly lost by the hydrolytic cleavage of the β-lactam or macrolide ring. Therefore, the biological process can be generally used for the selective inactivation of antibiotics, affording a considerable acceleration of the naturally occurring transformation process as its greatest advantage. This method is considered to be a complementary technology for the treatment of concentrates and water from special applications.:Glossar Abkürzungsverzeichnis Symbolverzeichnis Kurzfassung Abstract 1 Einleitung 1.1 Motivation 1.2 Zielstellung 2 Theoretische Grundlagen 2.1 Antibiotika und Antibiotikaresistenzen 2.1.1 Antibiotika: Definition, Bedeutung, Einsatzmengen, Klassifikation 2.1.2 Wirkmechanismen: Antibiotika versus Antibiotikaresistenzen 2.1.3 Antibiotika und antibiotikaresistente Organismen in der Umwelt 2.1.4 β-Lactam-Antibiotika 2.1.5 Resistenzen gegenüber β-Lactam-Antibiotika 2.1.6 Makrolid-Antibiotika 2.1.7 Resistenzen gegenüber Makrolid-Antibiotika 2.2 Gentechnische Methoden zur gezielten Proteinbiosynthese 2.3 Der eukaryotische Modellorganismus Saccharomyces cerevisiae 2.4 Enzymkinetik 2.5 Spurenstoffanalytik mittels LC-MS/MS-Technik 2.5.1 Einleitung, Entwicklung und Bedeutung 2.5.2 Elektrospray-Ionisation 2.5.3 Der Quadrupol als Massenanalysator 2.5.4 Analysenmodi bei der Tandem-Massenspektrometrie 3 Material und Methoden 3.1 Verwendete Geräte und Chemikalien 3.2 Arbeiten mit gentechnisch veränderte S. cerevisiae-Zellen 3.2.1 Eingesetzte S. cerevisiae-Stämme 3.2.2 Nährmedien und Kultivierung 3.3 Gewinnung von rekombinanten, in S. cerevisiae exprimierten Enzymen 3.3.1 Gewinnung von β-Lactamase-haltigen Kulturüberständen und gereinigter MFα-TEM-1-His 3.3.2 Zellaufschluss zur Gewinnung der intrazellulären Enzyme 3.4 Einsatz der rekombinanten Enzyme zur Umsetzung von β-Lactam- und Makrolid-Antibiotika 3.4.1 Herstellung und Lagerung von Antibiotika-Stammlösungen, internen Standards und Pufferlösungen 3.4.1.1 Antibiotika-Stammlösungen 3.4.1.2 Interne Standards 3.4.1.3 Herstellung von Kaliumphosphatpuffer 3.4.2 Einsatz von enzymhaltigen Kulturüberstand 3.4.2.1 Nitrocefin-Assay 3.4.2.2 Allgemeine Vorgehensweise und Standardversuchsbedingungen 3.4.2.3 Variation der Antibiotika Konzentration 3.4.2.4 Untersuchungen mit TEM-8-haltigen Kulturüberständen 3.4.3 Einsatz von gereinigter TEM-1 β-Lactamase 3.4.3.1 Proteinbestimmung 3.4.3.2 Allgemeine Vorgehensweise und Standardversuchsbedingungen 3.4.3.3 Variation der Enzymkonzentration 3.4.3.4 Einfluss der Art des Puffers 3.4.3.5 Pufferkonzentration und Leitfähigkeit 3.4.3.6 Variation des pH Wertes 3.4.3.7 Einfluss der Temperatur 3.4.3.8 Variation des eingesetzten β-Lactam-Antibiotikums (Substrat) 3.4.3.9 Variation der AMP-Konzentration 3.4.3.10 Bestimmung der Michaelis-Menten-Konstante Km bei der AMP-Umsetzung mittels TEM-1-His 3.4.3.11 Aktivität und Stabilität der TEM-1-His in Realwässern 3.4.3.12 Bestimmung der spezifischen Enzymaktivität 3.4.4 Einsatz von zellfreien Rohextrakten 3.4.4.1 Allgemeine Versuchsbedingungen 3.4.4.2 Untersuchungen zur Esterase Ere-A 3.5 LC-MS/MS-Analytik 3.5.1 Probenvorbereitung und Herstellung von Kalibrierstandards 3.5.2 HPLC-Parameter 3.5.2.1 Zusammensetzung der Eluenten 3.5.2.2 HPLC-Methoden 3.5.3 Massenspektrometrische Parameter 3.5.4 Auswertung mittels Analyst 3.5.5 Leistungsgrenzen für die qualitative und quantitative AMP Bestimmung 3.5.6 Charakterisierung von Transformationsprodukten 4 Ergebnisse und Diskussion 4.1 Einsatz von TEM-1-haltigem Kulturüberstand zur Transformation von β-Lactam-Antibiotika 4.1.1 Entwicklung einer Versuchsvorschrift zum Nachweis der Enzymaktivität gegenüber β-Lactam-Antibiotika im Kulturüberstand 4.1.1.1 Nachweis der enzymatischen Aktivität mittels Nitrocefin-Assay 4.1.1.2 Versuche mit β-Lactam-Antibiotika 4.1.1.3 Probenvorbereitung 4.1.2 Optimierung einer HPLC-MS/MS-Methode zur Quantifizierung von β-Lactam-Antibiotika unter Berücksichtigung der Probenmatrix 4.1.3 Nachweis der Antibiotika Umsetzung mit TEM-1-haltigen Kulturüberständen 4.1.4 Wirksamkeit der TEM-1-haltigen Kulturüberstände in Abhängigkeit von ausgewählten Randbedingungen 4.1.4.1 Einfluss der Enzymkonzentration 4.1.4.2 Einfluss der Leadersequenz 4.1.4.3 Einfluss des pH-Wertes 4.1.4.4 Einflüsse auf die Enzymkonzentration im Kulturüberstand 4.1.4.5 Enzymatische Stabilität bei Lagerung 4.1.4.6 Variation der Substratkonzentration 4.1.4.7 Substratspezifität 4.1.5 Zwischenfazit 4.2 Einsatz von TEM-8-haltigem-Kulturüberstand zur Transformation von β-Lactam-Antibiotika 4.2.1 Nachweis der enzymatischen Aktivität von TEM-8 4.2.1.1 Auswahl der Modellsubstanzen AMP und CEF 4.2.1.2 Versuche zum Nachweis der TEM-8-Aktivität in nicht-gepuffertem Kulturüberstand 4.2.1.3 Nachweis der TEM-8-Aktivität unter Verwendung von MES-gepuffertem Kulturmedium 4.2.2 Wirksamkeit der TEM-8-haltigen Kulturüberständen in Abhängigkeit von ausgewählten Randbedingungen 4.2.2.1 Einfluss der Leadersequenz 4.2.2.2 Einfluss des Polyhistidin-tags 4.2.2.3 Substratspezifität 4.2.3 Vergleich TEM-1 und TEM-8 4.2.3.1 Prinzipielle Unterschiede in der Kultivierung zur Gewinnung von TEM-8 4.2.3.2 Versuche zur AMP-Umsetzung 4.2.3.3 Abnahme der AMP-Konzentration in den Kontrollproben 4.2.3.4 Versuche zur CEF-Umsetzung 4.2.4 Zwischenfazit 4.3 Einsatz von isolierter TEM-1-His zur Transformation von β-Lactam-Antibiotika 4.3.1 Nachweis der Enzymaktivität 4.3.2 Wirksamkeit des Enzyms TEM-1-His in Abhängigkeit von ausgewählten Randbedingungen 4.3.2.1 Variation der Enzymkonzentration 4.3.2.2 Variation der Pufferkonzentration und Pufferart 4.3.2.3 Variation des pH-Wertes 4.3.2.4 Variation der Temperatur 4.3.2.5 Variation des Substrates 4.3.2.6 Variation der Substratkonzentration 4.3.2.7 Kinetik der enzymatischen Reaktion mit TEM-1-His 4.3.2.8 Untersuchungen zur Umsetzung in Realwässern 4.3.2.9 Langzeitstabilität der isolierten TEM-1-His 4.3.3 Zwischenfazit: spezifische enzymatische Aktivität der TEM-1-His in Abhängigkeit von verschiedenen Versuchsparametern 4.4 Einsatz von Esterase Ere-A-haltigen Rohextrakten 4.4.1 Nachweis der Enzymaktivität im Rohextrakt 4.4.2 Wirksamkeit der Esterase Ere-A in Abhängigkeit von ausgewählten Randbedingungen 4.4.2.1 Einfluss verschiedener Puffer 4.4.2.2 Einfluss von C- und N-terminal angefügten Sequenzen 4.4.2.3 Substratspezifität 4.4.3 Zwischenfazit 4.5 Charakterisierung von Transformationsprodukten 4.5.1 Vorbemerkungen 4.5.2 Transformationsprodukte bei der Umsetzung von β-Lactam-Antibiotika 4.5.3 Einsatz der Esterase Ere A zur Transformation von Makrolid-Antibiotika 4.5.3.1 Transformationsprodukte von Erythromycin 4.5.3.2 Transformationsprodukte von Clarithromycin 4.5.3.3 Transformationsprodukte von Roxithromycin 4.5.4 Zwischenfazit 5 Zusammenfassung 6 Ausblick Literaturverzeichnis Abbildungsverzeichnis Tabellenverzeichnis Anhang A-1 Weitere Analysenmodi bei der Tandem-Massenspektrometrie A-2 Verwendete Geräte und Chemikalien A-3 HPLC-Methoden A-4 Massenspektrometrische Parameter A-5 Erster Versuch zum Nachweis der enzymatischen Aktivität von TEM-1-haltigen Kulturüberstand A-6 Nachweis der Inhibitorwirkung von Sulbactam in Kombination mit TEM-1-His A-7 TEM-1: Variation der Substratkonzentration A-8 TEM-8: Substratspezifität A-9 Vergleich der AMP-Umsetzung mit TEM-1- und TEM-8-haltigen Kulturüberständen sowie den Rohextrakten A-10 TEM-1-His: Variation des pH-Wertes A-11 TEM-1-His: Substratspezifität A-12 Ere-A: Variation der Puffer A-13 Ere-A: Substratspezifität Selbstständigkeitserklärung