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Dissertação de mestrado em Biotechnology, As infecções das vias respiratórias inferiores (IVRI) são uma causa comum de mortalidade/morbilidade em todo o mundo. As IVRI são frequentemente governadas por biofilmes, tipicamente polimicrobianos e na sua maioria dominadas por espécies bacterianas Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Acinetobacter baumannii, Klebsiella pneumoniae), mas também por fungos (por exemplo, Candida albicans). Os biofilmes contribuem significativamente para o aparecimento de resistência antimicrobiana (RAM), o que é de grande preocupação clínica. A ineficácia dos antibióticos e a falta de novos antibióticos exige fortemente estratégias alternativas que possam restabelecer a acção dos antibióticos existentes contra os agentes patogénicos. O principal objectivo deste trabalho foi o de encontrar estratégias combinatórias eficazes de antibiótico-adjuvante capazes de atenuar os traços de RAM nos agentes patogénicos associados ao IVRI, isolados e em co-infecção. Em primeiro lugar, a susceptibilidade das populações microbianas foi avaliada em relação a um painel de compostos, incluindo antibióticos e potenciais compostos adjuvantes (PCAs). Os antibióticos ineficazes foram testados em combinação com todos os PCAs e verificados quanto à sinergia através de um checkboard assay. As combinações antibiótico-adjuvante mais promissoras foram então empregadas contra biofilmes pré-estabelecidos 24 h de uma única espécie, de dupla (P. aeruginosa/S. aureus) e tripla espécie (P. aeruginosa/S. aureus/K. pneumoniae) para avaliar a sua eficácia. A maioria das populações microbianas mostrou resistência à maioria dos antibióticos (12 em 25). Não foi encontrada actividade antimicrobiana para os 4 AAE testados (EDTA, SucA, FAR, LIN). Foram encontradas combinações sinergéticas contra S. aureus, K. pneumoniae e A. baumannii, conforme determinado pelo índice FIC. EDTA e LIN mostraram os melhores resultados ao interagirem com sucesso com todos os antibióticos que anteriormente tinham sido considerados ineficazes. As combinações antibiótico-adjuvante de PIP+EDTA, PIP+COL, COL+EDTA, e COL+LIN foram testadas contra biofilmes de uma e várias espécies. Todas as combinações testadas levaram a reduções significativas na biomassa do biofilme de P. aeruginosa e S. aureus; reduções igualmente visíveis no número de células foram também obtidas nos biofilmes formados por cada espécie. No entanto, não foi observada qualquer redução significativa na massa do biofilme de K. pneumoniae e A. baumannii, mas houve uma diminuição nas células cultiváveis. As combinações antibiótico-adjuvantes contra biofilmes de dupla espécie resultaram em reduções significativas na biomassa do biofilme e nas células cultiváveis de P. aeruginosa. Quanto aos biofilmes tri-espécies, a única redução significativa na massa dos biofilmes foi encontrada quando foram utilizadas combinações de COL. Contudo, nenhuma combinação foi capaz de erradicar completamente as populações de biofilmes., Lower respiratory tract infections (LRTIs) are a common cause of mortality/morbidity worldwide. Biofilms often govern LRTIs, typically polymicrobial and dominated mainly by bacterial species Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Acinetobacter baumannii, Klebsiella pneumoniae), but also fungi (e.g., Candida albicans). Biofilms contribute significantly to the emergence of antimicrobial resistance (AMR), which is of great clinical concern. The antibiotic ineffectiveness and the lack of new antibiotics strongly demand alternative strategies that may restore the action of existing antibiotics against pathogens. The main goal of this work was to find effective antibiotic-adjuvant combinatorial strategies able to attenuate AMR traits in LRTI-associated pathogens, isolated and in co-infection. Firstly, the susceptibility of the microbial populations was evaluated against a panel of compounds, including antibiotics and potential adjuvant compounds (AAEs). Ineffective antibiotics were tested in combination with all the AAEs and checked for synergy through a checkerboard assay. The most promising antibiotic-adjuvant combinations were then employed against 24 h pre-established biofilms of single species and of dual (P. aeruginosa/S. aureus) and triple-species (P. aeruginosa/S. aureus/K. pneumoniae) to evaluate their effectiveness. Most microbial populations showed resistance to most antibiotics (12 out of 25). No antimicrobial activity was found for the 4 tested AAEs (EDTA, SucA, FAR, LIN). Synergistic combinations were found against S. aureus, K. pneumoniae, and A. baumannii, as determined by the FIC index. EDTA and LIN showed the best outcomes by successfully interacting with all antibiotics previously found ineffective. Antibiotic adjuvant combinations of PIP+EDTA, PIP+COL, COL+EDTA, and COL+LIN were tested against single and multi-species biofilms. All tested combinations led to significant reductions in the biofilm biomass of P. aeruginosa and S. aureus; similarly visible reductions in the number of cells were also obtained in the biofilms formed by each species. However, no significant reduction in the biofilm mass of K. pneumoniae and A. baumannii were observed, but there was a decrease in cultivable cells. The antibiotic-adjuvants combinations against dual-species biofilms resulted in significant reductions in biofilm biomass and cultivable cells of P. aeruginosa. As for triple-species biofilms, the only significant reduction in biofilm mass was found when COL combinations were employed. However, no combination was able to eradicate biofilm populations.

Resumo Objetivo Avaliar a integridade da superfície e as condições microbiológicas de parafusos prontos para uso em bandejas ortopédicas após múltiplos processamentos. Métodos Após o processamento completo, as bandejas utilizadas em cirurgias de pequenos fragmentos, fornecidas por meio de sistema de consignação/comodato em um hospital brasileiro, foram selecionadas aleatoriamente durante quatro meses. Os parafusos mais utilizados (números 14, 16 e 18 – Grupo 1) e menos utilizados (números 10 e 38 – Grupo 2), portanto, os mais e menos expostos a agentes biológicos, químicos e físicos, foram aleatoriamente removidos e submetidos a inspeção visual (n=126), seguido de cultura bacteriana (n=6 parafusos/bandeja, 9 bandejas), teste de proteínas (n=6 parafusos/bandeja, 9 bandejas) e Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) (n=2 parafusos/bandeja, 9 bandejas). As culturas positivas foram submetidas a métodos automatizados de identificação bacteriana e suscetibilidade antimicrobiana. Resultados Foram detectadas ranhuras em 8,7% dos parafusos, predominantemente no Grupo 2 (8/11). Proteína residual foi detectada em 96,3%, e não houve diferença estatisticamente significativa na quantidade de proteína entre os grupos (P=0,07). Crescimento bacteriano foi identificado em 3/54 parafusos. Danos na superfície e presença de sujidade foram visualizados em todos os parafusos submetidos a MEV. Formação de biofilmes extensos foi detectada em oito parafusos, três do Grupo 1 e cinco do Grupo 2. Conclusão Recuperação de bactérias viáveis, acúmulo de biofilme e danos na superfície foram detectados nos parafusos prontos para uso. Os parafusos costumam permanecer nas bandejas cirúrgicas e serem submetidos a múltiplos processamento, sendo expostos a contaminação e danos repetidas vezes. Esses achados apontam para a necessidade de discutir e repensar a forma como esses implantes de uso único são atualmente disponibilizados para cirurgias. Resumen Objetivo Evaluar la integridad de la superficie y las condiciones microbiológicas de tornillos listos para uso en bandejas ortopédicas después de múltiples procesamientos. Métodos Después del procesamiento completo, fueron seleccionadas aleatoriamente durante cuatro meses las bandejas utilizadas en cirugías de pequeños fragmentos, proporcionadas mediante el sistema de consignación/comodato en un hospital brasileño. Los tornillos más utilizados (números 14, 16 y 18 – Grupo 1) y menos utilizados (números 10 y 38 – Grupo 2), por lo tanto, los más y menos expuestos a agentes biológicos, químicos y físicos, fueron quitados aleatoriamente y sometidos a inspección visual (n=126), seguido de cultivo bacteriano (n=6 tornillos/bandeja, 9 bandejas), prueba de proteínas (n=6 tornillos/bandeja, 9 bandejas) y microscopía electrónica de barrido (MEB) (n=2 tornillos/bandeja, 9 bandejas). Los cultivos positivos fueron sometidos a métodos automatizados de identificación bacteriana y susceptibilidad antimicrobiana. Resultados Se detectaron ranuras en el 8,7 % de los tornillos, predominantemente en el Grupo 2 (8/11). Se detectó proteína residual en el 96,3 % y no se encontró diferencia estadísticamente significativa en la cantidad de proteína entre los grupos (P=0,07). En 3/54 tornillos se identificó crecimiento bacteriano. Se visualizaron daños en la superficie y presencia de suciedad en todos los tornillos sometidos a MEB. En ocho tornillos se detectó la formación de biopelículas, tres del Grupo 1 y cinco del Grupo 2. Conclusión Se detectó recuperación de bacterias viables, acumulación de biopelícula y daños en la superficie en los tornillos listos para uso. Los tornillos suelen permanecer en las bandejas quirúrgicas y son sometidos a múltiples procesamientos, donde están expuestos a contaminación y daños repetidas veces. Estos descubrimientos señalan la necesidad de discutir y repensar la forma como estos implantes de uso único se ponen a disposición para cirugía actualmente. Abstract Objective Assess the surface integrity and microbiological conditions of patient-ready screws in orthopaedic trays that had been multiply reprocessed. Methods After full reprocessing, clinical trays used for small fragment surgery provided through a loaner system to a Brazilian hospital were randomly selected during four months. The most (numbers 14, 16 and 18 – Group 1) and least (numbers 10 and 38 – Group 2) frequently implanted screws, therefore, the ones estimated to be the most and least exposed to biological, chemical and physical agents, were randomly removed and subjected to visual inspection (n=126), followed by bacterial culture (n=6 screws/tray, 9 trays), protein test (n=6 screws/tray, 9 trays) and Scanning Electron Microscopy (SEM) (n=2 screws/tray, 9 trays). Positive cultures were subjected to automated bacterial identification and antimicrobial susceptibility tests. Results Grooves were detected on 8.7% screws, predominantly in Group 2 (8/11). Residual protein was detected on 96,3%, and there was no statistically significant difference in the amount of protein between the groups (P=0.07). Bacterial growth was identified in 3/54 screws. Surface damage and soil were visualized on all screws subjected to SEM. Extensive biofilms were detected on eight screws, three from Group 1 and five from Group 2. Conclusion Recovery of bacteria, biofilm accumulation and surface damage were detected on patient-ready screws. Screws frequently remain in surgical trays for multiple reprocessing; thus they are repeatedly exposed to contamination and damage. These findings point to the need to discuss and review the way these single-use implants are currently made available for surgeries.

Aim: Stevia rebaudiana Bertoni (Stevia) is a natural non-caloric sweetener that can modify the cariogenicity of biofilms. This study aimed to evaluate the effect of Stevia infusion in microbial and biochemical composition of biofilms formed in the presence of sucrose and on enamel demineralization. Materials and Methods: In a cross-over design, eleven volunteers wore an intraoral palatal appliance containing 4 slabs of bovine enamel during 3 phases of 7 days each. Sucrose solution (20%) was dripped onto slabs 8 times/day and 0.9% sodium chloride (NaCl), 0.12% chlorhexidine (CHX), or 5% infusion of Stevia were dripped 2x/day. Biofilm formed on the slabs was collected and analyzed for counts of microorganisms (total bacteria, Lactobacilli, Candida spp., and Streptococcus mutans) biochemical composition in terms of soluble and insoluble extracellular polysaccharides and qualitative assessment by scanning electron microscopy. The percentage of surface hardness loss (%SHL) was determined on enamel slabs taken baseline and post-biofilm Knoop surface hardness values. Results: The % SHL in the CHX treatment was statistically lower in comparison to NaCl (p < 0.05). No differences were found between Stevia and CHX and between Stevia and NaCl. No other difference was found among the experimental groups with respect to the other outcomes. Discussion: Under high cariogenic conditions resembling frequent exposure to sucrose and absence of mechanical disruption, use of Stevia can neither modify the counts of cariogenic microorganisms nor the concentration of extracellular polysaccharides on in situ formed biofilms. This may have occurred due to the exposure of the biofilm to high sucrose concentration for all treatments and the condition of the microorganism growth in situ, which may hinder the diffusion of substances through the thick biofilm. Conclusion: Biofilm exposed to a high cariogenic challenge and without mechanical disruption is not affected by an infusion of Stevia rebaudiana Bertoni., Objetivo: A Stevia rebaudiana Bertoni (Stevia) é um adoçante natural não calórico que pode modificar a cariogenicidade de biofilmes. Este estudo teve como objetivo avaliar o efeito da infusão de Stevia na composição microbiana e bioquímica de biofilmes formados na presença de sacarose e na desmineralização do esmalte. Materiais e métodos: Em um desenho cruzado, onze voluntários usaram um aparelho intraoral palatino contendo 4 placas de esmalte bovino durante 3 fases de 7 dias cada. A solução de sacarose (20%) foi gotejada em placas 8 vezes/dia e cloreto de sódio a 0,9% (NaCl), clorexidina a 0,12% (CHX) ou infusão a 5% de Stevia foram gotejados 2x/dia. O biofilme formado nas placas foi coletado e analisado para contagem da composição bioquímica de microrganismos (bactérias totais, Lactobacilos, Candida spp. e Streptococcus mutans) em termos de polissacarídeos extracelulares solúveis e insolúveis e avaliação qualitativa por microscopia eletrônica de varredura. A porcentagem de perda de dureza superficial (%SHL) nos blocos de esmalte foi determinada com base nos valores de dureza superficial Knoop tomadas no início e pós-biofilme. Resultados: O % SHL no tratamento CHX foi estatisticamente menor em comparação ao NaCl (p < 0,05). Não foram encontradas diferenças entre Stevia e CHX e entre Stevia e NaCl. Nenhuma outra diferença foi encontrada entre os grupos experimentais em relação aos outros resultados. Discussão: Sob condições cariogênicas elevadas que se assemelham a exposição frequente à sacarose e ausência de disrupcao mecânica, o uso de Stevia não pode modificar as contagens de microrganismos cariogênicos nem a concentração de polissacarídeos extracelulares em biofilmes formados in situ. Isso pode ter ocorrido devido à exposição do biofilme à alta concentração de sacarose para todos os tratamentos e à condição de crescimento do microrganismo in situ, o que pode dificultar a difusão de substâncias através do biofilme espesso. Conclusão: O biofilme exposto a um alto desafio cariogênico e sem disruptucao mecânica não é afetado por uma infusão de Stevia rebaudiana Bertoni.

Catheter-associated urinary tract infections continue to be of concern, given the growth of epidemiological data, costs, bacterial resistance, and complications and morbidity. Bioprospection of plants as a strategy to control pathogenic microorganisms has gained space in the literature, due to the wide diversity existing in the Brazilian flora, which allows the exploration of endophytic fungi and various compounds, to be used in planktonic cells or to inhibit the formation of biofilms. This review aims to address the formation of biofilm in bladder catheters and perspectives with endophytic fungi, secondary metabolites and bioactive compounds against pathogenic microorganisms. The present data demonstrate a favorable use of endophytic fungi in the control of gram-positive and gram-negative microorganisms. The metabolites extracted from endophytic fungi with antibacterial action can be categorized especially among the class of phenolic compounds. In addition, they can be used to control the formation of biofilms in medical devices, such as indwelling bladder catheters, which are very susceptible to microbial colonization, being responsible for severe and persistent infections. Las infecciones del tracto urinario asociadas al catéter continúan siendo motivo de preocupación, dado el aumento de los datos epidemiológicos, los costos, la resistencia bacteriana y las complicaciones y la morbilidad. La bioprospección de plantas como estrategia para el control de microorganismos patógenos ha ganado espacio en la literatura, debido a la amplia diversidad existente en la flora brasileña, lo que permite la exploración de hongos endófitos y diversos compuestos, para ser utilizados en células planctónicas o para inhibir la formación de biopelículas. Esta revisión tiene como objetivo abordar la formación de biopelículas en sondas vesicales y perspectivas con hongos endófitos, metabolitos secundarios y compuestos bioactivos frente a microorganismos patógenos.Los presentes datos demuestran un uso favorable de los hongos endófitos en el control de microorganismos grampositivos y gramnegativos. Los metabolitos extraídos de hongos endófitos con acción antibacteriana se pueden categorizar especialmente dentro de la clase de compuestos fenólicos. Además, pueden usarse para controlar la formación de biopelículas en dispositivos médicos, como sondas vesicales permanentes, que son muy susceptibles a la colonización microbiana, siendo responsables de infecciones graves y persistentes. As infecções do trato urinário associadas a cateteres continuam sendo motivo de preocupação, dado o crescimento de dados epidemiológicos, custos, resistência bacteriana, complicações e morbidade. A bioprospecção de plantas como estratégia de controle de microrganismos patogênicos tem ganhado espaço na literatura, devido à grande diversidade existente na flora brasileira, que permite a exploração de fungos endofíticos e diversos compostos, para serem utilizados em células planctônicas ou para inibir a formação de biofilmes. A presente revisão tem como objetivo abordar a formação de biofilme em cateteres vesicais e perspectivas com fungos endofíticos, metabólitos secundários e compostos bioativos contra microrganismos patogênicos. Os presentes dados demonstram um uso favorável de fungos endofíticos no controle de microrganismos gram-positivos e gram-negativos. Os metabólitos extraídos de fungos endofíticos com ação antibacteriana podem ser categorizados principalmente na classe dos compostos fenólicos. Além disso, podem ser usados para controlar a formação de biofilmes em dispositivos médicos, como sondas vesicais de demora, que são muito susceptíveis à colonização microbiana, sendo responsáveis por infecções graves e persistentes.

Dissertação de mestrado em BioInformatics, Throughout the last decades, bacteria have become increasingly resistant to available antibiotics, leading to a growing need for new antibiotics and new drug development methodologies. In the last 40 years, there are no records of the development of new antibiotics, which has begun to shorten possible alternatives. Therefore, finding new antibiotics and bringing them to market is increasingly challenging. One approach is finding compounds that restore or leverage the activity of existing antibiotics against biofilm bacteria. As the information in this field is very limited and there is no database regarding this theme, machine learning models were used to predict the relevance of the documents regarding adjuvants. In this project, the BIOFILMad - Catalog of antimicrobial adjuvants to tackle biofilms application was developed to help researchers save time in their daily research. This application was constructed using Django and Django REST Framework for the backend and React for the frontend. As for the backend, a database needed to be constructed since no database entirely focuses on this topic. For that, a machine learning model was trained to help us classify articles. Three different algorithms were used, Support-Vector Machine (SVM), Random Forest (RF), and Logistic Regression (LR), combined with a different number of features used, more precisely, 945 and 1890. When analyzing all metrics, model LR-1 performed the best for classifying relevant documents with an accuracy score of 0.8461, a recall score of 0.6170, an f1-score of 0.6904, and a precision score of 0.7837. This model is the best at correctly predicting the relevant documents, as proven by the higher recall score compared to the other models. With this model, our database was populated with relevant information. Our backend has a unique feature, the aggregation feature constructed with Named Entity Recognition (NER). The goal is to identify specific entity types, in our case, it identifies CHEMICAL and DISEASE. An association between these entities was made, thus delivering the user the respective associations, saving researchers time. For example, a researcher can see with which compounds "pseudomonas aeruginosa" has already been tested thanks to this aggregation feature. The frontend was implemented so the user could access this aggregation feature, see the articles present in the database, use the machine learning models to classify new documents, and insert them in the database if they are relevant., Ao longo das últimas décadas, as bactérias tornaram-se cada vez mais resistentes aos antibióticos disponíveis, levando a uma crescente necessidade de novos antibióticos e novas metodologias de desenvolvimento de medicamentos. Nos últimos 40 anos, não há registos do desenvolvimento de novos antibióticos, o que começa a reduzir as alternativas possíveis. Portanto, criar novos antibióticos e torna-los disponíveis no mercado é cada vez mais desafiante. Uma abordagem é a descoberta de compostos que restaurem ou potencializem a atividade dos antibióticos existentes contra bactérias multirresistentes. Como as informações neste campo são muito limitadas e não há uma base de dados sobre este tema, modelos de Machine Learning foram utilizados para prever a relevância dos documentos acerca dos adjuvantes. Neste projeto, foi desenvolvida a aplicação BIOFILMad - Catalog of antimicrobial adjuvants to tackle biofilms para ajudar os investigadores a economizar tempo nas suas pesquisas. Esta aplicação foi construída usando o Django e Django REST Framework para o backend e React para o frontend. Quanto ao backend, foi necessário construir uma base de dados, pois não existe nenhuma que se concentre inteiramente neste tópico. Para isso, foi treinado um modelo machine learning para nos ajudar a classificar os artigos. Três algoritmos diferentes foram usados: Support-Vector Machine (SVM), Random Forest (RF) e Logistic Regression (LR), combinados com um número diferente de features, mais precisamente, 945 e 1890. Ao analisar todas as métricas, o modelo LR-1 teve o melhor desempenho para classificar artigos relevantes com uma accuracy de 0,8461, um recall de 0,6170, um f1-score de 0,6904 e uma precision de 0,7837. Este modelo foi o melhor a prever corretamente os artigos relevantes, comprovado pelo alto recall em comparação com os outros modelos. Com este modelo, a base de dados foi populda com informação relevante. O backend apresenta uma caracteristica particular, a agregação construída com Named-Entity-Recognition (NER). O objetivo é identificar tipos específicos de entidades, no nosso caso, identifica QUÍMICOS e DOENÇAS. Esta classificação serviu para formar associações entre entidades, demonstrando ao utilizador as respetivas associações feitas, permitindo economizar o tempo dos investigadores. Por exemplo, um investigador pode ver com quais compostos a "pseudomonas aeruginosa" já foi testada graças à funcionalidade de agregação. O frontend foi implementado para que o utilizador possa ter acesso a esta funcionalidade de agregação, ver os artigos presentes na base de dados, utilizar o modelo de machine learning para classificar novos artigos e inseri-los na base de dados caso sejam relevantes.

Human skin banks around the world face a serious problem with the high number of allogeneic skins that are discarded and cannot be used for grafting due to persistent bacterial contamination even after antibiotic treatment. The biofilm formation capacity of these microorganisms may contribute to the antibiotic tolerance; however, this is not yet widely discussed in the literature. Thisstudy analyzed bacterial strains isolated from allogeneic human skin samples,which were obtained from a hospital skin bank that had already been discardeddue to microbial contamination. Biofilm formation and susceptibility topenicillin, tetracycline, and gentamicin were evaluated by crystal violetbiomass quantification and determination of the minimum inhibitoryconcentration (MIC), minimum biofilm inhibitory concentration (MBIC), andminimum biofilm eradication concentration (MBEC) by the broth microdilutionmethod with resazurin dye. A total of 216 bacterial strains were evaluated, and204 (94.45%) of them were classified as biofilm formers with varying degrees ofadhesion. MBICs were at least 512 times higher than MICs, and MBECs were atleast 512 times higher than MBICs. Thus, the presence of biofilm in allogeneicskin likely contributes to the inefficiency of the applied treatments as antibiotictolerance is known to be much higher when bacteria are in the biofilmconformation. Thus, antibiotic treatment protocols in skin banks shouldconsider biofilm formation and should include compounds with antibiofilmaction.

The increasing use of pesticides has induced great environmental concern due to the high ecological risk of aquatic contamination. Thus, microorganisms that inhabit rivers are among the first aquatic organisms to come into contact with residues of these contaminants. Recently, epilithic biofilms have come to be used as a matrix for environmental contamination studies, as they act as bioaccumulators of organic and inorganic compounds. The objective of this research was to investigate the impacts of agricultural activities on surface water contamination with pesticides, with emphasis on glyphosate and its metabolite AMPA, using three monitoring matrices (water, suspended sediments, and epilithic biofilms) and with emphasis on the resilience of glyphosate and AMPA in biofilms. Three watersheds were monitored: one representative of "Modern Agriculture" in a subtropical environment (Quinze de Novembro/RS); one representative of the recent expansion of agriculture over the Pampa biome with Agrarian Reform Settlement (Júlio de Castilhos/RS); and the last one, representative of Argentine agriculture (Quequén Grande - Buenos Aires province). The thesis was presented in three studies. In the first, it was evident that glyphosate and AMPA are bioaccumulated in epilithic biofilms and, were detected in all monitoring sites, in concentrations ranging from 195 to 7673 μg kg-1 for glyphosate and from 225 to 4180 μg kg-1 for AMPA, being that these compounds are also permanently impregnated in the sediments. Also noteworthy was the fungicide tebuconazole, detected in all biofilm’s samples. The second study showed that natural biofilms previously impregnated with glyphosate and AMPA, once transferred to an aquatic environment less contaminated with such compounds, are not able to self-deepen, keeping the initial contamination with them. The phylum Proteobacteria was benefited by the high concentrations of these two xenobiotics. The microbial community is highly and constantly stressed, with difficulties in self-deepening. The third, carried out in the Quequén Grande river basin in Argentina, showed that atrazine was the only compound with 100% detection in the water matrix, and was not detected in sediments and biofilms. Herbicides were detected in 100% of biofilms, in concentrations ranging from 1.61 μg kg-1 (imazethapyr) to 655.00 μg kg-1 (glyphosate), with emphasis on glyphosate and its metabolite AMPA. Biofilms allowed integrative analysis of compounds, especially in comparison with point water sampling, and can bioaccumulate pesticide molecules, providing much more advanced insight into the degree of contamination of the aquatic environment, than the use of active water and even suspended sediment sampling. In addition, studies in subtropical regions with soybean and other transgenic crops must include glyphosate and its metabolite AMPA. A crescente utilização de agrotóxicos induziu grande preocupação ambiental devido ao alto risco ecológico de contaminação aquática. Assim, os microrganismos que habitam os rios estão entre os primeiros organismos aquáticos a entrar em contato com os resíduos desses contaminantes. Recentemente, biofilmes epilíticos passaram a ser utilizados como matriz de estudos de contaminação ambiental, na medida em que atuam como bioacumuladores de compostos orgânicos e inorgânicos. O objetivo desta pesquisa foi investigar os impactos das atividades agrícolas na contaminação das águas superficiais com agrotóxicos, com ênfase ao glifosato e seu metabólito AMPA, usando três matrizes de monitoramento (água, sedimentos em suspensão e biofilmes epilíticos) e com ênfase na capacidade de resiliência de glifosato e AMPA nos biofilmes. Foram monitoradas três bacias hidrográficas: uma representativa da “Agricultura Moderna” em ambiente subtropical (Quinze de Novembro/RS); uma representativa da expansão recente da agricultura sobre bioma Pampa com Assentamento de Reforma Agrária (Júlio de Castilhos/RS) e uma representativa da agricultura Argentina (Quequén Grande - província de Buenos Aires). A tese foi apresentada em três estudos. No primeiro, ficou evidente que glifosato e AMPA estão bioacumulados nos biofilmes epilíticos e, foram detectados em todos os sítios de monitoramento, em concentrações que variaram de 195 a 7673 μg kg-1 para glifosato e de 225 a 4180 μg kg-1 para AMPA, sendo que estes compostos também estão permanentemente impregnados nos sedimentos. Destacou-se ainda o fungicida tebuconazol, detectado em todas as amostras de biofilmes. O segundo estudo demonstrou que os biofilmes naturais previamente impregnados com glifosato e AMPA, uma vez transferidos à meio aquático menos contaminado com tais compostos, não são capazes de se autodepurar guardando consigo a contaminaçao inicial. O filo Proteobacteria foi favorecido pelas altas concentrações desses dois xenobióticos. A comunidade microbiana está alta e constantemente estressada, com dificuldades em se autodepurar. O terceiro, realizado na bacia hidrográfica do rio Quequén Grande - Argentina, evidenciou que a atrazina foi o único composto com 100% de detecção na matriz água, não sendo detectado em sedimentos e biofilmes. Os herbicidas foram detectados em 100% dos biofilmes, em concentrações que variaram de 1,61 μg kg-1 (imazetapir) a 655,00 μg kg-1 (glifosato), com destaque para glifosato e seu metabólito AMPA. Os biofilmes permitiram a análise integrativa de compostos, principalmente em comparação com a amostragem pontual da água, e são capazes de bioacumular moléculas de agrotóxicos, fornecendo um panorama muito mais avançado sobre o grau de contaminação do ambiente aquático, do que o uso da amostragem ativa da água e mesmo dos sedimentos em suspensão. Além disso, os estudos em regiões subtropicais com cultivos de soja e outras culturas transgênicas devem obrigatoriamente incluir o glifosato e seu metabólito AMPA.

O objetivo deste estudo foi avaliar o crescimento e a adesão de microrganismos sobre a superfície de resinas compostas expostas a diferentes ciclos de fotoativação. Foi realizado um estudo experimental laboratorial in vitro do tipo analítico de adesão de levedura e bactéria em superfície de resina composta (Opallis, FGM, Brasil) fotoativadas nos modos contínuo e chaveado (Optilight Max, Dabi Atlante, Brasil) com 1200 mW/cm2 de densidade de potência. Foram confeccionados 80 discos de resina composta, divididos aleatoriamente de acordo com o meio de imersão (n=40): caldo TSB para bactéria, e caldo Sabouraud dextrose para levedura. As amostras fotoativadas no modo contínuo tiveram maior adesão de Candida tropicalis e de Staphylococcus aureus, todavia sem diferença estatisticamente significante, de acordo com o teste exato de Fisher. Com base nos achados do presente estudo, não há diferenças de adesão de biofilme em superfície de restaurações em resina composta no tocante à variação dos ciclos de fotoativação; desta forma, o cirurgião-dentista tem a liberdade de optar pelo ciclo de cura que mais se adapte. This study aimed to evaluate the growth and adhesion of microorganisms over the surface of composite resins exposed to different light curing cycles. An in vitro analytical laboratory experimental study of adhesion of yeast and bacteria over the surface of light cured composite resin (Opallis, FGM, Brazil) in continuous and switched modes was carried out (Optilight Max, Dabi Atlante, Brazil) with 1200 mW/cm2 power density. Eighty composite resin discs were produced, randomly divided according to the immersion medium (n=40): TSB broth for bacteria, and Sabouraud dextrose broth for yeast.The samples light-cured in continuous mode had greater adhesion of Candida tropicalis and Staphylococcus aureus, although without statistically significant difference, according to Fisher's exact test. Based on the findings of the present study, there are no differences in biofilm adhesion on the surface of composite resin restorations regarding the variation of light-curing cycles; in this way, the dental clinician is free to choose the curing cycle that best suits you. El objetivo de este estudio fue evaluar el crecimiento y adhesión de microorganismos sobre la superficie de resinas compuestas expuestas a diferentes ciclos de fotoactivación. Se realizó un estudio experimental de laboratorio in vitro del tipo analítico de adhesión de levaduras y bacterias sobre la superficie de resina compuesta (Opallis, FGM, Brasil) fotoactivadas en modo continuo y conmutado (Optilight Max, Dabi Atlante, Brasil) con 1200 mW/cm2 de densidad de potencia. Se fabricaron 80 discos de resina compuesta, divididos aleatoriamente según el medio de inmersión (n=40): caldo TSB para bacterias y caldo Sabouraud dextrosa para levaduras. Las muestras fotopolimerizadas en modo continuo presentaron mayor adherencia de Candida tropicalis y Staphylococcus aureus, pero sin diferencia estadísticamente significativa, según la prueba exacta de Fisher. Con base en los hallazgos del presente estudio, no existen diferencias en la adhesión del biofilm en la superficie de las restauraciones de resina compuesta con respecto a la variación de los ciclos de fotopolimerización; de esta forma, el odontólogo es libre de elegir el ciclo de cicatrización que más le convenga.

Healing films provide excellent results in the adjuvant treatment of injuries. Its association with plant extracts allows the achievement of therapeutic activities, favoring skin regeneration. This study aimed to develop pullulan films incorporated with an extract from the aerial parts of Cyclospermum leptophyllum to be used as healing dressings and to evaluate their morphological and physicochemical characteristics and their potential antioxidant activity. Polymeric films in the proportion of 4% PU (m/v) and 15% plant extract and control films composed only of the polymer matrix were produced using the casting method. The films were evaluated for thickness, visual aspects, solubility, water vapor permeability, swelling, degradation, and antioxidant activity. They showed good appearance and flexibility but heterogeneity due to the precipitation of components. A high degree of solubility and swelling was observed, and despite its rapid dissolution in contact with water, the formation of a hydrogel can enable greater adherence to wounds. The films have controlled water vapor transmission, that allows gas exchange. A DPPH radical inhibition rate of 17.23% was obtained, proving its antioxidant activity. Therefore, the biofilms produced have healing potential, which can be better studied in the future through tests demonstrating antimicrobial, and anti-inflammatory activities. Filmes curativos propiciam excelentes resultados no tratamento adjuvante de lesões. Sua associação à extratos vegetais permite a obtenção de atividades terapêuticas, favorecendo a regeneração cutânea. O objetivo do trabalho foi desenvolver filmes de pululana incorporados com extrato das partes aéreas de Cyclospermum leptophyllum para serem utilizados como curativos cicatrizantes, bem como avaliar suas características morfológicas e físico-químicas e sua potencial atividade antioxidante. Foram produzidos pelo método de casting filmes poliméricos na proporção de 4% PU (m/v) e 15% extrato vegetal e filmes controle compostos apenas pela matriz polimérica. Os filmes foram avaliados quanto a espessura, aspectos visuais, solubilidade, permeabilidade ao vapor d'água, intumescimento, degradação e atividade antioxidante. Eles apresentaram boa aparência e flexibilidade, mas heterogeneidade pela precipitação de componentes. Observou-se alto grau de solubilidade e intumescimento, e apesar de sua rápida dissolução em contato com a água, a formação de um hidrogel pode possibilitar melhor aderência à feridas. Apresentaram também controlada transmissão de vapor d'água, a qual permite a troca gasosa. Uma taxa de inibição do radical DPPH de 17,23% foi obtida, comprovando sua atividade antioxidante. Portanto, os biofilmes produzidos apresentam potencial atividade curativa, a qual pode ser melhor estudada em futuros estudos por meio da realização de testes que demonstrem suas exatas atividades antioxidante, antimicrobiana e antiinflamatória. Las películas cicatrizantes proporcionan excelentes resultados en el tratamiento adyuvante de lesiones. Su asociación con extractos de plantas permite la consecución de actividades terapéuticas, favoreciendo la regeneración de la piel. El objetivo de este trabajo fue desarrollar películas de pululano incorporadas con extracto de partes aéreas de Cyclospermum leptophyllum para ser utilizadas como apósitos cicatrizantes, así como evaluar sus características morfológicas, fisicoquímicas y su potencial actividad antioxidante. Se produjeron películas poliméricas en la proporción de 4% PU (m/v) y 15% de extracto vegetal y películas de control compuestas únicamente por la matriz polimérica por el método de fundición. Se evaluó el espesor de las películas, aspectos visuales, solubilidad, permeabilidad al vapor de agua, hinchamiento, degradación y actividad antioxidante. Presentaron buena apariencia y flexibilidad, pero heterogeneidad debido a la precipitación de componentes. Se observó un alto grado de solubilidad e hinchamiento y, a pesar de su rápida disolución en contacto con el agua, la formación de un hidrogel puede permitir una mejor adherencia a las heridas. También mostraron transmisión controlada de vapor de agua, lo que permite el intercambio de gases. Se obtuvo una tasa de inhibición del radical DPPH del 17,23%, demostrando su actividad antioxidante. Por lo tanto, las biopelículas producidas tienen una actividad curativa potencial, que puede estudiarse mejor en futuros estudios a través de pruebas que demuestren sus actividades antioxidantes, antimicrobianas y antiinflamatorias exactas.

Apical periodontitis is mainly caused by both microrganisms and their virulence factors. This process can be associated with the survival of its causative agents due to coronary microleakage after chemical-mechanical preparation and filling. However, persistent apical periodontitis can be solved through endodontic retreatment or apical surgery. In addition, its association with systemic diseases has been reported in different studies. The aim of the current study is to perform a literature review on studies about apical periodontitis, with emphasis on current microbial profile and treatment modalities. Studies have shown significant heterogeneity in microbial profile, as well as likely associations with some diseases. Moreover, they have mainly focused on investigating persistent apical periodontitis based on molecular biology. It was possible concluding that, although Enterococcus faecalis is the species most often associated with failure in endodontic treatments, the incidence of other microrganisms, such as Candida albicans, Streptococcus spp., Actinobacteria spp., has been observed at the same, or even at higher, level than that of E. faecalis. Retreatment should always be taken into consideration as the first option to treat morbidities, although surgery can be performed if retreatment is not successful. La periodontitis apical es causada principalmente por microorganismos y sus factores de virulencia. Este proceso puede ocurrir a través de la supervivencia de los agentes causales debido a la microinfiltración coronaria luego de la preparación químico-mecánica y la obturación. Sin embargo, la periodontitis apical persistente puede ser solucionada a través del retratamiento endodóntico o la cirugía apical. Este trabajo tuvo como objetivo realizar una revisión de literatura sobre la periodontitis apical destacando el perfil microbiano actual y modalidades de tratamiento. Las investigaciones han demostrado gran diversidad en lo que respecta al perfil microbiano, así como posibles asociaciones con algunas enfermedades sistémicas. Además, los estudios han dado gran enfoque a la periodontitis apical persistente a nivel molecular. Pudimos concluir que a pesar del Enterococcus faecalis ser la especie más comúnmente asociada a la falla del tratamiento endodóntico, se ha observado la presencia de otros tipos de microorganismos, como: Candida albicans, Streptococcus spp., Actinobacteria spp. En relación con las modalidades de tratamiento, el retratamiento debe ser considerado como primera opción y en caso de fracaso, la cirugía puede ser realizada. A periodontite apical é causada principalmente por microrganismos e seus fatores de virulência. Esse processo pode estar associado à sobrevivência de seus agentes causadores devido à microinfiltração coronariana após preparo químico-mecânico e preenchimento. No entanto, a periodontite apical persistente pode ser resolvida através de retratamento endodôntico ou cirurgia apical. Além disso, sua associação com doenças sistêmicas tem sido relatada em diferentes estudos. O objetivo do presente estudo é realizar uma revisão de literatura sobre periodontite apical, com ênfase no perfil microbiano atual e modalidades de tratamento. Estudos têm demonstrado significativa heterogeneidade no perfil microbiano, bem como prováveis associações com algumas doenças. Além disso, eles se concentraram principalmente na investigação da periodontite apical persistente com base na biologia molecular. Foi possível concluir que, embora Enterococcus faecalis seja a espécie mais frequentemente associada ao insucesso em tratamentos endodônticos, a incidência de outros microrganismos, como Candida albicans, Streptococcus spp., Actinobacteria spp. nível superior ao de E. faecalis. O retratamento deve sempre ser considerado como a primeira opção para tratar as morbidades, embora a cirurgia possa ser realizada se o retratamento não for bem sucedido.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES Biofilms are responsible for up to 80% of antimicrobial-resistant nosocomial infections. Most of these infections are associated with the use of medical devices such as urinary catheters, and in this context, it is estimated that 90-100% of patients who undergo long-term catheterization develop bacteriuria, with Proteus mirabilis being the most prevalent microorganism, indicated as responsible for 20-45% of these infections. In view of the above, due to the difficulty of treating biofilms, new alternatives have been tested daily to fight infections and antimicrobial photodynamic therapy is an emerging strategy for the treatment of antimicrobial-resistant microorganisms. This therapy uses a photosensitizer and specific wavelength light to generate reactive oxygen species. Among the photosensitizers used, porphyrins have been extensively evaluated, since they have already been shown to be efficient against several microorganisms, in addition to the possibility that some are soluble in water. Thus, this work aims to evaluate the antimicrobial and antibiofilm activity of porphyrins on the ATCC 25933 strain of P. mirabilis and clinical isolates, as well as their cytotoxic and genotoxic effects on human mononuclear cells. The porphyrins 3-H2TPyP, 4-H2TPyP, 3-cis-PtTPyP e 4-cis-PtTPyP were evaluated in broth microdilution tests to determine the minimum inhibitory concentration and minimum bactericidal concentration. Time-kill assay, checkerboard assay, test with reactive oxygen species scavengers and conventional biofilm formation assay and biofilm with catheters were also performed. Tests were performed with human mononuclear cells in order to determine the cytotoxicity and genotoxicity of porphyrins. The results of the microdilution tests showed greater efficacy against P. mirabilis when the porphyrins were exposed to white LED light (370 to 800 nm), which also occurred when the time-kill test was performed at times 0, 2, 6 and 12h. P. mirabilis was considered a strong biofilm former when MH broth supplemented with 1% glucose was used. In biofilm assays (conventional and catheter), porphyrins obtained better results when irradiated with light. In the checkerboard assay, both porphyrins showed indifference when administered together. From the cytotoxicity and genotoxicity tests performed on human mononuclear cells, it was possible to observe that the porphyrin 3-cis-PtTPyP in the presence of light was the only one to show a decrease in cell viability in the MTT test. This same porphyrin caused DNA damage when not irradiated with light. None of the porphyrins caused an increase in DCF and nitrite in the tests performed. It can be concluded from the above that aPDT together with the use of porphyrins with cisplatin obtained positive results, and may become an alternative in the treatment of P. mirabilis infections. Os biofilmes são responsáveis por até 80% das infecções hospitalares resistentes aos antimicrobianos. Grande parte dessas infecções está associada ao uso de dispositivos médicos como cateteres urinários, e nesse contexto, estima-se que 90-100% dos pacientes que se submetem a cateterismo de longo prazo desenvolvem bacteriúria, sendo Proteus mirabilis o microrganismo mais prevalente, apontado como responsável por 20-45% dessas infecções. Tendo em vista o exposto, devido à dificuldade de tratamento dos biofilmes, novas alternativas têm sido testadas diariamente para combater infecções e a terapia fotodinâmica antimicrobiana é uma estratégia emergente para o tratamento de microrganismos resistentes a antimicrobianos. Essa terapia utiliza um fotossensibilizador e luz com comprimento de onda específico para geração de espécies reativas de oxigênio. Dentre os fotossensibilizadores utilizados, as porfirinas têm sido extensivamente avaliadas, uma vez que já demonstraram ser eficientes contra diversos microrganismos, além da possibilidade de algumas, serem solúveis em água. Deste modo, este trabalho visou avaliar a atividade antimicrobiana e antibiofilme de porfirinas sobre a cepa ATCC 25933 de P. mirabilis e isolados clínicos bem como os efeitos citotóxicos e genotóxicos das mesmas em células mononucleares humanas. As porfirinas 3-H2TPyP, 4-H2TPyP, 3-cis-PtTPyP e 4-cis-PtTPyP foram avaliadas em testes de microdiluição em caldo para determinar a concentração inibitória mínima e concentração bactericida mínima. Também foram realizadas curvas de viabilidade microbiana, ensaio de checkerboard, teste com sequestradores de espécies reativas de oxigênio e ensaio de formação de biofilme convencional e biofilme com cateteres. Com células mononucleares humanas foram feitos testes a fim de determinar a citotoxicidade e gentoxicidade das porfirinas. Os resultados dos testes de microdiluição demostraram eficácia maior contra P. mirabilis, quando as porfirinas foram expostas a luz de LED branca (370 a 800 nm), o que também ocorreu quando foi realizado o teste de curva de viabilidade microbiana nos tempos 0, 2, 6 e 12h. P. mirabilis foi considerada forte formadora de biofilme quando se utilizou caldo Muller Hinton suplementado com 1% de glicose. Nos ensaios de biofilme (convencional e cateter), as porfirinas obtiveram melhores resultados quando irradiadas com luz. No ensaio de checkerboard, ambas porfirinas apresentaram indiferença quando testadas em associação. A partir dos testes de cito e genotoxicidade realizados em células mononucleares humanas, foi possível observar que a porfirina 3-cis-PtTPyP na presença de luz foi a única a apresentar diminuição da viabilidade celular no teste de viabilidade celular. Essa mesma porfirina causou danos ao DNA quando não irradiada com luz. Nenhuma das porfirinas causou aumento de Diclorofluoresceína e de nitrito nos testes realizados. Pode-se concluir a partir dos resultados que a Terapia Fotodinâmica Antimicrobiana juntamente com o uso de porfirinas com cisplatina obteve resultados positivos, podendo vir a tornar-se uma alternativa no tratamento de infeções por P. mirabilis.

Dissertação de Mestrado em Química Medicinal apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia As infeções por microrganismos multirresistentes (MDR) são um dos grandes desafios para os sistemas de saúde e para as empresas farmacêuticas e prevê-se que este problema aumente, consideravelmente, ao longo das próximas décadas. A Organização Mundial da Saúde (OMS) informou que podemos retornar à época onde infeções comuns e ferimentos leves podem matar, causando consequências desastrosas ao longo da vida. Existe, assim, uma necessidade urgente de uma nova classe de antibióticos ou de um novo tratamento que seja eficaz contra as espécies multirresistentes. As infeções podem ser causadas por diferentes tipos de microrganismos, como bactérias, vírus, fungos ou parasitas. Do ponto de vista biológico, as bactérias podem ser dividas em dois grupos, as gram-positivas ou as gram-negativas. Estes dois grupos possuem diferenças nas suas paredes celulares. Uma grande parte dos estudos de terapia fotodinâmica antimicrobiana (aPDT) são realizados com bactérias na forma planctónica, contudo as bactérias persistem em ecossistemas de biofilmes e raramente em culturas de uma única espécie. Nos biofilmes, os microrganismos são notavelmente menos suscetíveis aos antimicrobianos em comparação com os seus homólogos planctónicos. Para além das infeções causadas por células bacterianas, os vírus são muito abundantes e podem ser encontrados em uma ampla variedade de formas. Eles têm a capacidade de infetar células eucarióticas ou procarióticas para forçá-las a produzir milhares de cópias do vírus infetante. A terapia fotodinâmica antimicrobiana surgiu, deste modo, como uma proposta promissora para o tratamento de infeções localizadas, especialmente infeções cutâneas ou mucosas. A terapia fotodinâmica (PDT) consiste na administração de um medicamento ou de um corante não tóxico, designado como fotossensibilizador (PS, do inglês photosensitizer). Após um determinado intervalo de tempo, a lesão é iluminada com luz visível, com um comprimento de onda específico absorvido pelo PS administrado. O PS após absorver a luz fica num estado eletrónico excitado e reage com moléculas de oxigénio levando à formação de espécies reativas de oxigénio (ROS). O objetivo deste trabalho consistiu em avaliar o potencial de uma clorina catiónica como possível fotossensibilizador em terapia fotodinâmica antimicrobiana. Primeiramente, foi avaliada a capacidade deste composto em reduzir a carga viral, em células HEK que expressam o recetor ACE2 e que se encontram infetadas com partículas lentivirais pseudotipadas, garantindo a viabilidade celular destas células. Numa das experiências, o fotossensibilizador foi ativado juntamente com o vírus e só depois foi adicionado às células. Nesta experiência, verificou-se que ocorria uma redução de cerca de 50 % da carga viral em condições que eram mantidas a viabilidade celular. Numa segunda condição, as células foram incubadas com o vírus e com o PS e só depois ocorreu a irradiação diretamente nas células. Nas condições de realização deste ensaio, a viabilidade celular após tratamento foi muito baixa e é necessário a realização de um novo ensaio de forma a garantir condições em que haja viabilidade celular elevada. Numa segunda parte do trabalho, o objetivo consistiu em avaliar a atividade do fotossensibilizador para iluminação de bactérias gram-positivas e gram-negativas na forma planctónica e na forma de biofilmes, garantindo sempre, condições de viabilidade celular para as células hospedeiras. Os resultados obtidos mostram que com apenas 0,3 µM de fotossensibilizador, incubado por 1 hora e com apenas 5 J/cm2 já é possível obter uma redução de 3 log de CFU/ml nas bactérias S. aureus, enquanto que com as E. coli são precisos 0,4 µM de fotossensibilizador para se verifica esta redução.Nos biofilmes, a redução de pelo menos 3 log de CFU/ml só foi atingida usando uma concentração de 50 µM com 1h de incubação e 4 J/cm2. Por fim, com 10 µM de PS foi realizado um estudo para verificar se o tempo de incubação tinha influência e verificamos que ao aumentar o tempo de incubação do fotossensibilizador em contacto com o biofilme antes da irradiação, a inativação era maior. Infections by multidrug-resistant microorganisms (MDR) are a major challenge for health systems and pharmaceutical companies, and this problem can be expected to increase considerably over the coming decades. The World Health Organization (WHO) has reported that we can return to a time when common infections and infectious diseases can kill. There is thus an urgent need for a new class of antibiotics or a new treatment that is effective against multidrug-resistant species. Infections can be sensitive to different types of microorganisms such as bacteria, viruses, fungi, or parasites.From a biological point of view, bacteria can be divided into two groups: gram-positive or gram-negative. These two cell groups have differences in their walls. A large part of the studies done on antimicrobial photodynamic therapy (aPDT) is carried out with bacteria in planktonic form, but persistent bacteria form biofilm ecosystems and rarely of a single species. In biofilms, bacteria are notably less accessible to antimicrobials compared to their planktonic counterparts.In addition to very flexible bacterial cell infections, viruses are plentiful and can be found in a variety of forms. They all have the common ability to infect eukaryotic or prokaryotic cells and force them to produce copies of infective viruses.Antimicrobial photodynamic therapy has emerged as a promising proposal for the treatment of localized infections, especially skin infections or infections of mucous membranes. Photodynamic therapy (PDT) consists of the administration of a drug, which is a non-toxic dye called a photosensitizer (PS). After a certain time, the lesion is illuminated with visible light, with a specific wavelength absorbed by the administered PS. The PS after absorbing light is in an excited oxygen state and reacts with oxygen molecules, forming reactive oxygen species (ROS).The objective of this work is to evaluate the potential of a cationic chlorin as a possible photosensitizer in antimicrobial photodynamic therapy. First, the ability of this compound to reduce viral load was evaluated in HEK cells that express the ACE2 receptor and that are infected with pseudo typed lentiviral particles, guaranteeing the cell viability of these cells. In one of the experiments, the photosensitizer was activated together with the virus and only then was it added to the cells. In this experiment, a reduction of about 50% in viral load was found to occur under conditions that maintained cell viability. In a second condition, the cells were incubated with the virus and with the PS, and the irradiation occurred directly in the cells. Cell viability was low in this assay, and it is necessary to carry out new experiments to guarantee conditions in which cell viability is high.In a second part of the work, the objective was to evaluate the activity of the photosensitizer towards gram-positive and gram-negative bacteria in planktonic and biofilm form, always ensuring cell viability conditions for the human cells. The results show that it is possible to obtain a reduction of 3 log CFU/ml in S. aureus bacteria with only 0.3 µM of photosensitizer, incubated for 1 hour, and with only 5 J/cm2, whereas in E. coli, 0.4 µM of photosensitizer is required to verify this reduction.In biofilms, a reduction of at least 3 log CFU/ml was only achieved using a concentration of 50 µM with 1 h of incubation and 4 J/cm2. Finally, with 10 µM of PS, a study was carried out to verify if the incubation time had an influence, and we found that by increasing the incubation time of the photosensitizer in contact with the biofilm before irradiation, the inactivation was greater.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES Pseudomonas aeruginosa is an opportunistic pathogen that can be found in diverse environments and is often associated with serious infections in immunocompromised patients. This microorganism has a notorious ability to form biofilms, thus being able to colonize medical devices, wounds and burns. Biofilms are characterized as bacterial communities surrounded by an extracellular matrix. This phenomenon makes microorganisms more resistant, resulting in a decrease in the effectiveness of treatment with antimicrobial agents. As a result, new treatments are being developed to reduce this problem, such as photodynamic therapy. This process is based on the use of a photosensitizer and the subsequent application of visible light to generate reactive oxygen species, thus causing cell death. In this context, the present work aims to evaluate the antimicrobial and antibiofilm activities of tetra-cationic porphyrins against Pseudomonas aeruginosa (PA01) and clinical isolates. The determination of the minimum inhibitory concentration (MIC) and the minimum bactericidal concentration (MBC) of porphyrins 3-H2TMePor and 4-H2TMePor front PA01 were performed by assays of antibacterial activity in different concentrations, being submitted to dark conditions and irradiation with white light for 120 minutes. The photosensitizer (PS) 4-H2TMePor was chosen for the other tests, as it showed better MIC and MBC activity. The main photoinactivation mechanism in the use of PS was mediated by singlet oxygen. In the cell viability curve assay, 4-H2TMePor porphyrin under white light irradiation at a concentration of 2xMIC inhibited bacterial growth in 60 minutes and MIC in 90 minutes. Porphyrin 4- H2TMePor associated with the antimicrobial Imipenem (IMP) against PA01 showed synergistic activity. Biofilms were formed with standard strain PA01 and three clinical isolates. To evaluate the antimicrobial activity of PS on the biofilm formed, the biofilm destruction assay was performed, using concentrations of MIC, 2xMIC and 4xMIC for each microorganism. The PS associated with the IMP potentiated the destruction of the biofilm against PA01 when compared to the positive control. The cytotoxicity assay with porphyrin 4- H2TMePor proved to be non-toxic against healthy human keratinocyte cells and mouse fibroblasts. Atomic force microscopy showed a common morphology for PA01. The nanomechanical properties were tested comparing PA01 without and with ½MIC treatment. The treated control showed lower adhesion strength, greater cell wall deformation and greater dissipation energy compared to untreated PA01, indicating interference of porphyrin directly with the cell wall of the microorganism even at concentration below the MIC. In view of these results, water-soluble tetra-cationic porphyrin showed excellent antimicrobial and antibiofilm activity, in addition to presenting good safety of use, showing to be a potential photosensitizer against infections caused by P. aeruginosa. Pseudomonas aeruginosa é um patógeno oportunista, que pode ser encontrado em diversos ambientes e está frequentemente associado a infecções graves em pacientes imunocomprometidos. Esse microrganismo possui uma notória capacidade de formar biofilmes, podendo assim colonizar dispositivos médicos, feridas e queimaduras. O biofilme é caracterizado como comunidade bacteriana envolta por uma matriz extracelular. Esse fenômeno torna os microrganismos mais resistentes resultando na diminuição da eficácia do tratamento com agentes antimicrobianos. Com isso, novos tratamentos estão sendo desenvolvidos para reduzir essa problemática, como a terapia fotodinâmica. Esse processo baseia-se no emprego de um fotossensibilizador e a subsequente aplicação de luz visível para geração de espécies reativas de oxigênio, acarretando assim, na morte celular. Nesse contexto, o presente trabalho tem por objetivo avaliar a atividade antimicrobiana e antibiofilme de porfirinas tetra-catiônicas frente a Pseudomonas aeruginosa (PA01) e isolados clínicos. As determinações da concentração inibitória mínima (CIM) e da concentração bactericida mínima (CBM) das porfirinas 3-H2TMePor e 4-H2TMePor frente PA01 foram realizadas por ensaios de atividade antibacteriana em diferentes concentrações, sendo submetidas a condições de escuro e irradiação com luz branca por 120 minutos. O fotossensibilizador (FS) 4-H2TMePor foi escolhido para os demais testes, pois apresentou melhor atividade de CIM e CBM. O mecanismo de fotoinativação majoritário na utilização do FS foi mediado por oxigênio singleto. No ensaio de curva de viabilidade celular a porfirina 4-H2TMePor sob irradiação com luz branca na concentração de 2xCIM inibiu o crescimento bacteriano em 60 minutos e a CIM em 90 minutos. A porfirina 4-H2TMePor associada ao antimicrobiano Imipenem (IMP) frente a PA01 apresentou atividade sinérgica. Os biofilmes foram formados com cepa padrão PA01 e três isolados clínicos. Para avaliar a atividade antimicrobiana do FS sobre o biofilme formado se realizou o ensaio de destruição do biofilme, utilizando concentrações de CIM, 2xCIM e 4xCIM referente a cada microrganismo. O FS associado ao IMP pontencializou a destruição do biofilme frente PA01 quando comparado ao controle positivo. O ensaio de citotoxicidade com a porfirina 4-H2TMePor demonstrou ser atóxica frente as células saudáveis de queratinócitos humanos e fibroblastos de camundongos. A microscopia de força atômica apresentou morfologia comum para PA01. As propriedades nanomecânicas foram testadas comparando PA01 sem e com ½CIM de tratamento. O controle tratado apresentou menor força de adesão, maior deformação da parede celular e maior energia de dissipação comparando com PA01 não tratada, indicando interferência da porfirina diretamente com a parede celular do microganismo mesmo em concentração abaixo da CIM. Diante desses resultados, a porfirina tetra-catiônica solúvel em água apresentou uma excelente atividade antimicrobiana e antibiofilme, além de apresentar boa segurança de uso, mostrando ser um potencial fotossensibilizador contra infecções causada por P. aeruginosa.

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Os peptídeos da família das Histatinas são moléculas promissoras para esse tratamento, devido a sua forte ação contra C. albicans. Histatina-5 (Hst5), um dos peptídeos dessa família, apresenta ação contra esse micro-organismo, mas sofre rápida degradação em saliva humana. Nesse trabalho foram propostas três novas sequências de peptídeos baseados na Hst5, denominados 8WH5, 7WH5 e 6WH5, e os peptídeos análogos 0WHst5, WP113. Além disso, foram desenvolvidos lipossomas produzidos pela técnica de hidratação do filme lipídico, com objetivo de proteger os peptídeos da degradação salivar. Os peptídeos 0WHst5 e WP113 apresentaram degradação após 1,5 horas em saliva humana. Já os peptídeos 8WH5, 7WH5 e 6WH5 foram encontrados na saliva após 8 horas de incubação. Todos os peptídeos apresentaram ação antifúngica, com destaque para o peptídeo 8WH5 que apresentou concentração inibitória mínima (CIM) de 20 µmol L-1 para C. albicans ATCC 90028. Os peptídeos foram eficazes em prevenir a formação de biofilme de C. albicans, mantendo seu crescimento abaixo de 20% em concentrações de 320 e 160 µmol L-1. Os lipossomas vazios apresentaram diâmetro hidrodinâmico médio de 80,0 nm e os lipossomas incorporados com os peptídeos apresentaram aumento nesse diâmetro com valores na faixa de 90,0 a 120,0 nm. O potencial zeta das formulações foi negativo, com valores de -11,6 mV para os lipossomas vazios e valores abaixo de -8,7 mV para os lipossomas incorporados com os peptídeos. O índice de polidispersão ficou entre 0,200 e 0,300 para todos os sistemas lipossomais. A eficiência de incorporação (IPD) foi maior de 90% para todos os peptídeos, indicando uma alta incorporação mesmo se tratando de moléculas hidrofílicas. Estudos de microscopia de força atômica (AFM) e de espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR) indicaram que os peptídeos podem interagir eletrostaticamente com bicamada externa dos lipossomas. Os lipossomas foram mais eficazes do que os peptídeos livres para inibição de biofilmes maduros inibindo seu crescimento com concentração oito vezes menor do que os peptídeos livres. Dessa forma, é possível concluir que os peptídeos 8WH5, 7WH5 e 6WH5 são mais resistentes a degradação por proteases salivares e foram eficazes em prevenir a formação de biofilme. Já os sistemas lipossomais, apesar de apresentaram proteção reduzida contra degradação proteolítica dos peptídeos, foram eficazes em inibir biofilmes maduros. Dessa forma, os peptídeos e sistemas lipossomais produzidos nesse trabalho surgem como uma nova estratégia para prevenção de infecções causadas por C. albicans na cavidade bucal. Candida albicans is the main microorganism that causes infections in the oral cavity and already shows resistance to most antifungals used for treatment. The peptides of the Histatin family are promising molecules for this treatment due to their strong action against C. albicans. Histatin-5 (Hst5), a peptide from the histatin family, has action against this microorganism, but it undergoes rapid degradation in human saliva. In this work, three new peptides based on Hst5 were proposed, called 8WH5, 7WH5 and 6WH5, and the analogous peptides 0WHst5, WP113. In addition, liposomes produced by the thin film hydration technique, were developed in order to protect the peptides from salivary degradation. The 0WHst5 and WP113 peptides showed degradation after 1.5 hours in human saliva. The peptides 8WH5, 7WH5 and 6WH5 were found in saliva after 8 hours of incubation. All peptides showed antifungal action, especially peptide 8WH5, which showed a minimum inhibitory concentration (MIC) of 20 μmol L-1 for C. albicans ATCC 90028. The peptides were effective in preventing C. albicans biofilm formation, maintaining its growth below 20% at concentrations of 320 and 160 μmol L-1. The empty liposomes showed a mean hydrodynamic diameter of 80.0 nm and the liposomes incorporated with the peptides showed an increase in this diameter with values in the range of 90.0 to 120.0 nm. The zeta potential of the formulations was negative, with values of -11.6 mV for empty liposomes and values below -8.7 mV for liposomes incorporated with peptides. The polydispersion index (PDI) was between 0.200 and 0.300 for all liposomal systems. The incorporation efficiency was greater than 90% for all peptides, indicating a high incorporation even in the case of hydrophilic molecules. Atomic force microscopy (AFM) and Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR) studies indicated that peptides can interact electrostatically with the outer bilayer of liposomes. Liposomes were more effective than free peptides for inhibiting mature biofilms, inhibiting their growth at eight times lower concentration than free peptides. Thus, it is possible to conclude that peptides 8WH5, 7WH5 and 6WH5 are more resistant to degradation by salivary proteases and were effective in preventing biofilm formation. Liposomal systems, despite showing reduced protection against proteolytic degradation of peptides, were effective in inhibiting mature biofilms. Thus, the peptides and liposomal systems produced in this work emerge as a new strategy to prevent infections caused by C. albicans in the oral cavity. CAPES:001

The Brazilian propolis market has expanded greatly, leading the processing sector to pursue the best way to produce extracts with biological activities. The purpose of this research was to optimize the green propolis extraction by the antifungal activity and perform incorporation into a chitosan biofilm. The extracts were prepared using ethanol, acetone, ethyl acetate and isopropanol according to the three designs. The minimum inhibitory concentration (MIC) and the minimum fungicidal concentration (MFC) were determined against Candida albicans, Candida tropicalis e Candida glabrata. From the MIC, the response surface analysis was carry out to find the optimal conditions for the extraction for each design. The optimized extracts were incorporate into chitosan biofilm that were subsequently evaluate for thickness, water vapor permeation, water solubility and anti-Candida activity. It was establish that all extracts tested showed antifungal activity against the three Candida species. The extract obtained with acetone/ethanol stood out because it presented the lowest values of MIC and MFC (0.76 – 2.50 mg/mL). It was observe that the optimal extraction points of each design were the blend of acetone/isopropanol, acetone/ethanol and ethyl acetate/isopropanol yet the biofilms incorporated with these extracts showed few differences in thickness, vapor permeability and water solubility in relation to the control design. The biofilm obtained by acetone/isopropanol displayed the higher activity anti-Candida. This results show the importance of optimizing propolis processes for the application and product development. O mercado de própolis brasileiro sofreu grande expansão, levando o setor de beneficiamento a buscar a melhor forma de produzir extratos com atividades biológicas. O objetivo deste trabalho foi otimizar a extração de própolis verde pela atividade antifúngica e realizar a incorporação em um biofilme de quitosana. Os extratos foram preparados utilizando etanol, acetona, acetato de etila e isopropanol, de acordo com três planejamentos, e a concentração inibitória mínima (CIM) e a concentração fungicida mínima (CFM) foram determinadas contra Candida albicans, Candida tropicalis e Candida glabrata. A partir da CIM, realizou-se a análise de superfície de resposta, para encontrar as condições ótimas de extração para cada planejamento. Os extratos otimizados foram incorporados em biofilmes de quitosana que, posteriormente, foram avaliados quanto a espessura, permeação de vapor de água, solubilidade em água e atividade anti-Candida. Verificou-se que todos os extratos testados apresentaram atividade antifúngica contra as três espécies de Candida. Destacou-se o extrato obtido com acetona/etanol que apresentou os menores valores de CIM e CFM (0,76 - 2,50 mg/mL). Observou-se que os pontos ótimos de extração de cada planejamento foram as misturas de: acetona/isopropanol, acetona/etanol e acetato de etila/isopropanol e os biofilmes incorporados com estes extratos mostraram poucas diferenças de espessura, permeabilidade de vapor e solubilidade em água em relação ao controle. O biofilme contendo extrato obtido por acetona/isopropanol foi o que demonstrou maior atividade anti-Candida. Estes resultados mostram a importância da otimização dos processos de extração de própolis para aplicação e desenvolvimento de produtos.

As lagoas salino-alcalinas presentes na sub-regi?o Nhecol?ndia, Mato Grosso do Sul (Brasil), abrigam esp?cies microbianas conhecidas como haloalcal?filas, pois estas possuem capacidade de viver em condi??es de alta salinidade e alcalinidade. Para tal, estas esp?cies apresentam genes espec?ficos e utilizam estrat?gias metab?licas diversas, podendo tamb?m produzir subst?ncias polim?ricas extracelulares (do ingl?s, Extracellular Polymeric Substances ou EPS) que auxiliam em seu estabelecimento e prote??o nestes ambientes. Al?m disso, de forma indireta, as esp?cies haloalcal?filas podem estar envolvidas em processos biogeoqu?micos, sendo capazes de atuar na dissolu??o e precipita??o de carbonatos nestes locais. Neste sentido, este trabalho buscou investigar a influ?ncia de diferentes par?metros f?sicos e qu?micos na precipita??o de carbonato de c?lcio desempenhada por 24 bact?rias haloalcal?filas isoladas a partir de tr?s lagoas salino-alcalinas do Pantanal brasileiro. Os precipitados minerais formados pelos microrganismos em meio de cultivo para precipita??o de carbonatos (MPC), sob diferentes condi??es, foram avaliados morfologicamente e selecionados para an?lises de Microscopia Eletr?nica de Varredura (MEV) e Difra??o de Raios-X (DRX). Dentre os isolados selecionados de acordo com a morfologia dos precipitados formados, seis foram identificados taxonomicamente como pertencendo ao g?nero bacteriano Halomonas. Destes, tr?s isolados distintos foram selecionados e novamente cultivados para avalia??o de UFC/mL, presen?a e quantifica??o de EPS eventualmente formado, al?m de peso ?mido e seco. Um co-cultivo com estes tr?s isolados tamb?m foi realizado e seus precipitados avaliados. Al?m disso, os precipitados minerais formados em in?culos individuais em MPC contendo estes isolados previamente autoclavados tamb?m foram avaliados. Com intuito de avaliar o papel dos EPS no processo de precipita??o, estes foram caracterizados quimicamente, isolados dos microrganismos e inoculados em MPC. Al?m disso, l?minas petrogr?ficas de precipitados minerais selecionados ap?s an?lises de MEV e DRX foram comparados com forma??es de carbonatos de diferentes estratos do Pr?-sal descritos na literatura. Por fim, um manuscrito de revis?o abrangendo o tema biofilmes em ambientes naturais foi desenvolvido com intuito de promover uma melhor compreens?o do tema em diferentes ?reas do conhecimento. The saline-alkaline lakes present in the sub-region Nhecol?ndia, Mato Grosso do Sul (Brazil), harbor microbial species known as haloalkalophiles, as they have the ability to live in conditions of high salinity and alkalinity. For such, adaptability, these species have specific genes and use different metabolic strategies. They may also produce Extracellular Polymeric Substances or EPS that help in their establishment and protection in these environments. Moreover, indirectly, haloalkalophilic species may be involved in biogeochemical processes, being able to act in the dissolution and precipitation of carbonates in these sites. In this context, this work sought to investigate the influence of different physical and chemical on calcium carbonate precipitation performed by 24 haloalkalophilic bacteria isolated from three saline-alkaline lakes of Brazilian Pantanal. Mineral precipitates formed by microorganisms in medium for carbonate precipitation (MPC) under different conditions were morphologically evaluated and selected for Scanning Electron Microscopy (SEM) and X-Ray Diffraction (XRD) analysis. Among the isolates selected according to the morphology of the formed precipitates, six were taxonomically identified as belonging to the bacterial genus Halomonas. Of these, three distinct isolates were selected and cultured again for evaluation of CFU/mL, presence and quantification of eventually formed EPS and wet and dry weight. A co-culture with these three isolates was also carried out and their precipitates evaluated. In addition, mineral precipitates formed in individual inocula in MPC containing the isolates previously autoclaved were also evaluated. In order to evaluate the role of EPS in the precipitation process, they were chemically characterized, isolated from microorganisms and inoculated into MPC. Also, petrographic slides of mineral precipitates selected after SEM and XRD analyzes were compared to carbonate formations of different Pre-salt strata described in the literature. Finally, a review manuscript covering the topic biofilms in nature was developed in order to promote a better understanding of the topic in different areas of knowledge. Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior - CAPES