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O uso de bactérias promotoras de crescimento vegetal ou agentes de biocontrole como inoculantes agrícolas é uma alternativa importante e ecologicamente correta, com grandes benefícios na agricultura para substituir, ou ao menos suplementar, a excessiva utilização de fertilizantes e pesticidas. Neste trabalho avaliamos a capacidade de biocontrole e de competência rizosférica de três bactérias com características de promoção de crescimento vegetal (Plant growth promoting - PGP): Bacillus mycoides B38V, Paenibacillus riograndensis SBR5 e Burkholderia sp. 89. As três bactérias avaliadas apresentaram grande versatilidade na utilização de substratos, o que poderia lhes garantir uma vantagem competitiva no ambiente rizosférico. Porém, inconsistências foram observadas nos ensaios em câmara de crescimento, ou seja, as características de PGP e de biocontrole observadas in vitro não se refletiram em benefícios para a planta. A linhagem 89 destacou-se pela produção de um metabólito estável com ampla atividade contra fungos fitopatogênicos. Através de abordagens genômicas e de análises multilocus, descrevemos Burkholderia sp. 89 como uma nova espécie membro do complexo Burkholderia cepacia, denominada de B. catarinensis 89T. O sequenciamento de seu genoma, seguido de uma análise pela ferramenta AntiSMASH, revelou a presença de um agrupamento gênico de peptídeo sintetases não ribossomais (NRPS) relacionadas com a biossíntese do sideróforo ornibactina e um agrupamento híbrido NRPS-policetídeo sintetase responsável pela biossíntese do glicolipopeptideo cíclico com atividade antifúngica burkholdina. Como estratégia de purificação de metabólitos secundários foi utilizada a metodologia da mineração de genoma combinada com fracionamento guiado por bioensaios seguida de análises em espectrômetro de massas. Desta forma, purificamos com sucesso duas variantes de ornibactina, D e F (761 e 789 Da, respectivamente), e detectamos a variante ornibactina B (m/z= 733) e as moléculas sinalizadoras homoserina lactonas C6-HSL, 3OH-C8-HSL e C8-HSL. Análises de espectrometria de massas demonstraram a presença de um grupo de metabólitos com massas de 1240, 1254, 1268, 1216, 1244 e 1272 Da, que, provavelmente, são novas variantes do antifúngico burkoldina. Sendo assim, B. catarinensis 89T possui potencial biotecnológico com possíveis aplicações farmacêuticas e agronômicas para o biocontrole de fungos fitopatogênicos. The use of plant growth promotion bacteria or biocontrol agents as agricultural inoculants is an important eco-friendly alternative to substitute, or at least supplement, the excessive use of fertilizers and pesticides. In this work, we evaluated the biocontrol potential and rhizosphere competence of three bacteria that had shown plant growth promotion (PGP) abilities: Bacillus mycoides B38V, Paenibacillus riograndensis SBR5 and Burkholderia sp. 89. All three bacteria presented great versatility in their substrate utilization, which could enable them to survive in a competitive rhizosphere environment. However, inconsistencies were observed in the greenhouse experiments, whereas their interesting abilities observed in vitro did not result in benefits to the plants. Strain 89 produces a stable metabolite with a wide range of antifungal activity. Genomic comparisons and multilocus sequence analysis revealed Burkholderia sp. 89 as a new species of the Burkholderia cepacia complex and we described it as B. catarinensis 89T. We sequenced its genome and analyzed it with the AntiSMASH tool. This in silico prediction revealed the presence of a nonribosomal peptide synthetase (NRPS) cluster, which is related to the production of the siderophore ornibactin. Moreover, a hybrid NRPS- polyketide synthetase cluster for the production of the antifungal cyclic glicolipopeptide burkholdin was also found. A genome mining combined with a bioassay-guided fractionation with further mass spectrometry analysis was applied for the purification of these compounds. This approach enabled us to purify and characterize two variants of the siderophore ornibactin, D and F (761 and 789 Da, respectively). Also, we could detect the variant ornibactin B (m/z= 733) and the quorum sensing molecules homoserine lactones C6-HSL, 3OH-C8-HSL and C8-HSL in the supernatant of B. catarinensis 89T. Mass spectrometry analysis showed the presence of a group of metabolites with the masses 1240, 1254, 1268, 1216, 1244 and 1272 Da, which are probably new variants of the antifungal metabolite burkoldin. Therefore, B. catarinensis 89T has a great biotechnological potential for the production of metabolites with pharmaceutical and agricultural applications for the biocontrol of phytopathogenic fungi.

Resíduos ricos em queratina são amplamente disponíveis como subprodutos de agroindústrias, e por sua recalcitrância tornam-se um problema ambiental e econômico por seu acúmulo e difícil manejo. Bactérias que hidrolisam a queratina, através da produção de queratinases, têm mostrado grande potencial biotecnológico. Este trabalho tem como objetivo selecionar, identificar e caracterizar um novo isolado bacteriano, proveniente de solos brasileiros, que seja produtor de queratinases úteis como biodegradadoras de penas, bem como caracterizar sua ação enzimática. Bactérias com atividade proteolítica e produtoras de proteína solúvel a partir de substratos queratinosos foram selecionadas e identificadas através do sequenciamento do 16S do DNAr. O extrato bruto de três linhagens Gram negativas foi caracterizado ao longo de 120 horas de cultivo. Dos 32 isolados, os maiores degradadores de penas foram as bactérias do gênero Bacillus, porém as características do extrato bruto das Gram negativas Aeromonas hydrophila K12, Chryseobacterium indologenes A22 e Serratia marcescens P3 também apresentam promissoras utilizações industriais. Ensaios enzimáticos e zimograma revelaram a produção de uma única protease queratinolítica por isolado, com características de metaloprotease. Utilizando técnicas de planejamento fatorial foi possível gerar um modelo validado estatisticamente para a otimização da produção enzimática. A utilização de sistema aquoso bifásico foi eficiente para a purificação da enzima produzida pela linhagem P3, gerando banda única em SDS-PAGE com massa molecular de aproximadamente 53 kDa. O sequenciamento da protease queratinolítica da linhagem P3, através de espectrômetro de massas, revelou homologia com metaloproteases dependentes de zinco semelhantes às serralisinas. Apesar das serralisinas serem comumente associadas a fatores de virulência, a importância das patogenias causadas por Serratia parece ser menor do que a causada por outras bactérias. Portanto, a enzima de P3, que é facilmente desnaturada por tratamento térmico, pode também ser utilizada biotecnologicamente em processos controlados. Keratin-rich wastes are widely available as an agroindustrial byproduct. Since these residues are difficult to degrade, they cause economical and environmental problems due to its accumulation and difficult management. Bacteria with keratin-degrading abilities, through keratinase production, have shown several biotechnological applications. This work aimed to select, identify and characterize a novel bacterial isolate from Brazilian soils, which is keratinase producer, useful for feather degradation and characterize its enzymatic activity. Bacteria with proteolytic activity and soluble protein production when cultivated with keratinous wastes were selected and identified based on 16S rDNA gene sequencing. Crude supernatant of three Gram negative strains were characterized over 120 hours of cultivation. Among 32 isolates, the bacteria from Bacillus genus showed higher feather hydrolyses. Although, the characterization of the crude extract produced by the Gram negative Aeromonas hydrophila K12, Chryseobacterium indologenes A22 and Serratia marcescens P3 also revealed their promising use in industrial processes. Enzymatic assays and zimogram analyses indicated the production of a unique proteolytic enzyme by each strain, which have presented metalloprotease characteristics. By using factorial design, a statistically validated model was generated for the optimization of enzymatic production. An aqueous two-phase system was effective for the purification of P3 enzyme, resulting in a single band of approximately 53 kDa on SDS-PAGE. The sequencing of strain P3 keratinolytic protease through mass spectrometry revealed homology with zinc-dependent metaloproteases of the serralysin family. In spite of serralysins being commonly related to virulence factors, the pathogenies caused by Serratia seems to be less concerning than the ones caused by other bacteria. Thus, the enzyme of P3, which is easily denatured by heat treatment, may also be biotechnologically useful in controlled processes.

O sistema radicular abriga uma ampla diversidade de bactérias que vivem no solo rizosférico ou colonizando endofiticamente o interior dos tecidos vegetais. Estes micro-organismos podem promover o crescimento das plantas, principalmente pela modulação dos níveis de fitohormônios e por favorecerem a aquisição de nutrientes, especialmente nitrogênio e fósforo (P). Também, como mecanismo indireto, inibem o crescimento de fitopatógenos. Por essas características, as PGPB (plant growth promoting bacteria) são agronomicamente empregadas como biofertilizantes ou agentes de biocontrole. A aplicação destes produtos biológicos tem um potencial elevado para aumentar a produção agrícola e reduzir o uso de fertilizantes químicos ambientalmente prejudiciais. O objetivo deste trabalho foi caracterizar as habilidades de promoção do crescimento vegetal e de biocontrole de bactérias provenientes de raízes de canola. Foram avaliadas trinta bactérias gram-positivas formadoras de esporos, pertencentes a quatro gêneros: Bacillus (24), Paenibacillus (4), Lysinibacillus (1) e Microbacterium (1). Esses micro-organismos foram capazes de fixar nitrogênio, sintetizar auxinas, solubilizar fosfato, produzir enzimas hidrolíticas e sideróforos. Cinco isolados apresentaram atividade antifúngica in vitro contra o patógeno de canola Sclerotinia sclerotiorum, e quatro desses isolados suprimiram o crescimento do fungo pela produção de compostos orgânicos voláteis (VOC). Os genomas das bactérias antagonistas foram sequenciados e três isolados (01TAZ, 08TAZ, 32PB) foram identificados como Bacillus safensis, um (7PB) como Bacillus pumilus e um (16PB) como Bacillus megaterium, usando métricas genômicas. Vários clusters gênicos de antimicrobianos e metabólitos secundários foram encontrados em comum no genoma dos isolados, usando a ferramenta de mineração de genoma antiSMASH. Esses grupos gênicos incluíram agrupamentos biossintéticos de lipopeptídeos, bacteriocinas e sideróforos. No entanto, nenhum tipo de lipopeptídeo antimicrobiano foi identificado por espectrometria de massas nos extratos das culturas bacterianas. Apesar dos resultados obtidos in vitro e do potencial genômico para o biocontrole, estes isolados foram incapazes de proteger a canola contra a infecção por S. sclerotiorum em condições de câmara de crescimento. A solubilização de P foi uma das características de promoção de crescimento vegetal mais comum entre os isolados. Essas bactérias foram triadas quanto à solubilização de diferentes fosfatos insolúveis: hidroxiapatita (Ca5(PO4)3(OH)), FePO4, AlPO4, e fosfato de rocha (RP). Seis isolados foram capazes de solubilizar hidroxiapatita e RP. Os três melhores (6PB, 20PB, 27PB) foram selecionados e melhor caracterizados. Essas bactérias foram identificadas como Paenibacillus graminis pelo sequenciamento do gene 16S rRNA e uso de métricas genômicas. Foi verificada a influência de fatores nutricionais, tais como a fonte de carbono, nitrogênio e P solúvel, sobre a eficiência de solubilização. As bactérias produziram exopolissacarídeos utilizando P insolúvel e também formaram biofilme sob condições de deficiência de P. Todos os isolados selecionados reduziram o pH do meio de cultura e produziram vários ácidos orgânicos, detectados por espectrometria de massas. Essas características constituem um possível mecanismo de solubilização de P. A análise do genoma dos isolados 6PB e 20PB revelou a presença de diferentes genes relacionados ao metabolismo e homeostase do P. Todas estas características destacam as bactérias avaliadas como potenciais candidatos a agentes de promoção do crescimento de plantas. Plant root systems harbor a wide diversity of bacteria living in the rhizospheric soil or colonizing endophytically the inner tissues of plants. These microorganisms can promote plant growth, mainly by modulating phytohormone levels, and by favoring the acquisition of nutrients, especially nitrogen and phosphorus (P). They can also inhibit the growth of phytopathogens as an indirect mechanism of plant growth promotion. Due to these features, PGPB (plant growth promoting bacteria) are agronomically used as biofertilizers or biocontrol agents. The application of these biological products has an elevated potential to increase crop yields and reduce the use of environmentally harmful chemical fertilizers. The aim of this work was to characterize the plant growth promotion and biocontrol abilities of bacterial isolates from canola roots. The thirty evaluated gram-positive spore-forming bacteria belong to four genera: Bacillus (24), Paenibacillus (4), Lysinibacillus (1) and Microbacterium (1). These microorganisms were able to fix nitrogen, synthesize auxins, solubilize phosphate, produce hydrolytic enzymes and siderophores. Five isolates displayed antifungal activity in vitro against the canola pathogen Sclerotinia sclerotiorum, and four of these isolates were able to suppress fungal growth by volatile organic compounds (VOCs) production. The genomes of these bacteria were sequenced and three isolates (01TAZ, 08TAZ and 32PB) were identified by genomic metrics as Bacillus safensis, one isolate (7PB) as Bacillus pumilus and one (16PB) as Bacillus megaterium. Several antimicrobial gene clusters were found in common among the genome of the isolates using the genome mining tool antiSMASH. These gene clusters included lipopeptides, bacteriocins and siderophores biosynthetic clusters. However, no antimicrobial lipopeptide compound was identified by mass spectrometry in bacterial culture extracts. In spite of the in vitro results and the genomic potential for biocontrol, these isolates were unable to protect canola plants against S. sclerotiorum in growth chamber conditions. One of the most spread plant growth promotion traits among the isolates was phosphate solubilization. The microorganisms were screened for solubilization of different insoluble P sources: Hydroxyapatite (Ca5(PO4)3(OH)), FePO4, AlPO4 and Rock phosphate (RP). Five isolates were able to solubilize Hydroxyapatite and RP. The three best isolates (6PB, 20PB, and 27PB) were selected and better characterized. These bacteria were identified as Paenibacillus graminis by 16S rRNA gene sequencing and genomic metrics. The influence of nutritional factors such as carbon and nitrogen sources or soluble P on their solubilization efficiency was evaluated. The isolates produced exopolysaccharide using P insoluble source and formed biofilm under P deficiency. All selected isolates reduced the pH of the culture medium and produced several organic acids, detected by mass spectrometry. These characteristics constitute a possible mechanism of phosphate solubilization. The genomic analyses of 6PB and 20PB isolates revealed the presence of different genes related to phosphate metabolism and homeostasis. All these features highlight the characterized bacteria as potential candidates for plant growth promotion agents.