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Orientadores: Helena Teixeira Godoy, Roy Edward Bruns Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos Resumo: Nos últimos anos, o interesse em relação ao consumo do azeite de oliva aumentou significativamente, em função da divulgação dos benefícios à saúde provenientes da sua ingestão. O azeite de oliva extravirgem é obtido das azeitonas somente por meios mecânicos, e a ausência de etapas posteriores de refino permite a retenção de diversos compostos minoritários, entre eles os compostos fenólicos. Além disso, possui elevado teor de ácidos graxos monoinsaturados. Este trabalho teve como objetivos empregar a técnica de Análise de Componentes Principais (PCA) para classificar as amostras de azeite de oliva extravirgem provenientes de diferentes países por meio da análise da composição em ácidos graxos por cromatografia em fase gasosa, bem como otimizar métodos para separação de 13 compostos fenólicos por eletroforese capilar (CE). Sete ácidos graxos foram determinados por cromatografia em fase gasosa com detector por ionização em chama (GC-FID), e os compostos foram positivamente identificados utilizando-se espectrometria de massas. Dentre as amostras analisadas, nenhuma apresentou indícios de adulteração, considerando-se apenas a composição em ácidos graxos. Com o emprego da PCA, foi possível agrupar separadamente uma amostra de azeite proveniente da Argentina em relação às demais, além da verificação de correlações entre grupos de ácidos graxos. A mistura de 13 compostos fenólicos consistiu em tirosol, hidroxitirosol, oleuropeína glicosídeo, ácido ferrúlico, ácido p-cumárico, ácido cinâmico, ácido p-hidroxibenzoico, ácido gálico, ácido cafeico, luteolina, apigenina, ácido vanílico e ácido 3,4- dihidroxibenzoico. Técnicas estatísticas multivariadas foram empregadas para otimizar a separação, como o planejamento composto central, análise de superfície de resposta e o método de otimização simultânea de Derringer e Suich. Dois tipos de eletrólito para CE foram avaliados: tetraborato de sódio e ácido bórico. Também foram estudadas técnicas de pré-concentração on-line para aumentar a sensibilidade. Os procedimentos multivariados foram eficientes na determinação da condição ótima de separação, usando como respostas a resolução entre pares de compostos e o tempo de corrida. Com o uso da pré-concentração on-line, foi possível reduzir em 7,5 vezes o consumo de amostra e de solventes orgânicos como hexano e metanol. O método com melhor eficiência e menor tempo de corrida utilizou capilar de 50 µm d. i. x 60 cm comprimento efetivo com bulbo estendido, eletrólito ácido bórico 50 mmol L¿1, pH 10,2, 25ºC, injeção de 50 mbar por 25 s com aplicação de voltagem inversa (¿30 kV por 5 s) antes da aplicação da voltagem de corrida (+30 kV) e detecção em 210 nm, promovendo a separação em 12 min Abstract: In recent years, interest concerning olive oil consumption has increased significantly, owing to the divulgation of health benefits that come from its ingestion. Extra-virgin olive oil is obtained from olives only by mechanical means, and the absence of subsequent refinement stages allows the retention of several minor compounds, phenolic compounds being among them. Moreover, it has a high level of monounsaturated fatty acids. The aims of this work were to employ Principal Component Analysis (PCA) for classifying extravirgin olive oil samples obtained from different countries by means of fatty acids composition analysis by gas chromatography, as well as to optimize methods for the separation of 13 phenolic compounds by capillary electrophoresis (CE). Seven fatty acids were determined by gas chromatography with a flame ionization detector (GC-FID), and the compounds were positively identified using mass spectrometry. Considering just the fatty acid profiles, none of the analyzed samples showed adulteration evidences. Employing PCA, it was possible to group an Argentinian sample separately from the others, as well as to verify certain correlations among fatty acids groups. The 13 phenolic compound mixture consisted of tyrosol, hydroxytyrosol, oleuropein glycoside, ferulic acid, p-coumaric acid, cinnamic acid, p-hydroxybenzoic acid, gallic acid, caffeic acid, luteolin, apigenin, vanillic acid and 3,4-dyhydroxybenzoic acid. Multivariate statistical techniques were employed to optimize the separation, central composite central design, response surface analysis and Derringer and Suich¿s simultaneous optimization method. Two CE electrolytes were assessed: sodium tetraborate and boric acid. Preconcentration techniques were also studied to improve CE sensitivity. Multivariate procedures were efficient to determine the optimal separation condition, using peak-pair resolution and running time as the responses. Using on-line preconcentration it was possible to reduce sample and toxic organic solvents, such as methanol and hexane, by a factor of 7,5. The method with the best efficiency and lowest running time employs a capillary column with 50 µm i. d. x 60 cm effective length with extended light path, 50 mmol L¿1 of boric acid electrolyte, pH 10,2, 25ºC, injection of 50 mbar for 25 s with application of reversed voltage (¿30 kV for 5 s) before setting running voltage (+30 kV), and detection at 210 nm, performing the separation at 12 min Mestrado Mestre em Ciência de Alimentos

Orientador: Helena Teixeira Godoy Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos Resumo: O consumo de azeite de oliva extravirgem (EVOO) é altamente recomendado por seus benefícios à saúde humana. No Brasil, a ingestão de EVOO, o qual é importado de outros países, vem aumentando anualmente. Nos últimos anos, o Brasil começou a produzir EVOO, porém de maneira experimental. No capítulo 1 foi apresentada uma revisão bibliográfica destacando os estudos mais relevantes acerca do composição química e dos benefícios à saúde do azeite de oliva extravirgem. No capítulo 2, o objetivo foi determinar o teor de fenólicos totais (TFT) e a capacidade antioxidante (CA), bem como a correlação entre o TFT e cada um dos quatro métodos de CA, de 15 marcas de EVOO, cada qual em três lotes, resultando em 45 amostras. O TFT foi avaliado pelo método do reagente de Folin-Ciocalteu, enquanto a CA foi determinada pelos ensaios de FRAP, ABTS, DPPH¿ e ORAC. O TFT variou de 70 a 297 mg EAG kg-1, FRAP de 114 a 1557 µmol ET kg-1, ABTS de 0,5 a 1,9 mmol ET kg-1, DPPH¿ de 72 a 1129 µmol ET kg-1, e ORAC de 1,1 a 12,9 µmol ET g-1. Houve elevada e significativa correlação entre o TFT e cada um dos métodos de CA (FRAP, r2 = 0,8904; p < 0,001; ABTS, r2 = 0,7837; p < 0,001; DPPH¿, r2 = 0,7908; p < 0,001; ORAC, r2 = 0,7431; p < 0,001). Portanto, a maioria das marcas de EVOO apresentaram considerável TFT e elevados valores de CA. No capítulo 3, o objetivo foi otimizar a separação de 17 compostos fenólicos previamente detectados em EVOO. Foi utilizado um planejamento experimental Doehlert, avaliando-se o pH e a concentração do eletrólito. Resolução, tempo de corrida e coeficientes de variação dos tempos de migração foram as respostas. A função de desejabilidade de Derringer foi utilizada para otimizar simultaneamente as 37 respostas. Os 17 picos dos compostos foram separados em 19 minutos em capilar de sílica fundida (50 µm diâmetro interno, 72 cm comprimento efetivo) com bulbo estendido e eletrólito ácido bórico 101,3 mmol L-1 (pH 9,15, 30 kV). O método foi validado e aplicado em 15 amostras comerciais de EVOO. No capítulo 4, o objetivo foi determinar o teor de compostos fenólicos, tocoferóis e ácidos graxos de 17 EVOO monovarietais produzidos em Minas Gerais, durante duas colheitas. Foram quantificados os ácidos palmítico (6-12,6%), palmitoleico (0,2-2,5%), esteárico (1,6-2,2%), oleico (70,8-84,3%), linoleico (3,2-11,7%), a-linolênico (0,6-1,4), araquídico (0,4-0,8%), 9-eicosenoico (0,4-0,9%) e os compostos tirosol (NQ-155,21 mg kg-1), (+)-pinoresinol (2,89-22,64 mg kg-1), hidroxitirosol (ND-37,74 mg kg-1), luteolina (ND-2,23 mg kg-1), a-tocoferol (28,92-232,93 mg kg-1), ß-tocoferol (ND-9,56 mg kg-1) e ?-tocoferol (ND-18,75 mg kg-1). Em geral, os resultados foram similares aos descritos na literatura. O objetivo do capítulo 5 foi determinar o teor de compostos fenólicos em EVOO brasileiros por cromatografia líquida de rápida resolução acoplada à espectrometria de massas por tempo de voo com ionização por electrospray (RRLC-ESI-TOF-MS). Foram analisadas 25 amostras de EVOO do Rio Grande do Sul, Santa Catarina e Minas Gerais e duas colheitas. Foram identificados e quantificados 20 compostos fenólicos das classes dos alcoóis fenólicos, secoiridoides, lignanas e flavonoides. Os teores de compostos fenólicos totais nos EVOOs destacaram-se nas variedades Coratina (364 mg kg-1), Arbosana (255 mg kg-1) e Grappolo (228 mg kg-1). Desta forma, os EVOOs brasileiros são promissores no que se refere ao teor de compostos fenólicos totais, visto que os valores são comparáveis àqueles dos EVOOs de elevada qualidade produzidos em outros países Abstract: Consumption of extra-virgin olive oil (EVOO) is highly recommended for its benefits to human health. In Brazil, consumption of EVOO, which is imported from other countries, is increasing annually. In the last years, Brazil started to produce EVOO,although in an experimental way. In chapter 1, a literature review highlighting the most relevant studies on the chemical composition and the health benefits of the extra-virgin olive oil is presented. In chapter 2, the aim was to determine the total phenolic content (TPC) and the antioxidant capacity (AC), as well as the correlation between TPC and each one of the four AC methods, of 15 EVOO brands, each one in three batches, resulting in 45 samples. TPC was evaluated by Folin-Ciocalteu reagent method, while the AC was assessed using FRAP, ABTS, DPPH¿ and ORAC assays. The TPC varied from 70 to 297 mg GAE kg-1, FRAP from 114 to 1557 µmol TE kg-1, ABTS from 0.5 to 1.9 mmol TE kg-1, DPPH¿ from 72 to 1129 µmol TE kg-1, and ORAC from 1.1 to 12.9 µmol TE g-1. High and significant correlation was found between the TPC and each one of the AC methods evaluated in this study (FRAP, r2 = 0.8904; p < 0.001; ABTS, r2 = 0.7837; p < 0.001; DPPH¿, r2 = 0.7908; p < 0.001; ORAC, r2 = 0.7431; p < 0.001). Therefore, most of the EVOO brands presented a considerable TPC and high AC values. In chapter 3, the aim was to optimize the separation of 17 phenolic compounds already detected in EVOO. A Doehlert matrix experimental design was used, evaluating the effects of pH and electrolyte concentration. Resolution, runtime and migration time relative standard deviation values were used as responses. Derringer¿s desirability function was used to simultaneously optimize all 37 responses. The 17 peaks were separated in 19 minutes using a fused-silica capillary (50 mm internal diameter, 72 cm of effective length) with an extended light path and 101.3 mmol.L-1 of boric acid electrolyte (pH 9.15, 30 kV). The method was validated and applied to 15 EVOO samples found in Brazilian supermarkets. In chapter 4, the aim was to determine the phenolic compounds, tocopherols and fatty acids contents of 17 monovarietal EVOOs produced in Minas Gerais state, during two crop years. Compounds identified comprised palmitic acid (6-12.6%), palmitoleic acid (0.2-2.5%), stearic acid (1.6-2.2%), oleic acid (70.8-84.3%), linoleic acid (3.2-11.7%), a-linolenic acid (0.6-1.4), arachidic acid (0.4-0.8%), 9-eicosenoic acid (0.4-0.9%), tyrosol (NQ-155.21 mg kg-1), (+)-pinoresinol (2.89-22.64 mg kg-1), hydroxytyrosol (ND-37.74 mg kg-1), luteolin (ND-2.23 mg kg-1), a-tocopherol (28.92-232.93 mg kg-1), ß-tocopherol (ND-9.56 mg kg-1), ?-tocopherol (ND-18.75 mg kg-1). Some of these monovarietal EVOOs presented results similar to those described in the literature. The aim of chapter 5 was to determine the phenolic compound contents of Brazilian EVOO, using rapid-resolution liquid chromatography coupled to electrospray ionization time-of-flight mass spectrometry (RRLC-ESI-TOF-MS). A total of 25 EVOO samples from Rio Grande do Sul, Santa Catarina and Minas Gerais states and two crops, were analyzed. It was possible to identify and quantify 20 phenolic compounds, belonging to the phenolic alcohol, secoiridoid, lignan and flavonoid classes. EVOOs from Coratina (364 mg kg-1), Arbosana (255 mg kg-1) and Grappolo (228 mg kg-1) varieties presented the highest total phenolic contents. The results showed that Brazilian EVOOs are promising concerning the total phenolic contents, since the values were comparable to those from high-quality EVOOs produced in other countries Doutorado Ciência de Alimentos Doutor em Ciência de Alimentos

Agradecimentos: We are grateful to the Spanish Ministry of Science and Innovation for Projects AGL2011-29857-C03-02, to the Andalusian Regional Government Council of Innovation and Science for Projects P09-CTS-4564, P10-FQM-6563 and P11-CTS-7625, to the University of Granada, Functional Food Research and Development Center, the University of Bologna, Aceites Maeva Company and to the International Olive Council (IOC). The author C.A. Ballus also would like to thank CAPES Foundation, Brazil (process no. 1580-12-4) for granting him with a PSDE scholarship Abstract: In the current study, a new approach has been developed for correcting the effect that moisture reduction after virgin olive oil (VOO) filtration exerts on the apparent increase of the secoiridoid content by using an internal standard during extraction. Firstly, two main Spanish varieties (Picual and Hojiblanca) were submitted to industrial filtration of VOOs. Afterwards, the moisture content was determined in unfiltered and filtered VOOs, and liquid–liquid extraction of phenolic compounds was performed using different internal standards. The resulting extracts were analyzed by HPLC-ESI-TOF/MS, in order to gain maximum information concerning the phenolic profiles of the samples under study. The reduction effect of filtration on the moisture content, phenolic alcohols, and flavones was confirmed at the industrial scale. Oleuropein was chosen as internal standard and, for the first time, the apparent increase of secoiridoids in filtered VOO was corrected, using a correction coefficient (Cc) calculated from the variation of internal standard area in filtered and unfiltered VOO during extraction. This approach gave the real concentration of secoiridoids in filtered VOO, and clarified the effect of the filtration step on the phenolic fraction. This finding is of great importance for future studies that seek to quantify phenolic compounds in VOOs COORDENAÇÃO DE APERFEIÇOAMENTO DE PESSOAL DE NÍVEL SUPERIOR - CAPES Fechado

Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis is known as the etiologic agent of Johne's disease, or paratuberculosis, which affects mostly ruminants. M. paratuberculosis belongs to Mycobacteriaceae family, which also includes M. tuberculosis and M. bovis, human and cattle tuberculosis-causing species, respectively. It has been suggested that M. paratuberculosis could be involved at Crohn's disease pathogenesis, which has symptoms similar to paratuberculosis, but affects humans. As the microrganism may be excreted in the milk of infected animals, the first step was to assess its thermal resistance. Some studies showed that the bacterium could survive to heat treatment of HTST pasteurization (72ºC/15 s). However, until this moment, studies from scientific literature don't allow to state that M. paratuberculosis is responsible by Crohn's disease, as well as they show some doubts about its thermal resistance. More research about this microorganism is of great importance, with the goal of producing dairy products with absence of M. paratuberculosis contamination. Mycobacterium avium subesp. paratuberculosis é conhecida como o agente etiológico da doença de Johne, ou paratuberculose, que afeta principalmente animais ruminantes. É integrante da família Mycobacteriaceae, da qual também fazem parte a M. tuberculosis e a M. bovis, responsáveis pela tuberculose humana e bovina, respectivamente. Foi sugerido que a M. paratuberculosis poderia estar envolvida na patogênese da doença de Crohn, a qual possui sintomas similares à paratuberculose, mas afeta seres humanos. Como o microrganismo pode ser excretado no leite de animais infectados, o primeiro passo foi avaliar a sua termoresistência. Alguns estudos indicaram que a bactéria sobrevive ao tratamento térmico da pasteurização HTST (72ºC/15 s). Entretanto, os estudos existentes na literatura científica até o momento não permitem afirmar que M. paratuberculosis seja responsável pela doença de Crohn, bem como apresentam dúvidas sobre a termoresistência dessa bactéria. A realização de mais pesquisas sobre este microrganismo é de fundamental importância, com o objetivo de orientar a produção de produtos lácteos isentos de contaminação por M. paratuberculosis.