Search

Orientador: Wirla Maria da Silva Cunha Tamashiro Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Trabalhos anteriores de nosso laboratório mostraram que camundongos transgênicos DO11.10, cuja maioria dos linfócitos T expressam TCR específico para ovalbumina (OVA) no contexto de...Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital Abstract: Previous work from our laboratory showed that DO11.10 transgenic mice, in which the most of T lymphocytes express TCR specific for ovalbumin (OVA) in the context of...Note: The complete abstract is available with the full electronic document Doutorado Imunologia Doutor em Genética e Biologia Molecular

Orientador: Sara Teresinha Olalla Saad Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: Exossomos são nanopartículas importantes na comunicação intercelular, carregando conteúdos de proteínas, RNAs e microRNAs que recapitulam as células de origem. Assim, poderiam ser úteis como pulso antigênico no desenvolvimento de novas formas de imunoterapia, e análise de seu conteúdo interno poderia representar uma interessante ferramenta prognóstica. O objetivo deste estudo foi avaliar o uso de exossomos extraídos do soro de pacientes com leucemia mieloide aguda (LMA) e síndromes mielodisplásicas (SMD) como fonte antigênica para células dendríticas (DC) e os efeitos sobre a citotoxicidade antitumoral. Além disso, os níveis de expressão de mir-223, importante microRNA no sistema hematopoiético, foram avaliados nos exossomos e correlacionados com dados clínicos e laboratoriais, com o intuito de explorar seu potencial uso prognóstico nessas doenças. Sangue venoso foi obtido de 14 pacientes com LMA, 28 pacientes com SMD e 19 controles saudáveis. Exossomos foram isolados usando método ExoQuick®; sua concentração e distribuição de tamanho foram caracterizadas por Nanoparticle Tracking Analysis (NanoSight, UK). Os níveis de expressão de mir-223 e mir-192 (controle endógeno) foram avaliados por RT-PCR. Para os estudos de citotoxicidade, 100µL da suspensão de exossomos (aproximadamente 1015 nanopartículas) foram incubados com DCs maduras ou imaturas e a citotoxicidade direta ou dependente de linfócitos foi avaliada pela porcentagem de lise específica de células leucêmicas K562 nas coculturas, comparado a situações de DCs não pulsadas. A concentração de exossomos nas amostras de soro variou de 5,6 x 1011 a 3,3 x 1013 partículas por ?l de suspensão, com concentrações significativamente menores nas amostras de pacientes em relação aos indivíduos saudáveis (p= 0,004). Diminuição significativa na expressão de mir-223 foi observada em exossomos de indivíduos com SMD de alto risco em comparação com controles (p= 0,002) e doença de baixo risco (p= 0,012). Curiosamente, houve correlação positiva significativa entre expressão de mir-223 exossomal e contagens de: leucócitos totais (rs de Spearman = 0,37, p = 0,003), neutrófilos (rs= 0,392, p = 0,002), monócitos (rs= 0,484, p

Orientadores: Lucimara Gaziola de la Torre, Patrícia Cruz Bergami-Santos O texto da introdução e conclusão estão na lingua portuguesa Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química Resumo: Esta pesquisa teve como objetivo o desenvolvimento tecnológico de uma vacina lipossomal contendo RNA tumoral destinado à imunoterapia do câncer. Nesta estratégia, RNA total codificando o antígeno tumoral Her-2/neu extraído de linhagem de células de adenocarcinoma de mama humano SK-BR-3 foram incorporados em lipossomas catiônicos introduzidos in vitro em células dendríticas (DCs). A vacina de DCs tem a função de auxiliar o sistema imunológico a identificar antígenos tumorais para que as células cancerígenas sejam eliminadas. Porém uma das etapas críticas é a introdução (transfecção) de RNA nas DCs. Lipossomas catiônicos é uma alternativa promissora, pois além de ativarem as DCs, é capaz mediar a transfecção de ácidos nucléicos para células. A experiência prévia do grupo de pesquisa na área de lipossomas catiônicos mostrou a possibilidade da obtenção de lipossomas em larga escala para o desenvolvimento de vacina de DNA contra a tuberculose. Neste contexto, este trabalho avaliou os lipossomas catiônicos com a composição lipídica de fosfatidilcolina natural de ovo (EPC), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfatidiletanolamina (DOTAP) e 1,2-dioleoil-3-trimetilamônio-propano (DOPE), na respectiva proporção molar de 50/25/25%. Metodologicamente, o trabalho foi dividido em quatro partes: na primeira parte foi apresentada uma visão geral do trabalho desenvolvido, demonstrando o potencial dos lipossomas catiônicos complexados com RNA na imunoterapia do câncer. Na segunda parte do trabalho investigaram-se os efeitos dos lipossomas produzidos através do processo laboratorial na diferenciação/maturação das DCs in vitro e as DCs estimuladas por estes lipossomas, na indução da proliferação de linfócitos T, resultando em lipossomas catiônicos incorporados pelas DCs, com a capacidade de ativar as DCs in vitro e de induzir proliferação de linfócitos T. A terceira parte do trabalho teve como finalidade a otimização da produção dos lipossomas catiônicos obtidos através do método de injeção de etanol utilizando a ferramentas estatísticas, obtendo lipossomas com menor polidispersidade e tamanho, que demonstraram in vitro serem incorporadas e ativarem as DCs e induzirem a proliferação de linfócitos T. A última etapa refere-se ao estudo da incorporação do RNA nos lipossomas catiônicos produzidos através do processo escalonado otimizado e comparado com o laboratorial no intuito de serem internalizados pelas DCs, transfectar o RNA e induzir a proliferação de linfócitos T através das DCs. Os resultados demonstraram que os complexos foram internalizados pelas DCs e que estas são capazes de induzir a proliferação de linfócitos T, porém há necessidade de se obter a condição ótima de transfecção. Dessa forma, conclui-se que os lipossomas catiônicos em questão têm potencial para serem usados como ferramenta em futuras estratégias na imunoterapia do câncer Abstract: This research aimed at the technological development of a liposomal vaccine containing tumor RNA for cancer immunotherapy. In this strategy, total RNA encoding the Her-2/neu tumor antigen extracted from cell line of human breast adenocarcinoma SK-BR-3 were incorporated into cationic liposomes, which were introduced in vitro into dendritic cells (DCs). DCs vaccine has the function of helping the immune system to identify tumor antigens in order to eliminate cancerous cells. However, one of the critical steps is the introduction (transfection) of RNA in DCs. Cationic liposomes are a promising alternative, because besides activating DCs, they are able to mediate transfection of nucleic acids into cells. Previous work of our research group in the cationic liposomes field developed a liposomal nanostructure obtained by a scale up process containing DNA vaccine against tuberculosis. In this context, this work evaluated the cationic liposomes composed by egg phosphatidylcholine (EPC), 1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium propane (DOTAP) and 1,2-dioleoylphosphatidylethanolamine (DOPE), at 50/25/25% molar proportion respectively. Methodologically, the present work was carried out in four mean steps: in the first step, it was carried out an overview of all work, showing the relevancy of cationic liposomes complexed with RNA for cancer immunotherapy. The second part of this work investigated the effects of liposomes produced via laboratory process upon DCs differentiation/maturation in vitro and induction of T lymphocytes proliferation by DCs stimulated with these liposomes, resulting in cationic liposomes incorporated by DCs, capable to activate DCs in vitro and to induce proliferation of T lymphocytes. The third part of the work aimed at optimizing the production of cationic liposomes obtained via the ethanol injection method using statistical tools, obtaining liposomes with smaller size and polydispersity, which demonstrated to be incorporated and activate DCs in vitro and to induce T lymphocytes proliferation. The last step refers to the study of RNA incorporation in the cationic liposomes produced via optimized scalable process compared to the laboratory process in order to be internalized by DCs, transfected RNA and to induce T lymphocytes proliferation by DCs. The results showed that the complexes were internalized by DCs and they are able to induce T lymphocytes proliferation, however we still have to obtain the optimal transfection condition. In sum, we conclude that the cited cationic liposomes can be used as a potential tool in further strategies in cancer immunotherapy Mestrado Desenvolvimento de Processos Biotecnológicos Mestra em Engenharia Química