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134 p., La serina puede sintetizarse a través de una vía conservada, comenzando por el intermediario glucolítico 3-fosfoglicerato (PGA). Este último es oxidado por la primera enzima de esta vía, la 3-fosfoglicerato deshidrogenasa (PHGDH), en 3-fosfohidroxipiruvato (PHP). Aunque PHGDH siempre se ha considerado una deshidrogenasa clásica dependiente de NAD, recientemente se ha demostrado que en ciertos organismos, actúa como una transhidrogenasa utilizando ¿-ketoglutarato en lugar de NAD+ como aceptor final de electrones, produciendo tanto PHP como D-2-hidroxiglutarato (2HG). En este estudio, realizamos una detallada descripcion de la PHGDH de Saccharomyces cerevisiae, Ser33. Utilizando al proteína recombinante de Ser33, pudimos obtener cinco estructuras cristalinas diferentes de la enzima, a saber, sin ligando y en complejos con PHP, PGA, 2HG, serina, así como 2HG más serina. Además, se realizaron ensayos in vitro con varios mutantes, lo que permitió profundizar, a nivel molecular, en los mecanismos catalíticos y reguladores de Ser33. Este análisis estructural-funcional de Ser33 proporciona una base sólida para comprender mejor el mecanismo transhidrogenasa recientemente identificado de las enzimas PHGDH de tipo II.

170 p., {EN]The alpha-glucans, polysaccharides made of repetitive units of glucose, play a role as energy storage, as with intracellular glycogen, or as structural components, as with the capsular alpha-glucans surrounding the pathogenic Mycobacterium tuberculosis. Bacterial glycogen provides survival advantage during starvation periods whereas the mycobacterial capsule is critical in mediating host-pathogen interactions.The tetrameric enzyme ADP-glucose pyrophosphorylase (AGPase) catalyzes and controls: I) the initial step of glycogen biosynthesis and II) the synthesis of ADP-Glucose as precursor for the capsular alpha-glucanbio synthesis. In this work we disclose the cryoEM structures of the paradigmatic AGPase from Escherichia coli and Mycobacterium tuberculosis. The former, solved in the presence of the main positive and negative allosteric regulators, reveal distinct physiological conformational states that have different availability for ATP. Biochemical and microbiological evidence that support the latter show that single point-mutants in the catalytic and putative allosteric sites were unable to produce neither the product of reaction nor glycogen and the capsular alpha-glucans., [ES]Los alpha-glucanos, polisacáridos formados por unidades repetitivas de glucosa, desempeñan un papel como almacenamiento de energía, como ocurre con el glucógeno intracelular, o como componentes estructurales, como ocurre con los alpha-glucanos capsulares que rodean la bacteria patógena M. tuberculosis(Mtb). El glucógeno bacteriano proporciona una ventaja para la supervivencia durante los periodos de inanición, mientras que la cápsula de la micobacteria es fundamental en las interacciones huésped-patógeno. La enzima ADP-glucosa pirofosforilasa (AGPasa) cataliza y controla: I) el paso inicial de la biosíntesis de glucógeno y II) la síntesis de ADP-glucosa, precursor de la biosíntesis del alpha-glucanocapsular. En este trabajo presentamos las estructuras crioEM de la AGPasa de E. coli y M. tuberculosis.Las primeras, resueltas en presencia de los principales reguladores alostéricos, revelan estados conformacionales fisiológicos y distintos que presentan diferente accesibilidad por ATP. Las pruebas bioquímicas y microbiológicas que respaldan la estructura de la MtbAGPasa muestran que algunos mutantes del sitio catalítico y del posible sitio alostérico no son capaces de producir ni el producto de lareacción, ni el glucógeno, ni los alpha-glucanos capsulares.

216 p., Estudios de asociación de genoma completo han detectado polimorfismos asociados con el riesgo a padecer diabetes de tipo 1 (DM1) en ARN largos no codificantes (lncRNAs). Sin embargo, todavía se desconocen los mecanismos moleculares por los que la mayoría de estos lncRNAs contribuyen al desarrollo de la DM1.Los estudios recogidos en esta tesis doctoral confirman la presencia de lncRNAs implicados en el desarrollo de DM1. Así mismo, se ha realizado la caracterización funcional de 2 de estos lncRNAs; llamados Lnc13 y ARGI. Gracias a estos estudios se demuestra la importancia de estas moléculas no sólo en el funcionamiento celular (en esta tesis centrada en el estudio de las células ß pancreáticas), sino también en el desarrollo de diversas enfermedades como son la diabetes.

236 p., La macroautofagia es un proceso que ocurre en los organismos eucariotas, se caracteriza por la formación del autofagosoma, una estructura de doble membrana encargada de rodear los componentes celulares que se degradan cuando se fusiona con el lisosoma. En humanos, las seis proteínas LC3/GABARAP participan en varios pasos de la formación del proceso. Para llevar a cabo su función, estas proteínas establecen diferentes interacciones con lípidos. El objetivo principal de esta tesis fue estudiar el efecto de la ceramida en algunas interacciones entre estas proteínas y membranas modelo. Se demostró que la ceramida es capaz de aumentar su unión a membranas que contienen cardiolipina, lo significa que la ceramida podría tener un papel en la unión de estas proteínas solubles a mitocondrias durante la mitofagia. Se describió que este efecto tendría lugar en las zonas enriquecidas en cardiolipina, donde una baja cantidad de ceramida sería suficiente para aumentar su unión. Por último, la ceramida aumentó notablemente la capacidad fusogénica de los homólogos GABARAP y GABARAPL1, una vez anclados a la membrana, por lo que la ceramida podría estar implicada en la labor de expandir el autofagosoma.

226 p., CaM binds to the calcium responsive domain (CRD) of voltage-gated potassium channel 7.2 (Kv7.2), transmitting calcium signaling to control its pore gating. In addition, CaM affects other functions, such as trafficking to the membrane and regulation of the stability of the distal tetramerization domain. In this dissertation, novel roles of CaM in Kv7.2 function are described, such as its involvement in redox regulation and in co-translational folding have been found. On the one hand, CaM regulates the function of Kv7.2 channel via a non-canonical interaction between the non-helical S2S3 linker and EF3 hand loop. This is critical for redox regulation. By acting through the CRD coupled to the S6 gate and through the voltage-sensing domain, CaM can influence gating in two opposing directions simultaneously. In addition, it has been found that CaM assists during co-translational folding of the Kv7.2 CRD in a calcium dependent manner. Thus, the recognition mechanism to the Kv7.2 occurs during co-translational folding, and provably involves a combination of conformational selection and induced fit mechanisms.

419 p., The study of tumor metabolism has uncovered a new therapeutic window for the treatment of some cancer types. In such paradigm, cell signaling and metabolic reprogramming can act in tandem for the benefit of the cancer cell. Prostate cancer (PCa), the second most common cancer diagnosed in men worldwide, is a clear example of this convergence. Previous studies conducted in our lab have shown how polyamine (PA) biosynthesis is elevated in PCa with profound implications in the progression of the disease. However, PA deprivation therapy has failed in patients in the last years and currently, in spite of the conclusive data about the contribution of PAs to cancer biology, their molecular effectors remain obscure. In this thesis, we describe a mechanism orchestrated by activating transcription factor 4 (ATF4) signaling through which PCa cells could acquire survival properties and resistance to therapies targeting polyamine metabolism. In addition, we provide solid evidence about the regulatory function of PAs in the process of mRNA splicing through changes occurring at posttranslational level. Overall, our results expand the current knowledge about the role of PAs in both physiology and disease.

188 p., Aedes aegypti bacteria-responsive protein 1 (AgBR1) y neutrophil stimulating factor 1 (NeSt1) son dos proteínas salivales del mosquito Aedes aegypti que actúan como potenciadoras de la infección del virus Zika (ZIKV). En este trabajo se ha realizado el análisis estructural de AgBR1 y NeSt1 con el fin de relacionar su estructura con la actividad inmunomoduladora que presentan in vivo. La estructura cristalina de AgBR1 ha sido resuelta mediante cristalografía de rayos-X a una resolución de 1,25 Å mediante reemplazo molecular (MR). La estructura general de la proteína muestra el clásico barril TIM (barril ¿ß8), que pertenece, entre otros, a la familia 18 de las glicosil hidrolasas. La estructura de NeSt1 también ha sido resuelta mediante MR utilizando como modelo la reciente estructura del homólogo LIPS-2 con un 63% (los datos de la estructura no se muestran aquí). Desde el punto de vista funcional, las dos proteínas salivales de mosquito se internalizan en el citoplasma de los macrófagos derivados de la médula ósea de ratón (BMDM). La internalización sugiere la unión de las proteínas a un receptor. Los ensayos de estimulación apoyan que ambas las proteínas de las glándulas salivales del mosquito activan la respuesta inmune innata y la formación de fagosomas (solo por AgBR1, aunque NeSt1 también participa en este proceso) en células BMDM. Los receptores FCGR2A y TLR4 han sido identificados como reguladores aguas arriba de ambas proteínas salivales. Este podría ser un mecanismo empleado por las proteínas para acceder al citoplasma de los macrófagos murinos mediante la formación de fagosomas, activando así a los macrófagos.

197 p., A pesar de décadas de investigación el VIH aún no ha podido ser erradicado. La existencia de anticuerpos ampliamente neutralizantes se presume una herramienta potente para conseguir una cura funcional o como modelos para una vacuna. En el presente trabajo de Tesis, se estudian los mecanismos de unión de algunos anticuerpos anti-MPER, siendo el propio MPER uno de los puntos de vulnerabilidad del VIH. Para ello, se recurre a la técnica de MP-SPR, que permite conocer con gran precisión algunos de las constantes cinéticas de la unión en un entorno de membrana, requisito necesario para una presentación del epítopo en un entorno semejante a la forma nativa. Además, se estudia cómo mutaciones del anticuerpo 10E8, el cual ya ha sido utilizado en ensayos clínicos, influyen en la manera de unión a su epítopo, así como la correlación entre estas mutaciones y su polirreactividad. En segundo lugar se estudia si la longitud de la membrana y/o una mayor longitud de la región transmembrana de MPER influye en el reconocimiento del anticuerpo 10E8 nativo. Finalmente, se comprueba si esta misma estrategia es aplicable a otros anticuerpos anti-MPER y la correlación con su potencia y polirreactividad.

277 p., El cáncer de próstata (CaP) es el segundo cáncer con mayor índice de mortalidad en hombres en la actualidad. Estos fallecimientos se deben a la falta de un buen pronóstico que permita anticipar los casos que van a recidivar. Estudios previos han establecido firmas basadas en genes metabólicos que permiten diferenciar los pacientes con alto riesgo de recurrencia de los indolentes. Por ello, como primer objetivo de esta tesis, se mejoraron y validaron en una cohorte externa de pacientes estas firmas metabólicas. El análisis de los genes que constituyen dichas firmas descubrió una serie de alteraciones metabólicas no asociadas con ningún proceso oncológico hasta ahora y con funciones metabólicas muy diversas. Entre ellas, destacó la represión de ASPA observada en aquellos pacientes que presentaban recurrencia. De todas las alteraciones metabólicas, ASPA, era la que mayor poder pronóstico presentaba. Así, el análisis a nivel molecular de la contribución de ASPA al CaP nos permitió descubrir que es un gen que se reprime en los fibroblastos por acción de TGFß, cuando estos se convierten en fibroblastos asociados al tumor. Esta represión de ASPA genera la acumulación de su sustrato el NAA que provoca la repolarización de macrófagos hacia un fenotipo protumoral. Estos macrófagos protumorales contribuyen a la progresión tumoral y justifican que niveles bajos de ASPA se asocien a peor pronóstico de los pacientes de CaP.

467 p., El cáncer de próstata (CaP) es el segundo cáncer más frecuente en los hombres y ocupa el sexto lugar entre las causas de muerte relacionadas con el cáncer en todo el mundo. A pesar de las prometedoras respuestas clínicas a las terapias actuales, el 15% de los pacientes sigue experimentando recaídas y desarrolla una enfermedad metastásica agresiva, lo que limita las opciones de tratamiento. Para mejorar las estrategias de tratamiento del cáncer de próstata metastásico, es crucial identificar marcadores moleculares pronósticos de recaída y comprender la biología subyacente que impulsa el desarrollo de capacidades agresivas en las células cancerosas de próstata. La comunicación celular desempeña un papel fundamental en el correcto funcionamiento de los procesos biológicos, e implica interacciones entre distintos tipos de células y la matriz extracelular (MEC) en un microentorno específico. La comunicación puede ser directa, implicando interacciones célula-célula o célula-MEC, o indirecta, mediada por diversas moléculas secretadas. En esta tesis doctoral, hemos descrito cómo la alteración transcripcional de PGC1 afecta a genes implicados en la comunicación celular directa (integrinas) e indirecta (proteínas secretadas) en un modelo específico de supresión de tumores CaP. Además, hemos identificado a CTHRC1 como un potencial factor en el pronóstico y progresión del CaP a través del análisis in silico de genes relacionados con la comunicación celular y hemos investigado su expresión diferencial, regulación transcripcional y el impacto de su alteración en la agresividad de las células de CaP.

295 p.

403 p.

224 p., GIBaren gainazalean kokatzen den Env proteina da birusaren infekzioa hasteko gertatu behar den birusaren eta itu zelularen mintzen arteko fusioa eragiten duena eta immunitate sistemarentzako eskuragarri dagoen proteina bakarra. Beraz, GIBaren aurkako txerto profilaktiko bat garatzeko itu ezin hobea da. Halaber, GIBaren infekzioa blokeatzeko gaitasuna duten espektro zabaleko antigorputz neutralizatzaileak isolatu dira kutsatutako zenbait indibiduoen serumetik, birus honen aurkako erantzun immune babeslea sor daitekeela frogatuz. Antigorputz hauen artean, birusaren mintzean txertatuta dagoen MPER sekuentzia ezagutzen dutenak, espektro zabalena erakusten dute. Horrez gain, oso kontserbatua dagoen eskualdea da. Anti-MPER antigorputzek mintzarekin kontaktuan dagoen sekuentzia bat ezagutzen dutenez, MPER domeinuan oinarritutako antigenoa sortzeko mintz ingurune hori mantentzea garrantzitsua dela argudiatu da. Beraz, lan honetan 10E8 moduko antigorputz neutralizatzaileak sortzeko gai diren lipido-peptido formulazioen (LPF) diseinu arrazionalerako lagundu dezaketen zenbait baldintza definitu dira. Lehenbizi, N-MPER sekuentzia ezabatu beharko litzateke antigorputzen erantzuna 10E8aren epitopora bideratzeko. Gainera, transmintz domeinua gehitzean immunogeno egonkorragoak sor daitezkeela ikusi da eta domeinu honen sekuentziaren luzerak, epitopoaren irisgarritasuna eta ondorioz, antigorputzen afinitatea modula dezake. Azkenik, epitopoak mintzen gainazalean duen aurkezpena hobetzeko, LPFak kolesterolik gabe diseinatzea gomendagarriagoa dela ikusi da.

154 p., Chronic inflammatory diseases are the most significant cause of death in the world. Indeed, according to the World Health Organization (WHO), 3 out of 5 people die due to chronic inflammatory diseases such as stroke, chronic respiratory diseases, heart disorders, cancer, obesity or diabetes. It has been demonstrated that sphingolipid metabolism is altered in this type of disorders. Therefore, understanding the molecular mechanisms by which bioactive sphingolipids participate in the establishment or progression of those diseases may be useful for developing novel therapeutic strategies to control them. In the first chapter of this thesis, we demonstrate that the bioactive sphingolipid ceramide 1-phosphate (C1P) induces survival, proliferation and migration of preadipocytes through mechanisms that implicate the PI3K/Akt, MEK/ERK1-2 and JAK/STAT3 signaling pathways. These biological actions suggest a possible role of this phosphosphingolipid in fat accumulation and dysfunction of adipose tissue, which might lead to metabolic diseases, most notably, obesity. In the second chapter we show that exogenous C1P inhibits alveolar macrophage migration, an action that seems to be caused by dephosphorylation of important proteins that are involved in the regulation of cell migration, such as, PKB/Akt, ERK1-2, PAK1 and Paxillin. In addition, the latter study provides evidence that granular nanosized silica (SiO2)-conditioned medium enhances alveolar macrophage migration through activation of PI3K/Akt signaling cascade and that C1P inhibits this action by blocking PKB/Akt phosphorylation. Taken together, the results of this thesis support the notion that C1P may have anti-inflammatory properties in lung cells.

148 p., N6-metiladenosina (m6A) es una de las modificaciones más abundante del ARNm presente en los organismos eucariotas. Distintos estudios han revelado que la modificación m6A está involucrada en la regulación de la mayoría de los procesos del metabolismo del ARNm. Sin embargo, aún no existe mucho conocimiento acerca del impacto que esta modificación tiene sobre la regulación de la expresión génica, su función en los procesos celulares y el efecto que puede ejercer en el desarrollo y progresión de ciertas enfermedades, como, por ejemplo, el cáncer de mama. Por tal motivo, en este estudio, exploramos la presencia de la modificación m6A en el cáncer de mama, específicamente en los subtipos moleculares luminal A, luminal B HER2-, luminal B HER2+, HER2+ y triple negativo, con el fin de determinar el estado de la metilación del ARN y de su posible relación con futuras dianas terapéuticas. Para ello, se ha evaluado el estado de la metilación m6A y de la expresión de las principales metiltransferasas y desmetilasas en muestras provenientes de los mencionados subtipos moleculares de cáncer de mama. También, se han identificado m6A-SNPs relacionados con esta enfermedad y se ha determinado el perfil de metilación m6A presente en todo el transcriptoma de los distintos subtipos moleculares mediante el uso de la técnica MeRIP-seq. Los resultados obtenidos muestran la presencia de metilación m6A en numerosos ARNms de genes altamente relacionados con el inicio y desarrollo tumorales lo que genera nuevas vías de estudio en esta enfermedad.

266 p., La naturaleza dinámica y reversible de las modificaciones post-traduccionales por parte de los miembros de la familia de la ubiquitina plantea importantes desafíos durante su investigación. En esta Tesis presentamos dos nuevas estrategias, SUMO-ID y E3-ID, basadas en proteómica de proximidad y marcaje por biotina, que permiten investigar a fondo los fundamentos biológicos de los códigos de ubiquitina y SUMO. Por un lado, SUMO-ID combina la biotinilación de proximidad mediada por la enzima TurboID con la complementación de fragmentos proteicos para identificar interactores de proteínas de interés dependientes de SUMO. Hemos desarrollado un punto de escisión optimizado de TurboID y, fusionando un fragmento a SUMO y el fragmento complementario a PML, hemos podido identificar numerosos interactores de PML dependientes de SUMO. Hemos demostrado que dichos interactores representan un subconjunto del proteoma de los cuerpos nucleares de PML maduros y que participan en procesos nucleares esenciales tales como transcripción, reparación del ADN, respuesta al estrés y SUMOilación, estando altamente enriquecidos en motivos de interacción con SUMO. Asimismo, SUMO-ID nos ha permitido identificar nuevos interactores de SALL1 SUMOilado, cuyo rol es todavía desconocido. Finalmente, utilizando TP53 como sustrato, hemos identificado qué proteínas interactúan preferencialmente vía SUMO1, SUMO2 o ubiquitina, lo que demuestra la gran especificidad de SUMO-ID y que se puede aplicar para estudiar otras interacciones UbL-dependientes. Por otro lado, E3-ID se basa en la enzima BirA que biotinila específicamente la secuencia AviTag. Expresando en células la fusión de AviTag con ubiquitina junto a la fusión de BirA con una E3 ligasa de interés, E3-ID permite identificar sustratos específicos de E3 ligasas de ubiquitina. Mediante un AviTag de baja afinidad, el sistema E3-ID identifica específicamente los substratos de la E3 ligasa tipo RING RNF4, lo que ha permitido caracterizar sus funciones f

254 p., La autofagia es una vía de degradación conservada entre los eucariotas caracterizada por la formación de una vesícula de doble membrana (autofagosoma) alrededor de lo que se quiere degradar para su posterior eliminación en el lisosoma. Hay un gran número de proteínas implicadas, entre ellas encontramos dos sistemas tipo ubiquitina (UBL) cuyo objetivo es anclar las proteínas de la familia LC3/GABARAP a la membrana. Esta familia está compuesta por seis proteínas ortólogas a la proteína Atg8 de levaduras. El principal objetivo de esta tesis fue explorar los posibles distintos papeles de sus seis miembros. LC3A y LC3B fueron identificadas como las encargadas del reconocimiento de mitocondrias durante la autofagia mediada por la externalización de la cardiolipina. GABARAP y GABARAPL1 una vez unidas a membrana fueron las proteínas capaces de producir una mayor agregación y fusión de vesículas, presentándose como los principales candidatos para participar en la expansión del autofagosoma. Además, uno de los componentes de los sistemas UBL, el complejo E3, se identificó como inhibidor de la capacidad de fusión de estas proteínas.

159 p., La presente tesis se centra en la verificación experimental de las utilidades del NT como un sensor molecular. La membrana, tanto la plasmática como la que rodea al sistema endomembranoso, es un sistema dinámico, que sufre importantes remodelaciones y deformaciones, claves en numerosos procesos celulares. Estas remodelaciones son producto del efecto colectivo de proteínas y lípidos sobre la membrana. Y aunque es posible estudiar el efecto colectivo de estas moléculas sobre la memrbana y sus propiedades mecánicas, es difícil caracterizar el efecto que moléculas individuales de proteína tienen sobre la membrana, La presente tesis propone el desarrollo de un sensor molecular basado en el sistema de nanotubos lipídicos ultracortos, que permita determinar y caracterizar el efecto colectivo de lípidos y proteínas sobre la membrana y llegar incluso a discriminar, si no moléculas individuales, sí pequeños oligómeros de proteína.. Así, los objetivos del presente trabajo son los siguientes:Crear nanotubos de tamaño molecular a partir de diferentes composiciones lipídicas: caracterizar el efecto de lípidos sobre las propiedades mecánicas de estos NTs,comprobar la capacidad de los NTs de actuar como sensores moleculares (para proteínas y lípidos),desarrollar procedimientos electroforéticos para incorporar moléculas a esos NTs

289 p., El Magnesio (Mg2+) es un micronutriente esencial en la dieta humana debido a su papel en diversosprocesos celulares y enzimáticos. En esta tesis hemos identificado cómo un desequilibrio en el contenidode Mg2+ en el hígado tiene un papel clave en el desarrollo de las enfermedades hepáticas. Con estepropósito, hemos estudiado la expresión de los diferentes transportadores de Mg2+ encargados decontrolar los niveles intracelulares de Mg2+ en la célula. Hemos identificado que el transportador de Mg2+Ciclina M4 (CNNM4) actúa como un extrusor de Mg2+ en el hígado. Bajo condiciones dehepatotoxicidad, CNNM4 se transloca de la membrana plasmática al RE. Esta localización anómala deCNNM4 en el RE puede ser una de las principales causas que inducen estrés de retículo y desregulaciónde la homeóstasis de calcio (Ca2+) en el daño hepático causado por la sobredosis de paracetamol y laexposición prolongada al alcohol. La sobreexpresión de CNNM4 reduce los niveles de Mg2+mitocondriales, afectando a la movilidad del Ca2+ entre el RE y la mitocondria y dando lugar a una disfunción mitocondrial. Por lo tanto, proponemos el silenciamiento especifico de Cnnm4 como terapiapara el tratamiento de DILI causado por paracetamol así como la enfermedad hepática alcohólica (EHA).(1) GalNAc siCnnm4 revierte los niveles de Mg2+ a niveles basales, reduciendo la disfunciónmitocondrial y el estrés de RE. (2) GalNAc siCnnm4 es un tratamiento eficaz para el daño hepático porsobredosis de paracetamol en una ventana terapéutica en la que NAC no es efectiva. (4) En EHA,GalNAc siCnnm4 induce la actividad de la metiltransferasa PIMT, cuya función es la reparación deproteínas dañas a causa del alcohol. El silenciamiento de PIMT inhibe el efecto terapéutico del GalNAcsiCnnm4. (5) Hemos propuesto un modelo tridimensional de la estructura de CNNM4 combinando losresultados derivados de la biología estructural así como de Alphafold. (6) Hemos realizado unacaracterización biofísica y estructural del interactoma cono

268 p., Tesi honetan, aurretiaz Drosophila melanogaster eulian eta saguetan identifikatutako UBE3Aren balizko substratuak balioztatu ditugu, horretarako moldatutako purifikazio estrategia bat erabiliz ¿GFP pull-down estrategia¿. Halaber, estrategia hori masa espektrometriarekin konbinatuz UBE3Ak edozein substratutan sortutako ubikitina kate-motak eta substratu horien ubikitinazio-guneak identifikatzeko baliogarria dela egiaztatu dugu. Horrez gain, giza deubikitinasa (DUB) ezberdinak testatu ditugu, eta USP9X identifikatu dugu UBE3Aren aurkako funtzioa burutzen duen DUB gisa. USP9Xren inhibizioak UBE3Aren substratu den DDI1 proteinaren ubikitinazioa emendatzen du. Era berean, Angelman sindromearen modelo diren eulien fenotipoa ere hobetzen du, eta horrek, etorkizunean ASrentzako tratamenduak garatzen lagundu dezake. Inhibitzaile horren ondorioz, ubikitinazio-maila aldatzen duten, eta beraz, eulien fenotipoa hobetzearen eragile izan daitezkeen proteinak identifikatu ditugu masa espektrometrian oinarritutako esperimentu baten bidez. UBE3Arekin elkarrekin eta ligasaren funtzioa erregulatu dezaketen hainbat proteina ere identifikatu ditugu, baita proteina horiek UBE3Aren amino muturrarekin, karboxilo muturrarekin edo proteina osoarekin elkarrekiten duten zehaztu ere. Azkenik, UBE3Aren egitura osoa definitzeko helburuarekin, ligasa modu eraginkorrean purifikatzeko protokoloa ezarri dugu, eta UBE3A gainadierazten duten saguen portaera ikertu dugu.

234 p., Esta tesis doctoral se ha centrado en el empleo de diferentes herramientas químicas desarrolladas para el estudio de interacciones lípido-proteína y proteína-proteína en el contexto del Virus de la Inmunodeficiencia Humana de tipo 1 (VIH-1). Por un lado, se ha utilizado una sonda bifuncional, un colesterol fotoactivable marcado radiactivamente, para estudiar la posible interacción entre el colesterol de la membrana celular y la proteína Gag del HIV-1 durante la morfogénesis del virus. Se ha visto que, usando esta metodología, no parece haber una interacción directa entre Gag y el colesterol, sin embargo, se postula la existencia de una interacción indirecta entre ambos vía la proteína gp41 de la envuelta del virus. Por otro lado, se ha desarrollado un palmitoilo clickable, se ha probado su eficacia y se ha puesto a punto un protocolo de extracción de proteínas palmitoiladas basado en esta sonda, la química click y la fuerte unión entre biotina y avidina. Este protocolo se ha utilizado para la extracción de proteínas palmitoiladas a partir de partículas virales no infectivas de HIV-1 con el fin de descubrir su palmitoiloma, es decir, el conjunto de proteínas palmitoiladas que conforman el virión ya sean de origen viral o celular. Como resultado, los análisis proteómicos han demostrado la obtención de un abundante número de proteínas exclusivas de los viriones tratados con el palmitoilo clickable y que previamente se encontraban descritas en la literatura como proteínas palmitoiladas.

Photocuring of chitosan has shown great promise in the extrusion-based 3D printing of scaffolds for advanced biomedical and tissue engineering applications. However, the poor mechanical stability of methacrylated chitosan photocuring ink restricts its applicability. The inclusion of co-networks by means of simultaneous polycomplex formation is an effective method by which to solve this drawback, but the formed hydrogel inks are not printable. This work aims to develop new photocurable chitosan inks based on the simultaneous photocrosslinking of methacrylated chitosan (CHIMe) with N,N′-methylenebisacrylamide, polyethylene glycol diacrylate, and acrylic acid to be applied in extrusion 3D printing. Interestingly, the polycomplex co-network corresponding to the acrylic-acid-based ink could be successfully printed by the here-presented simultaneous photocuring strategy. Further, the conversion of photocrosslinking was studied via photo-DSC analyses that revealed a clear dependence on the chemical structure of the employed crosslinking agents (from 40 to ~100%). In addition, the mechanical and rheological properties of the photocured hydrogels were comparatively studied, as well as the printing quality of the extruded scaffolds. The newly developed chitosan photocurable inks demonstrated extrusion printability (squareness ~0.90; uniformity factor ~0.95) and tunable mechanical properties (Young modulus 14–1068 Pa) by means of different crosslinking approaches according to the chemical architecture of the reactive molecules employed. This work shows the great potential of photocrosslinkable chitosan inks.

[EN] Breast cancer (BC) is the most commonly occurring cancer in women and the most prevalent cancer overall. Indeed, data indicate that 1 in 8-10 women will suffer from it throughout their lives and 30% of BC patients will die from this disease. In this project, we will focus on ER+ (oestrogen receptor-positive) BC, which comprises around 70% of BC cases. These patients usually present a positive prognosis, but the major clinical problem of this subtype is that some patients develop resistance to endocrine therapy (ET), and eventually relapse, which significantly affects their survival. Among others, VAV3, a guanine nucleotide exchange factor (GEF) for small GTP-binding proteins (mainly, for Rho and Rac families), has been suggested as a controller of ET resistance. In this project, we have further characterized the expression and protein levels of VAV3 in patients' public databases as well as in breast cancer in vitro models, discovering that it is enriched particularly in the ER+ samples. Nevertheless, similar expression levels were found in MCF-7 cells and an in vitro model of ET resistance derived from them (LTED cells). In addition, short hairpin RNA technology was previously used for VAV3 silencing in the mammalian cells of interest to investigate its role in the ET resistance setting (Aguilar et al., 2014). Consequently, we have developed lentiviral particles to silence VAV3 expression in MCF-7 and LTED cells and, in the future, study in detail the molecular mechanisms controlled by VAV3 driving ET resistance. Thus, our research highlights the importance of VAV3 in ER+ breast tumours and contributes with tools to further study its roles in ET resistance, in which VAV3 may be used as a relevant prognostic/predictive biomarker and/or a future therapeutic target.

Childhood B-cell acute lymphoblastic leukemia (B-ALL) is a heterogeneous disease comprising multiple molecular subgroups with subtype-specific expression profiles. Recently, a new type of ncRNA, termed circular RNA (circRNA), has emerged as a promising biomarker in cancer, but little is known about their role in childhood B-ALL. Here, through RNA-seq analysis in 105 childhood B-ALL patients comprising six genetic subtypes and seven B-cell controls from two independent cohorts we demonstrated that circRNAs properly stratified B-ALL subtypes. By differential expression analysis of each subtype vs. controls, 156 overexpressed and 134 underexpressed circRNAs were identified consistently in at least one subtype, most of them with subtype-specific expression. TCF3::PBX1 subtype was the one with the highest number of unique and overexpressed circRNAs, and the circRNA signature could effectively discriminate new patients with TCF3::PBX1 subtype from others. Our results indicated that NUDT21, an RNA-binding protein (RBP) involved in circRNA biogenesis, may contribute to this circRNA enrichment in TCF3::PBX1 ALL. Further functional characterization using the CRISPR-Cas13d system demonstrated that circBARD1, overexpressed in TCF3::PBX1 patients and regulated by NUDT21, might be involved in leukemogenesis through the activation of p38 via hsa-miR-153-5p. Our results suggest that circRNAs could play a role in the pathogenesis of childhood B-ALL.

Naturally derived biopolymers modifying or combining with other components are excellent candidates to promote the full potential of additive manufacturing in biomedicine, cosmetics, and the food industry. This work aims to develop new photo-cross-linkable alginate-based inks for extrusion 3D printing. Specifically, this work is focused on the effect of the addition of cross-linkers with different chemical structures (polyethylene glycol diacrylate (PEGDA), N,N′-methylenebisacrylamide (NMBA), and acrylic acid (AA)) in the potential printability and physical properties of methacrylated alginate (AlgMe) hydrogels. Although all inks showed maximum photo-curing conversions and gelation times less than 2 min, only those structures printed with the inks incorporating cross-linking agents with flexible and long chain structure (PEGDA and AA) displayed acceptable size accuracy (~0.4–0.5) and printing index (Pr ~1.00). The addition of these cross-linking agents leads to higher Young’s moduli (from 1.6 to 2.0–2.6 KPa) in the hydrogels, and their different chemical structures results in variations in their mechanical and rheological properties. However, similar swelling ability (~15 swelling factor), degradability (~45 days 100% weight loss), and cytocompatibility (~100%) were assessed in all the systems, which is of great importance for the final applicability of these hydrogels.

394 p., The skin is a complex vital organ composed of several layers. The middle layer, the dermis, is mainly composed of fibroblasts that produce the extracellular matrix (ECM) providing structural support. Recent research using single-cell RNA sequencing (scRNAseq) has revealed previously unrecognized heterogeneity among dermal fibroblasts, challenging the traditional understanding of their organization.The work conducted in this thesis thoroughly analyses multiple human and mouse dermal scRNAseq datasets , uncovering a functional heterogeneity of fibroblasts never described. Fibroblast heterogeneity can be divided in major axes and minor populations, and more than 15 populations are described in each species. These populations were associated with specific functions, such as ECM production, immune response, involvement in skin adnexa such as hair follicles, or specialised supportive functions related to vasculature and nerve fibres. Additionally, while there are similarities between mouse and human fibroblasts, differences in their arrangement suggest species-specific variations in overall fibroblast function. This atlas serves as a valuable resource for researchers investigating skin function and diseases, enabling unbiased annotation of their datasets and facilitating the identification of compositional differences and novel fibroblast types associated with various skin conditions.

The enhanced phytoremediation of metal contaminated soils holds great promise for the recovery of soil health and functionality, while providing a range of co-benefits, from an environmental and human health perspective, derived from the revegetation of the degraded sites and the concomitant delivery of ecosystem services. Due to diverse evolutionary co-selection mechanisms between metal resistance and antibiotic resistance in bacteria, metal contaminated soils are considered potential reservoirs of antibiotic resistant bacteria (ARB) which can contribute to the existing antibiotic resistance crisis. During the enhanced phytoremediation of metal contaminated soils, the application of organic wastes (e.g., manure, slurry, sewage sludge) as soil amendments can aggravate the risk of antibiotic resistance spread, because they often contain ARB which harbor antibiotic resistance genes (ARGs) that can then be propagated among soil bacterial populations through horizontal gene transfer (HGT). Due to the magnitude and criticality of the antibiotic resistance crisis, as well as the higher risk of spread and dispersal of ARB and ARGs (they make copies of themselves) compared to metals, it is proposed here to aim enhanced phytoremediation strategies towards decreasing the soil resistome (and, hence, the risk of its potential link with the human resistome), while reducing total and/or bioavailable metal concentrations and restoring soil health and the delivery of ecosystem services. To this purpose, a decalogue of practices is tentatively suggested. Finally, a proper management of plant and soil microbial compositions is a most crucial aspect, together with the selection of the right organic wastes and phytoremediation practices.

128 p., originan multitud de patologías. El último paso de la división mitocondrial es la fisión de su doble membrana lipídica. En este Tesis se ha desarrollado un modelo in vitro de nanotubos lipídicos que imita el cuello mitocondrial que se produce antes de su fisión. Sobre él, se ha estudiado cómo las proteínas GTPasas de la familia de las Dinaminas, Drp1 y Dyn2, implicadas en el momento de la fisión mitocondrial, llevan a cabo el proceso de fisión. Drp1 no fue capaz de producir la fisión de los nanotubos de manera autónoma, viéndose influida esta acción por su etiquetado. Por el contrario, Dyn 2 sí llevó a cabo la fisión de los nanotubos, lo que indica que tiene un rol en llevar a cabo la división mitocondrial. Además, puede producir la fisión de la membrana interna independientemente del GTP, lo que se ha comprobado por Cryo-EM. Por primera vez, hemos visto la interacción de ambas proteínas in vitro. Estas actuarían sinérgicamente para producir la división mitocondrial.

200 p., Carbohydrates are one of the most variable and complex molecules of biological systems. They areusually located at the cell membrane, mainly as glycoconjugates, glycoproteins or glycolipids and play an important role in the specific molecular recognitions. Since structure and function are intrinsically correlated, the three-dimensional shape, dynamics and presentation of these molecules is essential for the recognition processes to take place.In this work, we have employed a combination of X-Ray crystallography and Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy (NMR) techniques, for obtaining atomic-scale information on the interactions of glycans and glycomimetics, using either intact glycoproteins (the receptor binding domain of the spikegly coprotein of SARS CoV2) or small molecules, with different receptors related to human diseases, with special emphasis on galectins and siglecs (immune response). The presented methodology allows disentangling the fine details of the vital glycan epitopes, providing key information for the developmentof novel therapeutics.

139 p., La Dinamina1 es una GTPasa implicada en el proceso de fisión de membrana durante la endocitosis. Para ello, la Dinamina1 adopta una estructura helicoidal alrededor de los cuellos de membrana. Utilizando la energía de la hidrólisis del GTP, esta maquinaria proteica constriñe y fisiona estas estructuras lipídicas. La estequiometría y los mecanismos de autoensamblaje de esta maquinaria helicoidal de fisión son objeto de debate actualmente. Para resolver estas cuestiones, reconstituimos la reacción de fisión de membrana, utilizando un sistema mínimo constituido por tubos lipídicos y la proteína estudiada marcada. Estudiamos, en tiempo real y constante presencia de GTP, la acción de pequeños oligómeros de Dinamina1 sobre los nanotubos lipídicos. A concentraciones bajas de proteína, dichos oligómeros eran menores a un anillo helicoidal de proteína. Aún así, estas estructuras no helicoidales eran capaces de mediar la fisión de las membranas. Además, mediante el uso de la nanotecnología, creamos un modelo de membrana que nos permitió estudiar un mecanismo de autoensamblaje alternativo, por el cual las estructuras no helicoidales de Dinamina1 eran capaces de enrollarse alrededor de la membrana y llevas a cabo su ruptura.

xv, 193 p., Las enfermedades neurodegenerativas (ENs) son un grupo de trastornos neurológicos caracterizados por la degeneración progresiva de la estructura y función del sistema nervioso central y periférico. Las ENs se caracterizan por la deposición de agregados proteicos denominados amiloides. La eliminación de estos agregados la lleva a cabo la red de homeostasis proteica compuesta por la maquinaria de traducción, chaperonas moleculares y cochaperonas, el sistema ubiquitina-proteasoma and las vías de autofagia. En esta tesis doctoral hemos profundizado en el mecanismo utilizado por las chaperonas para desensamblar amiloides de las proteínas ¿-sinucleina y tau, implicadas en las enfermedades de Parkinson y Alzheimer, respectivamente. Hemos visto que la desagregasa humana, compuesta por la chaperona Hsc70 y sus cochaperonas DnaJB1 y Apg2, desensamblan fibras amiloides mediante un proceso de despolimerización desde los extremos que se propaga a través del eje de la fibra. Este mecanismo es crucial para que las chaperonas desagreguen preferentemente los sustratos más pequeño, que son los más tóxicos. Para desagregar fibras grandes, la desagregasa humana parece colaborar con el proteasoma, el cual es capaz de fragmentar amiloides para su posterior procesado por las chaperonas. Por otra parte, demostramos que el truncamiento del dominio C-terminal de ¿-sinucleina bloquea la desagregación de amiloides de esta proteína. Por último, vemos que el polimorfismo de fibras amiloides tiene un impacto en la actividad de las chaperonas, existiendo estructuras más resistentes a la desagregación.

239 p., La presente Tesis Doctoral tiene como objetivo estudiar como nuevas variantes genéticas de diversos genes inducen el desarrollo de hipercolesterolemia familiar, así como descifrar los mecanismos moleculares detrás de los efectos pleiotropicos de las estatinas, consideradas como el tratamiento de referencia para los pacientes de dicha enfermedad.Está claramente establecido como mutaciones en los genes LDLR, APOB y PCSK9 son responsables del desarrollo de la hipercolesterolemia familiar, y a su vez, como el tratamiento con estatinas que reciben estos pacientes se asocia con un incremento del 13% en el riesgo de desarrollar Diabetes Mellitus de tipo 2 (DMT2). Por ello, con la intención de presentar los resultados obtenidos durante este estudio de la manera más clara posible, estos se han distribuido en dos capítulos.El capítulo 1 hace referencia al estudia llevado a cabo sobre nuevas variantes encontradas en los genes LDLR, APOB y PCSK9, asociados como hemos dicho anteriormente al desarrollo de la hipercolesterolemia familiar. Esta parte está compuesta por una Introducción General sobre la enfermedad, su diagnostico y tratamiento, unos Objetivos Generales, Materiales y Métodos, Resultados y Discusión de los resultados obtenidos en este capítulo. Además, se ha incluido una sección con los resultados obtenidos durante la ¿estancia virtual¿, un trabajo llevado a cabo en colaboración con la Dra. Giuliana Fortunato y Ma Donata di Taranto.Por otro lado, con la intención de elucidar los mecanismos moleculares implicados en el desarrollo de DMT2 en pacientes hipercolesterolémicos tratados con estatinas, y debido a la complejidad y extensión del estudio, los resultados experimentales obtenidos acerca del mismo se han incluido en el Capítulo 2. Este segundo capítulo, sin ser dependiente del primero, surge como consecuencia natural del estudio de los efectos secundarios asociados al tratamiento que reciben los pacientes con Hipercolesterolemia Familiar. Este capítulo consta de un

341 p., Esta tesis pretende explorar la función de los esfingolípidos en el crecimiento celular y en la composición y las propiedades físicas de las membranas. Para ello se han utilizado células que poseen una síntesis limitada de esfingolípidos. Tanto células modificadas genéticamente como tratadas químicamente.A lo largo del estudio se han utilizado diferentes técnicas biofísicas para la caracterización de estas propiedades: sobre todo la espectroscopía y microscopía fluorescente, la microscopia de fuerza atómica y la espectrometría de masas.Esta investigación demuestra que existe una clara correlación entre la disminución del contenido de SL de las membranas y los cambios biofísicos en las propiedades biofisicas de las mismas: Las membranas celulares se vuelven más fluidas al medirlas mediante la polarización general de laurdan y son más penetrables al inducir su ruptura mediante la espectrometría de fuerza (AFM).Cuando las cantidades de SL se reducen en las membranas celulares, las células CHO y HAP1 intentan mantener su orden de membrana nativo mediante una respuesta homeostática en su síntesis lipídico: Sintetizan más glicerofosfolípidos totalmente saturados y menos insaturado. Las LY-B (SPT deficiente) mantienen el orden molecular de sus membranas solo parcialmente, ya que su membrana plasmática es más penetrable en comparación a las de la línea celular CHO (wild type). Por otro lado, la línea celular humana HAP1-SPT (SPT deficiente) mantiene el orden de sus membranas, ya que no existen diferencias en comparación a la penetrabilidad de la membrana plasmática de las células HAP1 (wild type).

210 p., Immune checkpoint blockade therapies have enhanced cancer therapy in lung and renal cancers aswell as melanoma. Most patients are stratified for anti-PD-1 or anti-CTLA-4 treatments based ontheir PD-L1 ligand expression that is currently assessed by traditional immunohistochemistry (IHC)approaches, which are subjective, lack quantitation and a dynamic range. We have developed a novelquantitative imaging platform, underpinned by time-resolved Förster resonance energy transfer(FRET) determined by frequency-domain fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) tospatially quantitate these immune checkpoint interactions at a nanoscopic (<10nm) resolution. Thisassay is termed immune-FRET (iFRET). We validated the ability of iFRET to measure differentimmune checkpoints in patients with malignant melanoma and malignant non-small cell lungcarcinoma (NSCLC). Here, iFRET was predictive of patient outcome whereas IHC approaches werenot. This was then applied to a subset of colorectal cancer patients with bilateral lung metastases whofailed to respond to classical treatments and therefore had their metastases treated by radiofrequencyablation (RFA). iFRET could detect differential PD-1/PD-L1 and CTLA-4/CD80 interaction stateswithin patients and between patients. It was shown that neither CD80 nor PD-L1 expressioncorrelated with checkpoint interaction in these patients. Moreover, a negative correlation was seenbetween PD-1/PD-L1 interactive states and intratumoral CD3+ density. Taken together, these resultsindicate a novel technique by which to assess immune checkpoint engagement in patient samples.The results from this multi-disciplinary investigation and thus the implementation of iFRET to carryout quantitative immune surveyance may change the way patients are selected for immunotherapiesand may provide a mechanism by which to monitor their response to treatment.

It is necessary to complement next-generation sequencing data on the soil resistome with theoretical knowledge provided by ecological studies regarding the spread of antibiotic resistant bacteria (ARB) in the abiotic and, especially, biotic fraction of the soil ecosystem. Particularly, when ARB enter agricultural soils as a consequence of the application of animal manure as fertilizer, from a microbial ecology perspective, it is important to know their fate along the soil food web, that is, throughout that complex network of feeding interactions among members of the soil biota that has crucial effects on species richness and ecosystem productivity and stability. It is critical to study how the ARB that enter the soil through the application of manure can reach other taxonomical groups (e.g., fungi, protists, nematodes, arthropods, earthworms), paying special attention to their presence in the gut microbiomes of mesofauna-macrofauna and to the possibilities for horizontal gene transfer of antibiotic resistant genes.

N-maleimide-derivatized phospholipids are often used to facilitate protein anchoring to membranes. In autophagy studies, this is applied to the covalent binding of Atg8, an autophagy protein, to a phosphatidylethanolamine (PE) in the nascent autophagosome. However, the question remains on how closely the N-maleimide PE derivative (PE-mal) mimicks the native PE in the bilayer. In the present paper, spectroscopic and calorimetric techniques have been applied to vesicles containing either PE or PE-mal (together with other phospholipids) to compare the properties of the native and derivatized forms of PE. According to differential scanning calorimetry, and to infrared spectroscopy, the presence of PE-mal did not perturb the fatty acyl chains in the bilayer. Fluorescence spectroscopy and microscopy showed that PE-mal did not alter the bilayer permeability either. However, fluorescence emission polarization of the Laurdan and DPH probes indicated an increased order, or decreased fluidity, in the bilayers containing PE-mal. In addition, the infrared spectral data from the phospholipid phosphate region revealed a PE-mal-induced conformational change in the polar heads, accompanied by increased hydration. Globally considered, the results suggest that PE-mal would be a reasonable substitute for PE in model membranes containing reconstituted proteins.

The p.(Tyr400_Phe402del) mutation in the LDL receptor (LDLR) gene is the most frequent cause of familial hypercholesterolaemia (FH) in Gran Canaria. The aim of this study was to determine the age and origin of this prevalent founder mutation and to explore its functional consequences. For this purpose, we obtained the haplotypic information of 14 microsatellite loci surrounding the mutation in one homozygous individual and 11 unrelated heterozygous family trios. Eight different mutation carrier haplotypes were identified, which were estimated to originate from a common ancestral haplotype 387 (110–1572) years ago. This estimation suggests that this mutation happened after the Spanish colonisation of the Canary Islands, which took place during the fifteenth century. Comprehensive functional studies of this mutation showed that the expressed LDL receptor was retained in the endoplasmic reticulum, preventing its migration to the cell surface, thus allowing us to classify this LDLR mutation as a class 2a, defective, pathogenic variant.

189 p., La medicina de precisión debe considerarse como un enfoque innovador de la medicina tradicional ya que se centra en un tratamiento más personalizado de las patologías de los pacientes en función de sus características individuales. El estudio del mecanismo molecular asociado a una enfermedad y la identificación de los biomarcadores implicados en el desarrollo y la progresión de dicha patología se consideran factores esenciales para obtener un mejor diagnóstico y una optimización de la terapia. La metabolómica proporciona una imagen completa del organismo y permite observar los cambios metabólicos específicos que caracterizan a un individuo debido a su condición de salud o a factores externos. En concreto, la metabolómica por resonancia magnética nuclear (RMN) es especialmente adecuada para este tipo de análisis, ya que las mediciones se realizan de forma rápida y sencilla, es una técnica que ofrece la posibilidad de identificar y cuantificar numerosos metabolitos, las muestras no necesitan derivatización y por tanto se acelera la obtención de resultados. En este trabajo decidimos aplicar las ventajas que ofrece esta técnica al estudio de dos enfermedades no relacionadas entre sí: el síndrome metabólico y a la reciente pandemia mundial causada por el virus SARS-CoV-2.

This study was aimed at developing a sustainable versatile bio-based epoxy-silica material to be potentially employed as hydrophobic and biocidal consolidating product in the field of stone conservation. For this purpose, two hybrid formulations containing 2,2,4,4-tetramethyl-1,3-cyclobutanediol diglycidylether (CBDO-DGE), a cycloaliphatic epoxy precursor derived from the arnica root, together with (3-glycidyloxypropyl)trimethoxysilane (GPTMS) and octyltriethoxysilane (OcTES) as silica-forming additives, were chosen as the basis of the multifunctional material to be finely adjusted and gain biocidal properties. With this goal in mind, different synthetic strategies based on ionic liquids (ILs), essential oils (EOs) and nanoparticles (NPs) doping have been employed. Specifically, dimethyloctadecyl[3(trimethoxysilyl)propyl]ammonium chloride (QAS), tetradecyl phosphonium chloride (QPS) and thymol, as well as cerium-TiO2 NPs and thymol-loaded SiO2 NPs were incorporated into the starting hybrid formulations, during the sol-gel process, to investigate their influence on the network formation. First, distribution studies by scanning electron microscopy/energy-dispersive X-ray (SEM-EDS) analysis were performed, whereas the suitability of each formulation to match the main requirements for a stone conservation material was evaluated in terms of thermostability, hydrophobicity and inhibition of the microbiological growth by a combination of TG-DTA, DSC, dynamic mechanical analysis (DMA), with contact angle and disk-diffusion measurements, respectively. Based on the data analysis, it was observed that the direct incorporation of ILs and EOs had an adverse effect on the ability of GPTMS to act as a coupling agent. This resulted in decreased thermal stability and a 50 % reduction in glass transition temperatures, along with the retention of hydrophilic behavior. In contrast, the inclusion of NPs did not significantly interfere with the hybrid network formation, and effectively m

183 p., Among the hundreds of nuclear-encoded components of mitochondria that have been linked to human disease, mutations in the ATAD3 gene cluster have emerged as one of the most frequent in recent years. The ATAD3 locus encodes three highly homologous mitochondrial transmembrane proteins that are members of the AAA+ protein family. ATAD3 has been implicated in mitochondrial DNA and cholesterol metabolism, as well as mitochondrial morphology and ultrastructure. In this thesis, several new ATAD3 mutants have been characterized and have been studied in cultured human cells and in a Drosophila model. These investigations have identified elevated free and membrane-embedded cholesterol as core features of pathological ATAD3 variants. Thus, this is a recurring cellular phenotype characteristic of mutant ATAD3, and as such, it represents a valuable new diagnostic tool, in combination with ATAD3 protein separation and immunodetection. Moreover, a model of the molecular mechanism of the disease has been proposed in which the high level of cholesterol results in cholesterol aggregates in membranes provoking an extraordinary expansion of lysosomes to digest the aberrant membranes. Multiple strategies aimed at modulating cholesterol and lipid metabolism increased cholesterol levels and none decreased it, which might exacerbate rather than mitigate the ATAD3 cellular phenotypes. However, sphingosine supplementation distinguished the ATAD3 mutants from control cells, which identifies an important future avenue for developing therapies.

Medulloblastoma (MB) is the most common malignant brain tumor in childhood. Although recent multi-omic studies have led to advances in MB classification, there is still room for improvement with regard to treatment response and survival. Therefore, identification of new and less invasive biomarkers is needed to refine the diagnostic process and to develop more personalized treatment strategies. In this context, non-coding RNAs (ncRNAs) could be useful biomarkers for MB. In this article, we reviewed the role of two types of ncRNAs, long non-coding (lncRNAs) and circular RNAs (circRNAs), as biomarkers for the diagnosis, subgroup classification, and prognosis of MB. We also reviewed potential candidates with specific functions and mechanisms of action in the disease. We performed a search in PubMed and Scopus using the terms (“long non coding RNAs” OR ”lncRNAs”) and (“circular RNAs” OR ”circRNAs”) AND ”medulloblastoma” to identify biomarker discovery or functional studies evaluating the effects of these ncRNAs in MB. A total of 26 articles met the inclusion criteria. Among the lncRNAs, the tumorigenic effects of the upregulated lnc-IRX3-80 and lnc-LRRC47-78 were the most studied in MB. Among the circRNAs, the upregulation of circSKA3 and its functional impact in MB cell lines were the most consistent results, so this circRNA could be considered a potential biomarker in MB. Additional validation is required for many deregulated lncRNAs and circRNAs; therefore, further studies are warranted.

The relationship between milk fat intake (because of its high saturated fatty acid content) and the risk of suffering from cardiovascular diseases remains controversial. Thus, Golden Syrian hamsters were fed two types of fat—sheep milk fat that was rich in rumenic (cis9,trans11-18:2) and vaccenic (trans11-18:1) acids and olive oil—and two doses (a high- or normal-fat diet) for 14 weeks, and markers of lipid metabolism and atherosclerosis evolution were analyzed. The results revealed that the type and percentage of fat affected most plasma biochemical parameters related to lipid metabolism, while only the expression of five (CD36, SR-B1, ACAT, LDLR, and HMG-CoAR) of the studied lipid-metabolism-related genes was affected by these factors. According to aortic histology, when ingested in excess, both fats caused a similar increase in the thickness of fatty streaks, but the high-milk-fat-based diet caused a more atherogenic plasma profile. The compositions of the fats that were used, the results that were obtained, and the scientific literature indicated that the rumenic acid present in milk fat would regulate the expression of genes involved in ROS generation and, thus, protect against LDL oxidation, causing an effect similar to that of olive oil.

181 p., El objetivo a largo plazo de nuestro grupo es estudiar a nivel molecular la estructura, la especificidad por sustrato y el mecanismo de acción de diferentes enzimas bacterianas involucradas en el reconocimiento o modificación de carbohidratos que sean relevantes en la interacción, tanto beneficiosa como patogénica, con el ser humano como hospedador.En este contexto, durante mi tesis, he trabajado en la comprensión a nivel estructural de la catálisis, así como del mecanismo de reconocimiento del sustrato de enzimas de bacterias tanto beneficiosas (Akkermansia muciniphila) como perjudiciales (Mycobacterium tuberculosis) para la salud del hospedador. Siguiendo este criterio, la tesis ha sido dividida en dos secciones; el estudio de la maquinaria enzimática que Akkermansia muciniphila, bacteria que forman parte de la microbiota intestinal, presenta para la digestión de los azúcares presentes en las mucinas por un lado, y el estudio de la biosíntesis de los glucolípidos (fosfatidil-myo-inositol mannósidos; PIMs, lipomannanos; LM y lipoarabinomannanos; LAM) presentes en la compleja envoltura celular de M. tuberculosis, por otro lado.

Phosphatidic acid (PA) is a key bioactive glycerophospholipid that is implicated in the regulation of vital cell functions such as cell growth, differentiation, and migration, and is involved in a variety of pathologic processes. However, the molecular mechanisms by which PA exerts its pathophysiological actions are incompletely understood. In the present work, we demonstrate that PA stimulates the migration of the human non-small cell lung cancer (NSCLC) A549 adenocarcinoma cells, as determined by the transwell migration assay. PA induced the rapid phosphorylation of mitogen-activated protein kinases (MAPKs) ERK1-2, p38, and JNK, and the pretreatment of cells with selective inhibitors of these kinases blocked the PA-stimulated migration of cancer cells. In addition, the chemotactic effect of PA was inhibited by preincubating the cells with pertussis toxin (PTX), a Gi protein inhibitor, suggesting the implication of a Gi protein-coupled receptor in this action. Noteworthy, a blockade of LPA receptor 1 (LPA1) with the specific LPA1 antagonist AM966, or with the selective LPA1 inhibitors Ki1645 or VPC32193, abolished PA-stimulated cell migration. Moreover, PA stimulated the phosphorylation of the transcription factor STAT3 downstream of JAK2, and inhibitors of either JAK2 or STAT3 blocked PA-stimulated cell migration. It can be concluded that PA stimulates lung adenocarcinoma cell migration through an interaction with the LPA1 receptor and subsequent activation of the MAPKs ERK1-2, p38, and JNK, and that the JAK2/STAT3 pathway is also important in this process. These findings suggest that targeting PA formation and/or the LPA1 receptor may provide new strategies to reduce malignancy in lung cancer.

259 p., El envejecimiento es un proceso sistémico, multifactorial y degenerativo caracterizado por el declive y la pérdida de capacidades físicas y mentales. La esperanza media de vida ha aumentado considerablemente en el último siglo, incrementando así el número de personas mayores en la población y, por tanto, las limitaciones funcionales y las enfermedades relacionadas con la edad. En este sentido, la fragilidad representa un nuevo síndrome geriátrico que se caracteriza por una pérdida de la capacidad funcional y una disminución de la capacidad de respuesta al estrés fisiológico, lo que resulta en una mayor vulnerabilidad del individuo y en resultados negativos para la salud. Se trata de una afección dinámica que se está convirtiendo en un importante problema de salud que es necesario detectar e intervenir. Se sabe relativamente poco sobre la fisiopatología de este síndrome y los mecanismos moleculares subyacentes a la fragilidad siguen siendo poco conocidos. Con el fin de abordar esta cuestión, se analizó el perfil transcriptómico de un conjunto de individuos robustos y frágiles residentes en el País Vasco, y se encontraron 35 genes expresados diferencialmente que se asociaron con el estado e fragilidad. Éstos incluían genes asociados a inflamación, respuesta inmune o miRNAs, procesos previamente relacionados con la fragilidad. Entre ellos, 7 candidatos fueron validados en cohortes independientes y también mostraron un patrón de expresión similar en mioblastos y fibroblastos primarios humanos mantenidos en cultivo. Su expresión fue parcialmente restaurada tras diferentes programas de intervención en individuos frágiles. Análisis adicionales revelaron la expresión de un conjunto mínimo de 3 genes (aumento de EGR1 y disminución de DDX11L1 y miR454) fuertemente asociados con el estado de fragilidad y las características clínicas vinculadas a la fragilidad como la multimorbilidad y la polifarmacia. Además, descubrimos su papel en el envejecimiento celular e identificamos su

This Special Issue, “Cardiovascular Disease, Atherosclerosis and Familial Hypercholesterolemia: From Molecular Mechanisms Causing Pathogenicity to New Therapeutic Approaches”, contributes to advancing our knowledge of the molecular mechanisms that drive cardiovascular disease, atherosclerosis and familial hypercholesterolemia and the development of state-of-the-art research in the field. This Special Issues is the result of a call for papers that was sent out in late 2020 and continued till mid-2022, from which twelve papers (six original research articles, one hypothesis and five reviews) were published.

176 p., La hipertensión pulmonar (HP) es una condición compleja caracterizada por un incremento de la presión en las arterias de los pulmones, que puede dañar el lado derecho del corazón. Clásicamente se define por unos valores de presión arterial pulmonar media ¿25 mmHg. Con mayor frecuencia, la HP aparece como secuela de otra enfermedad, excepto en el caso de la HP del grupo I, hipertensión arterial pulmonar (HAP), que cursa con remodelación vascular pulmonar e incremento de la resistencia. El ventrículo derecho (VD) aumenta la fuerza de contracción para mantener el flujo sanguíneo, lo que acaba provocando su hipertrofia, y finalmente insuficiencia cardíaca. A nivel mundial se estima que casi el 1% de la población sufre de HP. A pesar de ello, sigue siendo una enfermedad mortal. Los síntomas incluyen dificultad respiratoria, fatiga, dolor en el pecho, aumento de la frecuencia cardíaca, y en casos más avanzados, mareos, síncopes y edema. Los principales métodos de diagnóstico comprenden el ecocardiograma como herramienta de cribado no invasiva y el cateterismo cardíaco derecho para establecer un diagnóstico definitivo. Dada la importancia del diagnóstico precoz en el manejo de la enfermedad, se necesita más investigación para refinar una técnica no invasiva y específica, capaz de detectar la HP en una etapa temprana. Como aún no hay cura, la terapia se dirige a paliar los síntomas y retrasar la progresión de la enfermedad. En este sentido, las intervenciones en el estilo de vida están ganando relevancia como tratamiento de apoyo de la enfermedad, entre las que se incluye la práctica de ejercicio físico. Sin embargo, sigue habiendo muchos aspectos desconocidos de la HP, y, a pesar de los avances, la falta de comprensión de la enfermedad puede obstaculizar la cura. Nos hemos centrado en algunos elementos clave de la patogénesis de la HAP, como la inflamación, la hipoxia y las alteraciones metabólicas, con el fin de analizar cómo afectan a la patología. La tesis se divide en

246 p., El cáncer colorrectal (CCR) es en la actualidad una de las neoplasias malignas más prevalentes,constituyendo una de las principales causas de mortalidad por cáncer en países desarrollados. En Euskadi es el tumor de mayor incidencia en ambos sexos.Pese a que los factores de riesgo para el CCR han sido ampliamente estudiados y definidos, no se ha determinado con claridad el motivo por el cuál existen diferente probabilidad de supervivencia en pacientes con el mismo diagnóstico y tratamiento.El pronóstico de los pacientes con cáncer colorrectal resecable se basa actualmente en los criterios histopatológicos de invasión tumoral de acuerdo con el sistema de clasificación TNM del American JointCommittee on Cancer (AJCC) y de la Unión Internacional para el Control del Cáncer (UICC) y en lascaracterísticas de la diferenciación de células tumorales. Este sistema proporciona información pronóstica útil pero incompleta ya que el resultado clínico puede variar sustancialmente entre los pacientes dentro dela misma etapa de tumor histológico.Por otro lado, cada vez se solicitan diagnósticos más precisos, que además de las características histomorfológicas, también incluyan información genética de los tumores que permitan aplicar tratamientos personalizados.Por esta razón, surgió nuestro interés en analizar tanto los factores clínico-demográficos de cada paciente como las características histopatológicas y moleculares de cada tumor con el objetivo de encontrar una combinación de parámetros capaz de explicar las diferentes respuestas al tratamiento de acuerdo a los objetivos de la medicina individualizada.

The process of cellular transformation encompasses the acquisition of key and distinctive features, commonly known as hallmarks of cancer. These hallmarks are supported by tumor-intrinsic molecular alterations, as well as changes in the microenvironment. Cellular metabolism represents one of the most intimate connections between a cell and the environment. In turn, metabolic adaptation is a research field of increasing interest in cancer biology. In this viewpoint, I will provide a panoramic perspective of the relevance and repercussions of metabolic alterations in tumors with nonexhaustive illustrative examples and I will speculate about the prospects of cancer metabolism research.