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Tesis (Doctora en Neurociencias) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2021 RESUMEN La enfermedad de Parkinson (EP) es un trastorno neurológico degenerativo y progresivo secundario a una degeneración de las neuronas dopaminérgicas de la vía nigroestriada. En las últimas décadas se ha convertido en uno de los desórdenes neurodegenerativos más comunes. Paralelamente al aumento de la expectativa de vida, la EP se ha incrementado significativamente, por lo que se prevé que se transforme en un serio problema de salud pública a nivel mundial. La degeneración progresiva de neuronas dopaminérgicas en la pars compacta de la sustancia nigra (SN) y el déficit dopaminérgico en el cuerpo estriado (CPu), genera modificaciones funcionales de los ganglios basales con las consecuentes disfunciones motoras características en el ser humano (temblores, rigidez, bradicinesia, trastornos en la marcha). Aunque actualmente se conoce bastante acerca de los síntomas, poco se sabe sobre su exacta etiología. El diagnóstico suele ser tardío, cuando más del 80% de las neuronas dopaminérgicas se han degenerado. A pesar de los avances científicos, no existe aún un tratamiento efectivo para frenar su progresión y la búsqueda de marcadores biológicos hasta el momento ha sido poco fructífera. Muchos grupos de investigación se han abocado a identificar marcadores tempranos que permitan un abordaje más efectivo en el estudio de esta enfermedad; por lo que se proponen múltiples teorías que podrían explicar el fenómeno neurodegenerativo. Particularmente, el modelo de hemiparkinsonismo (HP) de ratas inyectadas con la neurotoxina 6-OHDA (6-hidroxidopamina) en CPu, ha demostrado ser una excelente herramienta para estudiar los efectos de los neuroesteroides y otras moléculas sobre los procesos fisiopatológicos involucrados en esta enfermedad. El cambio en la vista tradicional de que la función del cerebro está modulada por hormonas de origen periférico surgió mediante el hallazgo de que ciertos esteroides (incluidos los sexuales) se producen de novo en el Sistema Nervioso Central (SNC), por lo que han sido llamados “Neuroesteroides” y los secretados por glándulas periféricas “Esteroides Neuroactivos”. Esto ha permitido identificar propiedades benéficas de algunas de estas moléculas en el SNC tanto en humanos como en modelos animales de la enfermedad, tales como protección frente a noxas, potenciación de capacidades cognitivas y neurogénesis. Sumado a esto, se ha descripto que estas moléculas se unen a sitios específicos de la membrana en células nerviosas en regiones del SNC que regulan funciones diferentes a aquellas implicadas en las funciones reproductivas. En relación a que esta patología afecta mayormente a hombres que a mujeres; se cree que los esteroides sexuales femeninos podrían proteger a las mujeres de la EP. Existen numerosos reportes que demuestran la influencia de los esteroides sexuales femeninos en los mecanismos neuroprotectores en la EP. Trabajos previos realizados en nuestro laboratorio indican que el tratamiento subcutáneo con P4 en un modelo de ratas macho hemiparkisnonianas (HP), mejora la disfunción motora e induce efectos neuromoduladores sobre los sistemas de neurotransmisión estriatal. También, hemos demostrado que P4 y Allo modulan la actividad del sistema dopaminérgico nigroestriatal y que esta modulación es diferencial dependiendo de la dosis de esteroide administrada o el estado del ciclo reproductivo de la rata. Otros estudios experimentales demuestran la existencia de una amplia gama de acciones del 17β-estradiol (E2) sobre el SNC de los mamíferos (que exceden a su clásica función reguladora sobre el eje hipotálamo-hiposario-gonadal), tales como: promotoras de la supervivencia celular, moduladoras la sinaptogénesis y de la arborización axonal y dendrítica y reguladoras de la expresión de receptores y segundos mensajeros. Por lo tanto, por tener capacidades tanto tróficas como moduladoras dentro del SNC, se cree que E2 tiene funciones cruciales en la protección del cerebro lesionado y participa en la reparación/ limitación de daños diseñados para reducir la muerte celular. Basados en la hipótesis de que los esteroides neuroactivos y los neuroesteroides modulan la funcionalidad de sistemas neurogliales íntimamente relacionados con patologías neurodegenerativas; propusimos estudiar, utilizando un modelo experimental de ratas macho adutas HP inducido por 6-OHDA, la participación del esteroide neuroactivo 17β-estradiol (E2) como un factor neuroprotector y/o neurorregenerador sobre las redes neuronales asociadas al control de la funcionalidad dopaminérgica del sistema nigroestriatal. Dentro del amplio espectro de acción conocido del E2, nuestra propuesta se enfocó en el estudio de la actividad dopaminérgica en la vía dopaminérgica nigroestriatal, asociado con el comportamiento y la actividad motora. En particular, para la evaluación de la natación forzada, de la acinesia del miembro anterior y para la determinación de neuronas reactivas a tirosina hidroxilasa (TH+) en sustancia nigra, desarrollamos sistemas informáticos en relación a la adquisición, el cálculo y el análisis datos. Así detectamos de manera precoz y con alta sensibilidad las modificaciones motoras, locomotoras e inmunohistoquímicas; eliminando la subjetividad y la cuantificación directa o manual de las observaciones. Las técnicas automatizadas están desarrolladas con software libre y pueden ser compartidas con los usuarios a través de un sistema de actualización integrado. Con una batería de evaluaciones comportamentales a lo largo de ocho semanas, observamos un deterioro de la actividad locomotora y exploratoria en los animales HP. También pudimos examinar el efecto del tratamiento en la disminución de los signos neurodegenerativos y en la restauración del movimiento, a corto y largo plazo. Los resultados revelaron que los signos motores de neurodegeneración propios de la EP pueden estar influenciados por la administración del 17β-estradiol; sugiriendo un rol neuroprotector del esteroide neuroactivo en este modelo in vivo de la EP. Gran cantidad de estudios relacionan los resultados de los test comportamentales y la pérdida de neuronas TH+ y de dopamina (DA) en la vía dopaminérgica nigroestriatal. Investigamos los efectos del 17β-estradiol a nivel celular y encontramos que permite activar mecanismos compensatorios sobre la síntesis y liberación de DA en SN pars compacta (SNpc) y CPu en animales lesionados.Vimos además que se produce un cambio en la dinámica de funcionalidad dopaminérgica donde los valores de la actividad metabólica tienden a restaurarse a niveles fisiológicos. Estos resultados evidencian que las deficiencias comportamentales observadas fueron consistentes y sugieren que el 17β-estradiol está actuando a nivel de las neuronas en relación a la síntesis de DA, mejorando las anormalidades que se presentan en los animales lesionados. En relación a los astocitos, pudimos observar que, tanto la neurotoxina como la lesión mecánica aumentan la reactividad de la astroglia. Asimismo, el tratamiento con 17β-estradiol disminuye el número de astrocitos reactivos en los animales lesionados. Además, aminora el cambio en la astroglia reactiva en relación al daño mecánico, disminuyendo el tamaño de la cicatriz glial y la proliferación de los astrocitos. Pudimos también establecer una relación entre las neuronas y astrocitos en la SNpc que permite analizar variables como el comportamiento de la lesión, la respuesta al daño y la evolución de cada proceso para cada grupo en particular. En general, la evidencia disponible apoya la opinión de que los astrocitos son objetivos importantes para los estrógenos circulantes, lo que podría contribuir a las diferencias de sexo en la EP. En particular, observamos que el 17β-estradiol participa en la regulación de activación de las vías dopaminérgicas a través de los receptores D1 y D2 en cultivos de astrocitos; por lo que (al modular la expresión de los receptores) está influyendo en la síntesis, liberación y metabolismo de la DA. Los resultados sugieren que las células responden a fenómenos plásticos compensatorios que actúan bidireccionalmente por interacciones neurona-glía; y que el tratamiento con 17β-estradiol está promoviendo la supervivencia celular, la recuperación y la reparación. Aunque las implicaciones funcionales requieren mayor estudio, los datos sugieren que en los machos los astrocitos pueden generar una mayor respuesta neuroinflamatoria potencialmente dañina, mientras que en las hembras los astrocitos contribuyen a compensar y promover la supervivencia. Sumado a esto, nuestros resultados muestran que el tratamiento participa en la modulación de factores pro y anti inflamatorios en cultivos de microglia. Observamos que las células de la microglia de los animales macho que no habían recibido tratamiento con 17β-estradiol aumentaron la expresión de marcadores pro inflamatorios y disminuyeron significativamente la expresión de factores antiinflamatorios. Sugiriendo que el tratamiento es un poderoso regulador de la actividad de las células microgliales. En conjunto, todas estas aproximaciones nos brindaron una amplia variedad de resultados los cuales nos permitieron clarificar el entendimiento sobre la función neuroprotectora del 17β-estradiol en las las células neurogliales de la vía dopaminérgica nigroestriatal en estados fisiológicos y patológicos. Los datos presentes muestran la potencialidad terapéutica del tratamiento con 17β-estradiol tras la lesión con 6-OHDA; en el que este esteroide neuroactivo podría desempeñar un papel importante en el restablecimiento de las propiedades fisiológicas y morfológicas de las neuronas dopaminérgicas y células de la glía lesionadas, así como mejorar las sinapsis y la liberación a través de los receptores específicos de DA. Por lo expuesto, se estima que el tratamiento con 17β-estradiol podría ser una terapia beneficiosa para patologías donde se vea afectada la síntesis, el transporte y la liberación de dopamina en el SNC. 2023-07-31 Fil: Bonaccorso Marinelli, María Paula. Universidad Nacional de Cuyo; Argentina. Fil: Bonaccorso Marinelli, María Paula. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina. Fil: Cabrera, Ricardo Jorge. Universidad Nacional de Cuyo; Argentina. Fil: Cabrera, Ricardo Jorge. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Fil: Baiardi, Gustavo. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Exactas, Físicas y Naturales. Instituto de Investigaciones Biológicas y Tecnológicas; Argentina. Fil: Baiardi, Gustavo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Fil: De Paul, Ana Lucía. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Médicas. Instituto de Investigaciones en Ciencias de la Salud; Argentina. Fil: De Paul, Ana Lucía. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Fil: Mascó, Daniel Hugo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Investigaciones Biológicas y Tecnológicas; Argentina.

Las disfunciones motoras características de la enfermedad de Parkinson (EP) son temblores, rigidez, bradicinesia y trastornos de la marcha. Utilizamos un modelo experimental de hemiparkinsonismo en ratas macho adultas e investigamos los efectos de la administración crónica de estrógeno en la funcionalidad del sistema dopaminergico nigroestriatal. La acinesia en las patas delanteras de las ratas es análoga a la acinesia de las extremidades y problemas de marcha observados en pacientes con EP. Hemos desarrollado un software para medir los pasos de los animales, el tiempo de paso, la longitud del paso y el tiempo de inicio. La implementación hace un seguimiento de cada movimiento animal de la extremidad anterior y mide esos parametros. Realiza análisis estadísticos y presenta datos en gráficos de barras o hojas de Excel. El software se valido correlacionando los pasos por conteo manual y automático. Los animales tratados con estrógeno exhiben un mecanismo compensatorio más alto ante la disfunción motora, mejorando el número de pasos y mostrando menos bradicinesia. Ademas, hay un efecto beneficioso del estrógeno relacionado con una energía promedio mas alta que podría mejorar el tiempo de avance y la magnitud del movimiento de las extremidades anteriores. En conclusión, este desarrollo e implementación de software es una valiosa herramienta para textit in vivo inferir sobre la acinesia de la extremidad anterior. Al aplicarlo, obtenemos un nuevo enfoque sensible en el efecto del estrógeno como fármaco neuroprotector en la EP, ya que restaura el equilibrio, la movilidad, la velocidad y también disminuye la bradicinesia. We use an experimental adult male rat model of hemiparkinsonism and investigate chronic estrogen administration effects in the functionality of the nigrostriatal dopaminergic system. Forelimb akinesia in rats is analogous to limb akinesia and gait problems seen in patients with PD. We have developed a software to test adjusting steps, stepping time, step length and initiation time. The implementation tracks each animal forelimb movement and measures those parameters. It performs statistical analysis and presents data in bar charts or Excel sheets. The software was validated by correlating manual and automated adjusting steps. Estrogen treated animals exhibit a higher compensatory mechanism to motor dysfunction, improving the number of adjusting steps and showing less bradykinesia. Also, there is a beneficial effect of estrogen related to a higher average energy that could be enhancing stepping time and forelimb movement magnitude. In conclusion, this software development and implementation is a worthy tool to in vivo infer on forelimb akinesia. By applying it, we obtain a new sensitive approach in the effect of estrogen as a neuroprotective drug in PD as it restores balance, mobility, speed and also diminishes bradykinesia. Fil: Bonaccorso Marinelli, María Paula. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mendoza. Instituto de Medicina y Biología Experimental de Cuyo; Argentina Fil: Ledesma M.J.. Universidad de Mendoza; Argentina Fil: Nieto Grimalt F.E.. Universidad de Mendoza; Argentina Fil: Cabrera R.J.. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mendoza. Instituto de Medicina y Biología Experimental de Cuyo; Argentina