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The aim of this work was to ascertain the usefulness of a new commercially-available single-assay chemiluminescence test (CHT) for the diagnosis of human tularemia (Tularaemia VIRCLIA IgG + IgM monotest, Vircell, Santa Fe, Granada, Spain). A total of 773 sera from 773 patients including 364 initial sera from patients with diagnosed tularemia, patients with suspected tularemia not confirmed (100), healthy people (152), patients with serology positive to Brucella (97), patients diagnosed with other infectious diseases (30), and patients diagnosed with autoimmune diseases (30) were included. All sera were tested by CHT, "in-house" microagglutination test (MAT), immunochromatographic test (ICT) (Virapid Tularaemia, Vircell, Santa Fe Granada, Spain), and "in-house" ELISA IgG, and ELISA IgM. Of the total initial sera, 334 (sensitivity 91.8%) were positive in the CHT, 332 (sensitivity 91.2%) in the MAT, 330 (sensitivity 90.7%) in the ICT, and 328 (sensitivity 90.1%) in the ELISA IgG and ELISA IgM tests. The specificity of the CHT was 96.7%; of the MAT, 100%; of the ICT, 98.7%; and of the ELISA IgG and ELISA IgM, 97.4%. In the group of patients with serology positive to Brucella, at least 12.4% of sera were positive in tularemia tests (12.4% in ELISA IgM, 13.4% in MAT, 14.4% in ICT, and 15.5% in CHT and ELISA IgG). In conclusion, CHT presents a sensitivity and specificity in early diagnosis of human tularemia, similar to MAT, ICT, and ELISA IgG and ELISA IgM. Its single assay design allows lower costs, especially in areas of low endemicity or inter-epidemic periods.

[EN]: The antibiotic susceptibility test (AST) in Clinical Microbiology laboratories is still time-consuming, and most procedures take 24 h to yield results. In this study, a rapid antimicrobial susceptibility test using ATP-bioluminescence has been developed. The design of method was performed using five ATCC collection strains of known susceptibility. This procedure was then validated against standard commercial methods on 10 strains of enterococci, 10 staphylococci, 10 non-fermenting gram negative bacilli, and 13 Enterobacteriaceae from patients. The agreement obtained in the sensitivity between the ATP-bioluminescence method and commercial methods (E-test, MicroScan and VITEK2) was 100%. In summary, the preliminary results obtained in this work show that the ATP-bioluminescence method could provide a fast and reliable AST in two hours., [ES]: La mayoría de procedimientos diagnósticos para el estudio de la sensibilidad de las bacterias a los antibióticos en Microbiología Clínica requieren unas 24 horas para la obtención de resultados. En este estudio se propone una metodología para llevar a cabo un antibiograma rápido mediante la medición de ATP por bioluminiscencia. El diseño del antibiograma se realizó mediante el uso de cinco cepas de colección ATCC, las cuales presentan una sensibilidad conocida. Este diseño fue posteriormente validado frente a los métodos comerciales de antibiograma mediante el procesamiento de 10 cepas de enterococos, 10 de estafilococos, 10 de bacilos gramnegativos no fermentadores y 13 de Enterobacteriaceae aisladas de pacientes. El acuerdo obtenido entre la sensibilidad obtenida mediante bioluminiscencia y la obtenida mediante los métodos comerciales (E-test, MicroScan and VITEK2) fue del 100%. Por lo tanto, los resultados preliminares obtenidos en este trabajo indican que las medidas de ATP mediante bioluminiscencia podrían proporcionar, en dos horas, un antibiograma rápido y seguro.

[Introducción]: La rapidez en la emisión del antibiograma es una de las prioridades del laboratorio de Microbiología Clínica. La resazurina es un indicador REDOX cuya la forma oxidada es de color azul. Cuando se incuban células no viables en presencia de resazurina, ésta no se reduce y mantiene su color azul; en cambio, las células viables la reducen a resorufina, que es de color rojo. Este cambio de color puede ser detectado a simple vista o mediante espectrofotometría. [Objetivos]: Realizar un antibiograma en enterobacterias mediante el uso de resazurina. [Material y métodos]: Se prepararon suspensiones de Escherichia coli ATCC 35218 a concentraciones de 106, 107 and 108 UFC/ml en 3 ml de caldo Mueller Hinton con los cationes ajustados. La ampicilina se ensayó a las concentraciones críticas de sensibilidad y resistencia propuestos por el EUCAST. Del mismo modo, Escherichia coli ATCC 25922 se testó frente a amicacina, cefotaxima y ciprofloxacino. En todos los casos, se preparó un tubo sin antibiótico como control positivo y otro sin inóculo bacteriano como control negativo. Se observó el color del medio cada 15 minutos de incubación. El cambio de color del medio de azul a rojo indicó crecimiento bacteriano. Además, se calculó el porcentaje de la forma reducida de resazurina a partir de las absorbancias a 570 y 600 nm (Smart Spec™ Plus, Bio‑Rad). [Resultados]: Inóculos de 106, 107 y 108 UFC/ml de Escherichia coli ATCC 35218, resistente a ampicilina, viraron el color del medio, indicando crecimiento bacteriano, durante la tercera, segunda y primera hora de incubación respectivamente, tanto incubados en presencia del antibiótico como sin él. Inóculos 106 UFC/ml de Escherichia coli ATCC 25922, sensible a los antibióticos estudiados, viraron el color del medio durante la tercera hora de incubación sin antibiótico y las cepas incubadas con antibiótico no lo viraron. Del mismo modo, inóculos de 107 UFC/ml viraron el color del medio durante la segunda hora de incubación si

[EN]: [Introduction]: Rapid determination of the antibiotic susceptibility test in bacteria remains a challenge for Clinical Microbiology laboratories. [Methods]: An improvement in the colorimetric antimicrobial susceptibility testing performed with resazurin in enterococci and staphylococci has been carried out. The design of method was performed using two collection strains, which have a known susceptibility. This procedure was then validated against standard commercial methods on 15 strains of staphylococci and 15 strains of enterococci from patients. [Results]: The essential agreement between the colorimetric method and commercial methods (E-test, MicroScan and VITEK2) was 100%. [Conclusion]: Resazurin allows us to obtain a reliable antibiotic susceptibility test in staphylococci and enterococci in less than two hours., [ES]: [Introducción]: La realización de un antibiograma rápido sigue siendo un reto para los laboratorios de Microbiología Clínica. [Métodos]: Se ha realizado una mejora en el antibiograma colorimétrico realizado mediante resazurina en estafilococos y enterococos. El diseño del método se realizó mediante el uso de dos cepas de colección que presentan una sensibilidad conocida. Este procedimiento se validó posteriormente frente a los métodos comerciales mediante el procesamiento de 15 cepas de estafilococos y 15 de enterococos aisladas de pacientes. [Resultados]: Se ha obtenido un 100% de concordancia entre la sensibilidad obtenida mediante resazurina y la obtenida mediante los métodos comerciales (E-test, MicroScan and VITEK2). [Conclusión]: Mediante el uso de resazurina es posible obtener un antibiograma en estafilococos y enterococos en menos de dos horas de forma fiable.

The rapid identification and antibiotic susceptibility test of bacteria causing bloodstream infections are given a very high priority by clinical laboratories. In an effort to reduce the time required for performing antibiotic susceptibility test (AST), we have developed a new method to be applied from positive blood culture bottles. The design of method was performed using blood culture bottles prepared artificially with five strains which have a known susceptibility. An aliquot of the blood culture was subcultured in the presence of specific antibiotics and bacterial counts were monitored using the Sysmex UF-1000i flow cytometer at different times up to 180 min. Receiver operating curve (ROC) analysis allowed us to find out the cut-off point for differentiating between sensitive and resistant strains to the tested antibiotic. This procedure was then validated against standard commercial methods on a total of 100 positive blood culture bottles from patients. First, bacterial identification was performed by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS) directly from positive blood culture bottles as we have previously reported. Secondly, antibiotic susceptibility test was performed in the same way that was carried out in artificially prepared blood culture bottles. Our results indicate that antibiotic susceptibility test can be determined as early as 120 min since a blood culture bottle is flagged as positive. The essential agreement between our susceptibility test and commercial methods (E-test, MicroScan and Vitek) was 99%. In summary, we conclude that reliable results on bacterial identification and antibiotic susceptibility test performed directly from positive blood culture bottles can be obtained within 3 h.

La bacteriemia es una entidad clínica que ocasiona una importante y creciente morbimortalidad (14). Diversas patologías como neumonía, infección urinaria, peritonitis, endocarditis entre otras cursan con bacteriemia. El hemocultivo constituye una muestra valiosa para el diagnóstico de procesos infecciosos con compromiso sistémico. Existen en el mercado diversos métodos para el manejo y procesamiento de estas muestras. Uno de ellos es el sistema automático de incubación Bactec (Becton Dickinson) (19) (13), el cual consiste en inocular aproximadamente 8-10 ml de sangre en frascos de vidrio que contienen un medio de cultivo líquido. Existen diversos frascos apropiados para el crecimiento de bacterias aerobias, anaerobias, hongos y micobacterias o frascos para pacientes pediátricos los cuales se incuban a 37ºC en constante agitación. Los frascos de cultivo para aerobios contienen resina adsorbente no iónica, resina de intercambio catiónico y un sensor químico que detecta los incrementos de CO2 producidos por el crecimiento de microorganismos. El instrumento monitoriza cada frasco cada 10 minutos. Una lectura positiva indica la posible presencia de microorganismos viables dentro del frasco. La detección se limita a los microorganismos capaces de crecer en un tipo de medio determinado (7). El frasco positivo es extraído del sistema automático y resembrado en medios de cultivo sólidos para la posterior identificación microbiana y estudio de sensibilidad a los antibióticos. Con la introducción en los laboratorios clínicos de la espectrometría de masas [matriz assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF)], la identificación microbiana se realiza en forma más rápida y ayuda al clínico a modificar sus conductas terapéuticas y dirigirlas más eficazmente. La técnica consiste en reconocer el patrón de las proteínas ribosomales y compararlas con la base de datos existente y a través de cálculos estadísticos informatizados establecer el microorg, Departamento de Biología Celular, Histología y Farmacología, Máster en Investigación en Ciencias de la Salud

La introducción de la identificación microbiana basada en el análisis de proteínas mediante espectrometría de masas MALDI‐TOF (de su nombre en inglés que describe el tipo de ionización y el analizador utilizado: Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization‐Time of Flight) ha permitido mejoras importantes en la rutina de trabajo de los laboratorios de Microbiología Clínica. Entre estas mejoras cabe destacar un ahorro significativo del tiempo necesario para llevar a cabo las identificaciones microbianas a partir de colonias. En este sentido, una de las posibles aplicaciones de la técnica MALDI‐TOF en la rutina de trabajo del laboratorio es lograr identificaciones microbianas a partir de diferentes muestras, como pueden ser las orinas y los frascos de hemocultivo crecidos, adelantando en 48/72 horas el resultado de la identificación microbiana si se compara con la identificación bioquímica clásica y en 24 horas si se compara con la identificación mediante MALDI‐TOF a partir de colonias., Departamento de Biología Celular, Histología y Farmacología, Máster en Investigación en Ciencias de la Salud

En esta tesis se proponen y se validan procedimientos diagnósticos microbiológicos llevados a cabo mediante el sistema MALDI-TOF a partir de muestra directa de orina, frasco de hemocultivo crecido y medio de enriquecimiento. Por otra parte se propone y valida un antibiograma rápido a partir del frasco de hemocultivo crecido mediante citometría de flujo., Departamento de Anatomía Patológica, Microbiología, Medicina Preventiva y Salud Pública, Medicina Legal y Forense

La aplicación técnica MALDI-TOF en la identificación de microbacterias atípicas, Farmacología, Máster en Investigación en Ciencias de la Salud