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Comunicación oral presentada en el XV Congreso Nacional de Micología, Valencia 7-9 sept. (2022), La lignocelulosa es la principal materia prima renovable para un desarrollo industrial sostenible. Los hongos juegan un papel central en el reciclado del C en los ecosistemas terrestres. Como consecuencia, poseen (y secretan) todas las enzimas implicadas en la transformación de lignina y carbohidratos vegetales, aportándonos herramientas biotecnológicas para las biorrefinerías de lignocelulosa. La degradación de celulosa ha sido considerada un proceso hidrolítico hasta el descubrimiento de Cu-oxidorreductasas responsables del ataque inicial al polímero cristalino ("lytic polysaccharide monooxygenases") [1]. La degradación de la lignina, definida como una "combustión enzimática", comenzó a ser mejor comprendida tras los primeros estudios "ómicos" de este complejo proceso multi-enzimático [2]. Las clásicas hemo-peroxidasas de basidiomicetos [3] siguen considerándose implicadas en el ataque a la lignina, junto con lacasas y flavo-oxidasas, pero estudios recientes han revelado la asombrosa diversidad generada durante la evolución de los ancestros de estos grupos de enzimas [4] y su adaptación a la evolución de la lignina en las plantas vasculares [5]. También recientemente, se ha puesto de manifiesto el enorme potencial de las hemo-peroxigenasas de estos hongos como biocatalizadores industriales [6]. 1. Martínez. Science. 2016, 352, 1050-1 2. Floudas et al. Science. 2012, 336, 1715-9 3. Tien et al. Science. 1983, 221, 661-3 4. Ruiz-Dueñas et al. Mol. Biol. Evol. 2020, 38, 1428-46 5. Ayuso-Fernández et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2019, 116, 17900-5 6. Municoy et al. ACS Catal. 2020, 10, 13584-95

1 p., Saccharomyces cerevisiae desempeña un papel importante como sistema de expresión heteróloga de proteínas debido a su fácil manipulación, bajos requerimientos y capacidad para realizar las modificaciones postraduccionales en las proteínas. Una de las estrategias más utilizadas para incrementar la secreción es el uso de péptidos señal que determinan la vía de secreción.Históricamente, la secuencia pre-prolíder de la feromona factor α de S. cerevisiae ha jugado un papel importante en la producción de proteínas recombinantes. El uso de este péptido señal en combinación con la evolución dirigida de enzimas ha permitido conseguir la difícil expresión de lacasas fúngicas en S. cerevisiae, obteniendo diferentes secuencias señales evolucionadas.Sin embargo, el diseño de un péptido señal optimizado, de carácter universal, que incremente la producción de diversas enzimas es un desafío pendiente.En este estudio, se aplicaron dos estrategias paralelas de ingeniería del pre-prolíder del factor α para mejorar la producción de enzimas analizando el efecto de mutaciones acumuladas en dicha secuencia a lo largo de sucesivas rondas de evolución dirigida y sus posibles interacciones epistáticas. Ambos enfoques coincidieron en el efecto sinérgico de cuatro mutaciones contenidas en el péptido señal optimizado final, que mejoraron notablemente la secreción de varias oxidorreductasas e hidrolasas fúngicas. Además, se proporcionan directrices adicionales para mejorar aún más la producción heteróloga de una enzima en particular mediante la mutagénesis saturada combinatorial de dos posiciones del péptido señal fusionado a la proteína de interés. Los resultados obtenidos ofrecen un importante avance para la producción de biocatalizadores de interés industrial., Spanish project BIO2017-86559-R. WoodZymes project funded by the Bio Based Industries Joint Undertaking (JU) under grant agreement No 792070

1 p., La conversión integral de biomasa vegetal en bienes industriales y de consumo es un gran desafío de la industria papelera para lograr su transformación en biorrefinerías. La biotecnología puede contribuir a ello proporcionando biocatalizadores capaces de convertir las fracciones infrautilizadas de lignocelulosa en componentes de bloque o productos de base biológica.Durante la fabricación de pasta de celulosa kraft, la tecnología predominante a nivel mundial para producir pasta de papel a partir de madera, la lignina se solubiliza en condiciones muy alcalinas y altas temperaturas, pasa a los licores negros, y se quema para generar energía. Las hemicelulosas son parcialmente liberadas en los efluentes de blanqueo de la pasta y tampoco son debidamente explotadas. Dado que la lignina constituye la principal fuente renovable de compuestos aromáticos, el objetivo actual es recuperarla y valorizarla. Sin embargo, no existe una tecnología establecida de despolimerización de ligninas kraft, siendo la despolimerización enzimática una de las vías más prometedoras para su valorización.El proyecto WoodZymes1 pretende suministrar “enzimas transformadoras de la madera” capaces de trabajar en el entorno extremo (“extremozimas”) necesario para modificar las hemicelulosas y la lignina de la pared celular vegetal, con el fin de: i) obtener compuestos biobasados y valorizarlos como adhesivos en la fabricación de tableros de madera, componentes de espumas de poliuretano o aditivos en la fabricación de papel; y ii) integrar las extremozimas en nuevos procesos industriales de fabricación de papel o tableros de madera. Durante la charla se comentarán algunos de los resultados más importantes obtenidos., 1WoodZymes (www.woodzymes.eu) is funded by the BBI JU (No 792070) between EU H2020 R&I programme and Bio Based Industries Consortium.

1 p., Los Agaricomycetes han desarrollado complejas maquinarias enzimáticas que les permiten descomponer los diferentes polímeros vegetales, incluida la lignina. Entre ellos, los Agaricales saprótrofos se caracterizan por su diversidad de hábitats y estilos de vida. El análisis de 52 genomas de Agaricomycetes aquí realizado revela que los Agaricales poseen una gran diversidad de enzimas hidrolíticas y oxidativas para la descomposición de la lignocelulosa. En base a las familias de genes con mayor velocidad evolutiva (dominios de unión a celulosa, glicosil hidrolasa GH43, monooxigenasas líticas de polisacáridos, peroxidasas ligninolíticas, enzimas de la superfamilia de glucosa-metanol-colina oxidasas/deshidrogenasas, lacasas y peroxigenasas), reconstruimos los estilos de vida de los ancestros que dieron lugar a los actuales Agaricomycetes degradadores de lignocelulosa. Los cambios en el conjunto de herramientas enzimáticas de los Agaricales ancestrales se correlacionaron con la evolución de su capacidad para crecer no solo sobre madera, sino también sobre hojarasca de bosques y madera en descomposición, siendo los descomponedores de la hojarasca de praderas el grupo ecofisiológico más reciente. En este contexto, las anteriores familias de enzimas se analizaron en relación con la diversidad de estilos de vida. Las peroxidasas aparecen como un componente central del set enzimático de los Agaricomycetes saprotrófos, consistente con su papel esencial en la degradación de la lignina y sus altas tasas evolutivas. Esto incluye no solo expansiones/pérdidas de genes de peroxidasas, sino también la presencia generalizada en Agaricales de nuevos tipos de peroxidasas que no se encuentran en Polyporales degradadores de madera, y en otros órdenes de Agaricomycetes., Projectos/contratos BIO2017-86559-R, BIO2015-73697-JIN, AGL2014-55971-R, NSF-grant-1457721, CEFOX-031B0831B, PIE-201620E081, ANR-11-LABX-0002-01, US-DOE-DE-AC02-05CH11231

1 p., Pleurotus eryngii es un hongo de prados y pastizales de interés biotecnológico por su capacidad para transformar el material lignocelulósico no leñoso. En este estudio combinamos análisis transcriptómicos, exoproteómicos y metabolómicos con objeto de ofrecer una explicación sobre los aspectos enzimáticos relacionados con la degradación de la paja de trigo. Durante la fase temprana de crecimiento encontramos un conjunto de enzimas extracelulares inducidas y constitutivas formado por glicosil hidrolasas, polisacárido liasas y carbohidrato esterasas activas sobre polisacáridos,lacasas activas sobre lignina, y una cantidad sorprendente de aril-alcohol oxidasas (AAOs). A tiempos largos identificamos una mayor diversidad y abundancia de enzimas, representada por oxidorreductasas implicadas en la despolimerización de celulosa y lignina, muchas de ellas inducidas desde la fase temprana de crecimiento. Estas enzimas oxidativas incluyeron monooxigenasas líticas de polisacáridos (LPMOs), celobiosa deshidrogenasa implicada en la activación de las LPMOs, y peroxidasas ligninolíticas (principalmente manganeso peroxidasas), junto a una gran abundancia de AAOs productoras de H2O2. Algunas de las enzimas más relevantes activas sobre polisacáridos aparecieron unidas a módulos de unión a celulosa. Esto se relacionó con el hábitat de P. eryngii.También elucidamos aspectos del catabolismo intracelular de compuestos aromáticos, un tema poco investigado en los basidiomicetos degradadores de lignina. Este enfoque multiómico revela que, aunque la descomposición de la paja de trigo no se traduce en grandes cambios (de acuerdo con análisis de 2D-NMR, entre otros), se produce la activación de enzimas hidrolíticas y oxidativas de gran interés biotecnológico en procesos dirigidos al aprovechamiento de la biomasa vegetal., Proyectos GENOBIOREF (BIO2017-86559-R), MICINN (cofinanciado con fondos FEDER); PIE-202120E019 y PIE-201620E081, CSIC; y contratos DE-AC02-05CH11231 y DE-AC36-08GO28308, U.S. DOE

Descripción de 1 páginas de la comunicación oral presentada en Oxizymes2022 10th edition of the international “Oxizymes” meeting. Siena, Italy, July 5-8, 2022, Basidiomycetes of the class Agaricomycetes have developed complex enzymatic machineries that allow them to decompose plant polymers, including lignin. Within this group, saprotrophic Agaricales are characterized by an unparalleled diversity of habitats and lifestyles in comparison with fungi from other orders. With the aim of shedding light on the evolution of lignocellulose-decaying lifestyles in Agaricales we conducted a comparative analysis of 52 Agaricomycetes genomes [1]. This study revealed that Agaricales possess a large diversity of hydrolytic and oxidative enzymes. Surprisingly, computer-assisted gene-family evolution analysis of these enzymes revealed that a few oxidoreductase families showed significantly higher evolutionary rates. Based on these gene families we reconstructed the lifestyles of the ancestors that led to the extant lignocellulose-decomposing Agaricomycetes. According to this, we determined that changes in the oxidative enzymatic toolkit of ancestral Agaricales correlate with the evolution of their ability to grow not only on wood, but also on leaf and grass litter and decayed wood. In this context, the aboye families were analyzed and special attention was paid to peroxidases as a central component of the enzymatic toolkit of saprotrophic Agaricomycetes responsible for lignin degradation. We identified a widespread presence of new ligninolytic peroxidase types in Agaricales, some of them not previously identified in this order, and others also not found in woodrottingPolyporales and other orders of Agaricomycetes. Peroxidase evolution was analyzed in Agaricomycetes by ancestral sequence reconstruction and several major evolutionary pathways were unveiled. The study of the newly identified peroxidases will provide insight into their role in the lignin degradation process. In fact, these studies have already been initiated with the expression and characterization of the first lignin peroxidase identified in Agaricales. [1] Ruiz-Dueñas FJ, Barrasa JM, Sánchez-García M, Camarero S, Miyauchi S, Serrano A, et al., 2021, Mol Biol Evol, 38, 1428-1446., Projects/contracts BI02017-86559-R, BI02015-7369-JIN, AGL2014-55971-R, NSFgrant-1457721 , CEFOX-031 B0831 S, PIE-201620E081 , ANR-11-LABX-0002-01 , US-DOE-DE-AC02-05CH11231

4 páginas.- 4 referencias.- Comunicación oral presentada en el 16th European Workshop on Lignocellulosics and Pulp (EWLP) Gothenburg, Sweden, June 28 – July 1, 2022, Enzymes can substitute harsh and energy-demanding chemical treatments for production of bio-based building blocks and products from wood processing. However, their properties need to be adapted to the extreme operation conditions (such as high T and pH) commonly used by these industries. Here, we summarize the main results obtained during the WoodZymes European Project (www.woodzymes.eu), which aimed to provide tailor-made extremozymes and extremozyme-based processes never assayed before in wood biorefineries. Novel extremophilic enzymes active on kraft lignin (laccases) and xylan (xylanases) were developed and produced at pilot or industrial scales. The enzymatic fractionation of kraft lignins using the METNINTM lignin refining technology, and the extremozyme-aided delignification and bleaching of kraft pulps were demonstrated at pilot scale. The resulting lignin and hemicellulose derived compounds were chemically characterized and applied as components of phenol-(lignin)-formaldehyde resins for wood panels and of polyurethane foams, or as papermaking additives. The new extremozymes were also applied to improve some of the latter applications. The techno-economic and environmental assessment of the new materials and processes, developed in WoodZymes project, showed that extremozyme-based processes led to clear benefits in energy savings during the refining of pulp or wood fibres, enabled lower addition of harsh chemicals (e.g. ClO2 during pulp bleaching), and resulted in a lower carbon footprint of the new bio-based products by substitution of fossil-derived components., WoodZymes project was funded by the Bio-based Industries Joint Undertaking (BBI JU) under GA 792070. The BBI JU received support from the EU’s H2020 research and innovation programme and the Bio Based Industries Consortium

32 p.-5 fig., Fungal laccases are multicopper oxidases with high catalytic versatility and low catalytic requirements (only O2 of the air is required for activation). Their high redox potential, especially of certain basidiomycete laccases, significantly increases their oxidation capacity compared to bacterial laccases. These characteristics together provide these enzymes with great potential for applications as biocatalysts in a range of synthetic or degrading reactions. We review here some of the main properties and biotechnological applications of fungal laccases, underlining their overexpression limitations for industrial scale application. We focus on the use of laccases as biocatalysts for organic synthesis, with special emphasis on polymer synthesis.

1 p., Los hongos Agaricomicetes responsables de la descomposición de la madera y de otros sustratos lignocelulósicos constituyen una valiosa fuente de enzimas degradadoras de lignina. Entre estas, las lacasas (oxidasas multicobre) presentan un notable potencial biotecnológico como biocatalizadores dada su capacidad de oxidar una amplia gama de compuestos aromáticos utilizando como único requisito el oxígeno. Las lacasas de especies saprótrofas de Agaricales, a pesar de ser excelentes fuentes de estas enzimas, han sido mucho menos estudiadas que las lacasas de Poliporales. En este trabajo, el gen de una nueva lacasa de Agrocybe pediades, que es secretada por el hongo durante la degradación de la lignocelulosa, fue sintetizado de novo y expresado en Saccharomyces cerevisiae utilizando evolución dirigida de la enzima y un péptido señal previamente mejorado. La caracterización de las nuevas variantes de lacasa obtenidas proporcionó nuevos conocimientos sobre la contribución de diferentes residuos de la enzima para modular la producción, actividad catalítica o el pH óptimo de las lacasas. La variante seleccionada, con dos mutaciones de diferencia con la lacasa nativa, mostró propiedades muy interesantes como biocatalizador, como la capacidad de oxidar una amplia gama de sustratos, incluyendo mediadores de alto potencial redox y colorantes orgánicos recalcitrantes, además de mayor actividad a pH neutro y alta tolerancia a ciertos inhibidores. Por último, demostramos la existencia de tres sitios de N-glicosilación en la lacasa y su distinto efecto sobre la secreción o la actividad catalítica de la enzima.

3 p.-1 fig., El grupo de Biotecnología para la Biomasa Lignocelulósica (https://bit.ly/2Fy0ITm) liderado por los profesores María Jesús Martínez y Ángel T. Martínez comenzó su andadura en la década de los 80 con el estudio (en colaboración con el Dr Aldo González) de los hongos saprófitos que producen el llamado “palo podrido” (Fig. 1) en la pluvisilva chilena (Martínez et al., 1995)., El estudio del material degradado y de los hongos implicados llevó a demostrar que la podredumbre de la madera tenía su origen en la degradación de la lignina, un polímero aromático difícil de descomponer que actúa como soporte estructural y protege a los polisacáridos de la pared celular vegetal frente al ataque de microorganismos., Durante estos primeros años se identificaron diferentes patrones de biodegradación y se seleccionaron hongos modelo con potencial biotecnológico para el aprovechamiento de la biomasa vegetal (Camarero et al., 1998). En estudios posteriores se determinó que su capacidad ligninolítica residía en la producción de oxidorreductasas extracelulares de tipo peroxidasa y oxidasa (incluyendo lacasas) capaces de actuar sinérgicamente sobre las unidades fenilpropano de la lignina y degradar también una variedad de compuestos aromáticos recalcitrantes.

34 p.-2 fig.-1 tab. Lignin Valorization: Emerging Approaches (Chapter 8). RSC Energy and Environment Series, In nature, white-rot fungi and some bacteria secrete powerful oxidative enzymes such as peroxidases and laccases to break down lignin and lignin products. These enzymes, together with different chemical mediators, form a chemo-enzymatic system for delignifying biomass so that the microbes can gain access to the polysaccharides. Ligninolytic oxidoreductases have been widely studied in terms of their unique reaction mechanisms and industrial applicability (largely related to production and stability issues). In the context of an integrated biorefinery, both ligninolytic organisms and ligninolytic enzymes may have a role to play for delignification and lignin valorization. This chapter reviews microbial degradation of lignin from an enzymatic perspective, discusses the recent discoveries and advances in a global context including genomic and structure/function information, and provides a perspective on the potential for its utilization in different green chemistry transformations., Funding of the INDOX (KBBE-2013-613549) and EnzOx2 (H2020-BBI-PPP-2015RIA-720297) EU projects, the NOESIS (BIO2014-56388-R) and GENO-BIOREF (BIO2017-86559-R) projects of the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness (MINECO), the latter ones co-financed by FEDER funds,and the RETO-PROSOT project of the Comunidad de Madrid (S2013/MAE-2907) are acknowledged.

2 p.- 1 fig., Nuestro grupo de investigación, coordinado por los Dres. Ángel T. Martínez y Mª Jesús Martínez, estáintegrado en el Departamento de Biología Medioambiental y en la Unidad IPSBB (Integrated Protein Science for Biomedicine and Biotechnology) del Centro de Investigaciones Biológicas (CIB) de Madrid, uno de los centros pluridisciplinares de mayor tradición en el área de Biología en España. El principal objetivo de nuestro trabajo es aplicar microorganismos, principalmente hongos filamentosos, y sus enzimas extracelulares, en procesos industriales destinados a la obtención de combustibles, materiales y productos químicos a partir de recursos vegetales renovables, tratando de contribuir al desarrollo sostenible de nuestra sociedad. Estas actividades se concretan en varios proyectos de investigación, estructurados en torno a dos grandes líneas que abordan la bioconversión de distintos componentes de la biomasa vegetal. Los componentes de la pared celular sobre los que trabajamos, por ser muy abundantes en la naturaleza, son los polisacáridos (celulosa y hemicelulosa) y la lignina., Los primeros son transformados gracias a la acción concertada de varias glicosil hidrolasas (principalmente endoglucanasas, endoxilanasas y gluco y xilosidasas, junto con LPMOs –lytic polysaccharide monooxygenases-), mientras que la degradación del polímero de lignina se lleva a cabo gracias a la intervención de un complejo sistema enzimático extracelular en el que las oxidorreductasas ligninolíticas (principalmente peroxidasas y lacasas) y otras enzimas auxiliares (GMC oxidasas/deshidrogenasas) juegan un papel fundamental. Los lípidos son otros de los componentes importantes en muchos residuos urbanos e industriales procedentes de biomasa vegetal y también pueden ser modificados y valorizados mediante el empleo de lipasas y esterol esterasas.

Póster presentado en OxiZymes 2016 (8th European Meeting on OxiZymes) 3–6 July 2016 (Wageningen) Netherlands.-- Ruiz-Dueñas, F. J. et al... [ ], the INDOX project (www.Indoxproject.eu) aims to provide relevant industrial case stories lo Demonstrate the efficiency of optimized oxidoreductase biocatalysts on targeted reactions, including intermediates for agrochemicals, APIs and dye-stuffs, as well as polymer precursors and functionalized polymers. The project flow comprises: (1) recovery of selective biocatalysts from fungal genomes and other sources; (2) improvement of their activity and stability by protein engineering to fulfil the operational and catalytic conditions required by the chemical industry; and (3) optimization of reaction conditions. Finally, the cost efficiency is evaluated. A diversity of genes were identified from genomes coding: (1) heme-peroxidases (heme-thiolate peroxygenases, dye-decolorizing perroxidases and classical peroxidases); (2) flavor-oxidases (vanillyl- alcohol and aryl-alcohol oxidases and cellobiose dehydrogenases); and (3) Cu-oxidoreductases (laccases and lytic polysaccharide monooxygenases). The most promising candidates were expressed in laboratory (and industrial) hosts and biochemically/structurally characterized. Rational enzyme engineering assisted by computational prediction was used to obtain binding, oxidative stability and operational improvements, while laboratory directed evolution allowed their adaptation to bioprocess requirements and the generation of more thermostable and alkalophilic enzymes. For developing industrially feasible bioprocesses, several parameters are being analyzed and optimized, including enzyme immobilization, two-liquid phase system, solvent free reactions and in situ peroxide generation, as well as bienzymatic cascade reaction using peroxygenases and oxidases. The above optimized enzymes and bioprocess are being applied for; (1) oxyfunctionalization reactions (of aliphatic and aromatic compounds) resulting in hydroxyl, epoxy, oxo and carboxy derivatives with different region- and stereo-selectivities; and (2) oxidation reactions, including coupling of phenols and other aromatics for polymers and dyes, production of chemical building blocks, cross-linking of feruloyl-arabinoxylans, and oxidative modification of aromatic compounds and lignin