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Quale variabile crescente fa in modo che dei gemelli monozigoti, che notoriamente condividono DNA identico, mostrino, dalla nascita alla vecchiaia, sempre maggiori differenze fra loro? Si potrebbe intuitivamente rispondere: il tempo e l’ambiente, o meglio il tempo passato a vivere in un diverso ambiente. Ma fino a qualche decennio fa nessun genetista avrebbe mai ammesso che l’interazione fra il DNA e l’ambiente potesse influenzare l’espressione genica anche non mutando il DNA. Oggi, invece, e ormai da circa 15 anni, è oggetto di studio, l’Epigenetica, secondo la quale possono esistere modificazioni chimiche ed ereditabili del DNA che non scaturiscono da mutazioni della sua sequenza nucleotidica. Il nostro DNA ci dà le informazioni per digerire o no determinati cibi ma anche può accadere che le molecole contenute nella dieta possono costituire “l’ambiente” che a contatto con i geni di alcune cellule ne influenzano l’espressione non in termini di mutazioni genetiche ma di modificazioni epigenetiche: questo costituisce un circuito a due direzioni, un “cross talk nutrienti-DNA-nutrienti” che dà origine a due scienze moderne, la Nutrigenetica e la Nutrigenomica oggi in piena esplosione di interesse nella comunità scientifica. L’interesse dei laboratori di Nutrigenomica si è concentrata sui fitochimici, composti contenuti in molti vegetali ad uso alimentare. Questi hanno mostrato molte proprietà biochimiche benefiche per la salute umana e recentemente sono state studiate anche per le loro proprietà nutrigenomiche suscitando grande entusiasmo specialmente perché, fra le varie, mostravano la capacità di influenzare il ciclo cellulare di cellule tumorali, inducendo la loro apoptosi, cioè la loro morte cellulare programmata. Negli ultimi 5-10 anni molto interesse si è concentrato sui cibi endemici della Sicilia e caratteristici anche di Ustica, facenti parte della ormai famosa “Dieta Mediterranea”, patrimonio immateriale dell’umanità (Dichiarazione UNESCO del 2010). Vale quindi la pena trattare una breve e non esaustiva antologia nutrigenomica di questi studi con particolare riferimento a quei prodotti della dieta caratteristici di Ustica: i capperi, le lenticchie, le melanzane, i fichi, i gelsi, l’aglio, il principe della dieta mediterranea l’olio di origine extravergine di oliva (EVOO) ed il fico d’india giallo-arancione. In particolare, studi condotti nel laboratorio universitario di cui sono coordinatore, hanno dimostrato che l’Indicaxantina, pigmento betalainico contenuto proprio nel fico d’india giallo arancione, ha, in vitro, effetti epigenetici e nutrigenomici su cellule di carcinoma di colon contribuendo a far cambiare alle cellule il loro fenotipo tumorale verso quello di enterocita-like normale. Infine, studi in corso non ancora pubblicati lasciano sperare che l’estratto di un frutto oleaceo siciliano è in grado di bilanciare, in alcune condizioni annullare, il danno epigenetico da arsenico, accumulato involontariamente da tutti noi, sia per il normale consumo di acqua potabile, sia per il consumo del tonno “ala lunga”, caratteristico di Ustica. Sebbene gli esperimenti in vitro sono abbastanza distanti dal poter avere una conferma in vivo o direttamente su soggetti o pazienti, si può certamente affermare, in termini epigenetici e nutrigenomici, quanto già pronunciato secoli addietro dalla saggezza popolare: variare la dieta assumendo vari cibi, tutti appartenenti alla dieta mediterranea, sicuramente aiuta l’organismo a beneficiare dell’effetto salutistico di alcune molecole in essi contenute anche quando si trovano in associazione ad altre molecole dannose delle quali sono in grado di abbatterne o ridurne gli effetti negativi. La Genetica ha abbandonato da tempo, con l’era genomica e post genomica del secolo attuale, la sua visione riduzionista del secolo scorso ed ha imparato che studiare un genoma senza le relazioni con l’ambiente equivale a vedere in bianco/nero un quadro a colori: se ne conoscono i tratti ma non si apprezzano tutte le sfumature in esso contenute, a volte più importanti: la Nutrigenomica ne è un chiarissimo esempio.

In Antartide sono presenti estreme condizioni ambientali e, fra i viventi, alcuni batteri, recentemente descritti da studiosi italiani, aventi la caratteristica di produrre molecole antibiotico-simili utili a curare soggetti affetti da fibrosi cistica. Studi condotti da esperti argentini e di altri paesi hanno portato alla scoperta di comunità batteriche con grosso potenziale biotecnologico sfruttabile nell’industria alimentare, tessile, dei biocarburanti ed anche utili come degradatori di idrocarburi da usare in protocolli di ripristino di suoli contaminati; anche lieviti e virus antartici sono di interesse biotecnologico. In conclusione l’Antartide è una miniera ecosostenibile di risorse a potenziale biotecnologico. Esistono competenze appropriate in Italia, in Argentina ed in altri paesi dell’America latina per poter studiare e applicare queste biorisorse. Tramite un coordinamento ed opportuni finanziamenti, dunque, si potrà fornire un ritorno, non solo scientifico ma anche economico, a quei paesi che intenderanno supportare queste ricerche.

A sessant’anni da quando Francis Crick enunciò il “dogma centrale della biologia molecolare” molte scoperte e nuove frontiere si sono avvicendate sulla questione “funzionale” di un genoma, cioè di come un DNA “parla” ai viventi. Oggi è abbastanza noto come un genoma “è”, ed occuparsi solo di questa questione strutturale ormai è sicuramente molto riduttivo, almeno sicuramente per quello umano. È invece il goal standard di questi anni scoprire come e quando un genoma si esprime, come funzio-nalmente traduce il suo messaggio rendendo questo visibile nei fe-notipi dei viventi, a prescindere dalla sua sequenza primaria di basi azotate. Ne consegue che il codice genetico, ancora valido e quasi universale fra i viventi, rappresenti, oggi, solo una piccola parte di come realmente un genoma si esprime e che esistono almeno altri 2 livelli ad oggi conosciuti di organizzazione genomica che a stesse sequenze nucleotidiche di DNA può associare espressioni geniche diverse: l’epigenetica, con i piccoli RNA oggi alla ribalta, l’architettura nucleare e la localizzazione cromosomica in un nu-cleo in interfase. Vengono descritti esempi sperimentali, paragoni didattici e percorsi cognitivi facilitati. Sixty years after Francis Crick enunciated the "Central dogma of molecular biology" many discoveries and new frontiers have taken places on the "functional" question of a genome, that is, how a DNA "speaks" to the livings. Today it is quite known as a genome "is", and discuss only with this structural question is cer-tainly very simplistic, at least certainly for the human DNA. It is instead the standard goal of these years to discover how and when a genome expresses itself, how it functionally translates its own message, making this visible in the phenotypes of the living, regardless of its primary sequence of nitrogenous bases. It follows that the genetic code, still valid and almost universal among the livings, today represents only a small part of how a genome really is expressed. Today, there are at least two other known levels of genomic organization which at the same nucleotide sequences can associate different genetic expressions: i) epigenetics, with small RNAs now in the limelight, ii) nuclear architecture and chromosomal localization in an inter-phase nucleus. Experimental examples, educational comparisons and facilitated cognitive paths are described.

Introducción: La hepatotoxicidad inducida por fármacos antituberculosis (HIFA) es una reacción adversa grave y potencialmente fatal del tratamiento de la tuberculosis (TB). Tres de los cuatro fármacos utilizados como terapia de primera línea (isoniacida, rifampicina, pirazinamida), han sido asociados a HIFA. Estudios sobre farmacogenética de la TB han asociado el desarrollo de HIFA con variaciones en genes de enzimas que metabolizan estos fármacos. Objetivos: Debido a que en Argentina la TB es una enfermedad re-emergente y a la elevada prevalencia de HIFA encontrada en pacientes internados, nos propusimos evaluar la posible asociación de factores ambientales y variantes genéticas en enzimas que metabolizan fármacos anti-TB con el desarrollo de HIFA. También, investigar las posibles interacciones gen-gen y gen-ambiente y su asociación con el desarrollo de HIFA, en una población de pacientes con TB hospitalizados de la Ciudad de Buenos Aires. Métodos: Se estudiaron 345 pacientes con TB tratados con fármacos anti-TB (96 con HIFA). Se analizaron variables clínicas y demográficas tomadas en fichas de datos. Las variaciones genéticas en las enzimas N-acetiltransferasa 2 (NAT2), citocromo P450 2E1 (CYP2E1), glutathione S-transferasa theta 1 (GSTT1) y glutathione S-transferasa mu 1 fueron detectadas por reacción en cadena de polimerasa (PCR), secuenciación o PCR-RFLP. Para comparar las posibles variables predictoras entre pacientes con y sin HIFA se utilizó un análisis de regresión logística binaria. Para estudiar las interacciones genéticas y ambientales en asociación con HIFA se utilizó el método de reducción de la dimensionalidad multifactorial (MDR). Resultados: Este estudio mustra que ser acetilador lento (AL) de NAT-2 [OR (IC95%) = 3,02 (1,82-5,00); p

Melatonin, oral-used in sleep disorders treatment, is the main secretory product of the pineal gland and in gastrointestinal tract (GIT) in which it has a local physiological poorly characterized role. Intraperitoneally-administered high dose has anti-inflammatory effects in experimental model of Inflammatory Bowel Diseases but the mechanisms is unclarified. Literature data show that melatonin inhibits the activation of neutrophils and monocytes and it is therefore conceivable that it has also inhibitory effect on mucosal inflammatory cell activation. The aim of this study was to evaluate in an in vitro model of inflamed intestinal epithelium the potential protective effects of melatonin. Differentiated monolayers of intestinal epithelial Caco-2 cells, in which the inflammatory response was induced by interleukin-1β and interferon-γ, were exposed at concentrations of melatonin in the range from 1 nM to 50 M. We also exposed differentiated monolayers to melatonin in presence of luzindole, an antagonist of melatonin membrane receptors, to determine whether or not potential effect of melatonin involve membrane receptors. Our results clearly show for the first time that melatonin decreased in release and expression some inflammatory mediators, including nitric oxide, interleukin-6, interleukin-8, cyclooxygenase-2, and that the treatment is associated with a reduced activation of the nuclear factor-B. Moreover, luzindole did not reverse the melatonin inhibition of stimulated- IL-6 release, indicating that the melatonin protective effect may be membrane receptor-independent. Our findings suggest that assumption of pharmaceutical preparation of melatonin can also exert beneficial effects to gastrointestinal physiology.

L’Antartide è un ambiente in cui sono presenti contemporaneamente estreme condizioni di temperatura, luce, umidità e vento. La biosfera locale presenta una notevole biodiversità ed una serie di fenomeni unici usati come soluzioni per poter vivere a queste condizioni. La componente più rappresentata è quella microbica e batterica in particolare; sono stati infatti recentemente descritti, da gruppi di ricerca dell’Università di Messina in collaborazione con l’Università di Palermo, batteri in grado di produrre delle molecole antibiotico-simili con spiccate proprietà batteriostatiche nei confronti di ceppi opportunisti particolarmente temibili in caso di infezioni in soggetti affetti da Fibrosi Cistica. Studi condotti da esperti Argentini e di altri paesi dell’America latina hanno portato alla scoperta di altre comunità batteriche con grosso potenziale biotecnologico sfruttabile nell’industria alimentare e dei mangimi animali, tessile, dei biocarburanti, delle sintesi chimiche e biosintesi industriale. Altri studi hanno permesso di conoscere batteri antartici efficienti degradatori di idrocarburi poli-aromatici da usare in protocolli di ”bioremediation” del suolo ed infine batteri in grado di produrre una quantità di acidi grassi del tipo omega-3, oggi molto usati come integratori alimentari, con una efficienza tale da risultare competitivi rispetto all’estrazione dal grasso di pesce, ritenuta non più ecosostenibile. L’Antartide è anche fonte di avanzamento di conoscenza in scienza di base; sono stati, infatti, recentemente descritti virus a RNA che forniscono una valida spiegazione alla biodiversità microbica di questi luoghi grazie alla loro straordinaria capacità di mutare il proprio acido nucleico ad una velocità notevole e di trasferire queste variazioni ai viventi che essi infettano. Sono stati anche di recente descritti lieviti antartici in grado di produrre “Astaxantina”, un efficace carotenoide usato con successo come antiossidante negli impianti di acquacultura. In conclusione l’Antartide rappresenta una miniera ecosostenibile di risorse a potenziale biotecnologico. La letteratura specifica dimostra che esistono competenze appropriate in Italia, in Argentina ed in altri paesi dell’America latina per poter studiare e applicare queste biorisorse. E’ auspicabile un coordinamento che possa attrarre finanziamenti-investimenti che, oltre a creare nuova conoscenza, fornirà un ritorno in termini anche economici a quei paesi che intenderanno supportare queste ricerche.

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Siamo diversi o siamo uguali? Questa apparentemente banale domanda posta a soggetti non esperti di biologia e genetica ha tendenzialmente sempre dato una risposta a favore dell’uguaglianza. Molte delle pratiche mediche sono state consolidate negli anni, sia in tipologia che in posologia, sull’assioma dell’uguaglianza di effetti e di controindicazioni che farmaci somministrati potevano dare ad un insieme di soggetti. Anche determinati stili di vita sono, in un primo momento, misurati da chiunque sull’assioma dell’uguaglianza: “se chi fuma non sta male, il fumo non farà male neanche a me” era il sillogismo in vigore fino agli anni 90.La percezione del gusto, nei vertebrati e nella specie umana, è sotto controllo genetico. Quando qualcuno disse “de gustibus non disputandum est” (sui gusti non si può discutere) non poteva mai immaginare che qualche migliaio di anni dopo la Genetica avesse reso non vera questa massima. Sul gusto non solo si può discutere ma oggi ci si fa addirittura ricerca a livello universitario ed internazionale. Proprio il laboratorio da me oggi coordinato si è occupato per anni di genetica del gusto ed ha preso parte ad uno studio mondiale, coordinato dal prof. Drayna (USA), che è culminato di recente con una pubblicazione sulla rivista internazionale del gruppo di Nature denominata “Scientific Reports”. Attraverso la genetica del gusto può essere dimostrata la variabilità genetica stessa. Avendo dimostrato la sussistenza evoluzionistica della variabilità genetica forse occorre un po’ ripensare alle frettolose e certamente non scientifiche teorie secondo le quali meglio essere uguali che diversi. La storia dell’uomo ha visto aumentare la variabilità genetica per migrazione di popoli e questo ha generato per l’uomo di oggi una tenore di salute genetica abbastanza alta. Quando si grida allo scempio per l’azzeramento della biodiversità di alcune specie vegetali, dovuto alle monocoltivazioni intensive, si fa bene, ma si dovrebbe parallelamente anche auspicare che la variabilità genetica della specie umana, quanto meno rimanga tale o possa aumentare. Infatti, visto che una forte diminuzione della variabilità in alcune specie animali è stata accompagnata dall’estinzione, cosa ci aspetteremmo che possa accadere di diverso nella nostra specie?

Acute Myeloid Leukaemia (AML) is frequently associated to normal karyotype and DNMT3A mutations (R882). Since we previously demonstrated distinctive miRNA expression in some AML groups, we study 384 miRNA in 9 selected DNMT3A-mutated NK-AML patients. Comparing these data with our previous results obtained in 31 DNMT3A-unmutated AML, we focused on a significant up-regulation of miR-155, miR-29a, miR-196b and miR-25. We investigated expression of these miRNAs in additional 24 DNMT3A-mutated AML patients and we confirm the up-regulation of miR-155, miR-29a and miR-196b; in particular, we judged very interesting the over expression of miR-29a since is known to directly target DNMT3A, TET1 and TDG mRNAs. Evaluating the expression levels of these targets in 17 AML DNMT3A-mutated patients, we revealed a no significant differences in expression of DNMT3A and TDG but a significant down-regulation of TET1. These data suggest that miR-29a acts as DNA methylation-regulator: in presence of DNMT3A activating mutations and TET1 down-regulation it may probably cause a perturbation of DNA methylation. In fact, analyzing the methylation of the bone marrow genomic DNA from 3 DNMT3A-mutated and 3 DNMT3A-unmutated cases by Methylation Sensitive Arbitrarily Primed-PCR, we found a genomic hypermethylation of DNMT3A-mutated cells compared to the unmutated ones. How DNMT3A mutations contribute to leukemogenesis is not yet well characterized. Uncovering how DNMT3A mutations affect DNA methylation and epigenetic regulation of gene expression may have important implications in treatment selection because DNA hypomethylating agents are increasingly used in AML therapies, and response to these drugs may be affected by DNMT3A changed function.

Inflammation is a complex physiological response that requires the activity of a sophisticated regulatory network involving the activation of specific genes for defense, tissue repair and remodeling. Although transcriptional activation has been shown to be critical in the regulation of inflammatory genes (1) the role of epigenetic phenomena in the modulation of the inflammatory response is now emerging (2). Specifically, it has been recently reported that proinflammatory stimuli induce DNA demethylation in the interleukin IL-1 promoter of human articular chondrocytes (3). IL-1 cytokine, among several proinflammatory agents, represents an essential player in the inflammatory conditions of the gut (4): functioning as the strongest signal transduction to NF-kB, IL-1 increases in intestinal paracellular permeability and over-expression of proinflammatory genes (5). In this tissue, moreover, inflammatory response is crucial to maintain its structural integrity and function, thus, alteration and deregulation of inflammatory pathways contribute to tissue damage and ulceration, and are pivotal factors in the pathogenesis of several inflammatory gut diseases. In the present study we evaluate both wide-ranging and gene-specific epigenetic changes in the inflammatory response of Caco-2 cells differentiated into intestinal epithelial cells and exposed to the inflammatory actions of IL-1β. Our results clearly show that IL-1induces changes in the DNA methylation either at genome and gene level and that the local methylation changes are induced in two pro-inflammatory genes that are IL-1-regulated. In particular, we show that a cell exposure to IL-1β for 24 h induces, in a dose-dependent manner, hypomethylation of genomic DNA in respect to untreated cells. We also observe a reduced DNA methyltransferases activity of cell lysates obtained from IL-1 treated cells. Finally our data show that IL-1 is able to induce hypomethylation of specific CpG sites in IL-6 and IL-8 genes. These preliminary results suggest that IL-1 in intestinal epithelial cells is able to act as an epigenetic modulator towards the entire genome and specific genes. Modulation of epigenetic changes in inflammation may provide a new “reading frame” of the inflammatory diseases molecular basis. Since epigenetic modifications are potentially reversible, a thorough understanding of these changes during inflammatory response opens opportunities to develop efficient agents for specific targets.

Tuberculosis (TB) remains a major worldwide health problem with an estimated of 9.0 million of new cases and 1.5 million of deaths in 2013. Anti–TB drug-induced hepatotoxicity (ATDH) is considered the most serious and prevalent adverse drug reaction in TB treatment. Isoniazid (INH), one of the first-line drugs against TB, is more commonly associated to ATDH and, it is well known that the enzyme Citochrome P450 2E1 (CYP2E1) is involved in INH metabolism. It has been found that variable number tandem repeat (VNTR) polymorphic sequences in the promoter region regulate negatively CYP2E1 gene transcription: consequently, it could be put in relationship with adverse TB-drugs reactions. In this report we for the first time show advanced investigations regarding the association between CYP2E1- VNTR and ATDH; the study started last year also thank to a small grant by CUIA but was widely extended with other funds. We studied genotypic frequency distributions of the CYP2E1-VNTR (using PCR-RFLP methodology) in a cohort 294 TB patients treated with anti-TB drugs: 167 were Argentines (130 controls without ATDH and 37 cases with ATDH) and 127 were Bolivians (83 controls without ATDH and 44 cases with ATDH). Chi-squared test was used to compare proportions: a value of P

Different individuals possess slightly different genetic information and show genetically-determined differences in several enzyme activities due to genetic variability. Following an integrated approach, we studied the polymorphisms and DNA methylation of the 5′ flanking region of the metabolizing enzyme CYP2E1 in correlation to its expression in both tumor and non-neoplastic liver cell lines, since to date little is known about the influence of these (epi)genetic elements in basal conditions and under induction by the specific inductor and a demethylating agent. In treated cells, reduced DNA methylation, assessed both at genomic and gene level, was not consistently associated with the increase of enzyme expression. Interestingly, the Rsa/Pst haplotype differentially influenced CYP2E1 enzyme expression. In addition, regarding the Variable Number of Tandem Repeats polymorphism, cells with A4/A4 genotype showed a greater expression inhibition (ranging from 20% to 30%) compared with others carrying the A2/A2 one, while those cells bringing A2/A3 genotype showed an increase of expression (of 25%, about). Finally, we demonstrated for the first time that the A2 and A3 CYP2E1 alleles play a more important role in the expression of the enzyme, compared with other (epi)genetic factors, since they are binding sites for trans-acting proteins. In conclusion our data contributes to define a hypothetical model of regulation of the expression of this enzyme. Clarifying the complex regulation of CYP2E1 enzyme expression, either by genetic or epigenetic elements, will give useful topics in pharmacogenomics, for typing people regarding its metabolizing capability and therapy response.

Background and Aims: Hepatic enzyme CYP2E1 is involved in the metabolism of a number of exogenous and endogenous substances (i.e. ethanol, drugs and chemical carcinogens). Being polymorphic, CYP2E1 gene can give different xeno-metabolic capabilities in a population and it is well known that inadequate or no enzymatic deactivation of xenobiotics could induce an increased susceptibility to disease and cancer. In particular, one of the 5 -flanking region polymorphisms, able to differentiate CYP2E1 gene transcriptional activity, is caused by the appearance/disappearance of RsaI and PstI restriction sites, which generates two different alleles, namely *C1(Rsa+/Pst−) and *C2(Rsa−/Pst+) respectively, reported to be in complete linkage disequilibrium. Methods: To confirm the existence of a correlation between some particular CYP2E1 genotypes/haplotypes and hepatocarcinoma, we determined CYP2E1 PstI/RsaI genotypes/haplotypes by RFLP-PCR in a cohort of central western Sicily hepatocarcinoma patients and in a population of healthy students from the same geographic area. Results: In hepatocarcinoma patients, modal genotype association was Rsa++/Pst−−, corresponding to CYP2E1 *C1/*C1 haplotype, whereas the Rsa+−/Pst−+ association, equivalent to CYP2E1 *C1/*C2 haplotype, resulted to have the lowest frequency both in patients and in controls. Moreover, both in patients and in controls, noncanonical genotype associations were frequent and arose from a no-linkage disequilibrium between the two polymorphic sites. Other authors reported this finding as a rare occurrence. Thus, from analysis of only one restriction site, Rsa++ genotype was approximately 1.5-fold more frequent in patients than in controls, and the non-canonical Rsa+− genotype was found relatively frequent in patients. Moreover, HuH7 and HA22T transformed hepatocarcinoma cell lines also showed the Rsa+− genotype. Conclusions: These results suggest that the presence in CYP2E1 genotype of at least one allele with an Rsa I restriction site is correlated with hepatocarcinoma. As this site is known a consensus sequence for some specific CYP gene transcription factors, like HNF-1, it may be supposed that a single nucleotide polymorphism can alter the possibility of HNF-1 to bind CYP2E1 promoter. This could determine a marked change in the transcriptional activity of the gene, incompetence in xenobiotic metabolism or in toxic substance deactivation and an increased susceptibility to neoplastic diseases, such as hepatocarcinoma.

The mechanisms by which arsenic-induced genomic instability is initiated and maintained are poorly understood. In previous studies long-term progression of chromosomal instability was typified by increasing aneuploidy in Chinese hamster V79 and human keratinocyte cells treated with arsenite for a 24 hr exposure period followed by growth in arsenic-free medium for 40-120 cell generations. In the current study the role of progressive DNA methylation changes was evaluated in long-term cell cultures after brief arsenite treatments as above. We have found altered genomic methylation patterns in cells that were briefly exposed to arsenic with evidence for widespread dysregulation of CpG methylation that persists for many population doublings after the treatment. In V79 cell populations, progressive aneuploidy increases were notable by 50 cell generations after a 24 hr exposure to 1-10 uM arsenite. Dicentric chromosomes and/or telomeric associations, as well as complex chromosome rearrangements, occurred by 90 cells generations post treatment; and mutator and transformed phenotypes began to appear thereafter. This increasing genomic instability correlated with modifications of global DNA methylation patterns in V79 cells evaluated by 5-methylcytosine antibody binding and MeSAP-PCR. The results show that short-term exposure to arsenite induced an apparent genome hypomethylating effect within a short time after exposure. In identical protocols using human HaCaT keratinocytes exposed to low doses of arsenite (0.05-0.1 M) for 24 hr, genomewide methylation levels were measured by LINE1 pyrosequencing and gene-specific methylation status was assessed by Methylation-Specific-PCR for up to 40 generations post exposure. Global demethylation following treatment was supported by preliminary LINE-1 studies. Moreover, the study of gene-specific MSP and determination of expression levels by RT-PCR of several genes (p16, hMLH1, hMSH2, DNMT1, DNMT3a and DNMT3b) demonstrated that hMSH2 gene was epigenetically regulated by arsenite and that down regulation of DNMT3a and DNMT3b genes occurred in an arsenite dose-dependent manner. The results reported here demonstrate that acute 24 hr arsenic exposure promptly induces genome wide DNA hypomethylation, and support the hypothesis that the cells continue to undergo epigenetic reprogramming both at the gene and genomic levels in the absence of further arsenite treatment; thus likely contributing to long-lasting genomic instability that manifests as aberrant chromosomal, mutator and cell transformation effects.

Mitosis is regulated by checkpoints that delay mitotic progression when chromosome segregation errors occur. Inaccuracy in checkpoint processes can lead to chromosome instability both in number and structure (CIN). Arsenic is reported to induce CIN by perturbing mitotic spindles and checkpoints, however, its carcinogenic mechanisms are poorly understood. We previously studied the long-term progression of chromosomal instability in V79 cells treated acutely with arsenite (10 M, 24 hr) followed by growth in arsenic-free medium for 120 cell generations, and found time-dependent increase of aneuploid cells. Here, we treated V79-derived G12 cells with sub-lethal doses (0.1-1.0 µM) of arsenite for 10 days followed by growth in arsenite-free medium for 40 cell generations. Cytogenetic analysis at the end of treatment showed concentration-dependent increases in the frequency of aneuploid cells that was even higher after 40 cell generations. Furthermore, the mitotic index (MI) of arsenite-exposed cells was higher than untreated cells at the end of the 10-day treatment or after 40 cell generations without arsenite. Surprisingly, we found that submicromolar 10-day arsenic exposure induced a large amount of cells in anaphase with premature centromere division. These aberrant mitotic figures dramatically increased after 40 cell generations. Taken together, these results raise the possibility that chronic exposure to sub-lethal arsenic doses induces bypass of the spindle assembly checkpoints and may be mechanistically involved in the induction of cell transformation.

Numerosi studi confermano l’associazione tra fumo di sigaretta e insorgenza di patologie-polmonari, cardiovascolari e tumori. Il fumo, infatti, contiene diversi composti mutageni c cancerogeni. Premesso che non esiste una sigaretta sicura, è comunque possibile attuare strategie per caratterizzare e ridurre il rischio. In questo studio, abbiamo utilizzato test in vitro per investigare i possibili meccanismi d’azione del condensato di sigaretta (CSC), ovvero la frazione particolata del fumo, assorbita nei polmoni del fumatore e successivamente metabolizzata. Analisi precedenti avevano dimostrato che il CSC, dopo 24h di trattamento induce decremento della vitalità delle cellule Swiss3T3 (IC50 = 130 µg/ml), inibizione dell’efficienza di clonaggio (circa il 60% a`50 µg/ml) e attivazione delle caspasi già a partire dalla prima dose testata (25 µg/ml). La natura degli effetti genotossici del CSC è stata analizzata con il Comet assay che ha evidenziato la capacità del CSC di indurre rotture a singolo e doppio filamento del DNA, dopo trattamenti per 90min e 3 h, a partire dalla dose di 100 µg/ml (p

CSC is a complex chemical mixture containing about 4800 compounds, many of them have cytotoxic and mutagenic activities on mammalian cells. Most of these compounds are able to interact with DNA at different levels. Cells may respond to DNA damage by following different pathways, such as the DNA repair processes and the cell cycle and DNA damage checkpoint activation. To the aim to evaluate the biological effects of CSC on cells, alkaline comet assay and flow cytofluorimetry were used to examine DNA damage/repair and cell cycle progression. All experiments were performed by using CSC from standard cigarettes in the range of doses 30-180g/ml and Swiss 3T3 murine fibroblasts. Results obtained by comet assay showed that CSC induces DNA strand breaks, significantly higher after 90 min of treatment than 3hrs. This difference, particularly evident at 100 and 150g/ml, it is probably due to a fast repair that can be explained by the oxidative component of the DNA damage CSC-induced. To clarify these results, further investigations on the evaluation of the oxidative damage are in progress by applying two different methods. one is the detection of the oxidised bases on the DNA by using the modified protocol of Comet assay with FPG and endo III, the second is the analysis of the intracellular levels of ROS, measured as the ability of treated cells to oxidise a fluorogenic dye, is going to be carried out. Previous results of long-term survival showed that cells lose their ability to form colonies in dose-dependent manner, after 24hrs of CSC treatment and 168 hrs of culture. However, the cytofluorimetric analysis showed that a fraction of cells, blocked in G2/M immediately after 24hrs of treatment, are gradually granted to continue the cell cycle, after incubation for further 6hrs in medium CSC-free. Further investigations on the cell cycle alteration are on going.

E’ stato dimostrato che la diversa capacità di metabolizzare alcune sostanze è la conseguenza di differenze geneticamente determinate nelle attività di alcuni enzimi. In particolare, il citocromo P450 CYP2A6 ha diversi livelli di espressione interindividuali ed interetnici a causa di polimorfismi genetici; metabolizza circa il 70-80% della nicotina e ciò determina in alcune popolazioni una dipendenza interindividuale più o meno elevata dal fumo di sigaretta. Più in dettaglio, individui con alleli CYP2A6 con elevata attività metabolizzante (CYP2A6*1) avranno una maggiore dipendenza dalla nicotina, poiché questa, essendo metabolizzata velocemente, rimane nell’organismo per breve tempo: di conseguenza questi individui fumeranno molte sigarette per sopperire alla carenza di nicotina. Al contrario, individui con alleli CYP2A6 che codificano per un enzima con bassa attività metabolizzante (CYP2A6*2, ad esempio) avranno una minore dipendenza dalla nicotina in quanto questa, essendo metabolizzata più lentamente, rimane nell’organismo per più tempo e questa condizione indurrà il soggetto a fumare meno. Allo scopo di verificare che la correlazione fra genotipo CYP2A6 e dipendenza dal fumo di sigaretta sia valido anche nella popolazione della Sicilia Occidentale, abbiamo analizzato la distribuzione di alcuni alleli CYP2A6 in 39 soggetti donatori abituali di sangue ai quali, dopo consenso informato, è stato somministrato un questionario sullo stile di vita con particolare riferimento all’abitudine al fumo. Il DNA, estratto da linfociti di sangue periferico mediante il sistema FASST DNA Releaser, è stato utilizzato come stampo in una Multiplex-PCR per amplificare una regione da 1717 bp comprendente gli esoni 1-4 del gene CYP2A6. Successivamente il prodotto della Multiplex-PCR è stato utilizzato come stampo per reazioni Multiplex-Nested-PCR, nelle quali sono state separatamente utilizzate coppie di oligonucleotidi innesco specifiche per l’allele selvatico CYP2A6*1 e per l’allele mutato CYP2A6*2. In queste condizioni è stato amplificato un frammento da 414 bp compreso fra gli esoni 3 e 4 del gene CYP2A6 nel quale può ricadere la trasversione TA che caratterizza l’allele mutato CYP2A6*2. In tal modo è stato possibile determinare il genotipo CYP2A6 dei soggetti esaminati visualizzando i prodotti di amplificazione su gel di poliacrilammide 12% in condizioni non denaturanti. I nostri risultati indicano che il genotipo omozigote CYP2A6*1/*1 è presente soltanto in soggetti fumatori, che tutti i soggetti non fumatori presentano il genotipo eterozigote CYP2A6*1/*2 e che nessun soggetto presenta genotipo CYP2A6*2/*2; inoltre, genotipi con delezione totale o parziale del gene CYP2A6 sono presenti tanto in fumatori che in non fumatori. Ciò dimostra che polimorfismi del gene CYP2A6 sono in correlazione alla dipendenza dal fumo anche nella popolazione della Sicilia Occidentale e suggerisce che alla definizione di questo fenotipo concorrano fattori genetici ai quali si affiancano fattori di tipo comportamentale-sociale. Studi più estesi sono auspicabili per definire le frequenze genotipiche del gene CYP2A6 dal momento che diverse configurazioni alleliche di questo gene, modulando la dipendenza dal fumo, indirettamente definiscono la suscettibilità individuale a contrarre alcune malattie come il cancro.

Vinyl monomer acrylamide (AA), generally used in numerous industrial applications, has been classified by the International Agency for Research on Cancer (IARC) as “probably carcinogenic to humans” (group 2A), but the molecular mechanism underlying its genotoxicity has not fully known. Previously, we observed that Acrylamide (AA) was able to antagonize in vivo the citotoxicity of well know poison etoposide suggesting that topoisomerase II (Topo II) activity was affected by AA. In the current studies we investigated the inhibitory activity of acrylamide toward topoisomerase II by performing tests in vitro.