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Glycoengineering by N- and/or O-hyperglycosylation represents a procedure to introduce potential sitesfor adding N- and/or O-glycosyl structures to proteins with the aim of producing biotherapeutics withimproved pharmacodynamic and pharmacokinetic properties. In this chapter, a detailed description of thesteps routinely performed to generate new proteins having high content of N- and/or O-glycosyl moietiesis carried out. The rational strategy involves the initial stage of designing N- and/or O-hyperglycosylatedmuteins to be expressed by mammalian cells and includes the upstream and downstream processing stagesnecessary to develop hyperglycosylated versions of the proteins of interest with the purpose of beginningthe long road toward producing biobetters. Fil: Gugliotta, Agustina. Universidad Nacional del Litoral. Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas. Laboratorio de Cultivos Celulares; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Santa Fe; Argentina Fil: Ceaglio, Natalia Analia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina Fil: Etcheverrigaray, Marina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Santa Fe; Argentina. Universidad Nacional del Litoral. Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas. Laboratorio de Cultivos Celulares; Argentina Fil: Kratje, Ricardo Bertoldo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina Fil: Roggero, Marcos Enrique. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina

Fil: Ceaglio, Natalia Analía. Universidad Nacional del Litoral. Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas; Argentina. El interferón alfa humano comprende una familia de proteínas que bloquean la infección viral e inhiben la proliferación celular. La citoquina producida en bacterias se encuentra aprobada para su uso clínico en el tratamiento de diversas patologías, siendo el principal problema su rápida eliminación del torrente sanguíneo. En el presente trabajo de Tesis se desarrolló exitosamente una estrategia de glicoingeniería mediante la introducción de sitios potenciales de N-glicosilación en la secuencia aminoacídica del rhIFNalfa2b, lo que permitió incrementar su vida media plasmática y, en consecuencia, su actividad biológica in vivo. Inicialmente, se seleccionaron las mutaciones más adecuadas para construir derivados del rhIFNalfa2b con un número variable de sitios de N-glicosilación. Conforme al aumento del número de sitios incorporados, se observó un incremento progresivo de la masa molecular de las muteínas. Por otra parte, la actividad biológica específica antiviral y antiproliferativa de las mismas disminuyó gradualmente en forma concomitante con la adición de sitios consenso. La farmacocinética de todas las variantes del rhIFNalfa2b en ratas demostró un incremento del tiempo de vida media y una disminución del clearance plasmático en forma concomitante con el agregado de sitios de N-glicosilación. De esta manera, el IFN con cuatro sitios de glicosilación (IFN4N) exhibió una vida media 25 veces superior y un clearance 20 veces inferior con respecto a la molécula no modificada. Además, a pesar de su menor actividad biológica in vitro, el IFN4N demostró un marcado incremento de su actividad antitumoral in vivo, determinada como su capacidad de inhibir el crecimiento de tumores en ratones inmunocomprometidos. Human alpha interferons comprise a family of closely related proteins that block viral infection and inhibit cell proliferation. Bacterially produced hIFNalpha2b has been approved for the treatment of a great variety of human diseases, but the clinical use of this cytokine has been restricted due to its short circulating half life. In the present Thesis work a successful glycoengineering strategy was developed through the introduction of potential N-glycosylation sites in the rhIFNalpha2b amino acid sequence, which allowed us to increase the cytokine´s plasma half-life and, in turn, its in vivo biological activity. Taking into account the carbohydrate content and the preservation of the biological activity, five amino acid mutations were chosen to construct rhIFNalpha2b derivatives with a variable number of N-glycosylation sites. Successive increases in size were observed after each addition of a functional consensus sequence. On the other hand, antiviral biological activity of rhIFNalpha2b was gradually reduced with the incorporation of new glycosylation sites. Pharmacokinetic experiments showed a 25-fold increase in the elimination half life and a 20-fold decrease in the systemic clearance rate of the IFN variant with four N-glycosylation sites (4N-IFN) compared to the non-glycosylated rhIFNalpha2b following subcutaneous administration to rats. Moreover, in spite of its lower in vitro activity, 4N-IFN showed a markedly enhanced in vivo antitumor activity in human prostate carcinoma implanted in nude mice. Universidad Nacional del Litoral Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas

Fil: Rodríguez, María Celeste. Universidad Nacional del Litoral. Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas; Argentina. La enfermedad de Fabry es un desorden metabólico asociado al cromosoma X en forma recesiva, producido por una alteración en el catabolismo de los esfingolípidos como resultado de la actividad defectiva de la enzima alfa-Galactosidasa A. La Terapia de Reemplazo Enzimático, está disponible para el tratamiento de la enfermedad de Fabry desde el año 2001. Se han desarrollado dos presentaciones comerciales: agalsidase beta (Fabrazyme) y agalsidase alfa (Replagal). Uno de los principales inconvenientes de este tipo de terapias es su elevado costo, el número reducido de pacientes y la necesidad de administración de elevadas y repetidas dosis. En el presente trabajo se desarrolló una tecnología de producción de la enzima alfa Galactosidasa A humana recombinante (rhalfaGAL) para uso terapéutico. Inicalmente, se llevó a cabo el desarrollo de métodos analíticos que permitieran el seguimiento del proceso de producción y el aseguramiento de la calidad del producto final. Posteriormente, se generaron líneas y clones recombinantes en células CHO-K1, obteniendo clones con valores de productividad específica de hasta 8 veces mayor que los valores reportados para el clon AGA5.3 (plataforma empleada para la producción de Fabrazyme). Luego, se desarrolló el protocolo de purificación a partir de sobrenadante de cultivos, obteniendo luego del segundo paso una pureza de aproximadamente 98% y una recuperación del 60%. La caracterización fisicoquímica y bioquímica, evidenció similares características a Fabrazyme, con un perfil de glicosilación mejorado. Todos los resultados obtenidos demuestran que el bioproceso desarrollado representa una alternativa interesante para la producción de la enzima rhalfaGAL para uso terapéutico. Fabry’s disease is an X-linked recessive metabolic disorder caused by deficiency in lysosomal alpha-Galactosidase A, producing an alteration in the catabolism of sphingolipids. Enzyme replacement therapy, in which the defective enzyme is replaced by an exogenous chronic administration of a recombinant variant, has been available for Fabry disease treatment since 2001. Currently, two commercial formulations have been developed: agalsidase beta (Fabrazyme) and agalsidase alfa (Replagal). However, this approach presented some disadvantages related to the high cost of the treatment, small number of patients and the need of repeated administration of large amount of the enzyme. In the present thesis work a production technology of the recombinant human alpha Galactosidase A (rhalphaGAL) enzyme for therapeutic use was developed. First, the optimization of reliable analytical methods was developed, in order to allow the tracing of the production process and the quality assurance of the final product. After that, recombinant cell lines and clones were developed in CHO-K1 cells, achieving up to eightfold higher productivities compared to the ones corresponding to AGA5.3 clone (the actual platform for the production of the commercially available product Fabrazyme). Later, a purification protocol was developed. The enzyme was purified from suspension culture supernatants, obtaining after the second step, 98% purity and 60% yield. Importantly, the purified enzyme evidenced biochemical and physicochemical properties similar to Fabrazyme, exhibiting improved properties regarding glycosylation. Taken together, our results represent a significant advance that could improve the overall production process of a promising therapeutic alternative for Fabry disease. Zelltek SA Universidad Nacional del Litoral Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas

Fil: Gugliotta, Agustina. Universidad Nacional del Litoral. Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas; Argentina. En el presente trabajo de tesis se llevó a cabo la producción de IFN4N empleando células CHO-K1 y HEK293 como huéspedes y purificación. IFN4NCHO e IFN4NHEK fueron caracterizados en términos de su grado de glicosilación, farmacocinética y actividad biológica. El IFN4NCHO presentó una masa molecular aparente superior y N-glicanos altamente ramificados con un mayor contenido de ácido siálico respecto de la molécula obtenida a partir de HEK. Estudios de farmacocinética revelaron la existencia de diferencias significativas sólo en la etapa de absorción. Si bien ensayos de actividad biológica antiviral in vitro demostraron similitud entre ambas proteínas, la actividad antiproliferativa específica in vitro resultó dos veces superior para la variante obtenida en células HEK. El análisis de la actividad biológica antitumoral in vivo permitió confirmar estos resultados, demostrando la mayor potencia antitumoral del IFN4NHEK. Por otra parte se llevó a cabo la generación de nuevas muteínas hiperglicosiladas del hIFN-alfa2b, con el objetivo de optimizar la molécula IFN4N. El estudio de las nuevas moléculas permitió observar que el grado de glicosilación de las mismas se incrementó conforme aumentó el número de sitios potenciales para N-glicosilación, lo cual se tradujo en un incremento del tiempo de vida media plasmática. A su vez, las variantes carentes de la modificación R23N evidenciaron valores de ABE antiproliferativa in vitro superiores respecto del IFN4N. Los resultados de esta tesis revelan la importancia de encontrar el balance apropiado entre la actividad biológica in vitro y las propiedades farmacocinéticas para la obtención de un producto terapéutico innovador y efectivo. In the present thesis work IFN4N was produced in CHO and HEK cells and purified. IFN4NCHO and IFN4NHEK were characterized in terms of glycosylation, pharmacokinetics and biological activity. IFN4NCHO exhibited a higher average molecular mass and more acidic and ramified isoforms compared to IFN4NHEK. Regarding pharmacokinetic studies, IFN4NHEK reached maximum plasma concentration 3-times faster than IFN4NCHO, however their elimination profile did not differ significantly. Also, despite the in vitro antiviral specific biological activity of both proteins was the same, IFN4NHEK was more efficient as an antiproliferative agent in different tumor-derived cell lines. Accordingly, IFN4NHEK showed a higher in vivo antitumor activity in animal models. As part of this thesis work new muteins of rhIFN-alpha2b were designed and constructed in order to improve the glycosylation degree and, consequently, the pharmacokinetic properties, and the in vitro antiproliferative activity of IFN4N. The characterization of the muteins showed that the introduction of new N glycosylation sites resulted in the increment of their glycosylation degree. The in vitro biological characterization showed that variants lacking the mutation R23N presented an increased antiproliferative activity. The results of this thesis demonstrate that searching for an appropriate balance between the in vitro biological activity and the pharmacokinetic properties in the context of an adequate production host would constitute the basis to generate an innovative and effective therapeutic product. Universidad Nacional del Litoral Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas