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Los cambios desfavorables en el ambiente, provocados por factores climáticos, edáficos y por la actividad del hombre, generan estrés en las plantas afectando severamente su productividad. Los estreses abióticos constituyen la principal causa de pérdidas en los cultivos. Estas pérdidas de productividad superan a veces, según cálculos estimativos, el 50% (Bray y col., 2000) y es por eso que los mejoradores se han dedicado, y lo hacen continuamente a elaborar estrategias de mejoramiento., Trabajo galardonado con el Premio "Pérez Companc", versión 2007, Academia Nacional de Agronomía y Veterinaria

Fil: Perotti, María Florencia. Universidad Nacional del Litoral. Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas; Argentina. La plasticidad del desarrollo vegetal, ha sido la clave en la adaptación de las plantas terrestres. El sistema radicular es altamente plástico, ya que se puede modular a través del crecimiento de la raíz principal o de las raíces laterales, eventos regulados esencialmente por hormonas y factores de transcripción (FT). Los miembros de la subfamilia de FTs Homeodominio-cierre de leucinas I modulan el desarrollo en respuesta a alteraciones en el medioambiente. En esta Tesis se demostró que el FT AtHB23 se expresa en raíces y cumple funciones en la formación de raíces laterales secundarias y terciarias. Este gen se encuentra activo transcripcionalmente en las primeras etapas de desarrollo del primordio de raíz lateral secundaria, desaparece cuando la raíz lateral emerge y se induce por las auxinas en las raíces secundarias, mientras que se expresa durante todas las etapas de formación de una raíz lateral terciaria. Mostramos asimismo que es un represor directo del FT LBD16 y activador directo de LAX3, actores claves en la formación de raíces laterales. A su vez, AtHB23 es regulado directamente por ARF7/19. En condiciones de salinidad, AtHB23 cumple un rol fundamental. Las plantas con niveles bajos de expresión, presentan dificultades para sobrevivir debido a que se altera el metabolismo del almidón, pierden sus amiloplastos y la percepción de la gravedad. La raíz primaria deja de crecer y se altera el desarrollo de raíces laterales. En conjunto, se concluye que AtHB23 es vital para la adaptación de la planta a las condiciones de estrés salino. The plasticity of plant development has been the key to the adaptation of terrestrial plants. The root system is highly plastic, as it can be modulated through the growth of the main root or lateral roots. In Arabidopsis, root development is mainly regulated by auxins and transcription factors (TFs) of the ARFs and LBDs family. Members of the TF homeodomain-leucine zipper family have been associated with responses to environmental conditions. In this Thesis, we showed that the FT AtHB23 is expressed in roots playing a key role in lateral root development. This gene is active in the early stages of secondary lateral root primordium development, disappears when the lateral root emerges and is induced by auxins in secondary roots, while it is expressed during all stages of tertiary lateral root formation. It represses LBD16, a key factor in lateral root initiation, and induces the auxin transporter LAX3. Taken together, the results indicate that AtHB23 acts as a link between the regulation of LAX3 by ARF7/19. On the other hand, AtHB23 was shown to be regulated by NaCl, both in the main and lateral roots, seriously affecting root development. In plants with altered AtHB23 levels, the main root arrested the growth, compromising the plant survival under salinity conditions were affected. These developmental defects were explained by altered starch metabolism in the tip of the primary root. On the whole, we can conclude that AtHB23 is vital for plant survival and adaptation to salt stress conditions. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas Agencia Nacional de Promoción de la Investigación, el Desarrollo Tecnológico y la Innovación Universidad Nacional del Litoral

Fil: Miguel, Virginia Natalí. Universidad Nacional del Litoral. Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas; Argentina. Los factores de transcripción (FTs) de tipo Homeodominio-cierre de leucinas (HD-Zip) I participan en el desarrollo vegetal y la respuesta a factores ambientales. En esta Tesis nos enfocamos en dos miembros de esta familia, HaHB11 de girasol y AtHB1 de Arabidopsis. HaHB11 expresado en Arabidopsis, maíz, arroz y soja confiere tolerancia a estrés y aumento de producción. Nos preguntamos si para generar estas características necesitaba alguna proteína endógena. Sorprendentemente, en un screening de un banco de ADNc, la única proteína que interaccionó con HaHB11 fue la Kinesina-13B. Corroboramos esta interacción in vitro e in vivo y determinamos en qué tejidos y estadios del desarrollo estas proteínas coexisten. Asimismo, determinamos que el FT de Arabidopsis que interacciona con Kinesina-13B es AtHB7, cercano evolutivamente a HaHB11. Finalmente, determinamos que Kinesina-13B es absolutamente necesaria para que HaHB11 y AtHB7 generen su fenotipo diferencial por sobreexpresión. En un segundo capítulo, estudiamos la función de AtHB1 en el desarrollo foliar. Este FT al ser sobreexpresado genera un dentado acentuado en los márgenes de las hojas. Evaluamos la expresión de CUC2, un gen con un papel fundamental en este evento del desarrollo y corroboramos que se encuentra modulado en plantas con niveles alterados de AtHB1 a través de su regulador conocido, el miR164. Este último sería un blanco directo de AtHB1 según indicó un experimento de Inmunoprecipitación de la cromatina. En conjunto los resultados presentados en este trabajo contribuyen al conocimiento sobre las funciones específicas de los miembros de la familia de FTs HD-Zip I. Homeodomain-zipper leucine (HD-Zip) I transcription factors (TFs) are involved in plant development and the response to environmental factors. In this Thesis, we focused on two members of this family, HaHB11 from sunflower and AtHB1 from Arabidopsis. HaHB11 expressed in Arabidopsis, maize, rice, and soybean confers stress tolerance and enhanced grain yield. We wondered whether HaHB11 needed any endogenous proteins to generate these traits. Surprisingly, in an Arabidopsis cDNA library screen, the only protein that interacted with HaHB11 was Kinesin-13B. We confirmed this interaction in vitro and in vivo by different techniques and determined in which tissues and developmental stages these proteins coexist. We also determined that the Arabidopsis TF that interacts with Kinesin-13B is AtHB7, evolutionarily close to HaHB11. Finally, we determined that Kinesin13B is absolutely necessary for HaHB11 and AtHB7 to generate their differential phenotype by overexpression. In a second chapter, we studied the function of AtHB1 in leaf development. This TF, when overexpressed, generates an accentuated serration at the leaf margins. We evaluated the expression of CUC2, a gene with a fundamental role in this developmental event, and corroborated that it is modulated in plants with altered AtHB1 levels through its previously known regulator, miR164. The latter would be a direct target of AtHB1 as indicated by a chromatin immunoprecipitation experiment (ChIP). Taken together, the results presented in this work contributed to the knowledge about the specific functions of the members of the HD-Zip I family of TFs. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas Agencia Nacional de Promoción de la Investigación, el Desarrollo Tecnológico y la Innovación Universidad Nacional del Litoral

Fil: Ribone, Pamela Anahí. Universidad Nacional del Litoral. Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas; Argentina. Los factores de transcripción (FT) de la familia homeodominio-cierre de leucinas (HD-Zip) son exclusivos de plantas y se clasifican en cuatro subfamilias. Los miembros de la subfamilia I participan principalmente de las respuestas al estrés abiótico. En este trabajo de Tesis se hizo una caracterización funcional de dos miembros de esta familia codificados por genes parálogos, AtHB13 y AtHB23. Estos genes se expresan en el meristema apical y flores de plantas adultas pero cumplen funciones diferentes. Mientras que AtHB13 es esencial para la correcta hidratación de los granos de polen, AtHB23 sólo suple la función del primero cuando este está ausente. En cambio ambos genes son necesarios para la correcta elongación de la vara floral. Se muestran estudios que indican una regulación fina y coordinada de estos dos FT que además depende del tejido y estadio de desarrollo. En otro capítulo de la Tesis se investiga la regulación de la expresión de otro miembro de la familia, AtHB1, que actúa corriente abajo de PIF1 para regular la elongación del hipocotilo. El gen que codifica este FT posee en la región 5 no codificante un uORF conservado capaz de regular negativamente su traducción mediante el trabado de los ribosomas. Esta regulación post-transcripcional que se produce en cis, de forma independiente del mORF corriente abajo, es dependiente del tejido y de las condiciones ambientales y es absolutamente necesaria para evitar los efectos deletéreos observados cuando AtHB1 se sobreexpresa: fenotipo aberrante con flores estériles. Homeodomain-leucine zipper (HD-Zip) transcription factors (TF) are unique to plants and have been classified into four subfamilies. Subfamily I members were mainly associated to abiotic stress responses. In this Thesis, functional characterization of two members of this subfamily, AtHB13 and AtHB23, was carried out. These TFs are encoded by paralogous genes expressed in the apical meristem and flowers of mature plants. Although they have similar expression patterns, their functions are different. While AtHB13 is essential for a proper pollen hydration, AtHB23 only replace it when AtHB13 is not present. In contrast, both are necessary for a correct inflorescence stem elongation. This suggests a finely coordinated regulation of the two TFs that depends on the tissue and developmental stage. In another chapter, the expression of AtHB1, another HD-Zip I TF, was investigated. AtHB1 is known to promote hypocotyl elongation acting downstream of PIF1. The gene encoding this TF has a conserved uORF in its 5’untranslated region that is able to repress the translation of the mORF through a ribosome stalling mechanism. This post-transcriptional regulation acts in cis, independently of the downstream mORF. Moreover, such regulation is tissue-specific and depends on illumination conditions. The repression exerted by the uORF is absolutely necessary to avoid the deleterious effects produced when AtHB1 is over-expressed: an aberrant phenotype with sterile flowers. Ministerio de Ciencia, Tecnología e Innovación Productiva Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas

Fil: Arce, Agustín Lucas. Universidad Nacional del Litoral. Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas; Argentina. La familia HD-Zip de factores de transcripción (FTs) de plantas está compuesta por proteínas que unen ADN a mediante un homodominio y dimerizan a través de un cierre de leucinas. Los miembros de la subfamilia I están principalmente involucrados en respuestas relacionadas al ABA y reconocen con máxima afinidad la misma secuencia. Sin embargo, generan una variedad de fenotipos cuando son expresados utilizando el promotor 35SCaMV. Para estudiar esta divergencia funcional, se realizó un análisis filogenético y se identificaron 6 clados con regiones C terminales (RCTs) características. Éstas presentaron motivos de activación AHA y sitios putativos de fosforilación y sumoilación. Mediante ensayos de símple híbrido en levaduras se observó la capacidad de transactivar de la RCT de AtHB13. La expresión en Arabidopsis de proteínas quiméricas mostró que estas regiones son funcionalmente divergentes in planta. Por otra parte, se reconstruyó una red de regulación transcripcional involucrando FTs HD-Zip I y II. Se utilizaron microarreglos de tratamientos de estrés abiótico de Arabidopsis, obteniéndose listas de blancos directos putativos para cada FT, llamadas módulos de actividad transcripcional (MATs). Los promotores de los genes de los MATs presentaron elementos ABRE, señalando una potencial regulación cruzada con otros FTs. La coordinación de la expresión en estrés por calor sugirió una participación de los FTs HD-Zip en esta respuesta. La caracterización funcional de los MTAs mostró categorías nuevas y desconocidas para los FTs estudiados. Este trabajo profundiza nuestro conocimiento sobre los mecanismos de acción de los FTs HD-Zip y genera nuevas hipótesis para investigaciones futuras. The HD-Zip family of transcription factors (TFs) is composed of proteins that bind DNA through a homeodomain and dimerize through a leucine zipper. Subfamily I members are mainly involved in ABA responses and bind the same sequence with maximum affinity. Nonetheless, they generate a variety of phenotypes when expressed under the 35SCaMV promoter. To study the source of this functional divergence, a phylogenetic and functional analysis was performed with 178 proteins, allowing the identification of 6 clades with characteristic C-terminal regions (CTRs) outside the HD-Zip domain. These regions presented AHA activation motifs and putative phosphorylation and sumoylation sites. Yeast-one hybrid assays verified the activation capability of the CTR of AtHB13. The overexpression in Arabidopsis of chimerical proteins from HaHB1 and HaHB4 and their phenotypical analysis showed that these regions are also functionally divergent in planta. The reverse engineering of the transcriptional regulatory networks in which HD-Zip I and II TFs participate was also performed. A dataset involving different abiotic treatments in Arabidopsis was used and lists of putative targets were obtained for each TF, called modules of transcriptional activity (MTAs). The promoters of MTA genes presented ABRE elements, indicating a potential cross-talk with TFs from other families. Coordinated expression of MTA genes was observed under heat stress, suggesting a previously unknown participation of HD-Zip TFs in this stress. The functional characterization of MTA genes revealed new and previously associated categories. This work improves our knowledge on the mechanism of action of HD-Zip TFs and generates new hypothesis for future research. Universidad Nacional del Litoral Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas

Fil: Ariel, Federico Damián. Universidad Nacional del Litoral. Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas; Argentina. La familia de las leguminosas incluye a varios de los cultivos más importantes del mundo. Sus miembros pueden generar otros meristemas de novo en sus raíces, llamados nódulos, a partir de la interacción simbiótica con las bacterias del suelo. Los nódulos simbióticos les permiten a las plantas fijar nitrógeno atmosférico y crecer en suelos poco fértiles. Por este motivo, las leguminosas son consideradas como los cultivos pioneros para la incorporación de suelos salinos en la agricultura. Además, su presencia estimula el crecimiento de otras especies de plantas. Sin embargo, tanto el crecimiento como la arquitectura de las raíces, incluyendo la formación de los nódulos, son muy sensibles a las limitaciones del ambiente, como la disponibilidad de agua y el estrés salino, condiciones que se reflejan en el detrimento de la productividad. En este trabajo de tesis caracterizamos dos factores de transcripción involucrados en el desarrollo de raíces y nódulos de la planta modelo de leguminosas Medicago truncatula. El primero, MtHB1, regula una respuesta adaptativa del desarrollo con el fin de minimizar la superficie de contacto de las raíces con el medio estresante. El otro, MtRR1, participa en la regulación de la formación de los nodúlos mediada por las fitohormonas citoquininas. The family of legumes includes several of the most important crops worldwide. Legumes can develop de novo organs from their roots, called nodules, triggered by the symbiotic interaction with soil bacteria. Symbiotic nodules allow the plant to fix atmospheric nitrogen and grow in poor soils. Thus, legumes are considered pioneer plants to start agricultural activities in salty regions. Moreover, their presence help the growth of other species. However, root growth and architecture, including the formation of nodules, are affected by environmental cues, such as water availability and salt stress, impairing crop productivity. In this PhD work, we have characterized two transcription factors involved in root and nodule development in the model legume Medicago truncatula. One of them, called MtHB1, controls the adaptative developmental response, minimizing the root surface to the stressing environment. The other, named MtRR1, participates in the regulation of nodule development mediated by the phytohormones cytokinins. Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica Ministerio de Educación de la Nación Universidad Nacional del Litoral Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas

Fil: Rueda, Eva Carolina. Universidad Nacional del Litoral. Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas; Argentina. Las proteínas HD-Zip conforman una familia de factores de transcripción que, en vegetales, actúan como reguladoras del desarrollo en respuesta a factores ambientales . En esta Tesis, se presentan los resultados obtenidos de la caracterización funcional de dos factores de transcripción de girasol de esta familia: HAHB1 y HAHB10, para lo cual se analizaron los patrones de expresión en girasol, y se obtuvieron plantas transgénicas de Arabidopsis thaliana que expresan estos genes constitutivamente.Los resultados mostraron que HAHB1 se expresa en tallos y en láminas de hojas. La misma aumenta en presencia de hormonas, en condiciones etioladas, o por estrés salino. Las plantas transgénicas que expresan el gen HAHB1 son más pequeñas y el ciclo de vida es más corto que las salvajes. Además son más sensibles al estrés salino. El gen HAHB10 se expresa principalmente en hojas y en plántulas etioladas. Las plantas que expresan el gen HAHB10 tienen las raíces más cortas, cotiledones más oscuros y menos expandidos, hojas planas, más pequeñas y de color verde más oscuro. Presentan una reducción del ciclo de vida, menor sensibilidad al tratamiento con giberelinas y mayor tolerancia a tratamientos con el herbicida metil viológeno. Los resultados obtenidos nos permiten proponer al gen HAHB1 como regulador negativo del desarrollo y de la respuesta al estrés salino y sugieren que el gen HAHB10 participa en la/s cascada/s de señalización que controla/n las respuestas de las plantas a la cantidad y calidad de la luz, así como en las vías de señalización por giberelinas. Homeodomain-leucine zipper are regulated by external factors and they were are involved in developmental responses to environmental conditions. Here, we report expression and functional studies performed in order to characterize two members of the sunflower HD-ZIP family: HAHB1 and HAHB10. HAHB1 is mainly expressed in stems and leaves and it is regulated by hormones or NaCl. The highest transcript levels were observed when seedlings were grown in etiolated conditions. Transgenic Arabidopsis thaliana plants ectopically expressing HAHB1 were smaller and flowering occurs later. Transgenic seeds and seedlings were more sensitive to salt stress: when they are grown in the presence of NaCl in Petri dishes their germination rate and the percentage of survivors is reduced compared with the wild-type. Northern blot assays show that HAHB10 is expressed in mature leaves and in etiolated seedlings. Transgenic Arabidopsis thaliana plants ectopically expressing HAHB10 show darker cotyledons and planar leaves, and a reduction in the life cycle. After gibberellin treatment, the relative difference in life cycle duration was considerably reduced. Additionally, the ectopic expression of HAHB10 confers a significant tolerance to a treatment with the herbicide methyl viologen. We propose that HAHB1 is a negative regulator of plant development and in response to salt stress and HAHB10 functions in the signalling cascade(s) that control(s) plant responses to light quality and quantity, and may also be involved in gibberellin transduction pathways. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas BIOCERES S.A. Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica Universidad Nacional del Litoral