La identificación de la fuente de alimentación de insectos hematófagos puede proporcionar información sobre la capacidad vectorial, patrones de alimentación en condiciones naturales y proveer indirectamente datos sobre probables reservorios de enfermedades. Varias técnicas de identificación son empleadas, entre ellas las más utilizadas son las basadas en reacciones antígeno-anticuerpo. Actualmente, se han desarrollado ensayos moleculares, algunos de ellos permiten detectar e identificar solo sangre humana. Otros como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) del gen mitocondrial citocromo b (cyt b), que ha mostrado alto grado de sensibilidad y especificidad, permite detectar e identificar otras especies de vertebrados. El objetivo del trabajo fue estandarizar la técnica PCR-RFLP del gen mitocondrial citocromo b(cyt b) para determinar la fuente de alimentación sanguínea de insectos. Inicialmente se realizó un análisis bioinformático para la búsqueda y alineamiento de secuencias del gen cyt bde los potenciales huéspedes, con secuencias que están disponible en el GenBank. Se utilizaron 10 muestras de sangre de potenciales huéspedes vertebrados (humano, perro, gallina y roedor) y para la reacción de PCR se empleó un par de cebadores universales que amplifican una región del gen cyt b, seguido de cortes con dos enzimas de restricción (RFLP) (HaeIII y MwoI), generando patrones de electroforesis específicos para los diferentes vertebrados. Se logró la estandarización de la técnica de PCR del gen cyt b que fue capaz de detectar ADN de al menos 1 µL de sangre observándose el producto de amplificación de 358 pb. El análisis de los patrones de bandas obtenidos con el corte de las enzimas mostró los tamaños de fragmentos esperados para humano, gallina, perro y roedor. Estos resultados muestran la utilidad de la técnica PCR-RFLP del gen cyt bque, con un simple par de cebadores seguido del corte con dos enzimas de restricción, permitió diferenciar las diferentes especies de vertebrados de nuestro interés a través de los patrones obtenidos sin llegar a la secuenciación y también presenta la ventaja de utilizar pequeños volúmenes de sangre. Identification of feeding sources of hematophagous insects can provide information about the vectorial capacity, feeding patterns in natural conditions and indirectly provide data on possible disease reservoirs preferences. Several identification techniques are used, most of them based on antigen-antibody reactions. Recently molecular assays have been developed and, some of these assays can detect and identificate only human blood. Other assays, like the polymerase chain reaction (PCR) based on mitochondrialcytochrome bgene, have shown high sensitivity and specificity allowing detection and identification of other vertebrate species. The aim of this study was to standardize a PCR-RFLP based on mitochondrial cytochrome bgene (cyt b) in order to determine blood meal from insects. Initially bioinformatic analysis was performed for searching and alignment of cyt bsequences of potential hosts available at the GenBank database. Blood samples from potential vertebrate hosts were used and PCR was performed using specific primers that amplify a region of cyt b gene. The products were digested with restriction enzymes (RFLP), generating specific electrophoresis patterns for several vertebrates.The PCR technique for cyt bgene was standardized allowing the detection of at least 1 µL of blood. The 359 bp band was correctly amplified and the profiles obtained after the enzyme digestion with HaeIII and MwoI were the expected for human, chicken, dog and rodents. These results showed the usefulness of the PCR-RFLP of cyt bgene that, with a single pair of primers followed digestion using two restriction enzymes, allowed the differentiation of the vertebrate species of our interest through the patterns obtained without sequencing having also the advantage of detecting small volumes of blood sample.