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Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq Papaya is the fourth most consumed fruit in Brazil and the third most exported fruit by the country. In search of better results in production and greater resistance to diseases and pests, pesticides have their widespread use in agriculture due to their effectiveness in pest control, but indiscriminate use can harm human health and the environment. This work aimed to establish a method for the multiresidue determination of pesticides in papaya using the QuEChERS method and analysis by ultra-high performance liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry (UHPLCMS/MS). The parameters that influence the extraction efficiency were studied and, after finding the best extraction conditions, the method was validated. The analysis by UHPLC-MS/MS allowed the determination of analytes with high selectivity and detectability. The original modified QuEChERS method employing the polymeric sorbent Strata SDB-L in the extract cleaning step was validated for 110 compounds and presented adequate values of accuracy, with recoveries between 70 and 120%, and precision, with RSD

[eng] Chemical exposure to emerging contaminants (ECs) is a major concern nowadays. These ECs have recently become a global environmental threat, and an in-depth characterization of their occurrence and toxic impact is needed. In this context, omic sciences have arisen as powerful tools to shed some light on the biological mechanisms affected by exposure to these chemicals. Particularly, metabolomics and lipidomics can provide a snapshot of what is actually happening at the molecular level, pointing to metabolic pathways affected by the contaminants. New analytical methodologies are required to extract the sought information in more complex biological matrices (from single cells to whole organisms). Hence, a major emphasis has been put on developing multidimensional separations and multiplatform approaches to increase the metabolome coverage. However, these novel approaches bring about massive datasets, and the complexity of the data analysis augments considerably. Therefore, chemometric strategies are a perfect match to get through this bottleneck and provide useful tools to obtain the most from the data collected. In this PhD Thesis, the focus was set on developing analytical protocols, especially using two-dimensional liquid chromatography coupled to mass spectrometry (LC×LC-MS), as well as chemometric data analysis strategies applicable to environmental metabolomic studies. On the one hand, LC×LC-MS methods have been developed for both untargeted and targeted analyses. Active modulation strategies have been also successfully implemented in the multidimensional chromatographic separation of lipids. On the other hand, the Regions Of Interest (ROI) approach for compression and filtering has been validated for LC×LC-MS analyses. Regarding chemometric resolution methods (i.e., which allow obtaining quantitative and qualitative information from the sample constituents), and due to deviations from an ideal trilinear behavior presented by LC×LC datasets, the use of the Multivariate Curve Resolution Alternating Least Squares (MCR-ALS) method has been preferred. Different quantification strategies have been tested based on the Regions Of Interest Multivariate Curve Resolution (ROIMCR) approach. In addition, several multivariate statistical methods based on the analysis of variance (ANOVA) have been compared for metabolomic studies. As a result, a combination of ANOVA-simultaneous component analysis (ASCA) and partial least squares discriminant analysis (PLS-DA) has been selected for statistical analysis and variable (metabolite) selection, respectively. All in all, different metabolomic workflows have been validated for the assessment of emerging contaminants in model biosystems., [spa] Actualmente, las ciencias ómicas han aparecido como herramientas muy útiles para arrojar luz sobre los mecanismos biológicos y rutas metabólicas que se ven afectados debido a las exposiciones a contaminantes emergentes. En concreto, la metabolómica y la lipidómica proporcionan información de lo que está ocurriendo a nivel molecular. Por tanto, se requieren nuevas metodologías que sean capaces de extraer dicha información en matrices cada vez más complejas (desde una única célula a un organismo entero). Esta Tesis doctoral se centra principalmente en el desarrollo de protocolos analíticos basados en el uso de la cromatografía líquida bidimensional acoplada a espectrometría de masas (LC ×LC-MS), así como en el desarrollo de estrategias quimiométricas que permitan su uso en aplicaciones medioambientales. Por un lado, se han optimizado métodos LC×LC-MS para análisis dirigidos y no dirigidos, implementando con éxito estrategias de modulación activa (en el caso de análisis de lípidos). Por otro lado, se ha validado la estrategia de regiones de interés (ROI) para comprimir y filtrar los datos obtenidos con LC×LC-MS. Asimismo, se ha preferido el uso de métodos de resolución multivariante de curvas mediante mínimos cuadrados alternados (MCR-ALS) para la resolución cualitativa y cuantitativa de muestras complejas en el caso de datos de LC×LC, debido a las deviaciones de la trilinealidad encontradas en dichos datos. Por otra parte, se han comparado diferentes estrategias cuantitativas aplicables a datos en LC×LC-MS, todas ellas basadas en el uso del método combinado de regiones de interés y resolución multivariante de curvas (ROIMCR). También se han comparado diversos métodos estadísticos multivariante basados en el análisis de varianza (ANOVA) y su aplicabilidad en estudios metabolómicos. Finalmente, se ha elegido una combinación de análisis estadístico efectuado con ANOVA-análisis de componentes simultáneos (ASCA) y un método de clasificación, análisis discriminante mínimos cuadrados parciales (PLS-DA) para seleccionar las variables (metabolitos) más relevantes. En resumen, se han validado diferentes flujos de trabajo para el estudio metabolómico del efecto de contaminantes emergentes en organismos modelo ambientales.

RESUMO Com intenso consumo e lançamento contínuo em efluentes domésticos e industriais, a cafeína tem sido regularmente detectada em meios aquáticos por todo o mundo. Esse psicoativo é considerado um excelente indicador de contaminação na água, relacionada à atividade humana. No entanto, os impactos que pode ocasionar à saúde e ao ambiente ainda não são bem compreendidos. Dessa forma, o objetivo deste trabalho foi verificar a presença da cafeína em água bruta e tratada por uma estação de tratamento de água convencional, em diferentes períodos hidrológicos, e avaliar o risco potencial que ela representa ao ambiente aquático. A cafeína foi detectada em todas as amostras de água bruta. A maior concentração foi observada no período mais intenso de seca. Ela não foi detectada na água tratada. O composto é considerado como de alto risco ao ambiente aquático. Os resultados indicam a vulnerabilidade do manancial em questão. ABSTRACT With an intense consumption and continuous release into domestic and industrial effluents, caffeine has been regularly detected in aquatic environments worldwide. This psychoactive is considered an excellent indicator of contamination in water, related to human activity. However, the impacts it can have on health and on the environment are still not well understood. Thus, the objective of this work was to verify the presence of caffeine in raw water treated by a conventional water treatment plant, in different hydrological periods, and to evaluate the potential risk that it represents to the aquatic environment. Caffeine was detected in all raw water samples. The highest concentration was observed in the most intense period of drought. It was not detected in the treated water. The compost is considered to be of high risk to the aquatic environment. The results indicate the vulnerability of the source in question.

This manuscript describes the development of an innovative method to determine cannabinoids (cannabidiol and tetrahydrocannabinol) in human plasma samples by pipette tip micro-solid phase extraction and liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectromtery. An octyl-functionalized hybrid silica monolith, which had been synthesized and characterized, was used as a selective stationary phase. The octyl-functionalized hybrid silica monoliths presented high permeability and adequate mechanical strength. The micro-solid phase extraction variables (sample pH, draw-eject cycles, solvent for phase clean-up, and desorption conditions) were investigated to improve not only the selectivity but also the sorption capacity. The method was linear at concentrations ranging from the lower limit of quantification (10.00 ng/mL) to the upper limit of quantification (150.0 ng/mL). The lack of fit and homoscedasticity tests, as well as the determination coefficients (r2 greater than 0.995), certified that linearity was adequate. The precision assays presented coefficient of variation values lower than 15%, and the accuracy tests provided relative error values ranging from 3.2 to 14%. Neither significant carry-over nor matrix effects were detected. Therefore, the pipette tip micro-solid phase extraction/liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry method has demonstrated to be adequate to determine cannabidiol and tetrahydrocannabinol simultaneously in plasma samples for therapeutic drug monitoring of patients undergoing treatment with cannabinoids.

processos 01.11.0135.00 e 01.13.0371.00 Finep - Financiadora de Estudos e Projetos A cromatografia líquida é a técnica de análise mais abrangente na quantificação de compostos orgânicos na atualidade, porém suas análises produzem um grande volume de resíduos devido ao uso de solvente orgânico na fase móvel, sobretudo para compostos polares. Adicionalmente, compostos polares apresentam baixa retenção em fases estacionárias tradicionais, C8 e C18 ligadas quimicamente ao suporte, restringindo maiores aplicações da cromatografia líquida. Uma estratégia para contornar essas limitações tem sido a utilização de polímeros pré-sintetizados imobilizados no suporte cromatográfico, garantindo seletividade finamente ajustada às fases estacionárias de acordo com a estrutura do polímero, além de maior estabilidade química. A preparação de fases estacionárias moderadamente polares e que requerem fases móveis altamente aquosas tem sido objeto de estudos por diversos pesquisadores para separação de compostos polares. Nesse trabalho foram preparadas fases estacionárias a partir da auto-imobilização do poli(metil-3,3,3-trifluorpropilsiloxano) (PMTFS) sobre suporte de sílica aluminizada. A preparação das fases auto-imobilizadas foi realizada durante um período de 180 dias analisando-as periodicamente quanto às características de retenção do material, visando a avaliar a reatividade da superfície do suporte de sílica aluminizada e a obtenção de uma fase estacionária estável e útil na separação de compostos polares. As caracterizações da fase SiAl(PMTFS) indicaram um material constituído de partículas esféricas e livre de aglomerações, mesmo após as incorporações da alumina e do polímero. A presença do polímero fluorado na sílica aluminizada foi confirmada por espectroscopia no infravermelho através de sinais característicos, como os estiramentos entre 1210 e 1449 cm-1, atribuídos às ligações C-F. A estabilidade do material foi avaliada dentro do protocolo produzido pelo grupo de pesquisa, se mostrando altamente estável como já fora observado com outras fases a base de sílica aluminizada. A caracterização cromatográfica foi realizada a partir de misturas testes e protocolos já consolidados na caracterização de novas fases estacionárias, sendo possível verificar que a fase SiAl(PMTFS) atua no modo de fase reversa com uma alta porcentagem de água em sua fase móvel. A fase SiAl(PMTFS) tem potencial para separação de compostos polares gerando menor quantidade de resíduos e apresenta maior estabilidade química. Nowadays, liquid chromatography is the most comprehensive analytical technique for the quantification of organic compounds. However, their analyzes produce a large volume of toxic residues due to the use of highly organic mobile phase, especially for polar compounds. Furthermore, polar compounds show poor retention in traditional stationary phases, C8 or C18 chemically bonded, restricting some applications of liquid chromatography. An alternative to overcome these limitations has been the use of immobilized pre-synthesized polymers on an inorganic support, resulting in a finely adjusted selectivity according to the polymer structure, in addition to higher chemical stability. The preparation of moderately polar stationary phases using water-rich mobile phases for the separation of polar compounds has been the object of studies by different researchers. In this work, we prepared stationary phases by self-immobilization of poly(methyl-3,3,3-trifluoropropylsiloxane) (PMTFS) on an aluminized silica support. The stationary phases were self-immobilized for 180 days and were periodically chromatographically analyzed. In this study, the retention properties and the polymeraluminized silica interaction were evaluated for the useful and stable stationary phase preparation. Physicochemical characterizations indicated that the SiAl(PMTFS) particles were spherical and free of agglomerations even after the incorporation of alumina particles and the self-immobilization of PMTFS. The immobilization of PMTFS on aluminized silica support was confirmed by infrared spectroscopy through signals attributed to the stretching C-F bonds between 1210 and 1449 cm-1. SiAl(PMTFS) phase showed high stability under alkaline conditions using a lab-made protocol, which can be associated with the aluminized silica support. The chromatographic characterization of the SiAl(PMTFS) phase was performed by the separation of test mixtures using consolidated protocols. These separations confirmed that the SiAl(PMTFS) phase acts in a reversed-phase mode but requiring water-rich mobile phases for the separation of polar compounds. Therefore, the SiAl(PMTFS) phase presents good chemical stability and also presents the potential to separate polar compounds, generating less toxic organic residues. Dissertação (Mestrado) 2022-02-15

Submitted by Mírian Farias Ribeiro (mirianfribeiro@yahoo.com.br) on 2022-05-16T11:25:53Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Lorini.pdf: 5241531 bytes, checksum: e42e67af95b937f1b8ae2456d3d42e63 (MD5) Approved for entry into archive by Aline Batista (alinehb.ufpel@gmail.com) on 2022-05-16T11:32:40Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Lorini.pdf: 5241531 bytes, checksum: e42e67af95b937f1b8ae2456d3d42e63 (MD5) Made available in DSpace on 2022-05-16T11:32:40Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Lorini.pdf: 5241531 bytes, checksum: e42e67af95b937f1b8ae2456d3d42e63 (MD5) Previous issue date: 2022-04-08 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES Durante a poda de colheita de Ilex paraguariensis são geradas de 2 a 5 toneladas de coprodutos (talos grossos) por hectare, recurso natural ainda inexplorado comercialmente. Este estudo objetivou a caracterização de compostos polares presentes neste coproduto, proveniente de plantas cultivadas em sistema de pleno sol e sombreado, bem como a comparação com as partes da planta empregadas na matéria prima (folhas e talos finos) de produtos comerciais. Além disso, visou a determinação das condições ótimas de extração destes compostos empregando solvente verde para aplicação em alimentos, através de um planejamento multivariado, além da avaliação do extrato obtido quanto à sua atividade antioxidante e antimicrobiana. A caracterização da matéria prima e do coproduto foi realizada por HPLC-ESI-QTOF-MS com extração com metanol:água, resultando na identificação de 46 compostos, sendo que a soma do ácido quínico, 3-cafeoilquinico, 5-cafeoilquinico, 3,5-di-cafeoilquinico e 4,5-dicafeoilquinico e rutina representam, em média, 93% e 91% da concentração de compostos fenólicos presentes nas folhas e no coproduto, respectivamente. Para a otimização da extração, as variáveis tempo, temperatura de extração e porcentagem de solvente (etanol) na solução extratora foram avaliadas através de um delineamento composto central rotacional (23 ) com ponto central. Todos os modelos obtiveram regressão significativa, resíduos aleatórios e não apresentaram falta de ajuste, sendo que, dos 55 modelos, 51 se caracterizaram como quadráticos. A partir da condição ótima de extração (31,3 minutos, 85 °C e 43,7% de etanol) foi possível extrair aproximadamente 15 g 100g-1 de compostos do coproduto, os quais incluem os 42 compostos identificados previamente, além de outros 13 compostos não extraídos com metanol:água. O extrato obtido a partir das condições ótimas de extração apresentou atividade antioxidante de 1857,51 µmol de equivalentes em Trolox por grama de extrato. Após a determinação da concentração mínima inibitória e concentração bactericida mínima deste extrato frente a quatro espécies bacterianas de interesse para a indústria de alimentos (Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium e Escherichia coli), foram observados resultados promissores quanto a inibição do micro-organismo Staphylococcus aureus. Os resultados obtidos evidenciaram que o coproduto da poda de colheita de I. paraguariensis é uma matriz com elevado potencial para aplicações em alimentos e fármacos devido à alta concentração de compostos fenólicos presentes. During the pruning of Ilex paraguariensis, 2 to 5 tons of co-products (thick branches) are generated per hectare, a natural resource that is still commercially unexplored. This study aimed to characterize the polar compounds present in this co-product, from plants grown in full sun and shade, as well as the comparison with the parts of the plant used in the raw material (leaves and fine branches) of commercial products. In addition, it aimed to determine the optimal conditions for extraction of these compounds using green solvent for application in food, through a multivariate planning, in addition to the evaluation of the extract obtained for its antioxidant and antimicrobial activity. The characterization of the raw material and the co-product was performed by HPLC-ESI-QTOF-MS with methanol:water extraction, resulting in the identification of 46 compounds, and the sum of quinic acid, 3-caffeoylquinic, 5-caffeoylquinic, 3, 5-di-caffeoylquinic and 4,5-di-caffeoylquinic and rutin represent, on average, 93% and 91% of the concentration of phenolic compounds present in the leaves and in the co-product, respectively. For the extraction optimization, the variables time, extraction temperature and percentage of solvent (ethanol) in the extracting solution were evaluated through a central rotational composite design (23 ) with central point. All models obtained significant regression, random residuals and showed no lack of fit, and of the 55 models, 51 were characterized as quadratic. From the optimal extraction condition (31.3 minutes, 85 °C and 43.7% ethanol) it was possible to extract approximately 15 g 100g-1 of compounds from the co-product, which include the 42 compounds identified previously, in addition to others 13 compounds not extracted with methanol:water. The extract obtained from the optimal extraction conditions showed an antioxidant activity of 1857.51 µmol of Trolox equivalents per gram of extract. After determining the minimum inhibitory concentration and minimum bactericidal concentration of this extract against four bacterial species of interest to the food industry (Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium e Escherichia coli), promising results were observed regarding the inhibition of the microorganism Staphylococcus aureus. The results obtained showed that the co-product of I. paraguariensis harvest pruning is a matrix with high potential for applications in food and pharmaceuticals due to the high concentration of phenolic compounds present.

The humankind is pretty dependent on food to control several biological processes into the organism. As the world population increases, the demand for foodstuffs follows the same trend claiming for a high food production situation. For this reason, a substantial amount of chemicals is used in agriculture and livestock husbandries every year, enhancing the likelihood of contaminated foodstuffs being commercialized. This outlook becomes a public health concern; thus, the governmental regulatory agencies impose laws to control the residues and contaminants in food matrices. Currently, one of the most important analytical techniques to perform it is LC. Despite its already recognized effectiveness, it is often time consuming and requires significant volumes of reagents, which are transformed into toxic waste. In this context, miniaturized LC modes emerge as a greener and more effective analytical technique. They have remarkable advantages, including higher sensitivity, lower sample amount, solvent and stationary phase requirements, and more natural coupling to MS. In this review, most of the critical characteristics of them are discussed, focusing on the benchtop instruments and their related analytical columns. Additionally, a discussion regarding the last 10 years of publications reporting miniaturized LC application for the analysis of natural and industrial food samples is categorized. The main chemical classes as applied in the crops are highlighted, including pesticides, veterinary drugs, and mycotoxins.

Amino acids (AA) composition in cocoa beans can predict the synthesis of compounds which affect cocoa flavor. Thus, their determination is of great interest for the community implied in the commercialization and production of cocoa. In consequence, in this work, the analysis of AA produced during cocoa beans fermentation and roasting was carried out. A high-performance liquid chromatographic method with DAD detection at 254 nm was optimized and validated for their selective determination in six varieties of cocoa beans with different genotypes, all of them grown in Venezuela. AA were extracted by defatted milled cocoa powder ultrasonication using purified water at 70 °C. Then, they were derivatized with phenyl isothiocyanate, and their derivatives were separated, using a reversed-phase column with gradient elution, achieving a satisfactory resolution among the peaks (greater than 1.0) in less than 29 min. 110 cocoa samples were analyzed. Results showed a significant content of free AA, ranging from 3.87 to 5.97 g/kg in absence of fermentation with a predominance of acidic AA. Moreover, there is a progressive increase in the AA content while fermentation process occurs, with a predominance of hydrophobic AA such as alanine, valine, isoleucine, leucine, phenylalanine, and tyrosine. On the other hand, all cocoa types showed a partial degradation of free AA during the roasting step, especially the hydrophobic ones. Resumen La determinación de aminoácidos (AA) en granos de cacao es de gran interés ya que estos son considerados como unos de los precursores de su sabor y aroma. Por esta razón, el presente trabajo tuvo como objetivo optimizar y validar un método por cromatografía líquida con detección DAD a 254 nm para la determinación selectiva de AA durante la fermentación y tostado en seis variedades de granos de cacao con diferentes genotipos, todos estos cultivados en Venezuela. Los AA se extrajeron del polvo de cacao molido y desgrasado con agua pura a 70 ºC, utilizando la técnica de ultrasonido. Luego, se derivatizaron con fenilotiocianato para separar sus derivados con buena resolución en menos de 29 min en una columna de fase reversa, utilizando gradiente de elución. Se analizaron 110 muestras de cacao. Los resultados mostraron un contenido significativo de AA libres, entre 3,87 y 5,97 g/kg, en ausencia de fermentación con predominio de AA ácidos, y un aumento progresivo en el contenido de AA, mientras ocurre el proceso de fermentación, con un predominio de AA hidrófobos como alanina, valina, isoleucina, leucina, fenilalanina y tirosina. Además, todos los tipos de cacao mostraron una degradación parcial de AA libres durante la etapa de tostado, especialmente los AA hidrófobos. Resumo A determinação dos aminoácidos (AA) nos grãos de cacau é importante, pois são considerados um dos precursores de seu sabor e aroma. Neste trabalho, um método foi otimizado e validado por cromatografia líquida com detecção DAD a 254 nm para a determinação seletiva de AA durante a fermentação e torrefação em seis variedades de grãos de cacau com diferentes genótipos, todos cultivados na Venezuela. Os AAs foram extraídos do pó de cacau moído e desengordurados com água pura a 70 ºC usando a técnica de ultrassom. Em seguida, foram derivatizados com feniltiocianato, e os derivados foram separados com boa resolução em menos de 29 minutos em uma coluna de fase invertida usando eluição em gradiente. Foram analisadas 110 amostras de cacau. Os resultados mostraram um conteúdo significativo de AA livre entre 3,87 e 5,97 g/kg na ausência de fermentação com predominância de AA ácidos e um aumento progressivo no conteúdo de AA enquanto o processo de fermentação ocorre com predominância de AA hidrófobos como alanina, valina, isoleucina, leucina, fenilalanina e tirosina. Além disso, todos os tipos de cacau apresentaram uma degradação parcial do AA livre durante a fase de torrefação, principalmente o AA hidrofóbico.

El metaboloma es el conjunto de compuestos orgánicos de bajo peso molecular (metabolitos) producidos por sistemas biológicos. El antagonismo microbiano es una importante fuerza evolutiva, por lo que el análisis de su metaboloma es una herramienta útil para la búsqueda de nuevas moléculas con actividad biológica. El objetivo de este trabajo fue implementar el uso de algoritmos quimiométricos para la identificación de variaciones en el metaboloma del antagonismo microbiano entre Pseudovibrio denitrificans y Vibrio harveyi. Extractos de bacterias y del medio de cultivo usado fueron analizados por cromatografía líquida de ultra alta eficiencia acoplada a un detector de arreglo de iodos (UHPLC-DAD). Además, algoritmos imiométricos fueron aplicados realizando un Análisis de Componentes Principales (PCA) de los cromatogramas obtenidos. Se encontraron tres picos que expresaron una mayor variabilidad entre el metaboloma individual y el metaboloma de la interacción de P. denitrificans y V. harveyi. De esta manera, la metabolómica con UHPLC-DAD y algoritmos quimiométricos demostró ser una herramienta útil para la identificación de picos responsables de las diferencias entre interacciones microbianas. Metabolome is a group of low molecular weight organic compounds (metabolites) produced by biological systems. Bacterial antagonism is an important evolving force, in this sense analysis of its metabolome represents a useful tool for discovering new molecules with biological activity. The objective of this research work was to implement the use of chemometric algorithms for the identification of variations in the metabolome of the microbial antagonism between Pseudovibrio denitrificans and Vibrio harveyi. Extracts from cultured bacteria and used culture media were analyzed by Ultra-high performance liquid chromatography coupled with a diode-array detector (UHPLC-DAD). Additionally, chemometric algorithms were employed, subjecting to Principal Component Analysis (PCA) for the obtained chromatograms. Three peaks were found that express the major variability between the individual metabolome and the metabolome from the interaction of P. denitrificans and V. harveyi. In this manner, metabolomic through UHPLCDAD and chemometric algorithms, showed to be a useful tool to identify the peaks responsible for differences between microbial interactions.

Pesticides are used worldwide in the agricultural production of different crops in order to avoid losses in production due to the attack of pests and diseases. Due to the increase in food production, consequently, the concern about the correct disposal of pesticide residues is growing. Thus, from 1990 onwards, biobeds began to be developed in order to reduce contamination from accidental spills during pesticide formulation dissolution and in the washing of sprayers. The biomix, made up of soil, straw and peat, which makes up the biobeds, is primarily responsible for retaining and biodegrading pesticides. Among those different classes of pesticides, herbicides represent a large percentage (59,56%) of the most sold active ingredients in Brazil. Therefore, the meangoal of this study was to develop and to validate two extraction methods for pesticide determinations. A multiclass method composed of five distinct classes of herbicides, in addition to an insecticide class and an individual method, for the imidazolinone class herbicides, in the biomix that compose biobeds and its determination applying HPLC-MS/MS. To evaluate biobeds efficiency through the contamination of reactors, with those active ingradients under study and verifying their degradation over time with collections and subsequent analysis at different times, was also a goal in this project. To method validation studies, the criterias of linearity, linear range, matrix effect, limit of detection (LD) and limit of quantification (LQ), precision, intermediate precision and accuracy were evaluated. For those pesticides determined via individual method, imazapic and imazethapyr, the detection and quantification limits were 12.5 μg kg -¹ and 20 μg kg -¹ respectively. For all pesticides determined via multiclass method, 2,4-D, acetochlor, atrazine, diuron, dicamba and methidathione, the LOD was 8 μg kg -¹ and LOQ 20 μg kg -¹. The positive matrix effect for the imidazolinone extraction method was very evident by comparing the analytical curves data, prepared in organic solvent and in blank matrix extract, because the biomix is a very complex matrix and the extraction procedure has a high pH variation, which influences the interferents co-extraction. The analysis of biomix samples from contaminated biobeds showed that most of pesticides (2,4-D, atrazine, diuron, methidathione) under study were degraded. The exception was for imazethapyr, which possibly due to its known persistence in environment and dependence on specific conditions to be available and to be biodegraded, was not degrated. Further more, dicamba presented a lower biodegradation compared to other pesticides, that may be due to interactions with other pesticides discharged in to the biobed. Os agrotóxicos são mundialmente empregados na produção agrícola de diferentes culturas a fim de evitar perdas na produção devido ao ataque de pragas e doenças. Devido ao aumento na produção de alimentos e, consequentemente o uso de agrotóxicos, cresce a preocupação com a destinação correta de seus resíduos. Assim, a partir de 1990 começaram a ser desenvolvidas camas biológicos a fim de reduzir a contaminação por derramamentos acidentais durante o preparo da calda e na lavagem de pulverizadores. A biomistura, composta por solo, palha e turfa, que compõe as camas biológicas é a principal responsável por reter e biodegradar os agrotóxicos. Dentre as diferentes classes de agrotóxicos existentes, os herbicidas representam um grande percentual (59,56%) dos princípios ativos mais vendidos no Brasil. Portanto, o principal objetivo deste estudo foi desenvolver e validar dois métodos de extração para determinação de agrotóxicos. Um método multiclasse, composto por cinco classes distintas de herbicidas, além de uma classe de inseticida e um método individual, para os herbicidas da classe das imidazolinonas, na biomistura que compõe as camas biológicas e sua determinação empregando HPLC-MS/MS. Também objetivou-se avaliar a eficiência das camas biológicas através da contaminação de reatores, com os princípios ativos em estudo e verificar sua degradação ao longo do tempo com coletas e posterior análise. No estudo de validação, foram avaliados os critérios de linearidade, faixa linear, efeito matriz, limite de detecção (LD) e limite de quantificação (LQ), precisão, precisão intermediária e exatidão. Para os agrotóxicos do método individual, do imazapique e imazetapir, os limites de detecção (LD) e quantificação (LQ) foram de 12,5 μg kg -¹ e 20 μg kg -¹ respectivamente. Já para os agrotóxicos do método multiclasse, composto pelo 2,4-D, acetocloro, atrazina, diuron, dicamba e metidationa, o LD foi de 8 μg kg -¹ e LQ de 20 μg kg -¹. O efeito matriz positivo para o método de extração das imidazolinonas ficou bem evidente através da comparação das curvas analíticas preparadas em solvente orgânico e no extrato branco da matriz, pois além da biomistura ser uma matriz complexa, o procedimento de extração apresenta uma alta variação de pH, o que influencia na coextração de interferentes. A análise de amostras de biomistura de camas biológicas contaminadas demonstrou que a maior parte (2,4-D, atrazina, diuron, metidationa) dos agrotóxicos em estudo foi degradada. A exceção foi para o imazetapir, que não foi biodegradado, possivelmente devido a sua conhecida persistência no ambiente e dependência de condições específicas para estar disponível e poder ser biodegradado. Além disso, o dicamba teve uma menor biodegradação em comparação com os demais agrotóxicos, fato que pode estar associado com possíveis interações deste com os demais agrotóxicos aplicados nas camas biológicas.

Orientador: Carla Beatriz Grespan Bottoli Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química Resumo: Nas últimas décadas, crescentes estudos têm sido observados na área da miniaturização de sistemas cromatográficos e preparo de amostras. Atualmente, os sistemas miniaturizados visam rapidez, eficiência, economia, segurança e menores limites de detecção. Seguindo essa tendência, a cromatografia líquida capilar (CLC) tem evoluído principalmente no desenvolvimento de novas fases estacionárias, com destaque para as colunas monolíticas (a base de sílica, orgânicas e híbridas). Os monolitos híbridos têm se destacado, pois combinam as vantagens dos monolitos orgânicos e dos baseados em sílica. Várias estratégias de síntese para a produção desse tipo de coluna têm sido utilizadas, como sol-gel, one-pot e click chemistry. Além do uso como fase estacionária, monolitos também podem ser utilizados no preparo de amostras como sorvente de métodos microextrativos. Um exemplo de técnica miniaturizada que utiliza sorventes como fase extratora é a microextração adsortiva em barra (BAµE, do inglês, Bar Adsorptive Microextraction). Desta maneira, esta tese teve como objetivo o desenvolvimento de novos materiais monolíticos híbridos utilizando reações do tipo click tiol-eno como rota sintética na produção de fases estacionárias para CLC e sorventes monolíticos para dispositivos microextrativos com barra adsortiva. Foram desenvolvidas colunas monolíticas híbridas baseadas na síntese sol-gel com pós-funcionalização via reação click tiol-eno com dodecanotiol (monolito A) com eficiência de 16.500 pratos m-1. Além das colunas, foram aplicados como sorventes outros dois materiais monolíticos híbridos para o preparo de amostras: o monolito B funcionalizado com mercaptotetrazol e o monolito C seguindo uma síntese one-step com dodecanotiol. Quando aplicados somo sorventes em dispositivos impressos em 3D, apresentaram retenções de 96% e eluição de 60% para tiametoxam e imidacloprida. Ao serem empregados como dispositivos em barra da BAµE, os três materiais sintetizados apresentaram porcentagens de extração global entre valores próximos de 80% para compostos mais apolares e em torno de 40% para compostos mais polares. Desta forma, é de grande interesse que as aplicações dos materiais monolíticos híbridos continuem sendo exploradas com o objetivo de melhorar as eficiências de separação e de extração para CLC e novas técnicas microextrativas Abstract: In recent decades, increasing studies have been observed in miniaturization of chromatographic systems and sample preparation. Currently, miniaturized systems aim at speed, efficiency, economy, safety, and increasingly lower detection limits. Following this trend, capillary liquid chromatography (CLC) has evolved mainly in the development of new stationary phases, with emphasis on monolithic columns (silica-based, organic and hybrid). Hybrid monoliths have stood out as they combine the advantages of organic and silica-based monoliths. Several synthesis strategies such as sol-gel, one-pot and click chemistry have been used to produce this type of column. In addition to being used as a stationary phase, monoliths can also be used as a sorbent for microextractive methods in sample preparation. An example of a miniaturized technique that uses sorbents as the extracting phase is bar adsorptive microextraction (BAµE). Thus, this thesis aimed to develop new monolithic hybrid materials using thiol-ene click reactions as a synthetic route in the production of stationary phases for CLC and monolithic sorbents for microextractive devices with adsorptive bar. Hybrid monolithic columns based on sol-gel synthesis with post-functionalization via click reaction thiol-ene with dodecanethiol (monolith A) with efficiency of 16,500 plates m-1 were developed. In addition to the columns, two other monolithic hybrid materials were synthesized and applied as sorbents in microextractive devices for sample preparation: monolith B functionalized with mercaptotetrazole and monolith C following a one-step synthesis with dodecanethiol. When applied as sorbents on 3D printed devices, 96% retentions and 60% elution for thiamethoxam and imidacloprid were obtained. The results of the BAµE bar devices for the three synthesized materials were close to 80% for more nonpolar compounds and around 40% for more polar compounds. Thus, it is of great interest that the applications of hybrid monolithic materials continue to be explored with the objective of improving separation and extraction efficiencies for CLC and new microextractive techniques Doutorado Química Analítica Doutora em Ciências FAPESP (2014/50867-3 CNPQ 88887318262/2019-00

Base teórica: A vancomicina é um antimicrobiano amplamente utilizado como tratamento de primeira linha para infecções por Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA). Na ausência de novas alternativas de antimicrobianos, o Monitoramento Terapêutico (MT) é essencial para otimizar a dosagem daqueles préexistentes. Assim, é possível aumentar a eficiência do tratamento minimizando efeitos adversos e prevenindo o surgimento de resistência microbiana. Considerando a importância da dosagem da concentração sanguínea no MT da vancomicina, dois trabalhos foram realizados. Trabalho 1. Objetivo: Desenvolvimento e validação analítica e clínica de um método de cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas em sequência (LC-MS/MS) para determinação simultânea de vancomicina e creatinina em amostras de sangue seco em papel, ou Dryed Blood Spots (DBS). Métodos: O método de LC-MS/MS para dosagem de vancomicina e creatinina em DBS foi validado de acordo com os parâmetros linearidade, precisão, acurácia e eficiência da extração. As concentrações de vancomicina e de creatinina foram então determinadas a partir de 54 e 35 amostras pareadas de DBS e de plasma, respectivamente, obtidas de 29 pacientes. Resultados: O método apresentou linearidade satisfatória com coeficientes de correlação acima de 0.99 para vancomicina e creatinina. Os resultados de precisão, acurácia e sensibilidade atenderam aos critérios de aceitação. As concentrações de vancomicina e creatinina em DBS e plasma foram significativamente correlacionadas: r = 0.892, p

Orientador: Carla Beatriz Grespan Bottoli Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química Resumo: O dendezeiro é uma das principais matrizes vegetais da cultura brasileira e uma das principais produções no norte do país. O dendê se destaca mundialmente por ser o fruto com maior produtividade de óleo do mundo. Apesar da importância econômica deste fruto e do conhecimento a respeito das principais doenças e pragas que podem atacar o dendezeiro e como combate-las, a literatura carece de metodologia analíticas para quantificação de resíduos de agrotóxicos no dendê. Tendo isto em vista, este trabalho tem como objetivo principal o desenvolvimento e validação de uma metodologia analítica para determinação de abamectina em dendê através da técnica de cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à espectrometria de massas sequencial. Quanto à etapa de extração, foi escolhido o uso do método QuEChERS modificado com acetato de sódio e uma etapa de limpeza envolvendo PSA. Para a etapa de validação foram avaliados os parâmetros efeito matriz, seletividade, linearidade, limite de quantificação, precisão e exatidão conforme preconizam as normas do ministério da agricultura, pesca e abastecimento. O método apresentou um efeito matriz significativo, um limite de quantificação de 25 µg/L e resultados dentro das faixas definidas pela legislação para exatidão e precisão em uma faixa linear de 25 a 125 µg/L. O método foi validado e utilizado em amostras de dendê tratadas com abamectina onde não se obteve sinal analítico referente à abamectina, indicando a não existência de resíduos do pesticida no fruto após seu tratamento em quantidade superior ao limite de quantificação do método Abstract: The dendê palm is one of the main vegetable matrices of Brazilian culture and one of the main productions in the north of the country. The dendê fruit stands out worldwide for being the fruit with the highest oil productivity in the world. Despite the economic importance of this fruit and knowledge about the main diseases and pests that can attack dendê palm and how to combat them, the literature lacks of analytical methodologies for quantifying pesticide residues in dendê fruit. With this in mind, this work has as main objective the development and validation of an analytical methodology for the determination of abamectin in dendê fruit through the technique of high performance liquid chromatography coupled to sequential mass spectrometry. As for the extraction step, the use of the QuEChERS method modified with sodium acetate and a clean-up step involving PSA were chosen. For the validation stage, the parameters matrix effect, selectivity, linearity, quantification limit, precision and accuracy were evaluated as recommended by the norms of the Ministério da Agricultura, Pesca e Abastecimento. The method showed a significant matrix effect, a quantification limit of 25 µg/L and results within the ranges defined by legislation for accuracy and precision in a linear range of 25 to 125 µg/L. The method was validated and used in samples of dendê fruit treated with abamectin where no analytical signal regarding abamectin was obtained, indicating the non-existence of pesticide residues in the fruit after treatment in an amount greater than the quantification limit of the method Mestrado Química Analítica Mestre em Química CAPES 001

Aquesta Tesi Doctoral se centra principalment en el desenvolupament i aplicació de mètodes analítics sensibles i selectius per a la determinació enantiomèrica d'un grup de catinones en mostres d'aigües mediambientals mitjançant l'ús d'extracció en fase sòlida (SPE) seguida de cromatografia líquida (LC) quiral acoblada amb espectrometria de masses d'alta resolució (HRMS). Amb aquesta finalitat, en la primera part d'aquesta Tesi, es van desenvolupar mètodes de separació LC quirals per al grup d'anàlits d'estudi. Es van avaluar diferents fases estacionàries quirals i diferents modes d'elució. També es van provar i optimitzar diferents variables per aconseguir enantioseparacions satisfactòries. A la segona part, el mètode d'enantioseparació optimitzat es va acoblar a HRMS per a la determinació enantiomèrica de cinc catinones en mostres d'aigües mediambientals. Per millorar la selectivitat dels mètodes, es van avaluar diferents sorbents d'SPE (incloent sorbents de mode-mixt d'intercanvi catiònic i d'empremta molecular) per a l'extracció de les catinones. Es van optimitzar diferents paràmetres d'SPE per aconseguir recuperacions i selectivitat elevades per als anàlits. El mètode desenvolupat es va aplicar amb èxit per a la determinació enantiomèrica de catinones en mostres d'aigua de riu i efluents d'aigües residuals. Esta Tesis Doctoral se centra principalmente en el desarrollo y aplicación de métodos analíticos sensibles y selectivos para la determinación enantiomérica de un grupo de catinonas en muestras de aguas medioambientales mediante el uso de extracción en fase sólida (SPE) seguida de cromatografía líquida (LC) quiral acoplada con espectrometría de masas de alta resolución (HRMS). Para este propósito, en la primera sección de esta Tesis, se desarrollaron métodos de separación quirales por LC para los analitos de interés. Se evaluaron diferentes fases estacionarias quirales y en diferentes modos de elución. También se probaron y optimizaron distintos parametros para lograr enantioseparaciones satisfactorias. En la segunda sección, se acopló el método optimizado de separación enantiomérica al HRMS para la determinación enantiomérica de cinco catinonas en muestras de aguas medioambientales. Para mejorar la selectividad de los métodos, se evaluaron diferentes sorbentes de SPE (incluyendo los de modo-mixto de intercambio catiónico y de huella molecular) para la extracción de las catinonas. Se optimizaron diferentes parámetros de SPE para lograr altas recuperaciones y selectividad para los analitos. El método desarrollado se aplicó con éxito para la determinación enantiomérica de catinonas de interés en muestras de agua de río y efluentes de aguas residuales. This Doctoral Thesis is mainly focused on the development and application of sensitive and selective analytical methods for the enantiomeric determination of a group of cathinones in environmental water samples on the use of solid-phase extraction (SPE) followed by chiral liquid chromatography (LC) coupled with high-resolution mass spectrometry (HRMS). For this purpose, in the first section of this Thesis, chiral LC separation methods were developed for target analytes. Different chiral stationary phases were evaluated for their chiral recognition abilities in different elution modes. The factors that affected the enantioseparation were optimized to achieve successful enantioseparations. In the second section, the optimized enantioseparation method was coupled to HRMS for the enantiomeric determination of five cathinones in environmental water samples. To improve the selectivity of the methods, different SPE sorbents (including mixed-mode cationic exchange sorbents and molecularly imprinted polymers) were assessed for the extraction of target cathinones. Different SPE parameters were carefully optimized to achieve high recoveries and selectivity for the analytes. The developed method was successfully applied for the enantiomeric determination of target cathinones in river water and effluent wastewater samples.

Orientador: José Luiz da Costa Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: O aparecimento de Novas Substâncias Psicoativas (NSP) no mercado ilícito mundial cresceu significativamente desde os anos 2000. Apesar da queda no número de novas identificações anualmente, elas ainda causam severos casos de intoxicações, diversos deles fatais. O presente trabalho desenvolveu e validou um método para a análise de mais de 100 NSP e drogas de abuso convencionais em amostras de fluido oral (OF) e analisado por cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas sequencial (LC-MS/MS). Foram coletadas 462 amostras em festas e festivais de música eletrônica em 3 estados brasileiros e analisadas com a metodologia desenvolvida. O 3,4-metilenodioximetanfetamina (MDMA, 88%) ainda foi a substância mais identificada nas amostras, mas 39% das amostras continham alguma NSP. Cetamina (75%) foi a mais prevalente, seguido da metilona (15%) e N-etilpentilona (10%). Ainda assim, apenas 5% dos voluntários haviam reportado o consumo de alguma NSP. A ingestão de múltiplas substâncias foi muito prevalente, com 80% das amostras contendo duas ou mais substâncias. Este foi o primeiro dado publicado no Brasil contendo dados epidemiológicos do consumo de NSP através da análise de amostras biológicas em contexto recreacional. As amostras contendo catinonas sintéticas foram quantificadas usando microextração por sorvente empacotado (MEPS). Entre as 41 amostras, metilona, N-etilpentilona, eutilona, mefedrona e 4-CEC foram quantificadas. As amostras contendo LSD foram quantificadas, assim como seu principal produto de biotransformação, 2-oxo-3-hidroxi-LSD, com limite de detecção de 0,01 ng/mL. Este foi o primeiro dado publicado na literatura contendo quantificação de ambos analitos em amostras autênticas de fluido oral. Ainda, como forma de suprir a necessidade de obter mais informações sobre as NSP, foi realizado o ensaio de metabolismo in vitro do canabinóide sintético ADB-4en-PINACA usando microssomas hepáticos humanos (HLM) e analisado com espectrômetro de massas de alta resolução. Dos 11 metabólitos identificados in vitro, 7 foram confirmados em amostras de sangue e urina post mortem., sendo os metabólitos derivados de hidroxilação e hidroxilação seguida de hidrólise interna os mais intensos Abstract: New Psychoactive Substances (NPS) emergence of in the global illicit market has grown significantly since the 2000s. Despite the drop in the number of new identifications annually, they still cause severe cases of intoxication, many of them fatal. The present work developed and validated a method for the analysis of more than 100 NPS and conventional drugs of abuse in oral fluid (OF) samples and analyzed by liquid chromatography?tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). 462 samples were collected at parties and electronic music festivals in 3 Brazilian states and analyzed using the developed methodology. 3,4-methylenedioxymethamphetamine (MDMA, 88%) was still the most identified substance in the samples, but 39% of them contained some NPS. Ketamine (75%) was the most prevalent, followed by methylone (15%) and N-ethylpentylone (10%). Even so, only 5% of the volunteers had reported some NPS consumption. Ingestion of multiple substances was very prevalent, with 80% of samples containing two or more substances. This was the first data published in Brazil containing epidemiological data on NPS consumption through the analysis of biological samples in a recreational context. Samples containing synthetic cathinones were quantified using microextraction by packed sorbent (MEPS). Among the 41 samples, methylone, N-ethylpentylone, euthylone, mephedrone and 4-CEC were quantified. Samples containing LSD were quantified, as well as its main biotransformation product, 2-oxo-3-hydroxy-LSD, with limit of detection of 0.1 ng/mL. This was the first published data quantifying both analytes in authentic oral fluid samples. Also, to meet the need for more information regarding NPS, an in vitro metabolism assay of the synthetic cannabinoid ADB-4en-PINACA was performed using human liver microsomes (HLM) and analyzed with a high-resolution mass spectrometer. Of the 11 metabolites identified in vitro, 7 were confirmed in post mortem blood and urine samples, with the metabolites derived from hydroxylation and hydroxylation followed by internal hydrolysis being the most intense Doutorado Farmacologia Doutora em Farmacologia FAPESP 2018/11849-0 CAPES 88887.571786/2020-00

Aromatic l-amino acid decarboxylase (AADC, EC 4.1.1.28) deficiency is a rare genetic disorder characterized by developmental delay, oculogyric crises, autonomic dysfunction and other problems, caused by biallelic mutations in the DDC gene leading to deficient activity of aromatic l-amino acid decarboxylase, an enzyme involved in the formation of important neurotransmitters, such as dopamine and serotonin. A clinical development program of gene therapy for AADC deficiency is ongoing. An important step for the success of this therapy is the early and precise identification of the affected individuals, but it has been estimated that around 90% of the cases remain undiagnosed. The availability measurement of the AADC activity is mandatory for an accurate biochemical diagnosis. Based on these statements, our objectives were to develop a liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) method suitable for the determination of the AADC activity, and to evaluate its capacity to confirm the deficiency of AADC in potential patients in Brazil. The AADC activities were measured in plasma samples of seven AADC deficient patients and 35 healthy controls, after enzymatic reaction and LC-MS/MS analysis of dopamine, the main reaction product. The results obtained showed clear discrimination between confirmed AADC deficient patients and healthy controls. The method presented here could be incorporated in the IEM laboratories for confirmation of the diagnosis of when a suspicion of AADC deficiency is present due to clinical signs and/or abnormal biomarkers, including when an increased level of 3-O-methyldopa (3-OMD) is found in dried blood spots (DBS) samples from high-risk patients or from newborn screening programs.

The active germplasm bank (AGB) of Carapichea ipecacuanha (Brot.) L. Andersson at Embrapa Eastern Amazon, in the city of Belém, PA, was the first of its kind to be opened in Brazil for this endangered medicinal species and holds important accessions for agricultural and reproductive research, including the production of active principles. This study aimed to chemically characterize 42 accessions from that AGB by simultaneously quantifying cephaeline and emetine contents in roots using high-performance liquid chromatography with a diode-array detector (HPLC-DAD). Cephaeline concentrations ranged from ‘undetected’ to 1.76%, whereas emetine concentrations were found between 0.64% and 2.49%. The overall emetine/cephaeline ratio varied from 0.43 to 3.52. The differences among mean concentrations of alkaloids observed by comparing the Scott-Knott test at 5% probability suggest the chemical variation among the samples assessed. Therefore, it is concluded such chemical differences may favor the selection of genetic material for commercial purposes based on the production of emetine and/or cephaeline, likewise may contribute to breeding programs. El banco de germoplasma activo (BGA) de Carapichea ipecacuanha (Brot.) L. Andersson de Embrapa Amazônia Oriental, en la ciudad de Belém, PA, fue el primero de su tipo en instalarse en Brasil para esta especie medicinal en peligro de extinción y cuenta con importantes accesos a la investigación agrícola y reproductiva, incluida la producción de principios activos. El objetivo de este estudio fue caracterizar químicamente 42 accesiones de esta BAG, cuantificando simultáneamente el contenido de cefalina y emetina en raíces mediante cromatografía líquida de alta resolución con detector diodo array (HPLC-DAD). Las concentraciones de cefalina variaron de "no detectado" a 1,76%, mientras que las concentraciones de emetina se encontraron entre 0,64% y 2,49%. La relación emetina/cefalina osciló entre 0,43 y 3,52. Las diferencias entre las concentraciones medias de alcaloides observadas al comparar la prueba de Scott-Knott al 5% de probabilidad sugieren una variación química entre las muestras evaluadas. Por tanto, se concluye que tales diferencias químicas pueden favorecer la selección de material genético con fines comerciales a partir de la producción de emetina y/o cefalina, de la misma forma que pueden ayudar a los programas de mejoramiento. O banco ativo de germoplasma (BAG) de Carapichea ipecacuanha (Brot.) L. Andersson da Embrapa Amazônia Oriental, na cidade de Belém, PA, foi o primeiro do tipo a ser instalado no Brasil para essa espécie medicinal ameaçada de extinção e detém importantes acessos à pesquisa agrícola e reprodutiva, incluindo a produção de princípios ativos. Este estudo teve como objetivo caracterizar quimicamente 42 acessos desse BAG quantificando simultaneamente os teores de cefalina e emetina em raízes por meio de cromatografia líquida de alta eficiência com detector de arranjo de diodos (HPLC-DAD). As concentrações de cefalina variaram de ‘não detectado’ a 1,76%, enquanto as concentrações de emetina foram encontradas entre 0,64% e 2,49%. A relação emetina/cefalina variou de 0,43 a 3,52. As diferenças entre as concentrações médias de alcaloides observadas pela comparação com o teste de Scott-Knott a 5% de probabilidade sugerem variação química entre as amostras avaliadas. Portanto, conclui-se que tais diferenças químicas podem favorecer a seleção de material genético para fins comerciais a partir da produção de emetina e/ou cefalina, da mesma forma que podem auxiliar programas de melhoramento.

The presence of steroid hormones in lake waters causes contamination of aquatic ecosystems, which may cause endocrine alterations in the organisms that inhabit them. Moreover, many of these waters are purified and distributed to populations located around the lake; therefore, these effects could be repeated in humans who consume these waters. This study reports the presence of steroid hormone residues in the waters of the inner bay of Lake Titicaca and drinking water in the city of Puno-Perú. The Solid phase extraction method was used for sample preparation, and the analyses were developed in an HPLC-DAD system. Results show maximum concentrations of steroid hormones estrone (E1) 1.56, 17 β- estradiol (E2) 2.27, 17 α- ethinylestradiol (EE2) 13. 88 ng L-1 respectively. These concentrations vary at the different monitoring points, and their presence could cause ecotoxicological effects to the endemic aquatic biota that inhabit this part of this lake; at the same time they also could affect the health of the human population that consumes this water La presencia de hormonas esteroides en las aguas de los lagos provoca la contaminación de los ecosistemas acuáticos, lo que puede provocar alteraciones endocrinas en los organismos que los habitan. Además, muchas de estas aguas se depuran y distribuyen a las poblaciones ubicadas alrededor del lago; por tanto, estos efectos podrían repetirse en los seres humanos que consumen estas aguas. Este estudio reporta la presencia de residuos de hormonas esteroides en las aguas del interior de la bahía del lago Titicaca y agua potable en la ciudad de Puno (Perú). Para la preparación de la muestra se utilizó el método de extracción en fase sólida y los análisis se desarrollaron en un sistema HPLC-DAD, laboratorio CENA- USP- Brasil. Los resultados muestran concentraciones máximas de hormonas esteroides estrona (E1) 1,56, 17 β-estradiol (E2) 2,27, 17 α-etinilestradiol (EE2) 13. 88 ng L-1 respectivamente. Estas concentraciones varían en los diferentes puntos de monitoreo, y su presencia podría ocasionar efectos ecotoxicológicos a la biota acuática endémica que habita esta parte de este lago; al mismo tiempo también podrían afectar la salud de la población humana que consume esta agua

Dissertação de Mestrado em Segurança Alimentar apresentada à Faculdade de Farmácia The consumption of pistachios (Pistacia vera L.) has been increasing, given its important benefit in human health. In addition to an excellent nutritional source, it has associated chemical hazards, such as mycotoxins, resulting of fungal contamination and its secondary metabolism. Pistachios are one of nuts with higher mycotoxin’s contamination worldwide, especially Aflatoxin B1 with a hepatotoxic effect and classified as proven carcinogenic to humans by the International Agency for Research on Cancer (IARC). More mycotoxins as ochratoxin A (OTA), fumonisins (FBs), zearalenone (ZEA) and trichothecenes (T2, HT2 and DON) and emerging mycotoxins have been concerned in nuts. This study developed a Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, and Safe (QuEChERS) method followed by Ultra-High Performance Liquid Chromatography combined with Time-of-Flight Mass Spectrometry (UHPLC–ToF-MS) for the determination of multi-mycotoxins in pistachios.Different approaches in dispersive solid phase extraction (d-SPE) as clean-up for high-lipid matrix were to evaluate. For this, classic sorbents, like C18 (octadecyl modified silica) and PSA (primary secondary amine) and new classes of sorbents, namely EMR-Lipid (enhanced matrix removal-lipid) and Z-Sep (modified silica gel with zirconium oxide) are used. Method with 100 mg Z-Sep sorbent provided the best analytical performance, with good recovery (79 to 120%), repeatability (RSDr

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES Fundação de Apoio à Tecnologia e Ciência - FATEC Denosumab (DmAb) is monoclonal antibody (mAb) that inhibits proliferation and activity of osteoclasts cells, that is commercially available in Brazil as Prolia® and Xgeva®, for treatment of bone diseases. Structurally, it is composed of two heavy chains and two light chains, having a molecular mass of 147 kDa. Fragment crystallizable (Fc) region of heavy chains contain N-glycosylation sites, where are linked structures with sialic acid residues. In this study, a capillary zone electrophoresis (CZE) method was developed and validated to quantitate DmAb and its charge variants in biopharmaceutical products. Uncoated fused-silica capillaries (50 μm i.d., 56 cm effective length) were employed, and the background electrolyte (BGE) solution was a 300 mmol/L epsilon-aminocaproic acid (EACA) and 2 mmol/L triethylenetetramine (TETA) buffer at pH 4.8 and 0.03% (v/v) Tween 20. DmAb samples were analyzed at a concentration of 5 mg/mL, spiked with the internal standard. Equally, the sialic acids levels of DmAb were determined by an reversed-phase liquid chromatography method with fluorescence detection (RP–HPLC–F), with a Kinetex® EVO C18 column (5 μm i.d., 100 Å, 250 mm × 4.6 mm). The sialic acids were released from DmAb biomolecules in a 0.5 mol/L sodium bisulfate solution (80 °C, 20 min), followed by derivatization reaction with the 40 mg/mL O-phenylenediamine (OPD) reagent (80 °C, 40 min). Besides, the in vitro bioassay was validated using RAW 264.7 macrophage cells (ATCC® TIB−71TM) that differentiated into osteoclasts. The DmAb potency were evaluated by its capacity of inhibits osteoclast cells proliferation induced in vitro. The CZE separation was obtained with a migration time approximately 11.3 min for DmAb. The CZE method demonstrated to be specific, accurate (101.61%) and robust, and were applied in conjunction with the size exclusion and reversed-phase liquid chromatographic (SE–HPLC and RP–HPLC) methods, previously validated, and with in vitro bioassay to quantitate DmAb in seven batches of Prolia®, giving mean values of content/potencies between 98.44% and 101.52%. These results were compared, demonstrating significant correlation (r > 0.98). The analytical methods enabled also to monitor charge variants, high-molecular-weight (HMW) proteins and fragments from DmAb. The RP−HPLC‒F method showed three separated peaks related to sialic acids of the DmAb biomolecule, with retention times of 9.2, 10.9, e 12.0 min. Pharmaceutical products Prolia® and Xgeva® showed 0.16 and 0.17 μg sialic acids/mg DmAb, respectively. Finally, after validation studies, the in vitro bioassay demonstrated to be specific, accurate (102.33%) and robust to evaluation of DmAb potency and were applied in conjunction with the SE–HPLC method to quantitate DmAb in six batches of Prolia®, giving mean values of content/potencies of 100.80% e 100.87%, respectively. Therefore, it is suggested that the analytical methods and the in vitro bioassay can be applied in conjunction to analyze DmAb biotechnology-derived products, establishing analytical tools that will assure the quality of the products and basis for future studies of biosimilarity of DmAb. O denosumabe (DmAb) é um anticorpo monoclonal (mAb) que inibe a proliferação e atividade de células osteoclásticas e encontra-se disponível comercialmente no Brasil como Prolia® e Xgeva®, para tratamento de doenças ósseas. Estruturalmente, apresenta duas cadeias leves e duas cadeias pesadas, com massa molecular de 147 kDa. A região região do fragmento cristalizável (Fc) das cadeias pesadas apresenta sítios de N-glicosilação, onde se ligam estruturas com resíduos de ácido siálico. Neste trabalho, desenvolveu-se e validou-se método por eletroforese capilar de zona (ECZ) para a avaliação de DmAb e suas variantes de carga em produtos biofarmacêuticos. Foi utilizado capilar de sílica fundida não revestido (50 μm d.i., 56 cm) e solução eletrolítica composta de tampão ácido épsilon-aminocaproico (EACA) 300 mmol/L e trietilenotetramina (TETA) 2 mmol/L, pH 4,8, adicionado de Tween 20 0,03% (v/v). As amostras de DmAb foram analisadas na concentração de 5 mg/mL, adicionadas de padrão interno. Paralelamente, determinou-se o conteúdo de ácidos siálicos da biomolécula de DmAb por cromatografia líquida em fase reversa com detecção por fluorescência (CL‒FR‒F), utilizando coluna C18 Kinetex® EVO (5 μm d.i., 100 Å, 250 mm × 4,6 mm). Os resíduos de ácidos siálicos foram liberados da molécula de DmAb por reação com bissulfito de sódio 0,5 mol/L (80 ºC, 20 min), seguida de derivatização com ortofenilenodiamina (OPD) 40 mg/mL (80 ºC, 40 min). Além disso, o bioensaio in vitro foi validado utilizando células de macrófagos RAW 264,7 (ATCC® TIB−71TM) que se diferenciaram em osteoclastos. A potência do DmAb foi avaliada pela capacidade de inibir a formação osteoclástica induzida in vitro. A separação eletroforética foi obtida com tempo de migração de 18,1 min para o DmAb. O método por ECZ demonstrou-se específico, exato (101,61%) e robusto e foi então aplicado em conjunto com métodos por cromatografia líquida por exclusão molecular e em fase reversa (CL‒EM e CL‒FR), previamente validados, e com o bioensaio in vitro, para quantificação de DmAb em sete lotes de Prolia®, fornecendo valores médios de teores/potências entre 98,44% e 101,52%. Estes resultados foram comparados, demonstrando correlação significativa (r > 0,98). Os métodos analíticos também permitiram monitorar a presença de variantes de carga, proteínas de alta massa molecular e fragmentos de DmAb. No método por CL‒FR‒F, foram separados três picos cromatográficos referentes aos ácidos siálicos da biomolécula de DmAb, com tempos de retenção de 9,2, 10,9, e 12,0 min. Os produtos biofarmacêuticos Prolia® e Xgeva® apresentaram 0,16 e 0,17 μg ácidos siálicos/mg DmAb, respectivamente. Por fim, após estudos de validação, o bioensaio in vitro demonstrou-se específico, exato (102,33%) e robusto para avaliação de potência de DmAb e foi aplicado em conjunto com método por CL‒EM para quantificação de DmAb em de seis lotes de Prolia®, fornecendo valores médios de teores/potências de 100,80% e 100,87%, respectivamente. Sendo assim, sugere-se que os métodos analíticos e o bioensaio in vitro sejam aplicados em conjunto para análise dos produtos biotecnológicos de DmAb, estabelecendo uma ferramenta analítica que assegurará a qualidade dos produtos e que servirá de base para futuros estudos de biossimilaridade de DmAb.