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Ustilago maydis, der Erreger des Maisbeulenbrandes, ist ein biotrophes Pflanzen-pathogen, das auf lebendes Pflanzengewebe angewiesen ist, um seinen Lebenszyklus zu beenden. Dies erfordert eine effiziente Unterdrückung des pflanzlichen Immunsystems, was durch die Sekretion sogenannter Effektorproteine erzielt wird. Ein Beispiel für einen solchen Effektor ist Pit2 (Protein important for tumors 2, Um01375). pit2-Deletionsmutanten können zwar Maispflanzen kolonisieren, sind jedoch nicht mehr dazu fähig, die Entstehung der für diesen Pilz charakteristischen Pflanzentumore zu induzieren. Stattdessen kommt es zu verstärktem Auftreten von Chlorosen in infizierten Pflanzen, was auf eine erhöhte Aktivität pflanzlicher Abwehrmechanismen hindeutet. Es konnte gezeigt werden, dass Pit2 mit den Abwehr-assoziierten apoplastischen Cysteinproteasen CP1A/B, CP2 und XCP2 interagiert und diese spezifisch inhibiert. Durch Sequenzvergleiche mit Pit2-Orthologen aus verwandten Brandpilzen konnte ein 14 Aminosäuren umfassendes Motiv (PID14) identifiziert werden, welches zur Protease-Interaktion und -Inhibition benötigt wird und zudem essentiell für die Virulenz von U. maydis ist. Darüber hinaus können synthetische UmPID14-Peptide apoplastische Maisproteasen inhibieren und die Virulenz der pit2-Deletionsmutanten partiell wieder herstellen. Diese Ergebnisse zeigen, dass Pit2 durch Inhibition apoplastischer Cysteinproteasen die pflanzliche Abwehr blockiert und dem Pilz dadurch die Etablierung und Aufrechterhaltung einer biotrophen Interaktion ermöglicht. Zusätzlich konnte durch Komplementationsversuche gezeigt werden, dass Pit2-Orthologe aus den verwandten Brandpilzen Ustilago hordei, Sporisorium reilianum oder Melanopsichium pennsylvanicum im U. maydis-Mais-Pathosystem nicht funktionell sind. Es wurde außerdem gezeigt, dass die orthologen PID14-Regionen innerhalb von UmPit2 die Funktion der UmPID14 in planta nicht ersetzen können. Umgekehrt war es jedoch möglich, die Wildtypvirulenz mithilfe von Chimären bestehend aus den orthologen Pit2-Proteinen kombiniert mit der UmPID14-Region teilweise wieder herzustellen. Insgesamt deuten diese Beobachtungen auf eine Wirtsspezifität der verschiedenen Pit2-Orthologe hin, die durch die jeweilige PID14-Region determiniert wird.

Ustilago maydis, der Erreger des Maisbeulenbrandes, ist ein biotrophes Pflanzen-pathogen, das auf lebendes Pflanzengewebe angewiesen ist, um seinen Lebenszyklus zu beenden. Dies erfordert eine effiziente Unterdrückung des pflanzlichen Immunsystems, was durch die Sekretion sogenannter Effektorproteine erzielt wird. Ein Beispiel für einen solchen Effektor ist Pit2 (Protein important for tumors 2, Um01375). pit2-Deletionsmutanten können zwar Maispflanzen kolonisieren, sind jedoch nicht mehr dazu fähig, die Entstehung der für diesen Pilz charakteristischen Pflanzentumore zu induzieren. Stattdessen kommt es zu verstärktem Auftreten von Chlorosen in infizierten Pflanzen, was auf eine erhöhte Aktivität pflanzlicher Abwehrmechanismen hindeutet. Es konnte gezeigt werden, dass Pit2 mit den Abwehr-assoziierten apoplastischen Cysteinproteasen CP1A/B, CP2 und XCP2 interagiert und diese spezifisch inhibiert. Durch Sequenzvergleiche mit Pit2-Orthologen aus verwandten Brandpilzen konnte ein 14 Aminosäuren umfassendes Motiv (PID14) identifiziert werden, welches zur Protease-Interaktion und -Inhibition benötigt wird und zudem essentiell für die Virulenz von U. maydis ist. Darüber hinaus können synthetische UmPID14-Peptide apoplastische Maisproteasen inhibieren und die Virulenz der pit2-Deletionsmutanten partiell wieder herstellen. Diese Ergebnisse zeigen, dass Pit2 durch Inhibition apoplastischer Cysteinproteasen die pflanzliche Abwehr blockiert und dem Pilz dadurch die Etablierung und Aufrechterhaltung einer biotrophen Interaktion ermöglicht. Zusätzlich konnte durch Komplementationsversuche gezeigt werden, dass Pit2-Orthologe aus den verwandten Brandpilzen Ustilago hordei, Sporisorium reilianum oder Melanopsichium pennsylvanicum im U. maydis-Mais-Pathosystem nicht funktionell sind. Es wurde außerdem gezeigt, dass die orthologen PID14-Regionen innerhalb von UmPit2 die Funktion der UmPID14 in planta nicht ersetzen können. Umgekehrt war es jedoch möglich, die Wildtypvirulenz mithilfe von Chimären bestehend aus den orthologen Pit2-Proteinen kombiniert mit der UmPID14-Region teilweise wieder herzustellen. Insgesamt deuten diese Beobachtungen auf eine Wirtsspezifität der verschiedenen Pit2-Orthologe hin, die durch die jeweilige PID14-Region determiniert wird., Ustilago maydis, the causative agent of corn smut disease, is a biotrophic plant pathogen that relies on living plant tissue to fulfill its life cycle. This lifestyle requires an efficient suppression of the plant’s immune system which is accomplished by the secretion of so-called effector proteins. One of these effectors is Pit2 (Protein important for tumors 2, Um01375). Deletion mutants for pit2 are still able to penetrate and colonize host plants but fail to induce tumor formation in infected plants. Instead, chlorosis can be observed at infection sites, indicating that an increased activity of plant defense reactions is elicited. Aim of this thesis was the functional characterization of Pit2. Yeast-two-hybrid analyses showed that Pit2 interacts with a set of defense-associated apoplastic maize cysteine proteases (CP1A/B, CP2 and XCP2) and inhibits their activity. Sequence comparison with Pit2 orthologs from related smuts identified a conserved 14 amino acid motif (PID14), which is required for protease inhibition and interaction. This domain is essential for virulence of U. maydis. Moreover, synthetic UmPID14-peptides are able to inhibit the activity of the tested proteases and expression of PID14 in U. maydis SG200Δpit2 partially restores fungal virulence. These results indicate that Pit2 is essential for U. maydis to establish and maintain a biotrophic interaction with maize and that this is determined by the inhibition of apoplastic cysteine proteases. Furthermore it was demonstrated that Pit2 orthologs from the related smuts Ustilago hordei, Sporisorium reilianum or Melanopsichium pennsylvanicum are not functional in the U. maydis-maize pathosystem. These findings were further confirmed by showing that the orthologous PID14-regions are not able to replace the function of the UmPID14-region inside UmPit2 in planta. In contrast to that, virulence of U. maydis SG200Δpit2 was partially restored by chimeric Pit2-versions consisting of any Pit2 ortholog combined with the UmPID14-region. Overall, these observations suggest that the different Pit2 orthologs are host specific and that host specificity is determined by the respective PID14-region.

Ustilago maydis, the causative agent of corn smut disease, depends on a variety of secreted effector proteins, to establish a biotrophic interaction with its host plant maize. The deletion of the gene um01987, which encodes the effector protein Pep1, leads to a complete loss of pathogenicity. Moreover the plant reacts to penetration attempts of the Δpep1-mutant strain with the induction of different defense reactions. This results in e.g. the formation of necrotic lesion as well as in the production of reactive oxygen species at the penetration sites. Pep1 is conserved among different species of smut fungi and contains a N-terminal signal peptide, a conserved core region as well as a low conserved glycine- and serine-rich C-terminus. In the present study, the effector protein Pep1 was heterologously expressed and purified. Via biochemical and molecular biological methods, two plant interaction partners of Pep1 were identified. By Activity based protein profiling it could be demonstrated, that Pep1 specifically inhibits the activity of papaine like cysteine proteases. Particularly, the activity of papaine like cysteine proteases, induced by the salicylic acid signaling pathway, was inhibited by Pep1 very efficiently. Obviously, these proteases are critical for the induction of maize plant defense. Additionally, Pep1 binds and inhibits plant class-III-heme-peroxidases. In cooperation with Christoph Hemetsberger, the in vitro inhibition of the horseradish peroxidase (HRP) could be shown. Moreover the physical interaction of Pep1 with the HRP was demonstrated. During the Δpep1-infection, a single peroxidase, the maize peroxidase-12, is transcriptionally upregulated. Virus induced gene silencing of the peroxidase-12 lead to a partial complementation of the Δpep1-mutant phenotype on POX12si plants. Thus, silencing of peroxidase-12 leads to the suppression of plant defense reactions, such as the formation of papillae, which enables the Δpep1-mutant strain to successfully penetrate the plant tissue. Taken together these results show, that Pep1 inhibits enzymes of the basal plant defense and therefore suppressing the innate immunity of maize against U. maydis., Ustilago maydis, der Erreger des Maisbeulenbrandes, benötigt zur Etablierung einer biotrophen Interaktion mit seiner Wirtspflanze Mais eine Vielzahl sekretierter Effektoren. Die Deletion des für den Effektor Pep1 kodierenden Gens um01987 führt zum vollständigen Pathogenitätsverlust. Die Pflanze reagiert auf Penetrationsversuche der Δpep1-Mutante mit der Induktion verschiedener Abwehrreaktionen, was sich z.B. durch die Bildung nekrotischer Läsionen sowie reaktiver Sauerstoffspezies an den Penetrationsstellen zeigt. Pep1 ist zwischen verschiedenen Brandpilzarten konserviert und besteht aus einem N-terminalen Signalpeptid, einem konservierten Kernbereich sowie einem weniger konservierten Glycin- und Serin-reichen C-Terminus. In der vorliegenden Arbeit wurde das heterolog in E. coli exprimierte Pep1 aufgereinigt. Durch biochemische und molekularbiologische Methoden konnten zwei pflanzliche Bindungspartner von Pep1 identifiziert. So konnte mittels Aktivitäts-basiertem Protein-Profiling gezeigt werden, dass Pep1 spezifisch apoplastische Papain-ähnliche Cysteinproteasen inhibiert. Diese Proteasen spielen offenbar eine wichtige Rolle in der Abwehrinduktion in der Maispflanze. Des Weiteren bindet und inaktiviert Pep1 pflanzliche Klasse-III-Häm-Peroxidasen. In Kooperation mit Christoph Hemetsberger konnte die Hemmung der Horseradish-Peroxidase (HRP) durch Pep1 in vitro gezeigt. Außerdem konnte die physische Interaktion von Pep1 mit der HRP bewiesen werden. Während der Δpep1-Infektion wird eine Mais Peroxidase, die sekretierte Peroxidase-12, transkriptionell induziert. Durch Virus-induziertes-Gen-silencing der Peroxidase-12 konnte eine partielle Restauration des Δpep1-Phänotyps auf POX12si-Pflanzen bewirkt werden. So führte das silencing der Peroxidase-12 zu einer Unterdrückung pflanzlicher Abwehrreaktionen, wie z.B. der Papillenbildung, was eine erfolgreiche Penetration der Δpep1-Mutante ermöglichte. Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, dass Pep1 Enzyme der basalen Pflanzenabwehr inhibiert und somit die angeborene Resistenz der Wirtspflanze gegen U. maydis unterdrückt.

Dipeptid-Bibliotheken mit epoxidischer Ankerfunktion wurden zur Gewinnung von Strukturinformationen über die P’-Bindungstaschen papainähnlicher Cysteinproteasen erzeugt. Die Präferenzen von Cathepsin L, B und X, sowie µ-Calpain wurden ermittelt und auf diesem Weg Inhibitoren mit erhöhter Affinität für Cathepsin L und B erhalten. Im Fall von µ-Calpain war hingegen ein von einem aus dem endogenen Inhibitor Calpastatin erhaltenen Fragment ausgehender Ansatz erfolgreicher. Es wurde ein 20-meres Peptid mit submikromolarer Hemmwirkung gefunden. Die Beteiligung der entsprechenden N- und C- Termini an der selektiven Bindung wurde mit entsprechenden Fragmenten und nicht peptidisch verbrückten Konstrukten ermittelt. Schließlich wurde die potentielle Existenz einer Typ II β-Schleife mit zyklischen homodetischen Peptiden überprüft. Das 20-mere Peptid wurde mit Photoaffinitätsmarkern versehen und zur Bestimmung des Bindungsmodus dieses neuen Inhibitors eingesetzt. Dipeptide libraries with epoxidic anchor function were produced in order to acquire structural information on the primed side binding pockets of papain-like cysteine proteases. The preferences of cathepsin L, B and X, as well as µ-calpain were investigated and inhibitors with augmented affinity for cathepsin L und B were obtained. In the case of µ-calpain, an approach based on a peptide fragment obtained from the endogenous inhibitor calpastatin was more successful. A 20-mer peptide with submicromolar inhibition capacity was found, while the N- and C-terminal parts’ share of the selective binding was elucidated with truncated fragments and non-peptidically bridged constructs. Finally, the previously postulated existence of a type II β-turn was confirmed with cyclic homodetic peptides. The 20-mer peptide was also fitted with photo labeling groups in order to elucidate the binding mode of this novel inhibitor to µ-calpain.