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Ustilago maydis, der Erreger des Maisbeulenbrandes, ist ein biotrophes Pflanzen-pathogen, das auf lebendes Pflanzengewebe angewiesen ist, um seinen Lebenszyklus zu beenden. Dies erfordert eine effiziente Unterdrückung des pflanzlichen Immunsystems, was durch die Sekretion sogenannter Effektorproteine erzielt wird. Ein Beispiel für einen solchen Effektor ist Pit2 (Protein important for tumors 2, Um01375). pit2-Deletionsmutanten können zwar Maispflanzen kolonisieren, sind jedoch nicht mehr dazu fähig, die Entstehung der für diesen Pilz charakteristischen Pflanzentumore zu induzieren. Stattdessen kommt es zu verstärktem Auftreten von Chlorosen in infizierten Pflanzen, was auf eine erhöhte Aktivität pflanzlicher Abwehrmechanismen hindeutet. Es konnte gezeigt werden, dass Pit2 mit den Abwehr-assoziierten apoplastischen Cysteinproteasen CP1A/B, CP2 und XCP2 interagiert und diese spezifisch inhibiert. Durch Sequenzvergleiche mit Pit2-Orthologen aus verwandten Brandpilzen konnte ein 14 Aminosäuren umfassendes Motiv (PID14) identifiziert werden, welches zur Protease-Interaktion und -Inhibition benötigt wird und zudem essentiell für die Virulenz von U. maydis ist. Darüber hinaus können synthetische UmPID14-Peptide apoplastische Maisproteasen inhibieren und die Virulenz der pit2-Deletionsmutanten partiell wieder herstellen. Diese Ergebnisse zeigen, dass Pit2 durch Inhibition apoplastischer Cysteinproteasen die pflanzliche Abwehr blockiert und dem Pilz dadurch die Etablierung und Aufrechterhaltung einer biotrophen Interaktion ermöglicht. Zusätzlich konnte durch Komplementationsversuche gezeigt werden, dass Pit2-Orthologe aus den verwandten Brandpilzen Ustilago hordei, Sporisorium reilianum oder Melanopsichium pennsylvanicum im U. maydis-Mais-Pathosystem nicht funktionell sind. Es wurde außerdem gezeigt, dass die orthologen PID14-Regionen innerhalb von UmPit2 die Funktion der UmPID14 in planta nicht ersetzen können. Umgekehrt war es jedoch möglich, die Wildtypvirulenz mithilfe von Chimären bestehend aus den orthologen Pit2-Proteinen kombiniert mit der UmPID14-Region teilweise wieder herzustellen. Insgesamt deuten diese Beobachtungen auf eine Wirtsspezifität der verschiedenen Pit2-Orthologe hin, die durch die jeweilige PID14-Region determiniert wird.

Ustilago hordei is the causative agent of covered smut on barley and oat. This basidiomycetous fungus establishes a biotrophic interaction with its host plant and therefore relies on a great variety of secreted effector proteins in order to cope with plant defense responses. This particularly implies the avoidance of host cell death reactions. Deletion mutants of the secreted effector Pep1 are blocked in epidermal penetration and elicit various plant defense responses, eventually leading to death of the invaded cell. The virulence factor Pep1 is functionally conserved in the corn smut pathogen Ustilago maydis and was recently shown to directly interact with apoplastic peroxidases, thus inhibiting the PAMP-triggered oxidative burst. Barley infections with the incompatible non-host pathogen U. maydis also result in epidermal cell death, which is similar to the hypersensitive response (HR). This study concentrates on molecular and cellular processes determining compatibility and incompatibility in different Ustilago/barley-interactions. Based on transcriptional analyses of U. hordei genes involved in compatible and incompatible plant interactions, 18 candidate genes were selected and further analyzed for a potential role during host colonization. So far, preliminary results point towards a virulenz function of five candidates. In the second part of this study cellular responses of barley were investigated, comparing the compatible U. hordei-interaction with responses during incompatibility caused by the non-host pathogen U. maydis as well as U. hordei and U. maydis pep1 mutants. Although incompatibility leads to programmed cell death respectively, a combination of live cell imaging techniques, an enzymatic activity assay and infections of transgenic plants overexpressing Bax Inhibitor-1 (BI-1) enabled the differentiation of two distinct pathways. While cell death responses towards pep1 mutants involve autophagy, non-host reactions after U. maydis infection trigger BI-1-dependent apoptosis-like cell death. These data sets were supported by transmission electron microscopy. Additionally, by evaluating H2O2 contents in apoplastic fluid and the transcriptional regulation of typical HR-associated marker genes, it became apparent that a HR is only caused by U. maydis infections, whereas infections by pep1 mutants result in basal defense and PAMP-tiggered immunity. Therefore it was shown, that different cell death mechanisms determine resistance of barley in host and non-host interactions., Ustilago hordei ist der Erreger von Hartbrand bei Gerste und Hafer. Um pflanzlichen Abwehrreaktionen entgegenzuwirken ist dieser basidiomycete Brandpilz zur Etablierung einer biotrophen Interaktion mit seiner Wirtspflanze auf eine Vielzahl sekretierter Effektor-proteine angewiesen, wobei der Unterdrückung von programmiertem Zelltod eine besondere Rolle zu kommt. Deletionsmutanten für den sekretierten Effektor Pep1 sind hingegen nicht in der Lage die Epidermis zu penetrieren und verursachen zahlreiche Abwehrreaktionen, welche im programmierten Zelltod der attackierten Pflanzenzelle resultieren. Im Maispathogen Ustilago maydis ist der Virulenzfaktor Pep1 funktionell konserviert und inhibiert den PAMP-vermittelten ‚oxidative burst’ durch direkte Interaktion mit apoplastischen Peroxidasen. Infektionen von Gerste mit dem inkompatiblen Nicht-Wirt-Pathogen U. maydis führen ebenfalls zu epidermalem Zelltod, ähnlich einer hypersensitiven Antwort (HR; hypersensitive response). Diese Arbeit beschäftigt sich mit den molekularen und zellulären Prozessen in kompatiblen und inkompatiblen Ustilago/Gerste-Interaktionen. Anhand einer U. hordei Transkriptomanalyse während kompatiblen sowie inkompatiblen Interaktionen wurden 18 Kandidatengene ausgewählt, die auf eine Rolle während der Wirtsbesiedelung untersucht werden sollten. Vorläufige Ergebnisse zeigen bislang fünf Kandidaten mit einer möglichen Virulenzfunktion. Im zweiten Teil der Arbeit wurden die zellulären Reaktionen bei Gerste während Ustilago-Interaktionen untersucht. Hier wurde zwischen der kompatiblen Interaktion mit U. hordei und den inkompatiblen Interaktionen mit dem Nicht-Wirt-Pathogen U. maydis, sowie der U. hordei und U. maydis pep1-Mutante verglichen. Zwar resultiert Inkompatibilität jeweils in programmiertem Zelltod, mittels verschiedener Lebendzellfärbungen, einem enzy-matischen Aktivitätstest und Infektionen Bax Inhibitor-1 (BI-1)-überexprimierender Pflanzen konnte jedoch zwischen zwei verschiedenen Zelltodarten unterschieden werden. Während Autophagie an Zelltod bei pep1-Infektionen beteiligt ist, kommt es in Abhängigkeit von BI-1 zu Apoptose-ähnlichem Zelltod nach U. maydis-Infektion. Dies konnte mittels Transmissionselektronenmikroskopie bestätigt werden. Zusätzlich haben die Bestimmung von Wasserstoffperoxid in Apoplastenflüssigkeit und die Genregulation typischer HR-assoziierter Marker gezeigt, dass eine HR nur duch U. maydis ausgelöst wird, während pep1-Infektionen in einer basalen, PAMP-vermittelten Immunität resultieren. Demnach konnte gezeigt werden, dass verschiedene Zelltodmechanismen die Resistenz von Gerste in Abhängigkeit des infizierenden Pathogens determinieren.