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BACKGROUND: Organogenesis of the thyroid gland requires the Pax8 protein. Absence or reduction of Pax8 results in congenital hypothyroidism in animal models and humans, respectively. This study aims at elucidating the regulatory mechanism leading to the expression of Pax8 in thyroid cells. METHODS: The murine Pax8 gene promoter was functionally dissected by mutagenesis and transfection in the thyroid cell line FRTL-5. Nuclear factors important for thyroid-specific gene expression were identified by DNA-binding assays. RESULTS: We show that Pax8 binds to and controls the expression of its own promoter. Furthermore, we identify a novel, thyroid-specific, DNA-binding activity (denominated nTTF [for novel Thyroid Transcription Factor]) that recognizes a specific region of the Pax8 promoter. CONCLUSIONS: The Pax8 promoter appears to be autoregulated, a feature that might be responsible for the haploinsufficiency displayed by this gene.

Questo documento riassume le attività svolte nell'ambito del quarto anno del Progetto ASI Detriti Spaziali, dalla IV alla V Riunione di Avanzamento. Oltre a ciò, sono descritte anche le attività del Primo Atto Aggiuntivo al contratto, svolte nello stesso periodo. Va sottolineato che il presente documento coincide con il rapporto finale delle attività contrattuali, escluse quelle relative ai WP130 e WP120b, per il completamento dei quali è stata ottenuta una proroga di sei mesi rispetto alla scadenza del 13 dicembre 2010. Per quanto concerne le misure ottiche (WP110), di responsabilità di UNIRM1, sono proseguite le attività di osservazioni ottiche riepilogate in una tabella e si è migliorata l'automazione dell'osservatorio SpaDE. E' stata analizzata la possibilità di effettuare misure spettrometriche con l'osservatorio di Toppo di Castelgrande. Problemi tecnici hanno impedito la consegna del nuovo telescopio da 50 cm da parte del fornitore che ha quindi messo a disposizione del GAUSS diversi sistemi ottici, tra cui un telescopio da 41 cm di diametro. Riguardo il Contributo di altri osservatori (WP111), di responsabilità di UNIRM1, vengono presentati i risultati delle osservazioni congiunte con gli osservatori amatoriali di Massa d'albe e Anguillara. Vengono riportati i risultati finali relativi all'analisi di immagini di campagne osservative congiunte con CNES e JAXA. Inoltre viene illustrata la rete di osservatori italiani e internazionali (in particolare Toppo di Castelgrande e Morehead (MSU)) coordinati dal GAUSS. Circa il Monitoraggio in-situ (WP130), di responsabilità di UNIRM, sono iniziate le prove di sensibilità dei trasduttori piezoelettrici e la revisione dell'elettronica. Le prove di impatto iperveloce per la calibrazione saranno effettuate congiuntamente a CISAS. Per quanto riguarda le misure radar (WP120a), di responsabilità IRA-OATO dell'INAF,. vengono riassunte le attività svolte tra la quarta e la quinta riunione di avanzamento, che portano al completamento di tutte le azioni previste nell'Allegato Tecnico. Viene presentato lo studio elettromagnetico dell'antenna VLBI di Medicina effettuato allo scopo di valutare la possibilità di installare un sistema ricevente in piggy-back. Tale studio viene interamente allegato al presente documento (vedi allegato 1). Per quanto concerne le campagne di misura, nel periodo in esame è stata effettuata la campagna osservativa con il sistema radar multistatico (Evpatoria-Medicina-Ventspils) e una campagna di test per localizzare delle sorgenti di interferenza. Vengono presentati i risultati di entrambe le sessioni osservative. Infine per quanto riguarda il software di analisi in real-time dei dati radar, è stato ultimata la realizzazione dello spettrometro installato su schede basate su FPGA. Si riportano quindi la descrizione e i risultati dei test di funzionamento di tale spettrometro. Per quanto riguarda le misure radar (WP120b), di responsabilità ISAC-CNR, ha avuto inizio a fine ottobre lo spostamento della stazione nel nuovo campo di Villa Sant'Elia in località Campi Salentina (Le), operazione che verrà conclusa inderogabilmente a fine novembre 2010. Sono proseguite le osservazioni mensili dei detriti al rientro in atmosfera. Per ogni giorno dei periodi mensili di osservazione fino ad ottobre 2010 sono stati calcolati i rapporti percentuali dei flussi dei debris rispetto ai flussi totali, i flussi medi dei debris su ogni periodo, e infine le variazioni giornaliere dei flussi totali e dei debris sull'arco temporale delle osservazioni. Dall'analisi dei dati storici relativi agli eventi del test ASAT Cinese del febbraio 2007, del test ASAT USA del febbraio 2008 e della collisione Iridium 333/Cosmos 2251 e inoltre dal successivo confronto con i dati del radar BL, si è osservato un generale incremento delle percentuali dei debris nei mesi del 2010 rispetto ai corrispondenti mesi del 2009. Questo è stato messo in relazione al notevole numero dei frammenti aggiuntivi prodotti dai citati eventi catastrofici presenti in orbite LEO. Per febbraio-aprile 2009 e per aprile 2010 sono stati analizzate le variazioni orarie dei debris in avanzato rientro, al fine di verificare possibili anomalie nei flussi orari. Si sta sviluppando il software per l'accquisizione dei dati da 5 canali che rappresentano le uscite dei ricevitori dell'interferometro. Per quanto riguarda la modellazione (WP200) e la mitigazione (WP400), di responsabilità ISTI/CNR, le ultime attività previste dal contratto originario (non essendo ISTI incluso nell'Atto Aggiuntivo) sono state completate in occasione dello IADC-28 e presentate alla RA4. Comunque, ISTI ha assicurato il proprio supporto alle attività IADC e contrattuali, fino alla chiusura naturale del presente contratto, per evitare ricadute negative sui task IADC in corso. Successivamente alla RA4 è continuata la caratterizzazione delle nubi di detriti collisionali di Fengyun 1C, Cosmos 2251 e Iridium 33. Sono inoltre ripartite le attività connesse con l'AI 27.1, per la valutazione della necessità di un Active Debris Removal in LEO, e si è svolta la programmata campagna test di rientro 2010-1, con esiti molto positivi. Per quanto riguarda specificamente le collaborazioni e la mitigazione, sono stati riveduti e commentati diversi importanti documenti IADC, è stato analizzato il contenuto di un database di informazioni spaziali su richiesta dell'ASI ed è proseguita l'attività nell'ambito degli AI 22.2, 26.2 e 27.2, relativamente all'aggiornamento e al supporto delle IADC Mitigation Guidelines e alla valutazione del rischio rappresentato dai rientri. Infine, per quanto concerne le problematiche di protezione (WP310 e 330), di responsabilità CISAS, vengono presentati i risultati degli ultimi esperimenti di impatto effettuati a supporto dell'AI 26-1 IADC per la caratterizzazione di ejecta da satellite. In particolare, è riportato l'esito della valutazione di diversi sensori per la caratterizzazione degli ejecta, oltre che lo studio del fenomeno di produzione di frammenti secondari in seguito ad impatti obliqui. I dati sperimentali raccolti hanno anche permesso di formulare delle procedure semi-empiriche per la previsione della distribuzione di massa e velocità delle particelle entro le nuvole di ejecta, producendo dunque un'informazione utile per il calcolo del flusso detritico secondario originato in seguito ad impatti primari su superfici satellitari. Per quanto concerne le attività numeriche, sono state affinate le tecniche di simulazione della generazione di ejecta mediante hydrocode, ottenendo buoni risultati a spese però di tempi di calcolo estremamente significativi. Infine, è stato predisposto un software specifico per il Risk Assessment, che consente di utilizzare MASTER e ORDEM come modelli di ambiente e implementa varie equazioni di danno per il calcolo della resistenza balistica del sistema. Lo stesso software consente di stimare il flusso detritico secondario originato a seguito della produzione di ejecta da impatto iperveloce su superfici di veicoli spaziali.

Fe65 interacts with the cytosolic domain of the Alzheimer amyloid precursor protein (APP). The functions of the Fe65 are still unknown. To address this point we generated Fe65 knockout (KO) mice. These mice do not show any obvious phenotype; however, when fibroblasts (mouse embryonic fibroblasts), isolated from Fe65 KO embryos, were exposed to low doses of DNA damaging agents, such as etoposide or H2O2, an increased sensitivity to genotoxic stress, compared with wild type animals, clearly emerged. Accordingly, brain extracts from Fe65 KO mice, exposed to non-lethal doses of ionizing radiations, showed high levels of gamma-H2AX and p53, thus demonstrating a higher sensitivity to X-rays than wild type mice. Nuclear Fe65 is necessary to rescue the observed phenotype, and few minutes after the exposure of MEFs to DNA damaging agents, Fe65 undergoes phosphorylation in the nucleus. With a similar timing, the proteolytic processing of APP is rapidly affected by the genotoxic stress: in fact, the cleavage of the APP COOH-terminal fragments by gamma-secretase is induced soon after the exposure of cells to etoposide, in a Fe65-dependent manner. These results demonstrate that Fe65 plays an essential role in the response of the cells to DNA damage.

We previously demonstrated the presence of an enhancer that is located between nucleotides - 2264 and - 2495 in the 5' flanking region of the rat sodium/iodide symporter (NIS) gene (Ohno et al., 1999). When attached to NIS or heterologous promoters, this 232 bp fragment, which we call NUE, is able to stimulate transcription in a thyroid-specific and cAMP-dependent manner. A paired-domain transcription factor Pax8 binds to this enhancer and can stimulate the transcription in non-thyroid cells that do not normally support the NUE activities. Cotransfection of PKA, a downstream effector of cAMP, further potentiates the Pax8-mediated transactivation. However, this transcriptional machinery containing pax8 seems to require contributions from the neighboring cis-acting element that is similar to CRE/AP-1 consensus sequences. Modification of this putative CRE/AP-1 site not only represses the NUE transcriptional activities by 90% in FRTL-5 cells, but also nullifies the synergistic effect of PKA on pax8-mediated transactivation in HeLa cells. In this report, we have further characterized the putative CRE/AP-1 site within the NIS upstream enhancer using gel mobility shift assay. An oligonucleotide probe with NIS CRE/AP-1 sequence produced complex binding patterns in both FRTL-5 and HeLa cell, reflecting the presence of diverse classes of binding factors. When compared with CRE or AP-1 elements in other genes, the mobility shift pattern of NIS CRE/AP-1 was similar to those of collagenase TRE, c-Jun TRE, and somatostatin CRE, but the relative intensities of the binding complexes were quite different. This observation raises a possibility that the NIS CRE/AP-site is regulated by a novel mechanism.

In solitary ascidians the fate of endoderm is determined at a very early stage of development and depends on cytoplasmic factors whose nature has not been determined. We have isolated a member of the NK-2 gene family, Cititf1, from the ascidian Ciona intestinalis, showing high sequence homology to mammalian TITF1. The Cititf1 gene was expressed in all endodermal precursors at the pregastrula and gastrula stages, and is thus the first specific regulatory endodermal marker to be isolated from an ascidian. Cititf1 expression was downregulated at the end of gastrulation to reappear at middle tailbud and larval stages in the most anterior and ventral parts of head endoderm, regions which give rise, after metamorphosis, to the adult endostyle, where Cititf1 mRNA was still present. Microinjection of Cititf1 mRNA into fertilized eggs resulted in tadpole larvae with abnormalities in head-trunk development consequent to the formation of excess endoderm, perhaps due to recruitment of notochord precursors to an endodermal fate. These data suggest that Cititf1 plays an important role in normal endoderm differentiation during ascidian embryogenesis.

Permanent congenital hypothyroidism (CH) is a common disease that occurs in 1 of 3,000–4,000 newborns. Except in rare cases due to hypothalamic or pituitary defects, CH is characterized by elevated levels of thyroid-stimulating hormone (TSH) resulting from reduced thyroid function. When thyroid hormone therapy is not initiated within the first two months of life, CH can cause severe neurological, mental and motor damage1,2. In 80–85% of cases, CH is associated with and presumably is a consequence of thyroid dysgenesis (TD). In these cases, the thyroid gland can be absent (agenesis, 35–40%), ectopically located (30–45%) and/or severely reduced in size (hypoplasia, 5%). Familial cases of TD are rare, even though ectopic or absent thyroid has been occasionally observed in siblings3. The pathogenesis of TD is still largely unknown. Although a genetic component has been suggested, mutations in the gene encoding the receptor for the thyroid-stimulating hormone (TSHR) have been identified in only two cases of TD with hypoplasia4,5. We report mutations in the coding region of PAX8 in two sporadic patients and one familial case of TD. All three point mutations are located in the paired domain of PAX8 and result in severe reduction of the DMA-binding activity of this transcription factor. These genetic alterations implicate PAX8 in the pathogenesis of TD and in normal thyroid development.

Loss of function of p53 is believed to result in transformation through impairment of its properties as a transcription factor, which interferes with the regulation of the cell cycle and under certain conditions, with programmed cell death. We report that stable transfection of clonal undifferentiated thyroid carcinoma cell lines harboring endogenous p53 mutations with a wild-type p53 expression vector only rarely yields transfectants expressing authentic wild-type p53. Among these, most exhibited an increase in doubling time and an impairment of colony formation in soft agar. Only one clonal wild-type p53-overexpressing derivative of the NPA papillary carcinoma cell line was obtained, and these cells were found to reexpress thyroid peroxidase (TPO). This clone also demonstrated reexpression of the paired box domain transcription factor Pax-8, which specifically activates transcription of TPO. Wild-type p53 did not directly stimulate transcriptional activity of a TPO promoter construct. Although the low frequency of authentic wild-type p53 stable transfectants limits the power of this analysis, these data suggest that in addition to its role in malignant transformation, p53 may be significant in the determination or maintenance of cell differentiation in thyroid neoplasms.

TTF-1 and PAX-8 are tissue-specific transcription factors expressed in the thyroid follicular cells, contributing to the maintenance of the differentiated phenotype. In fact, it has been demonstrated that TTF-1 and PAX-8 are able to activate transcription from thyroglobulin and thyroperoxidase (TPO) promoters, the transcriptional activity of which is in vivo restricted only to the thyroid follicular cell. In order to gain insight into how these transcription factors control in vivo the differentiation of the thyroid cell and to have a better molecular characterization of human thyroid tumors, TTF-1, PAX-8, thyroglobulin, and TPO mRNA levels were measured in nonmalignant and malignant human thyroid tissues. Results indicate that the expression of TTF-1 and PAX-8 is not sufficient per se for the expression of the thyroid-differentiated phenotype. Furthermore, in follicular adenomas, PAX-8 mRNA levels are strictly related to TPO mRNA levels, suggesting that the amount of PAX-8 could play a role in the modulation of TPO gene expression. TTF-1 mRNA is always well detectable in papillary carcinomas and, in contrast, always absent in anaplastic carcinomas. Identical results were obtained when the expression of TTF-1 protein was investigated using immunohistochemistry. Thus, TTF-1 gene expression could be a molecular marker in order to distinguish these two types of thyroid neoplasms.