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Introduction: With the advent of genomic sequencing, the identification of structural variants (SVs) is no longer a challenge, being possible to detect an average of 5 K SVs by individual. Contrarily, the annotation of the genome is incomplete, and the data is scattered along different databases, making SV manual evaluation complicated and time-consuming. Also, the available tools are limited on their scope. Thus, to address the need of a comprehensive application to assist evaluation of clinical outcome of SVs, we developed Structural Variant Interpreter (SVInterpreter). Methods: SVInterpreter is a free Python-CGI developed Web application able to analyze SVs using Topologically Associated Domains as genome units, within which genome browsers data, medically actionable genes, virtual gene panels and HPO similarity results, among other information, is retrieved. Results: We started by re-analysing 220 published SVs, of which about 50% were previously classified as VUS. SVInterpreter corroborated the previous classification in about 84% of the SVs. In about 5% of the SVs, SVInterpreter gave indication of possible position effect, through phenotype similarity, disrupted chromatin loops or genome wide association studies. Then, we show the applicability of SVInterpreter on the clinical setting, by inspecting 15 cases analysed by chromosomal microarray or genome sequencing. Conclusions: To our knowledge, SVInterpreter is the most comprehensive TAD based tool to assist prediction of clinical outcome of SVs. Based on gathered information, identification of possible disease-causing candidate genes and SVs is easily achievable. SVInterpreter is available at http://dgrctools-insa.min-saude.pt/cgi-bin/SVInterpreter.py info:eu-repo/semantics/publishedVersion

Introduction: Hemophilia B is an X-linked bleeding disorder caused by molecular defects in the Factor IX gene (F9), leading to either deficiency or functional abnormality of Factor IX. Actual data indicate a high heterogeneity of variants in F9. Over 1000 different variants have been reported, including pathogenic single nucleotide variants (SNPs), indels and complex variants. Materials and Methods: 86 index patients and 313 relatives were studied. F9 variant analysis was performed from total genomic DNA by PCR followed either by SSCP and DNA sequencing or direct DNA sequencing. When no variant was detected by sequencing, F9 analysis by MLPA was performed. Segregation studies were performed in each family. Results: Overall, 52 different F9 variants have been identified, including 49 SNPs or small indels, a gross duplication (exons 2-6) and two deletions of the entire gene. Ten of the variants had been firstly reported by us and three are novel: c.391+5G>T; c.432T>G, p.(Phe144Leu) and c.749C>A, p.(Ala250Glu). This approach allowed establishing the carrier state of over 300 women and 12 prenatal diagnoses were performed. Conclusions: The spectrum of F9 variants identified in the Portuguese population significantly overlaps that observed in other populations. Identification of F9 gene variants in patients allows genotype-phenotype correlations and carrier detection, as well as prenatal diagnosis. Sanger sequencing of the coding region and adjacent intronic sequences of F9 still remains a valid and effective tool for the molecular study of hemophila B, providing information for appropriate genetic counseling and new insights regarding the molecular basis of the pathology. info:eu-repo/semantics/publishedVersion

With the advance of genome sequencing technologies, it is currently possible to identify a large number of chromosomal or genomic structural variants in a single individual. Therefore, the validation and manual assessment of structural variants clinical significance becomes unpractical and time consuming when performed with previous methodologies. In order to assist the validation process, we developed two clinically inspired bioinformatics tools - TADGConTool and CNV-ConTool. They were developed in python with a Common Gateway Interface that allows easy and user-friendly access through any standards compliant web browser (available at: http://dgrctools.insa.min- saude.pt/). TAD-GConTool collects genomic information of breakpoint regions, using topological associated domains (TADs) as reference. It then accesses public databases to retrieve elements found inside TADs, and the associated clinical phenotypes, highlighting those causing dominant disorders. CNV-ConTool searches for overlaps between patient-specific breakpoints and CNVs, and those reported in several public databases. These tools were already successfully applied to about 40 cases studied under the project “Next-gen cytogenetics enters clinical care and annotates the human genome” (HMSPICT/0016/2013) and are now being made available to the broader scientific community. These tools allowed a faster and more informed evaluation of the genomic structural variants, helping select potential pathogenic variants, either by identifying phenotype- associated genes, or by overlapping deletions and duplications with already described benign or pathogenic CNVs. As genome sequencing is becoming more and more a routine method for identification of chromosomal and genomic structural variants, such clinically oriented bioinformatics tools are crucial and represent the first level of analysis toward personalized genomic medicine. This research was supported by national funds through FCT - Fundação para a Ciência e a Tecnologia, Research Grant HMSP-ICT/0016/2013. Study supported by Fundação para a Ciência e Tecnologia project HMSP-ICT/0016/2013. info:eu-repo/semantics/publishedVersion

Structural chromosomal rearrangements (SCRs) have long been recognized as a major source of human developmental anomalies, including, among others, congenital anomalies, and neurodevelopmental, intellectual and cognitive disabilities. Indeed, causal relationship between congenital anomalies and related SCRs are expected to occur in up to 40% of the affected subjects. Approaches used for detection of such SCRs evolved significantly from classical and molecular cytogenetic technologies, such as FISH and microarrays, to whole genome sequencing (WGS) with high physical and low sequence coverage, also known as large-insert WGS. N/A

Structural chromosomal rearrangements (SCRs) have long been recognized as a major source of human developmental anomalies, including, among others, congenital anomalies, and neurodevelopmental, intellectual and cognitive disabilities. Indeed, causal relationship between congenital anomalies and related SCRs are expected to occur in up to 40% of the affected subjects. Approaches used for detection of such SCRs evolved significantly from classical and molecular cytogenetic technologies, such as FISH and microarrays, to whole genome sequencing (WGS) with high physical and low sequence coverage, also known as large-insert WGS. The spectrum of SCRs, at DNA sequence-level resolution, in subjects carrying disease-associated SCRs, and the emerging pathogenic mechanisms will be presented. Like classical haploinsufficiency due to point mutations, disruption of the coding regions or genomic elements controlling quantitative expression of a dosage-sensitive gene will lead to a haploinsufficient phenotype. Position effect is a complex pathogenic mechanism of these SCR-associated disorders, resulting from disruption of native gene-specific and adoption of alien long-range cis-acting control elements. Haploinsufficiency or position effect on the same gene may lead to dissimilar clinical phenotypes. Certain balanced translocations can yield clinical phenotypes that are similar to microdeletion syndromes caused by hemizygosity of a major causal gene locus or of a variable number of contiguous genes. In such cases, haploinsufficiency of the causal gene with or without position effect on the contiguous genes can be considered as possible pathogenic mechanisms. Occasionally, gene fusions occur through SCRs that may lead to fusion transcripts. Although formation of such transcripts is a fundamental pathogenic mechanism behind different forms of cancer, apparently this is insignificant in SCR-associated disorders, mainly because many of such transcripts are non-functional and therefore non-pathogenic. There is no direct correlation between complexity of chromosomal rearrangements and severity of clinical phenotypes. Such genomic approach, that allows personalised medical genetics care, have necessarily to be accompanied by deep phenotyping. The emerging picture from these SCRs data highlights the extent to which the human genome can be affected by these rearrangements, its tremendous plasticity, and the intricacy of pathogenic mechanisms leading to SCRs-associated disorders. FCT (HMSP-ICT/0016/2013) info:eu-repo/semantics/publishedVersion

FCT: PTDC/SAU-GMG/118140/2010 e HMSP-ICT/0016/2013 N/A

Tese de mestrado em Biologia Humana e do Ambiente, apresentada à Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, 2017. Orientador Dezso David - Departamento de Genética Humana do Instituto Nacional de Saúde Congenital malformation syndromes can be caused by genomic and/or chromosome rearrangements. It is difficult to establish the underlying causes of malformations because of their high level of complexity. Although balanced chromosome inversions are in most cases subclinical, those disrupting transcripts or affecting the genomic architecture at breakpoint regions may well be pathogenic. Currently, the lack of a fully annotated human genome hinders the predictability of the phonotypic consequences of such rearrangements. The aim of this study is the identification of potential candidate genes for a malformation syndrome in an individual with an apparently balanced maternally inherited pericentric chromosome inversion inv(2)(p16.1;q14.3)mat. The proband has severe congenital malformation with multiple psychomotor and developmental anomalies, dismorphism and autistic features. The parents are phenotypically normal. Classical cytogenetic methods are of low resolution, often in the magnitude of a 5 to 10 Mb. Whole-genome Next-Generation Sequencing (NGS) of large-insert sequencing library (liWGS) has the capability to detect structural rearrangements with incomparably higher resolution, including cryptic alterations. As consequence, it was applied for the identification of inv(2)(p16.1;q14.3) breakpoints in the proband. Familial segregation analysis and definition of the inversion breakpoints at a nucleotide resolution were performed by amplification of junction fragments and Sanger sequencing. Genome and transcriptome array analysis were also carried out, for detection of additional genomic alterations and for gene expression profiling, respectively. Additionally, a possibly polymorphic duplication at 2q21.1, inherited from his father, was found. No apparent pathogenic genomic imbalances were identified in the proband. The inversion breakpoints are located at chr2:55,935,064 and chr2:123,767,685 (GRCh37), respectively, in 2p16.1 and 2q14.3. The inv2p16.1 breakpoint is flanked 14 kb proximal by the gene polyribonucleotide nucleotidyltransferase 1 (PNPT1; chr2:55,861,198-55,921,045, GRCh37; OMIM *610316) and 172 kb distal by EGF containing fibulin-like extracellular matrix protein 1 (EFEMP1; chr2:56,093,097-56,151,298, GRCh37; OMIM *601548). PNPT1, highly expressed in mice cochlea, has been associated with deafness (OMIM #614934) and with combined oxidative phosphorylation deficiency (OMIM #614932), both autosomal recessive. Meanwhile, the autosomal dominant Doyne honeycomb retinal dystrophy (OMIM #126600) is reported to be associated with mutations in EFEMP1. This gene is essential for the formation of elastic fibers in connective tissue. The 2q14.3 breakpoint is in a gene-poor region. Located 1.2 Mb proximal to the breakpoint is translin (TSN; chr2:122,513,120-122,525,428, GRCh37; OMIM *600575). Involved in DNA damage repair and RNA trafficking in neurons, TSN codes for a protein that specifically binds to breakpoint junctions of translocations in acute leukemia. The gene contactin-associated protein-like 5 (CNTNAP5; chr2:124,782,863-125,672,953, GRCh37; OMIM *610519) is localized 1 Mb, distal. CNTNAP5 is involved in cell adhesion and intercellular communication. Susceptibility to autistic syndromes has been suspected. The above described breakpoints at nucleotide resolution are the same in the proband’s mother, and did not directly disrupt any gene. Publicly available clinical information on alterations affecting the inversion flanking genes revealed no major similarity with the proband’s phenotype. Furthermore, no significant alteration in their expression level was observed. In-depth analysis of genome-wide expression data is in progress. Based on these findings, the causal relationship between clinical phenotype and the inv(2)(p16.1;q14.3) is most likely excluded, since the inversion is most likely non-pathogenic. Therefore it is not yet possible to identity the underlying genetic cause of the malformation syndrome reported in this subject. Whole-exome sequencing is proposed as a future task to detect the disease causing alteration. This study highlights the application of NGS-based methodology, with its capability in mapping chromosome inversion breakpoints at a very high resolution. Large scale application of this approach will represent a hallmark in the characterization of congenital malformations associated with structural chromosomal abnormalities. As síndromes de malformação congénitas são um dos principais grupos de patologias que afetam neonatos e crianças em países desenvolvidos. Muitos destes casos têm como base genética os arranjos genómicos ou cromossómicos. No entanto, por norma, devido à complexidade inerente às síndromes de malformação, é difícil e laborioso identificar com exatidão a alteração molecular que lhes deu origem. Aliado à inexistência atual de um genoma humano completamente anotado, torna-se complicado a compreensão e a previsão das consequências fenotípicas dos rearranjos cromossómicos. As inversões cromossómicas são rearranjos que ocorrem quando dois pontos de quebra ocorrem num mesmo cromossoma e são reinseridos invertidos, sem alteração de número de cópia. Normalmente as inversões são subclínicas, sem um fenótipo clínico associado. Se estes forem transmitidos a mais de 1% de uma dada população, tratam-se de polimorfismos. Se um rearranjo afectar transcritos ou a arquitetura genética junto dos pontos de quebra, perturbando assim o normal funcionamento dos genes, sobretudo os de expressão indispensável, este estará envolvido na etiologia de uma patologia potencialmente grave. Comparado com outros rearranjos cromossómicos, são poucas as inversões atualmente detalhadamente caracterizadas, frequentemente devido a dificuldades técnicas relacionadas com regiões repetitivas, frequentes nos pontos de quebra das inversões. Metodologias clássicas de citogenética são de baixa resolução e por vezes incapazes de identificar determinadas anomalias estruturais. As tecnologias atualmente mais avançadas para o estudo de rearranjos incluem microarrays genómicos, ideal na análise de variações no número de cópias, e a sequenciação de próxima geração (NGS), mais concretamente sequenciação pangenómica, para a generalidade dos rearranjos cromossómicos. Esta última tem a particularidade de ser eficiente na identificação de alterações crípticas, de oferecer uma potencial resolução bastante elevada (em certos casos nucleotídica) e de gerar grande quantidade de dados rapidamente. Das plataformas NGS existentes, as mais aptas para a análise de inversões envolvem a construção de bibliotecas mate-pair de grandes insertos, cuja distância entre pares de leitura é de 2 a 6 kb, permitindo superar dificuldades técnicas com zonas repetitivas e pequenas alterações junto aos pontos de quebra. Esta tese pretende identificar as alterações moleculares responsáveis pela síndrome de malformação congénita num indivíduo portador de uma inversão cromossómica pericêntrica aparentemente equilibrada de origem materna. O caso índex, portador da síndrome de malformação, apresenta acentuado atraso de desenvolvimento mental e psicomotor, dismorfia facial e perturbações do espectro do autismo. Ele tem muito baixo peso e altura para a idade. Foram também diagnosticadas cardiopatias, criptorquidia, escoliose e hipotonia generalizada. Estudos citogenéticos detetaram a existência de uma inversão pericêntrica no cromossoma 2, também encontrada na mãe. Os pais têm fenótipo aparentemente normal. Primeiramente, procedeu-se à identificação de alterações estruturais desequilibradas no indivíduo índex. Foram detetaram várias alterações de número de cópia, na maioria pequenas (< 100kb) e sem envolver genes OMIM, com a exceção da duplicação de 590 kb em 2q21.1. Os genes na duplicação não aparentam estar relacionados com o fenótipo observado. Ademais, foi detetado uma duplicação de 610 kb no pai nesta mesma região genómica, sugerindo que se trata de uma alteração de origem paterna, muito provavelmente não-patogénica e possivelmente de natureza polimórfica. Sequenciação pangenómica de grandes insertos (large-insert whole-genome sequencing) usando ácido desoxirribonucleico (ADN) do caso índex foi realizada para a identificação dos pontos de quebra da inversão no cromossoma 2. Uma vez delimitado a região dos pontos de quebra por NGS, foram desenhados oligonucleotídeos específicos para a amplificação dos fragmentos de junção e, seguidamente, procedeu-se à análise de segregação familiar e determinação nucleotídica dos pontos de quebra através de sequenciação Sanger. O estudo do perfil de expressão genética foi feito com Human Transcriptome Assay (HTA 2.0) da Affymetrix, utilizando ácido desoxirribonucleico (ARN) da linha celular linfoblastóide do indivíduo índex. Os dados obtidos por NGS permitiram a redefinição da localização genómica da inversão. O cariótipo do caso índex foi assim redefinido como 46, XY, inv(2)(p16.1q14.3)mat. Os pontos de quebra da inversão no cromossoma 2, no caso índex e na sua mãe, foram determinados. Estes localizam-se na posição chr2:55,935,064 e chr2:123,767,685 (GRCh37), respetivamente, nas bandas p16.1 e q14.3. Na sequência invertida ocorreu a deleção de 5 bases. Os pontos de quebra da inversão são iguais em ambos os indivíduos, sem quaisquer alterações detetadas nos fragmentos de junção. Segundo a nomenclatura baseada em citogenética de próxima geração, esta inversão é descrita como seq[GRCh37] inv(2)(pter→2p16.1(55,935,06{1-3})::2q14.3(123,767,68{3-1})→2p16.1 (55,935,06{5-4})::2q14.3(123,767,68{4-5})→qter). Os pontos de quebra não interrompem diretamente genes conhecidos. Em inv2p16.1, este é flanqueado a 5’ pelo gene polirribonucleotídeo nucleotidiltransferase 1 (PNPT1; chr2:55,861,198-55,921,045, GRCh37; OMIM *610316), e a 3’ pelo gene proteína 1 da matriz extracelular tipo-fibulina contendo EGF (EFEMP1; chr2:56,093,097-56,151,298, GRCh37; OMIM *601548) a 158 kb. O PNPT1 está envolvido na cadeia respiratória mitocondrial. Mutações em homozigotia foram associadas com deficiência na fosforilação oxidativa (OMIM #614932), originando nomeadamente encefalopatias, e com a surdez hereditária autossómica recessiva 70 (OMIM #614934). Em murganhos, tem expressão acentuada na cóclea. EFEMP1 é essencial para a correta formação de fibras elásticas em tecido conjuntivo, tendo elevada expressão nos pulmões e esófago em murganhos, e baixa no cérebro e coração. Mutações neste gene estão descritas como causa genética da distrofia da retina de Doyne (OMIM #126600), patologia autossómica dominante com início na segunda década de vida, causando perda progressiva de visão. O ponto de quebra em inv2q14.3 situa-se numa região pobre em genes. O gene translina (TSN; chr2:122,513,120-122,525,428, GRCh37; OMIM *600575) franqueia o ponto de quebra proximamente a 1240 kb, enquanto o gene tipo-proteína associada à contatina 5 (CNTNAP5; chr2:124,782,863-125,672,953, GRCh37; OMIM *610519) localiza-se 1020 kb distal do ponto de quebra. TSN codifica uma proteína que reconhece sequências-alvo em junções de pontos de quebra de translocações em doentes com leucemia, e está envolvido no mecanismo de reparação de ADN e transporte de ARN em neurónios. Em murganhos, expressa-se preferencialmente no tecido adiposo. O CNTNAP5 produz uma proteína que atua no sistema nervoso como moléculas de adesão celular e de recetor na comunicação intercelular. Em murganhos, expressa-se predominantemente no sistema nervoso. Existe suspeita de que mutações pontuais possam conferir suscetibilidade a comportamentos do espectro do autismo. Quanto à expressão genética, os resultados mostraram que os genes que flanqueiam a inversão não aparentam ter nível de expressão significativamente alterada comparativamente com os controlos. O estudo aprofundado de expressão a nível genómico está a decorrer. Os restantes genes próximos dos pontos de quebra da inversão relevaram baixa probabilidade de serem as alterações causadoras do fenótipo, nomeadamente a nível das doenças associadas. Tendo em conta os resultados obtidos, especialmente a confirmação da origem materna da inversão, esta alteração não aparenta ser a principal e única causa molecular do fenótipo. Ademais, esta conclusão é suportada pela pouca sobreposição clínica dos genes flanqueadores com a síndrome de malformação congénita, e da expressão génica aparentemente não alterada. Assim, atualmente, a relação causal entre o fenótipo observado e a inversão no cromossoma 2 foi excluída. Esta inversão é muito provavelmente não-patogénica por si só. Até ao momento e com os dados disponíveis, não foi possível identificar genes candidatos nem as alterações moleculares por detrás da síndrome de malformação congénita no caso índex. Informação médica disponível exclui influência de fatores ambientais na embriogénese. Futuramente, sugere-se recorrer à sequenciação do exoma, visto que tem uma sensibilidade muito superior para a deteção de pequenas em exões, potencialmente não detestáveis pelas abordagens até ao momento utilizadas. Adicionalmente, o estudo nos restantes membros da família permitirão obter uma melhor visão sobre a segregação familiar. Este trabalho é financiado por fundos nacionais através da FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologia, I.P., no âmbito do projeto HMSP-ICT/0016/2013. N/A

Tese de mestrado em Biologia Humana e Ambiente, apresentada à Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, 2017. Orientador Dezso David - Departamento de Genética Humana do Instituto Nacional de Saúde. Congenital anomalies are devastating conditions responsible for high neonatal mortality, as well as high morbidity of the surviving individuals. Chromosomal rearrangements are a leading cause of severe congenital malformations and are associated with about 25% of perinatal deaths due to congenital anomalies. The aim of this study is the identification of candidate genes responsible for the phenotype characterized by intrauterine growth retardation, severe developmental delay, brain malformations and refractory epilepsy identified in an individual with an apparently balanced de novo double chromosomal translocation t(2;7)(q23;q32),t(5;6)(q23;q26)dn. Identification and mapping of the structural chromosomal aberrations were performed by whole-genome array analysis, array painting with genomic amplicons of the derivative chromosomes and by whole genome sequencing of large-insert jumping libraries (liWGS). Subsequently all junction fragments were amplified and the breakpoints were identified at nucleotide resolution by Sanger sequencing. Genome array analysis identified a 651.76 kb deletion at 14q24.3 (g.76,673,181-77,324,937 [GRCh37/hg19]). Transforming growth factor beta 3 (TGFB3), a gene associated with autosomal dominant arrythmogenic right ventricular dysplasia and Loeys-Dietz syndrome (OMIM #107970 and #615582), is situated 224 kb upstream from the proximal deletion breakpoint.. Translocation breakpoints were identified both by array painting and liWGS. The 2q23.3 breakpoint of the t(2;7)(q23.3;q32.1), disrupts IVS5 of pre-mRNA processing factor 40 homolog A (PRPF40A), a protein coding gene related to Huntington’s disease (OMIM#143100). The calcium channel, voltage-dependent, beta-4 subunit (CACNB4) gene, localized 600 kb upstream of this breakpoint, is associated with three epilepsy related autosomal dominant disorders (OMIM #613855, 607682 and 607682). The Staphylococcal nuclease and tudor domain containing 1 (SND1) gene disrupted by the 7q32.1 breakpoint, is not presently associated with any known phenotype. However, the RNA binding motif protein 28 coding gene (RBM28), situated 300 kb downstream of the 7q32.1 breakpoint, has been associated with progressive neurological defects (OMIM #612079). Concerning the t(5;6)(q23.2;q26) translocation, the 5q23.2 breakpoint is situated in an intergenic region whereas the 6q26 breakpoint disrupts IVS3 of PARK2 co-regulated gene (PACRG). This gene shares a bidirectional promoter with parkin RBR E3 ubiquitin protein ligase (PARK2), which is associated with early onset Parkinson disease. About 300kb downstream of this breakpoint is the homolog of quaking mouse (QKI) gene that also plays a role in brain development. The application of liWGS unveiled the presence of two additional cryptic alterations on der(6), an excision/insertion and an inversion. The cryptic excision at 6q22.33 disrupts protein tyrosine phosphatase receptor type K (PTPRK), a gene from the protein tyrosine phosphatase family which is associated with tumor suppression. As a result of the excision/insertion, the excised 48 kb fragment containing PTPRK exon 7 and flanking intronic sequences is inserted 36 Mb further distal at 6q26. Located 70kb from the PTPRK gene, the laminin 2 (LAMA2) gene was reported has being involved in brain malformations, including polymicrogyria. The inversion breakpoint at 5q23.2 is located within an intergenic region. In conclusion, these findings suggest that disruption of PRPF40A and PACRG genes, in association with misregulation of CACNB4, RBM28, PARK2, QKI and LAMA2 genes from the breakpoint regions are the most likely candidate genes responsible for this complex malformation phenotype. Additionally the modulating effect of TGFB3 gene cannot be excluded. Comparative analysis of this complex chromosome rearrangement by array painting and liWGS demonstrates that currently only liWGS is able to identify the full spectrum of balanced, otherwise cryptic, structural alterations. In this way, liWGS allows high-throughput delineation of chromosomal rearrangements, allowing a better phenotype-genotype association. A major drawback of studying chromosome anomalies is the unavailability of relevant human biological material or of data from such samples. Theoretically, to overcome this issue, animal or induced pluripotent stem cells models can be used. During this study, the obtainment of a proband-specific iPSC model was attempted. Unfortunately, the complexity of the pluripotency induction process, the associated costs and the requisites of using non-viral vectors hinder the development of such cellular models for the study of the molecular pathogenesis of congenital anomalies. Proband derived lymphoblastoid cell line (LCL), non-integrative episomal plasmids containing the four Yamanaka factors – OCT3/4, c-MYC, SOX2 and KLF4 and an electroporation platform were used for the pluripotency induction experiments. Electroporated cells were maintained on a human foreskin fibroblasts (HFF) feeder-layer. While performing the reprogramming experiments, several technical difficulties were identified. A major difficulty is achieving high transfection efficiency of LCL with episomal plasmids without high cell mortality rates. Although no LCL derived iPSC colonies were obtained, the identification of the critical steps in the induction protocol of LCL derived cells will certainly contribute for further development of such cellular models. Furthermore, the availability of individual-derived iPSCs will definitely lead to a robust cellular model for the study of the molecular pathogenesis of chromosome rearrangements associated with congenital anomalies. As anomalias congénitas constituem uma das principais causas da mortalidade fetal, neonatal e infantil na Europa. Adicionalmente, devido à gravidade dos fenótipos apresentados pelos indivíduos que sobrevivem, este tipo de anomalias contribui em grande medida para a morbilidade, sobrecarregando em muito o sistema público de saúde. Os rearranjos cromossómicos constituem uma das principais causas no desenvolvimento de malformações congénitas graves e estão associados a cerca de 25% das mortes devidas a anomalias congénitas no período perinatal. Por seu lado, os rearranjos cromossómicos estruturais, nomeadamente deleções, duplicações, inversões e translocações cromossómicas, têm vindo a ser recorrentemente associados a diversos fenótipos deletérios, nomeadamente síndromes malformativos caracterizados por atraso global do desenvolvimento psicomotor e anomalias cerebrais graves. O principal objetivo deste estudo é a identificação de genes candidatos responsáveis pelo fenótipo caracterizado por atraso do crescimento intrauterino, atraso grave do desenvolvimento psicomotor, malformações cerebrais e epilepsia refratária identificado num indivíduo portador de uma translocação cromossómica dupla de novo, aparentemente equilibrada - t(2;7)(q23;q32),t(5;6)(q23;q26)dn. A identificação e mapeamento das alterações cromossómicas estruturais foi realizada através da utilização de array genómico, de array painting com amplicões dos cromossomas derivados e ainda por sequenciação pangenómica de grandes insertos (do inglês large-insert Whole Genome Sequencing). Seguidamente, todos os fragmentos de junção das diversas alterações estruturais foram amplificados e os respetivos pontos de quebra foram identificados com resolução nucleotídica por sequenciação de Sanger. Através da análise do array genómico foi possível a identificação de uma deleção de 651.76 kb na banda 24.3 do cromossoma 14, nas posições g.76,673,181- 77,324,937 (Genoma de Referência [GRCh37/hg19]). A montante do ponto de quebra proximal da deleção, a uma distância de 224 kb, o gene codificante para o fator de transformação do crescimento beta 3 (TGFB3) encontra-se associado a duas doenças autossómicas dominantes, displasia arritmogénica do ventrículo direito e síndrome de Loeys-Dietz (OMIM#107970 e #615582). Os pontos de quebra da translocação dupla foram identificados por array painting e por sequenciação pangenómica de grandes insertos. O ponto de quebra do derivado do cromossoma 2 da t(2;7)(q23.3;q32.1) interrompe o homólogo para o fator 40 de processamento de pré-mRNA (PRPF40A), um gene codificante para uma proteína associada com a doença de Huntington (OMIM#143100). O gene codificante para a subunidade beta do canal de cálcio dependente de voltagem (CACNB4), localizado 600 kb a montante deste ponto de quebra está associado com três condições autossómicas dominantes que envolvem diversos variantes de epilepsia (OMIM #613855, #607682 e #607682). O gene codificante para a nuclease estafilocócica e domínio tudor 1 (SND1), que se encontra interrompido pelo ponto de quebra do derivado do cromossoma 7, não está, presentemente, associado a qualquer fenótipo conhecido. Por outro lado, o gene codificante para a proteína 28 de ligação de RNA (RBM28), localizado 300 kb a jusante do ponto de quebra deste derivado, tem vindo a ser associado a defeitos neurológicos progressivos (OMIM #612079). Relativamente à translocação t(5;6)(q23.2;q26), o ponto de quebra do derivado do cromossoma 5 está localizado numa região intergénica, enquanto que o ponto de quebra da translocação no derivado do cromossoma 6 interrompe o terceiro intrão do gene co-regulador da Parkina (PACRG). Este gene partilha um promotor bidirecional com o gene codificante para a proteína ubiquitina ligase da Parkina RBR E3 (PARK2), o qual se encontra associado com o aparecimento precoce da doença de Parkinson. A jusante deste ponto de quebra, a cerca de 300 kb, encontra-se o gene homólogo do murganho quaking (QKI), o qual apresenta igualmente um papel no desenvolvimento cerebral. A aplicação da sequenciação pangenómica de grandes insertos revelou a presença de duas novas alterações crípticas no derivado do cromossoma 6, uma excisão/inserção e uma inversão. A excisão críptica na banda q22.33 no derivado do cromossoma 6 interrompe o gene codificante para o recetor da proteína tirosina fosfatase tipo K (PTPRK). Este gene é um membro da família das proteínas fosfatases de tirosina que se encontram maioritariamente associadas à supressão de tumores. Como resultado da excisão/inserção o fragmento excisado, que tem uma extensão de 48 kb, contém o exão 7 do gene PTPRK e flanqueia sequências intrónicas, é inserido a montante no ponto de quebra da banda 6q26, a uma distância de 36 Mb. Localizado 70 kb a jusante do gene PTPRK, o gene codificante para a laminina 2 (LAMA2) foi reportado como estando envolvido em malformações cerebrais, incluindo polimicrogiria. Por outro lado, o ponto de quebra da inversão no 5q23.2 está localizado numa região intergénica. Em suma, os dados encontrados sugerem que a interrupção dos genes PRPF40A e PACRG, em associação com a desregulação dos genes CACNB4, RBM28, PARK2, QKI e LAMA2 que flanqueiam as regiões dos pontos de quebra, serão os genes candidatos mais prováveis para a explicação do fenótipo reportado de malformação complexa. Adicionalmente, o efeito modulador do gene TGFB3, que se encontra a montante do ponto de quebra proximal da deleção no cromossoma 14, não poderá para já ser excluído. A análise comparativa deste rearranjo cromossómico complexo por array painting e por sequenciação pangenómica de grandes insertos, permitiu demonstrar que, neste momento, apenas a última abordagem tem a capacidade de identificar o espectro completo dos rearranjos cromossómicos estruturais aparentemente equilibrados, que de outra forma continuariam desconhecidos. Desta forma, a sequenciação pangenómica de grandes insertos permite a delineação dos rearranjos cromossómicos estruturais com uma elevada resolução, permitindo uma associação mais fiável entre o genótipo e o fenótipo reportados. Um dos principais obstáculos no estudo de anomalias cromossómicas é a indisponibilidade de material biológico humano relevante, bem como de dados acerca desse mesmo material biológico. Teoricamente, de forma a ultrapassar este problema poderão se utilizados modelos animais ou modelos celulares, incluindo células pluripotentes induzidas. Durante o decorrer deste estudo foram iniciadas as experiências para a obtenção de um modelo de células pluripotentes induzidas específicas do indivíduo portador da translocação t(2;7)(q23;q32),t(5;6)(q23;q26)dn. Contudo, a complexidade do processo de indução de pluripotência, os custos associados e a necessidade da não utilização de vetores virais, dificultou grandemente o desenvolvimento deste modelo celular para o estudo da patogénese molecular das anomalias congénitas apresentadas. De forma a realizar as experiências de indução de pluripotência foram utilizadas linhas linfoblastóides derivadas do indivíduo índex, plasmídeos epissomais não integrativos contendo os quatro fatores de Yamanaka - OCT3/4, c-MYC, SOX2 e KLF4 – e uma plataforma de eletroporação celular. As células eletroporadas e em processo de indução foram mantidas numa camada de suporte constituída por fibroblastos de prepúcio humano inativados por radiação gama. Ao longo do desenvolvimento destas experiências foram encontradas diversas dificuldades técnicas. A principal dificuldade encontrada deteve-se na obtenção de uma elevada eficiência de transfecção da linha linfoblastóide com os plasmídeos epissomais sem obter, simultaneamente, taxas de mortalidade excessivamente elevadas. Apesar de não ter sido possível a obtenção de colónias de células pluripotentes derivadas da linha linfoblastóide, foram identificados os passos críticos do protocolo de indução, o que contribuirá certamente para o futuro desenvolvimento destes modelos celulares. Adicionalmente, a disponibilidade de células pluripotentes induzidas específicas para cada indivíduo portador de um rearranjo cromossómico irá definitivamente conduzir a um modelo celular robusto para o estudo da patogénese molecular dos rearranjos cromossómicos associados com anomalias congénitas e síndromes malformativos. Da mesma forma, a possibilidade de diferenciar células pluripotentes induzidas específicas de um indivíduo índex em quaisquer células dos três folhetos embrionários é, sem dúvida, uma vantagem no estudo dos rearranjos cromossómicos. Este trabalho é financiado através da FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologia, I.P., no âmbito do projeto HMSP-ICT/0016/2013. info:eu-repo/semantics/publishedVersion

Tese de mestrado, Biologia Humana e Ambiente, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2017 Submitted by Teresa Boa (tdboa@fc.ul.pt) on 2017-05-02T10:09:57Z No. of bitstreams: 1 ulfc121658_tm_Mariana_Marques.pdf: 2351636 bytes, checksum: abef4dbd3cbb02dac7b27f23f8a7cf12 (MD5) Made available in DSpace on 2017-05-02T10:10:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ulfc121658_tm_Mariana_Marques.pdf: 2351636 bytes, checksum: abef4dbd3cbb02dac7b27f23f8a7cf12 (MD5) Previous issue date: 2017

Tese de mestrado em Biologia Humana e do Ambiente, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2017 Submitted by Cristina Manessiez (camanessiez@fc.ul.pt) on 2017-04-20T15:12:02Z No. of bitstreams: 1 ulfc120790_tm_Manuela_Cardoso.pdf: 1799734 bytes, checksum: 1f7928ced6a782f41253544e0cd3f53d (MD5) Made available in DSpace on 2017-04-20T15:12:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ulfc120790_tm_Manuela_Cardoso.pdf: 1799734 bytes, checksum: 1f7928ced6a782f41253544e0cd3f53d (MD5) Previous issue date: 2017

Dissertação de mestrado em Genética Molecular e Biomedicina apresentado à Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa, 2013 Dezso David, investigador do Departamento de Genética Humana do INSA. [ENG] Peter’s anomaly (PA) is a congenital defect of the anterior chamber of the eye. The aim of this study is molecular characterization of a de novo balanced chromosome translocation [t(11;18)(q23.3;q11.2)] identified in a proband with syndromic form of Peter´s anomaly (ectopia lentis and mild CNS abnormalities). Chromosome breakpoints were identified at nucleotide resolution. The 11q23.3 breakpoint is at position 120,097,868 (genome assembly GRCh37/hg19) within intron 3 of out at first (OAF) homolog (Drosophila) gene (OAF) while, 18q11.2 breakpoint in the intergenic region between CTAGE1 and RBBP8 genes, at position 20,220,714. Although OAF is disrupted, its expression level is unchanged in proband´s lymphoblastoid cell line (LCL). Cell adhesion protein Nectin 1 or PVRL1, located 500 kb upstream from the 11q23.3 breakpoint, reveal 3.5 fold increase in proband’s LCL. Expression levels of additional genes from breakpoint regions are not significantly different. Furthermore, RT-qPCR confirmed that expression level of CYP1B1 from chromosome 2p22.2, and EDIL3 from chromosome 5q14 are significantly changed in proband´s LCL, 16.5 fold decreased and 126 fold increased, respectively. Alterations in CYP1B1 have been reported as PA causing mutations. Therefore, mutation screening of CYP1B1 was performed and no pathogenic mutation was identified in the proband, although, a disease-causing 13 bp, homozygous deletion was identified in a Portuguese patient with PA. In conclusion, we hypothesize that PVRL1 is a candidate gene for at least some of the observed clinical features, which is elicited in mouse models by association of its paralog Pvrl3 to lens and other ocular defects involving the ciliary body. Furthermore, the involvement of the POU family domain containing transcription factor (POU2F3) from 11q23.3, CYP1B1 and/or EDIL3, localized outside of the breakpoint regions, in the molecular pathogenesis of syndromic PA remains to be determined. [PT] A anomalia de Peters é um defeito congénito da camara anterior do olho. Este estudo tem como objetivo caracterizar molecularmente uma translocação cromossómica equilibrada de novo [t(11;18)(q23.3;q11.2)] identificada num proband com forma sindrómica de Peters, (ectopia lentis e ligeiras anomalias do SNS). Os pontos de quebra foram identificados ao nível da resolução nucleotídica. O ponto de quebra 11q23.3 está na posição g.120,097,868_120,097,869 (GRCh37/hg), no intrão 3 do out of first protein homolog (OAF) enquanto o ponto de quebra 18q11.2, região intergénica entre o CTAGE1 e o RBBP8 encontra-se na posição g.20,220,714_20,220,715. Apesar do OAF estar interrompido, o nível de expressão está inalterado em linha linfoblastóide (LCL) do proband. O PVRL1, localizado a 500 kb a montante do ponto de quebra 11q23.3, revelou um aumento de 3.5 vezes no proband. Os níveis de expressão dos genes adicionais aos pontos de quebra não foram significativamente diferentes. Confirmou-se por RT-qPCR que os níveis de expressão do CYP1B1 (2p22.2), e EDIL3 (5q14) estão significativamente alterados em LCL do proband, com redução de 16,5 vezes e aumento de 126 vezes, respetivamente. Alterações no CYP1B1 têm sido descritas como mutações causadoras de PA. Desta forma, a pesquisa de mutações no CYP1B1 não encontraram mutações patogénicas no proband, no entanto foi identificado uma deleção em homozigotia com13 nucleótidos causador de doença num paciente Português com PA. Em conclusão, sugerimos que o PVRL1 é o principal gene candidato para parte da clínica descrita, o qual é sustentado por modelos de murganho pela associação com o seu parálogo PVRL3 para o cristalino e para outros defeitos oculares no corpo ciliar. Por outro lado, o envolvimento com o factor de transcrição, contendo o domínio da família POU, da região do ponto de quebra 11q23.3 e o CYP1B1 ou EDIL3, subjacente à patogénese molecular do fenótipo observado contínua por ser determinado. FCT