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Dissertação de mestrado em Biofísica e Bionanossistemas, Um rápido diagnóstico nos primeiros estadios de doenças é um passo crucial para melhorar a eficácia dos tratamentos de cancro e outras doenças. O estudo de alterações genéticas é particularmente essencial na análise da presença de mutações e alterações transcriptómicas no cancro, sendo crucial no desenvolvimento de estratégias de tratamento personalizado e no avanço da eficácia da terapia. O mesmo conceito é aplicado ao estudo de ácidos nucleicos (NA) de origem viral, o que pode ajudar na diminuição da taxa de infeção de doenças como a COVID-19. Atualmente, testes de amplificação de Nas de pacientes são o método principal no diagnóstico da COVID-19 e na identificação de mutações no cancro. Contudo, este método requer mão de obra especializada nos processos de extração e amplificação, e a obtenção dos resultados demora entre 2 e 3 horas o que limita o potencial ‘point-of care’ (POC) da sua aplicação em zonas com recursos limitados. Este estudo foi realizado com o intuito de desenvolver dispositivos médicos à base de espectroscopia Raman amplificada por superfície (SERS) para a identificação rápida de NAs sem processos de amplificação, o que pode não melhorar a eficácia de deteção, mas simplificará o diagnóstico POC e alargar a sua implementação. Duas estratégias à base de SERS foram desenvolvidas: um ‘nanoassembly’ de dímeros de nanopartículas de ouro (AuNP) para a deteção de miR-223 (marcador oncogénico) e um ‘hairpin design’ num substrato de ouro@prata ‘core shell nanorods’ (Au@Ag NRs) para a deteção de NAs derivados de SARS-CoV-2. A estratégia de ‘nanoassembly’ consiste na formação de nanoestruturas diméricas na presença da sequência-alvo miRNA (miR-223), o que resulta em zonas electromagneticamente ativas que aumentam a intensidade do sinal Raman. O princípio básico da estratégia ‘hairpin design’ depende no uso de sondas moleculares que reconhecem sequências-alvo específicas ao vírus SARS-CoV-2, monitorizando este processo de hibridização com espetros Raman. Três sequências virais, regularmente usadas em estudos da COVID-19, foram selecionadas como sequências-alvo. As sondas moleculares foram desenvolvidas e integradas num ‘chip’ de SERS para a identificação simultânea destes oligonucleótidos. Passos de otimização do protocolo é ainda necessário, seguidos de ensaios de deteção com RNA extraído de vírus inativado e com amostras clínicas de pacientes., Rapid diagnosis at an early stage is a critical step for successful outcome in cancer and in other diseases. In particular, the study of genetic alterations is paramount to analyze the presence of mutations and transcriptomic alterations in cancer which is crucial to design personalized treatment strategies and advance therapeutic efficacy. The same concept applies to the detection of viral-specific nucleic acid (NA), which can aid on the early diagnosis and prevention of disease spreading, like in the case of COVID-19. Currently, NA amplification technologies constitute the standard for diagnosis of SARS-CoV-2-infected individuals and for the identification of tumor-related genetic alterations in cancer. However, these techniques require trained personnel to deal with the extraction and amplification steps and it takes up to 3 hours to obtain the results, which limits point-of-care (POC) applications in resource-limited settings. The scope of this project is to develop new strategies based on surface enhanced Raman scattering spectroscopy (SERS) for fast screening of specific NAs without the need of amplification, which might not improve the efficiency and sensitivity of detection but will simplify the POC diagnosis and widen its implementation. Herein, two different SERS strategies were developed: a gold nanoparticle (AuNP) dimer nanoassembly for miR-223 detection (oncogenic marker) and a hairpin design on gold@silver core-shell nanorods (Au@Ag NRs) substrate for SARS-CoV-2 nucleic acid detection The AuNP dimer nanoassembly, strategy consisted of the formation of structurally reproducible dimeric nanostructures in the presence of the target miRNA (miR-223), where the newly generated electromagnetic hot spots provide significantly enhanced Raman scattering. The basic principle of the hairpin-based strategy is to employ molecular probes to recognize a set of target sequences specific for the SARS-CoV-2 virus, while monitoring this hybridization process with SERS spectrum. Three viral NA sequences, which have been commonly used for COVID-19 diagnosis sequences have been selected as the detection targets. The molecular probes have been designed and integrated into a SERS chip for simultaneous identification of these oligonucleotdies. Further optimizations will still need to be conducted for optimal results, followed by assays involving RNA extracted from inactivated virus samples and further validation with clinical samples.

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[Excerto] Preâmbulo O Mestrado em Biofísica e Bionanossistemas (MBB) comemora, em 2020, 10 anos de existência. Este curso tem por objetivo formar profissionais com competências avançadas nas áreas interdisciplinares da Física e da Biologia, destacando-se no domínio da nanotecnologia.

O objetivo deste trabalho foi isolar, caracterizar e identificar a comunidade bacteriana endofítica de sementes de soja e avaliar o seu potencial biotecnológico. Foram utilizadas sementes de 12 cultivares de soja. Os isolados bacterianos endofíticos obtidos foram avaliados in vitro quanto ao antagonismo a fungos fitopatogênicos, síntese de ácido indolacético (AIA) e solubilização de fosfato. A caracterização foi realizada com técnicas de isolamento, análise de restrição do DNA ribossomal amplificado (ARDRA) e sequenciamento parcial do gene 16S rDNA. Os isolados com maior potencial biotecnológico foram inoculados em sementes de soja, para se avaliar a capacidade de promoção de crescimento de plantas. Foi possível identificar 12 ribótipos por meio da ARDRA, que foram classificados como: Acinetobacter, Bacillus, Brevibacterium, Chryseobacterium, Citrobacter, Curtobacterium, Enterobacter, Methylobacterium, Microbacterium, Micromonospora, Pantoea, Paenibacillus, Pseudomonas, Ochrobactrum, Streptomyces e Tsukamurella. Quanto ao potencial biotecnológico da comunidade, 18% dos isolados controlaram o crescimento de fungos fitopatogênicos, 100% produziram AIA, e 39% solubilizaram fosfato. O isolado 67A(57) de Enterobacter sp. aumentou significativamente a massa de matéria seca da raiz. A inoculação de isolados com elevado potencial biotecnológico em avaliações in vitro não promoveu o crescimento de plantas de soja na maioria dos casos. The objectives of this work were to isolate, characterize and identify the endophytic bacterial community of soybean seeds, and to test the biotechnological potential of this community. Seeds from 12 soybean cultivars were used. The endophytic bacterial isolates were evaluated for in vitro antagonism against phytopathogenic fungi, synthesis of indoleacetic acid (IAA), and capacity to solubilize phosphate. Isolation techniques, amplified ribosomal DNA restriction analysis (ARDRA) grouping, and identification by means of partially sequencing the 16S rDNA were used in community characterization. The isolates with best biotechnological potential were inoculated in seeds to evaluate their ability to promote plant growth. Twelve ribotypes were identify by means of ARDRA and classified as: Acinetobacter, Bacillus, Brevibacterium, Chryseobacterium, Citrobacter, Curtobacterium, Enterobacter, Methylobacterium, Microbacterium, Micromonospora, Pantoea, Paenibacillus, Pseudomonas, Ochrobactrum, Streptomyces and Tsukamurella. As for the biotechnological potential of the community, 18% of the isolates were able to antagonize phytopathogenic fungi, 100% to synthesize IAA, and 39% to solubilize phosphate. The strain 67A(57) of Enterobacter sp. increased significantly the dry root biomass. Inoculation of promising isolates did not promote growth in soybean plants in most of the cases.