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Rare diseases are defined as conditions with a prevalence of no more than 6.5 per 10,000 people. Although each rare disease individually affects a small number of people, collectively, the 6,000 to 8,000 rare conditions (80% of them with genetic cause) affect around 8% of the world’s population. Research about the natural history and underlying pathophysiological mechanisms of rare diseases, as well as clinical trials with new drugs, are important and necessary to develop new strategies for the treatment of these conditions. This report describes the experience of a clinical research group working with rare diseases in a reference center for lysosomal diseases in Brazil (Medical Genetics Service, Hospital de Clínicas de Porto Alegre). The activities of this research group enabled its participation in several international multicenter clinical research protocols related to the natural history or therapy development for rare genetic diseases. This participation has allowed the development of personal skills and institutional facilities for clinical research. The clinical research developed in our center has raised the quality of the medical assistance provided to non-clinical research patients in addition to enabling early access to new therapies to many patients with orphan conditions.

Mucopolysaccharidosis (MPS) are a group of rare genetic disorders caused by deficiency in the activity of specific lysosomal enzymes required for the degradation of glycosaminoglycans (GAGs). A defect in the activity of these enzymes will result in the abnormal accumulation of GAGs inside the lysosomes of most cells, inducing progressive cellular damage and multiple organ failure. DNA samples from 70 patients with biochemical diagnosis of different MPSs genotypes confirmed by Sanger sequencing were used to evaluate a Next Generation Sequencing (NGS) protocol. Eleven genes related to MPSs were divided into three different panels according to the clinical phenotype. This strategy led to the identification of several pathogenic mutations distributed across all exons of MPSs-related genes. We were able to identify 96% of all gene variants previously identified by Sanger sequencing, showing high sensitivity in detecting different types of mutations. Furthermore, new variants were not identified, representing 100% specificity of the NGS protocol. The use of this NGS approach for genotype identification in MPSs is an attractive option for diagnosis of patients. In addition, the MPS diagnosis workflow could be divided in a two-tier approach: NGS as a first-tier followed by biochemical confirmation as a second-tier.

Lysosomal diseases (LDs), also known as lysosomal storage diseases (LSDs), are a heterogeneous group of conditions caused by defects in lysosomal function. LDs may result from deficiency of lysosomal hydrolases, membrane-associated transporters or other non-enzymatic proteins. Interest in the LD field is growing each year, as more conditions are, or will soon be treatable. In this article, we review the diagnosis of LDs, from clinical suspicion and screening tests to the identification of enzyme or protein deficiencies and molecular genetic diagnosis. We also cover the treatment approaches that are currently available or in development, including hematopoietic stem cell transplantation, enzyme replacement therapy, small molecules, and gene therapy.

Lysosomal storage diseases (LSDs) are inherited conditions caused by impaired lysosomal function and consequent substrate storage, leading to a range of clinical manifestations, including cardiovascular disease. This may lead to significant symptoms and even cardiac failure, which is an important cause of death among patients. Currently available treatments do not completely correct cardiac involvement in the LSDs. Gene therapy has been tested as a therapeutic alternative with promising results for the heart disease. In this review, we present the results of different approaches of gene therapy for LSDs, mainly in animal models, and its effects in the heart, focusing on protocols with cardiac functional analysis.

Resumo: Neste trabalho objetivou-se avaliar a técnica de biópsia hepática como um teste de valor diagnóstico para intoxicações por plantas que contém swainsonina. Para isso, reproduziu-se experimentalmente a doença com as folhas secas de Ipomoea marcellia contendo 0,02% de swainsonina em caprinos. O Grupo I foi constituído por 6 caprinos que receberam a planta misturada a ração na dose de 4g/kg (0,8mg de swainsonina/kg) até a observação dos primeiros sinais clínicos neurológicos. Outros dois caprinos que não receberam a planta na dieta constituíram o grupo controle (Grupo II). Foram realizadas biópsias hepáticas pela técnica percutânea cega com agulha de Menghini, no dia zero e com intervalos semanais nos caprinos do experimento. As biópsias hepáticas foram fixadas em formol tamponado 10%, processadas rotineiramente, coradas pela hematoxilina-eosina e histoquímica de lectinas. Vacuolização hepatocelular similar àquelas descritas em caso de doença de depósito lisossomal foram identificadas em todos os caprinos do Grupo I no 7º dia de experimento nas amostras coradas pela hematoxilina-eosina. Em relação à histoquímica de lectinas, marcações consistentes foram obtidas com as lectinas Concanavalia ensiformis (Con-A) e Triticum vulgaris (WGA). Concluiu-se que a avaliação histológica rotineira de biópsias hepáticas pode ser usada no diagnóstico de intoxicações por plantas que contem swainsonina, mesmo em caprinos que não apresentam sinais clínicos, e que a histoquímica de lectinas pode ser usada como método diagnóstico complementar. Abstract: With the aim to investigate the use of hepatic biopsies for the diagnosis of poisoning by swainsonine-containing plants, dry leaves of Ipomoea marcellia containing 0.02% of swainsonine were administered to goats. Group I, with six goats, ingested 4g/kg of dry plant (0.8mg of swainsonina/kg) daily until the observation of the first neurologic signs. Two goats that did not receive the plant were used as control (Group II). Hepatic biopsies with the Menghini needle were performed by the percutaneous technique at day zero and at weekly intervals after the start of the administration of I. marcellia. Biopsy samples were fixed in 10% formaline, processed routinely, and stained by hematoxilin-eosin and by lectins histochemistry. Hepatocellular vacuolization similar to those described in cases of lysosomal storage disease were identified in all goats of Group I from the seven day of plant consumption in the samples satained with hematoxylin-eosin. Using lectin histochemistry, consistent labellings were observed with Concanavalia ensiformis (Con-A) e Triticum vulgaris (WGA). It is concluded that routinely histological evaluation of liver biopsies can be used in the diagnosis of poisoning by swainsonine containing plants, even in goats without clinical signs, and lectin histochemistry which can be used as supplementary diagnostic method.

In Brazil, the consumption of Sida carpinifolia by livestock has been associated with neurological diseases linked to lysosomal storage disorders. This paper describes the pathological findings in two caprine fetuses from dams that were experimentally poisoned with S. carpinifolia. The goats were orally dosed with 10 and 13g/kg of a paste of green chopped S. carpinifolia for 30 days and were observed for an additional 15 days period after the last dosage with the plant; thereafter they were euthanized and necropsied. The dams showed only slight clinical signs. The study also includes the findings in one bovine fetus from a naturally S. carpinifolia poisoned cow which showed mild incoordination, generalized tremors, staggering, and frequent falls. The cow was euthanized and necropsied. While there were no significant histopathological changes in the goats, in the cow vacuolation of Purkinje neurons of the cerebellum, pancreatic acinar cells, and thyroid follicular cells were observed. The main microscopic changes observed in the caprine and bovine fetuses were vacuolation in the epithelium of renal tubules, thyroid follicular cells, and Purkinje neurons of the cerebellum. Transmission electron microscopy of sections from CNS of the cow and its fetus revealed vacuoles containing fine granular material surrounded by membrane. Lectin-histochemistry of CNS sections from goat fetuses marked lightly to sWGA lectins, WGA, and Con-A. No Brasil, o consumo de Sida carpinifolia por animais de produção tem sido associada a doenças neurológicas relacionadas com doença de depósito lisossômico. Este trabalho descreve os achados patológicos observados em dois fetos caprinos de mães que foram experimentalmente intoxicadas por S. carpinifolia. As cabras foram intoxicadas experimentalmente com S. carpinifolia nas doses de 10 e 13g/kg durante 30 dias e foram acompanhadas durante 15 dias após o consumo da planta. Após este período foram eutanasiadas e necropsiadas. O estudo também inclui os achados patológicos encontrados em um feto de uma fêmea bovina intoxicada naturalmente pela planta, que mostrou leve incoordenação, tremores generalizados, andar desequilibrado e quedas frequentes. A vaca foi eutanasiada e necropsiada. Embora não houvesse alterações histológicas significativas nas cabras, vacuolização dos neurônios de Purkinje do cerebelo, das células acinares do pâncreas e nas células foliculares da tireoide foram observadas na vaca. As principais alterações histológicas observadas nos fetos caprinos e no feto bovino foram vacuolização no epitélio dos túbulos renais, nas células foliculares da tireoide e nos neurônios de Purkinje do cerebelo. Na microscopia eletrônica de transmissão do sistema nervoso central da vaca e de seu feto revelaram-se vacúolos contendo material finamente granulado e delimitado por membrana. Na técnica de lectina-histoquímica dos fetos caprinos houve marcação leve no SNC para as lectinas sWGA, WGA e para Con-A.

Descrevem-se os achados clinicos e patologicos da intoxicacao espontânea e experimental por Sida carpinifolia em caprinos. Os achados da intoxicacao espontânea serao apresentados em dois artigos. Um deles relata pela primeira vez uma doenca investigada em de 1997 no municipio de Lajeado, RS. O outro artigo descreve os aspectos clinicos e patologicos da intoxicacao espontânea em dois surtos adicionais, ocorridos no ano de 2001 no municipio de Glorinha e em Porto Alegre, RS. Nesses trabalhos caracterizou-se atraves de exames clinicos, patologicos e ultra-estruturais uma doenca de deposito lisossomal. Por analise do padrao de coloracao com histoquimica de lectinas, em cortes histologicos do cerebelo, pâncreas e figado, observou-se afinidade de marcacao especificamente com Concanavalia ensiformis, Triticum vulgaris e T. vulgaris- succinilado, similar ao de alfa-manosidose hereditaria ou adquirida por ingestao de plantas do genero Swainsona, Oxytropis, Astragalus e Ipomoea. A caracterizacao do principio toxico da planta, associada com as lesoes que induzem o quadro clinico, foi apresentada em forma de um artigo. Para caracterizar o quadro clinico e patologico, foi administrada a 14 caprinos, divididos 7 grupos de dois individuos cada, Sida carpinifolia , secada a sombra e triturada por periodos de 15, 20, 40, 60, 90 e 120 dias. O consumo diario variou de 14 a 21g/kg nos diferentes grupos durante o experimento. Para outros 3 caprinos efetuou-se a administracao forcada da planta seca por via oral, de 10 a 12,5 g/kg, durante 30 dias. O quadro clinico ate os 30 dias de consumo da planta consistia principalmente de letargia, alteracao intermitente da consistencia das fezes e diminuicao no ganho de peso. Por volta de 40 dias de consumo, os caprinos demonstravam tambem incoordenacao motora aos estimulos e apos os 60 dias de consumo ocorria incoordenacao motora espontânea, com tremores musculares de cabeca e pescoco principalmente. As principais alteracoes histologicas e ultra-estruturais foram vacuolizacao e tumefacao citoplasmatica em neuronios, celulas da tireoide e pâncreas observadas com intensidade leve apos 15 dias de consumo e acentuada apos os 90 dias de consumo de Sida carpinifolia.

Dezenove casos de intoxicação por Solanum fastigiatum são descritos em bovinos de três municípios do Rio Grande do Sul no período de 2003-2005. Os coeficientes de morbidade e mortalidade foram respectivamente de 6,7% e 3,4%. Os bovinos afetados tinham idade média de 5 anos (2-8 anos) e a evolução clínica variou de 3-18 meses. Os sinais clínicos observados em todos os bovinos foram de disfunções cerebelares caracterizadas por hipermetria, incoordenação, quedas, tremores musculares, convulsões esporádicas e permanência em estação com os membros em base ampla. Em um bovino foi observada hemorragia traumática subdural no encéfalo e em outro, atrofia macroscópica do cerebelo. As lesões histológicas eram confinadas ao cerebelo e consistiram de vacuolização parcial ou total do pericário dos neurônios de Purkinje com ocasionais esferóides axonais na camada de células granulares e na substância branca cerebelar. Nos casos avançados, havia acentuada perda dos neurônios de Pukinje e proliferação dos astrócitos de Bergmann. O estudo morfométrico do número de neurônios de Purkinje e da espessura da camada molecular revelou um decréscimo no número de células de Purkinje que se correlacionou com conseqüente diminuição da espessura da camada molecular. Nineteen cases of Solanum fastigiatum (Solanaceae) poisoning in cattle from three municipalites in the State of Rio Grande do Sul, Brazil, occurring from 2003 to 2005, are described. Morbidity and mortality rates were respectively 6.7% and 3.4%. Average age of affected cattle was five-year-old (2 to 8-year-old) and duration of clinical courses was 3-18 months. Clinical signs observed in all affected cattle were cerebellar deficits characterized by hypermetry, incoordination, falls, muscle tremors, transitory seizures and wide base stance. One affected bovine had encephalic traumatic subdural hemorrhage and another had gross atrophy of the cerebellum. Histologically, lesions were restricted to the cerebellum and consisted of partial or complete vacuolation of the perikaria of Purkinje neurons with occasional axonal spheroids in the granular cell layer and in the white matter of the cerebellum. In advanced cases there were extensive loss of cerebellar Purkinje neurons and proliferation of the Bergmann's glia. The morphometric evaluation of the numbers of Purkinje neurons and of the thickness of the cerebellar molecular layer indicated decreased numbers of Purkinje neurons with consequent decrease in the molecular layer thickness.

Dois bovinos, fêmeas, mestiças, 6 anos (caso 1) e 18 meses (caso 2) de idade mantidos em pastagem com intensa invasão por S. carpinifolia apresentaram dificuldade locomotora com inicio nos membros pélvicos progredindo para decúbito esternal ou lateral, nistagmo, tremores e fasciculação de cabeça em um período de quatro a cinco dias. No exame histológico evidenciou-se meningoencefalite e ganglioneurite não supurativa com corpúsculos de Negri em neurônios do cerebelo, tronco encefálico, hipocampo, gânglio trigeminal e medula espinhal. Havia vacuolização citoplasmática nas células de Purkinje e nos neurônios do gânglio trigeminal. A imunofluorescência direta (IFD) para raiva foi positiva nos dois bovinos e na imuno-histoquímica (IHQ) houve marcação do antígeno rábico nos neurônios do córtex cerebelar e cerebral, hipocampo e gânglio trigeminal. A histoquímica com lectinas evidenciou que o citoplasma vacuolizado dos neurônios apresentaram marcação para Con-A, WGA e sWGA. De acordo com os achados morfológicos, os epidemiológicos, a IHQ e a IFD para raiva e o padrão histoquímico com lectinas conclui-se que o presente relato representa dois casos subclínicos de intoxicação por S. carpinifolia em bovinos com infecção pelo vírus da raiva. Two female bovine, crossbreed, 6-year-old (case 1) and 18-month-old (case 2) grazing in pasture infested by Sida carpinifolia showed gait difficulties, initially at the pelvic limbs, progressing to sternal or lateral decumbency, nystagmus, tremors, and fasciculation of the head for four to five days. Histologically was observed meningoencephalitis and ganglioneuritis nonsuppurative with Negri corpuscles in the neurons of the cerebellum, brain steam, hippocampus, trigeminal ganglion and spinal cord. Another histological finding was a cytoplasmic vacuolation of the Purkinje cells and in the trigeminal ganglion neurons. Direct immunofluorescence (DIF) for rabies viral antigen was positive in both animals and anti-rabies immunohistochemistry (IHC) was positive in the neurons of the cerebellar and cerebral cortex, hippocampus, and trigeminal ganglion. Con-A, WGA, and sWGA lectin histochemistry were positive in the vacuolated neurons. Based on the morphological and epidemiological features, rabies DIF and IHC, and lectin histochemistry the present report consists of two cases of subclinical poisoning with S. carpinifolia in cattle infected with rabies virus.

Descrevem-se os achados epidemiológicos, clínico-patológicos, ultra-estruturais e lectino-histoquímicos de herbívoros intoxicados naturalmente por Sida carpinifolia no Estado do Rio Grande do Sul, Brasil. Este estudo incluiu a elaboração de três artigos. Foi realizado um estudo retrospectivo de intoxicação natural por Sida carpinifolia em bovinos no Rio Grande do Sul, outro relata pela primeira vez uma intoxicação natural por esta planta em um animal silvestre e o terceiro artigo relata os achados patológicos observados em fetos de fêmeas caprina e bovina que foram intoxicadas experimentalmente e naturalmente respectivamente por Sida carpinifolia. No primeiro artigo foram afetados cinco bovinos entre os anos de 2001 a 2008. O quadro clínico foi caracterizado por emagrecimento, incoordenação, dificuldade de locomoção, tremores generalizados, quedas frequentes e morte. Microscopicamente as principais alterações foram vacuolização dos neurônios de Purkinje do cerebelo, vacuolização das células acinares do pâncreas e das células foliculares da tireoide. No segundo artigo, o cervídeo desenvolveu uma síndrome neurológica caracterizada por fraqueza muscular, tremores de intensão, déficit visual, quedas, postura e comportamento anormal. Os principais achados microscópicos foram vacuolização citoplasmática nos neurônios de Purkinje do cerebelo. No terceiro artigo duas cabras prenhes foram intoxicadas experimentalmente com Sida carpinifolia nas doses de 10 e 13 g/kg respectivamente durante 30 dias e foram acompanhados durante 15 dias após o consumo da planta. Após este período foram eutanasiadas e necropsiadas. Adicionalmente foi incluído um feto bovino no qual a mãe havia sido intoxicada naturalmente por S. carpinifolia. As principais alterações microscópicas observadas nos fetos foram vacuolização do epitélio dos túbulos renais, das células foliculares da tireoide e cerebelo com discreta vacuolização dos neurônios de Purkinje. Na microscopia eletrônica de todos os casos foi observado vacúolos contendo material finamente granulado e delimitado por membrana. Na lectinahistoquímica dos bovinos, do cervídeo e dos fetos observou-se marcação em neurônios com as lectinas Concanavalia ensiformis (Con-A), Triticum vulgaris (WGA) e Succinyl WGA (sWGA). Describes the epidemiological, clinical, pathological, ultrastructural and lectinhistochemical herbivore naturally poisoned by Sida carpinifolia in Rio Grande do Sul, Brazil. This study included the preparation of three articles. We conducted a retrospective study of natural poisoning by Sida carpinifolia in cattle in Rio Grande do Sul and the other reports for the first time a natural poisoning by this plant in a wild animal. The third article reports the pathologic findings observed in fetuses of female goats and cattle that were naturally and experimentally poisoned by Sida carpinifolia respectively. In the first paper were affected five cattle between the years 2001 to 2008. The clinical picture was characterized by weight loss, incoordination, difficulty walking, generalized tremors, frequent falls and death. Microscopically the main changes were vacuolation of the Purkinje neurons of cerebellum, vacuolization of acinar cells of the pancreas and thyroid follicular cells. In the second paper, the deer developed a neurological syndrome characterized by muscular weakness, intention tremors, visual and standing-up deficits, falls, and abnormal behavior and posture. The main microscopic findings were vacuolation in Purkinje neurons of cerebellum. In the third paper were two pregnant goats experimentally poisoned with Sida carpinifolia in doses of 10 and 13 g / kg for 30 days and were followed for 15 days after consumption of the plant. Additionally included a bovine fetus where the mother had been poisoned by S. carpinifolia. The main microscopic changes observed in the fetuses were vacuolation of the epithelium of renal tubules, thyroid follicular cells in the cerebellum and mild vacuolation of Purkinje neurons. On electron microscopy all cases was observed vacuoles containing finely granular material and bordered by membrane. In lectin-histochemistry of cattle, the deer and fetuses was observed in neurons marking to lectins Concanavalia ensiformis (Con-A), Triticum vulgaris (WGA) e Succinyl WGA (sWGA).

Descrevem-se os achados clínicos e patológicos da intoxicação espontânea e experimental por Sida carpinifolia em caprinos. Os achados da intoxicação espontânea serão apresentados em dois artigos. Um deles relata pela primeira vez uma doença investigada em de 1997 no município de Lajeado, RS. O outro artigo descreve os aspectos clínicos e patológicos da intoxicação espontânea em dois surtos adicionais, ocorridos no ano de 2001 no município de Glorinha e em Porto Alegre, RS. Nesses trabalhos caracterizou-se através de exames clínicos, patológicos e ultra-estruturais uma doença de depósito lisossomal. Por análise do padrão de coloração com histoquímica de lectinas, em cortes histológicos do cerebelo, pâncreas e fígado, observou-se afinidade de marcação especificamente com Concanavalia ensiformis, Triticum vulgaris e T. vulgaris-succinilado, similar ao de alfa-manosidose hereditária ou adquirida por ingestão de plantas do gênero Swainsona, Oxytropis, Astragalus e Ipomoea. A caracterização do princípio tóxico da planta, associada com as lesões que induzem o quadro clínico, foi apresentada em forma de um artigo. A metodologia e resultados do estudo experimental da intoxicação por Sida carpinifolia serão aqui descritos. Para caracterizar o quadro clínico e patológico, foi administrada a 14 caprinos, divididos 7 grupos de dois indivíduos cada, Sida carpinifolia, secada a sombra e triturada por períodos de 15, 20, 40, 60, 90 e 120 dias. O consumo diário variou de 14 a 21g/kg nos diferentes grupos durante o experimento. Para outros 3 caprinos efetuou-se a administração forçada da planta seca por via oral, de 10 a 12,5 g/kg, durante 30 dias. O quadro clínico até os 30 dias de consumo da planta consistia principalmente de letargia, alteração intermitente da consistência das fezes e diminuição no ganho de peso. Por volta de 40 dias de consumo, os caprinos demonstravam também incoordenação motora aos estímulos e após os 60 dias de consumo ocorria incoordenação motora espontânea, com tremores musculares de cabeça e pescoço principalmente. As principais alterações histológicas e ultra-estruturais foram vacuolização e tumefação citoplasmática em neurônios, células da tireóide e pâncreas observadas com intensidade leve após 15 dias de consumo e acentuada após os 90 dias de consumo de Sida carpinifolia. The clinical and pathological findings in the spontaneous and experimental Sida carpinifolia poisoning in goats are descrobed. Two papers that report Sida carpinifolia toxicosis in goats are the basis of this work. The initial outbreak of Sida carpinifolia toxicosis, was investigated in 1997 and occurred in the county of Lajeado, Rio Grande do Sul (RS), Brazil. Another article includes our observations on two additional outbreaks of Sida carpinifolia poisoning, which occurred in the counties of Glorinha and Porto Alegre in 2001. A lysosomal storage disease was characterized through clinical, pathological, and ultrastructural exams. The lectin histochemistry applied to sections of cerebellum, pancreas and liver revealed strong reactions with Concanavalia ensiformis, Triticum vulgaris and succinil-T. vulgaris. This binding pattern characterizes an alpha-manosidosis similar to that observed in other plant poisonings including the genera Swainsona, Oxytropis, Astragalus, and Ipomoea. The characterization of the swainsonine alkaloid associated with the lesions that induced the clinical picture is presented in a third article. The clinical and pathological picture was reproduced by dosing goats with dry and crushed Sida carpinifolia leaves. Fourteen goats were distributed in seven groups of two animals, which consumed the plant during 15, 20, 40, 60, 90 and 105 days. The daily consumption varied from 14 to 21g/kg in different groups. Additional three goats were forced fed the plant at 10 to 12.5 g/kg, for 30 days. Up to the 30th day of consumption signs included mainly lethargy, intermittent alteration in the consistence of feces and lower average daily weight gains. At the 40th day, goats demonstrated incoordination to the exercise, and after the 60th day of consumption spontaneous incoordination gait and muscular tremors of the head and neck were also noticed. The main histological and ultrastructural change consisted cytoplasmic vacuolation in neurons, cells of the thyroid and pancreas. These changes were mild’ at 15 days of consumption and enhanced after the 90th day of Sida carpinifolia ingestion.