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Tese de doutoramento em Engenharia de Materiais, O cancro é a principal causa de morte a nível mundial. Apesar dos avanços alcançados na área, a deterioração progressiva da qualidade de vida dos doentes urge a procura de novas estratégias de tratamento. Assim, este trabalho centrou-se no desenvolvimento e otimização de magnetolipossomas enquanto nanotransportadores de agentes quimioterápicos e na avaliação in vitro da seu desempenho terapêutica em meios miméticos ao ambiente tumoral e numa linha celular de interesse. Inicialmente, sintetizaram-se nanopartículas (NPs) superparamagnéticas esféricas de ferrite de magnésio e cálcio (CaxMg1-xFe2O4, com x=0,25; 0,50 e 0,75) e estudaram-se os efeitos da variação destes elementos nas suas propriedades. O maior potencial das NPs de Ca0.25Mg0.75Fe2O4 instigou o desenvolvimento de uma nova metodologia de síntese com anisotropia de forma, de modo a potenciar a sua magnetização de saturação em relação às homólogas esféricas. Estas revelaram potencial em mediarem o estímulo térmico sob campo magnético alternado e irradiação de laser infravermelho. Posteriormente, testou-se a incorporação das NPs em magnetolipossomas aquosos (AMLs) e sólidos (SMLs), sendo que os SMLs se revelaram mais promissores. Da mesma forma, desenvolveu-se um novo método de síntese de SMLs para aumentar a quantidade de NPs por vesícula lipídica. Este método permitiu a reprodutibilidade de síntese de SMLs baseados em múltiplas combinações lipídicas com propriedades estruturais e coloidais adequadas para aplicação biomédica. A otimização de SMLs avançou no sentido de lhes conferir capacidade de libertar doxorrubicina (DOX) sob a presença de múltiplos estímulos (fusogénicos, temperatura e de pH). Assim, foram quantificados sistematicamente os efeitos de nove combinações lipídicas nos perfis de libertação da DOX sob condições miméticas às fisiológicas (37 °C e pH=7,4) e em condições terapêuticas (42 °C e/ou pH ácido). Este processo permitiu selecionar a combinação lipídica com maiores taxas de libertação nas condições terapêuticas. O efeito da DOX livre e encapsulada em SMLs (2 mg de NPs em 1 mM de formulação lipidica) foi avaliado na linha celular Sk-br-3 do cancro da mama, cultivada em diferentes níveis organizacionais celulares (2D e 3D). Por fim, plataformas microfluídicas foram fabricadas para retenção de esferóides de Sk-br-3 que visa a simulação de gradientes espacio-temporais do microambiente tumoral heterogéneo. Em suma, este trabalho apresenta uma abordagem multidisciplinar no desenvolvimento e otimização de magnetolipossomas enquanto nanotransportadores multifuncionais para tratamento de tumores sólidos. Reforça ainda a importância de estabelecer métodos de cultura celular miméticos ao contexto in vivo na validação rigorosa de novas estratégias de tratamento., Cancer is the leading cause of death worldwide. Despite the advances in the area, the progressive deterioration of patients' quality of life urges the search for new treatment strategies. Thus, this work focused on developing and optimizing magnetoliposomes as nanocarriers of chemotherapeutic agents and evaluating their in vitro therapeutic performance in tumoral mimetic environments in a suitable cell line. Initially, spherical superparamagnetic nanoparticles (NPs) of magnesium and calcium ferrite (CaxMg1- xFe2O4, with x=0.25; 0.50 and 0.75) were synthesized, and the effects of varying these elements on their properties were studied. The more significant potential of Ca0.25Mg0.75Fe2O4 NPs prompted the development of a new synthesis methodology with shape-anisotropy to enhance its magnetic properties in relation to its spherical counterparts. The developed NPs demonstrated the potential to obtain a thermal stimulus under alternating magnetic fields and infrared laser irradiation. Subsequently, the incorporation of NPs in aqueous magnetoliposomes (AMLs) and solid magnetoliposomes (SMLs) was evaluated, and the SMLs proved to be more promising systems. Likewise, a new method of synthesizing SMLs was developed to increase the amount of NPs per lipid vesicle. This method allowed the synthesis reproducibility of SMLs based on multiple lipid combinations with structural and colloidal properties suitable for biomedical applications. Furthermore, the optimization of SMLs allowed to induce the ability to release doxorubicin (DOX) under the presence of multiple stimuli (fusogenic, temperature and pH). Thus, the effects of nine lipid combinations on DOX release profiles were systematically quantified under physiological conditions (37°C and pH=7.4) and under therapeutic conditions (42°C and/or acidic pH). This process allowed the selection of the lipid combination with the highest release rates under therapeutic conditions. Furthermore, the effect of free and encapsulated DOX in SMLs (2 mg of NPs in 1 mM of lipid formulation) was evaluated on the Sk-br-3 breast cancer cell line cultured at different cell organizational levels (2D and 3D). Finally, microfluidic platforms for the retention of Sk-br-3 spheroids were designed, aiming to simulate space-time gradients of the heterogeneous tumour microenvironment. Overall, this work presents a multidisciplinary approach to the development and optimization of magnetoliposomes as multifunctional nanosystems for the treatment of solid tumours. It also reinforces the importance of establishing mimetic cell culture methods to the in vivo context, allowing to validate the accuracy of new treatment strategies for the disease., This research was funded by the Portuguese Foundation for Science and Technology (FCT) under the PhD grant SFRH/BD/141936/2018, COVID/BD/153009/2022 and in the framework of the Strategic Funding UIDB/04650/2020, UIDB/04436/2020, UIDP/04436/2020 and through the research project PTDC/QUI-QFI/28020/2017 (POCI-01-0145-FEDER-028020), co-financed by European Fund of Regional Development (FEDER), COMPETE2020 and Portugal2020.

Breast cancer (BC) is the most common malignancy in women worldwide. While the main systemic treatment option is anthracycline-containing chemotherapy, chemoresistance continues to be an obstacle to patient survival. Carnitine palmitoyltransferase 1C (CPT1C) has been described as a poor-prognosis marker for several tumour types, as it favours tumour growth and hinders cells from entering senescence. At the molecular level, CPT1C has been associated with lipid metabolism regulation and important lipidome changes. Since plasma membrane (PM) rigidity has been associated with reduced drug uptake, we explored whether CPT1C expression could be involved in PM remodelling and drug chemoresistance. Liquid chromatography-high resolution mass spectrometry (LC-HRMS) lipid analysis of PM-enriched fractions of MDA-MB-231 BC cells showed that CPT1C silencing increased PM phospholipid saturation, suggesting a rise in PM rigidity. Moreover, CPT1C silencing increased cell survival against doxorubicin (DOX) treatment in different BC cells due to reduced drug uptake. These findings, further complemented by ROC plotter analysis correlating lower CPT1C expression with a lower pathological complete response to anthracyclines in patients with more aggressive types of BC, suggest CPT1C as a novel predictive biomarker for BC chemotherapy., This study was funded by the Spanish Ministry of Science and Innovation (MCIN) (PID2020-114953RB-C22 to N.C.) and co-funded by the European Regional Development Fund, and the CIBER de Fisiopatología de la Obesidad y la Nutrición (CIBEROBN) (Grant CB06/03/0001 to N.C.).

Nel corso del mio dottorato sono stata coinvolta principalmente in due progetti con lo scopo di studiare la disfunzione cardiaca indotta da invecchiamento o chemioterapia. Il primo studio aveva lo scopo di riprodurre e caratterizzare i meccanismi dell’invecchiamento utilizzando cardiomiociti (CMs) da cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSCs) e inoltre testare terapie cardioprotettive, come gli esosomi (Exo) da cellule progenitrici cardiache (CPCs). L’invecchiamento cardiaco coinvolge rimodellamenti a livello dei singoli CMs che predispongono allo scompenso cardiaco e la cui incidenza aumenta con l’avanzare dell’età. Curiosamente, fino ad ora non è stato ancora sviluppato un modello di invecchiamento cardiaco umano. Abbiamo riprogrammato CPCs umane ad iPSC e successivamente le abbiamo differenziate in CMs. Un fenotipo simile alla senescenza (SenCMs) è stato indotto con un breve trattamento (3 ore) con doxorubicina (Dox) a concentrazioni sub-letali (0.2 µM). 24 ore dopo il trattamento, alcuni SenCMs sono stati esposti ad Exo (~2·10^3 particelle/cellula) isolati dal medium di coltura delle CPCs. Il trattamento con Dox induce senescenza, come confermato dall’attivazione di p21 e dalla maggiore positività a SA-β-gal in confronto ai controlli (cCMs). Analisi biochimiche hanno rivelato la presenza di stress ossidativo e un potenziale di membrana mitocondriale depolarizzato nei SenCMs, con una ridotta produzione di ATP dai mitocondri. I SenCMs hanno anche difetti nel calcium handling e un QTc prolungato a causa dell’aumento di INaL. Questi effetti sono mitigati dal trattamento con Exo. Complessivamente, i SenCMs ricapitolano il fenotipo dei CMs invecchiati in termini di markers di senescenza e proprietà elettriche e metaboliche. Inoltre, l’esposizione ad Exo prodotti da CPCs limita molte delle anomalie cardiache indotte dall’invecchiamento. Il secondo studio mirava a valutare la disfunzione cardiaca causata dalla somministrazione in combinazione di Dox e Trastuzumab (Trz) in miociti cardiaci di ratto. Il trattamento combinato con Dox e Trz in pazienti con cancro al seno è limitato a causa della cardiotossicità, che si manifesta con disfunzione contrattile ed aritmie. Il ruolo specifico dei due agenti nella cardiotossicità causata dalla terapia combinata è però non ancora del tutto chiarito. I ratti hanno ricevuto 6 dosi di Dox, Trz o entrambi in maniera sequenziale. La disfunzione del ventricolo sinistro (LV) mediata da Dox era aggravata dalla somministrazione di Trz. Il trattamento con Dox, ma non con Trz, induceva danno ai tubuli T, prolungamento della durata del potenziale d’azione (APD), aumento dell’incidenza di post-depolarizzazioni tardive (DADs), decadimenti dei transienti di Ca2+ più lenti e la fuoriuscita di Ca2+ dal reticolo in Ca2+ sparks o Ca2+ embers. Il trattamento in combinazione esacerbava queste anomalie. Trz, ma non Dox, riduceva l’ampiezza dei transienti di Ca2+ e il contenuto di Ca2+ nel reticolo sarcoplasmatico (SR). Entrambi gli agenti aumentavano le onde di Ca2+ spontanee e diminuivano l’espressione di SERCA. Questi risultati suggeriscono che Dox, ma non Trz, potrebbe causare danno ai tubuli T in vivo e, inoltre, indurre cambiamenti nei parametri elettrici e nel Ca2+-handling. Mentre Dox induceva cambiamenti reversibili nei parametri elettrofisiologici, la successiva somministrazione di Trz impediva il rescue. Questi risultati illustrano il ruolo specifico di Dox e Trz e il loro ruolo nella cardiotossicità. During my PhD I was involved mainly in two research projects aimed to study myocardial dysfunction induced by aging or chemotherapy. The first study aimed to reproduce and characterize mechanisms involved in aging using cardiomyocytes (CMs) from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs), and to test cardioprotective therapies, like cardiac progenitor cell (CPC)-derived exosomes (Exo). Aging of the heart involves adverse remodeling in CMs which results in heart failure with incidence that increases with age. Interestingly, till now we lacked a human model of cardiac aging. We reprogrammed CPCs into hiPSCs and subsequently differentiated in hiPSC-derived CMs. A senescence-like phenotype (SenCMs) was induced by short exposure (3 hours) to doxorubicin (Dox) at sub-lethal concentration (0.2 µM). 24h following DOX treatment, SenCMs were exposed to Exo (~2·103 particles/cell) collected from culture media of CPCs by ultracentrifugation. Dox treatment induced senescence, as confirmed by activation of p21 and increased SA-β-gal positivity compared to control CMs (cCMs). Biochemical analysis revealed presence of oxidative stress and a depolarized mitochondrial membrane potential due to the treatment, which resulted in decreased ATP production by mitochondria. SenCMs also showed impaired calcium handling and prolonged QTc vs. cCMs due to upregulation of INaL. These effects were mitigated by exposure to Exo. Overall, SenCMs recapitulate the phenotype of aged CMs in terms of senescence markers and electrical and metabolic properties. Additionally, exposure to CPC-derived Exo limited age-related cardiac anomalies. The second study aimed to study the cardiac dysfunction dependent on the combined administration of Dox and trastuzumab (Trz) through evaluation of cardiac performance, T-tubule organization, and electrophysiological changes in cardiac myocytes from an in-vivo rat model. Combined treatment with Dox and Trz in patients with HER2-positive cancer is limited by cardiotoxicity, as manifested by contractile dysfunction and arrhythmia. The respective roles of the two agents in the cardiotoxicity of the combined therapy are incompletely understood. Adult rats received 6 doses of either Dox or Trz, or the two agents sequentially. Dox-mediated left ventricular (LV) dysfunction was aggravated by Trz administration. Dox treatment, but not Trz, induced T-tubule disarray. Moreover, Dox, but not Trz monotherapy, induced prolonged action potential duration (APD), increased incidence of delayed afterdepolarizations (DADs) and beat-to-beat variability of repolarization (BVR), and slower Ca2+ transient decay. Although APD, DADs, BVR and Ca2+ transient decay recovered over time after the cessation of Dox treatment, subsequent Trz administration exacerbated these abnormalities. Trz, but not Dox, reduced Ca2+ transient amplitude and SR Ca2+ content. Both agents increased Ca2+ waves and downregulated SERCA. Finally, Dox increased resting Ca2+ waves, Ca2+ spark frequency, spark-mediated sarcoplasmic reticulum (SR) leak, and long-lasting Ca2+ release events (so-called Ca2+ “embers”). These results suggest that Dox, but not Trz, may cause T-tubule disarray in cardiac myocytes in vivo while also inducing overall larger changes in electrical parameters and intracellular Ca2+ handling. While Dox-induced changes in electrical parameters are reversible, subsequent Trz administration prevents their recovery. These findings illustrate the specific roles of Dox and Trz, and their interactions in cardiotoxicity and arrhythmogenicity.

El uso de plasma atmosférico frío en tratamientos contra el cáncer ha demostrado ser eficaz y selectivo, distinguiendo su acción entre células sanas y células cancerígenas fruto del aporte de especies reactivas de oxígeno y nitrógeno (RONS) a las células. Complementándose con un principio activo antitumoral utilizado comúnmente en los tratamientos actuales, como lo es la doxorubicina, podría conseguirse una mayor efectividad así como reducir la propia cantidad de agente antitumoral usado en terapia. En el presente proyecto, se pretende fabricar y caracterizar un material compuesto por un hidrogel tratado con plasma atmosférico y microesferas de hidroxiapatita deficiente en calcio cargadas con doxorrubicina, para su posterior uso como plataforma de liberación dual de agentes activos para terapia de cáncer de hueso. Para ello, se han preparado microesferas a partir de una emulsión de un cemento de fosfato de calcio y posteriormente se han cargado dichas microesferas con doxorrubicina. Las microesferas se han añadido a un hidrogel compuesto de gelatina y alginato previamente tratado con plasma frío a presión atmosférica. Se ha estudiado la liberación de RONS así como la liberación de doxorrubicina en un medio acuoso a partir del material diseñado. En paralelo, se ha evaluado la posibilidad de realizar un recubrimiento a las microesferas con policaprolactona (PCL) mediante polimerización por plasma y se ha estudiado cómo influye sobre la cinética de liberación de la doxorubicina a partir del material compuesto. Los resultados indican que el material compuesto libera RONS y doxorubicina al medio de liberación. The use of cold atmospheric plasma in cancer treatments has been shown to be effective in creating a selectivity between healthy cells and cancer cells as a result of the contribution of reactive oxygen and nitrogen species (RONS) to the cells. Complementing it with an anti-cancer drug commonly used in current treatments, such as doxorubicin, greater effectiveness could be achieved as well as a reduction of the amount of antitumoral drug used in such therapy. In the present project, it is intended to synthesize and characterize a material composed of a hydrogel treated with cold atmospheric plasma and calcium-deficient hydroxyapatite microspheres loaded with doxorubicin, for its posterior use as dual release platform for bone cancer therapy. For this, microspheres have been successfully synthesized by emulsion of a calcium phosphate cement and microspheres have been loaded with doxorubicin. The microspheres have been added to a hydrogel composed of gelatin and alginate previously treated with cold atmospheric pressure plasma. The release of RONS and doxorubicin has been studied from the designed material to an aqueous medium. In parallel, it has been evaluated the relevance of proceeding to the coating of microspheres with polycaprolactone (PCL) by plasma polymerization and it has been studied how it influences the release kinetics of doxorubicin from the composite material. The results indicate that the composite material releases RONS and doxorubicin to the release medium.

A oncologia veterinária vem ganhando espaço devido ao envelhecimento da população de animais de companhia e subsequente desenvolvimento de neoplasias. A classe de antibióticos antineoplásicos, ou antraciclinas, compreende um grupo de fármacos produzidos a partir de diferentes espécies da bactéria gram-positiva Streptomyces, e seu mecanismo de ação se dá principalmente através de intercalação entre o DNA de fita-dupla, induzindo apoptose celular. Os agentes mais difundidos são doxorrubicina (DOX), mitoxantrona (MIT), actinomicina-D (ACT-D), bleomicina e epirrubicina (EPI), no entanto, devido a seus efeitos citotóxicos, ressaltando-se a cardiotoxicidade, novos agentes e formas de administração vem sendo desenvolvidas, com o objetivo de reduzir os efeitos adversos e potencializar a capacidade antineoplásica. A nano-oncologia possui destaque no desenvolvimento de novas tecnologias como lipossomas, nanopartículas de metais e polímeros, além do desenvolvimento recente de farmacogenética e farmacogenômica no âmbito veterinário. O objetivo desta revisão baseia-se em alinhar a excelente capacidade antineoplásica das antraciclinas associada a novos agentes, tecnologias e formas de administração e sua aplicabilidade e status na medicina de animais de companhia. Veterinary oncology has gained space since pet’s population is getting older, and, subsequently, developing neoplasias. Antineoplasic antibiotics’ class, or anthracyclines, comprehends a pharmacologic group produced by different species of gram-positive bacteria Streptomyces, and its action mechanism occurs mostly due to double-tape DNA intercalation, inducing cellular apoptosis. The most recognized agents are doxorubicin (DOX), mitoxantrone (MIT), actinomycin-D (ACT-D), bleomycin and epirubicin (EPI), however, due to its cytotoxic effects, mostly cardiotoxicity, new agents and administration forms have been developed, aiming to reduce adverse effects and potentialize antineoplastic activity. Nano-oncology highlights new technologies development, as liposomes, metal and polymer nanoparticles, besides recent development of pharmacogenetics and pharmacogenomics in veterinary field. The aim of this review is to align excellent anthracyclines antineoplastic capacity associated to new agents, technologies and administration forms and its applicability and status in pet’s medicine. La oncología veterinaria viene ganando espacio debido al envejecimiento de la población de animales de compañía y subsiguiente desarrollo de neoplasias. La clase de antibióticos antineoplásicos, o antraciclinas, comprende un grupo de fármacos producidos a partir de diferentes especies de la bacteria gram-positiva Streptomyces, y su mecanismo de acción se da principalmente a través de la intercalación entre el ADN de cadena dupla, induciendo apoptosis celular. Los agentes más difundidos son doxorubicina (DOX), mitoxantrona (MIT), actinomicina-D (ACT-D), bleomicina y epirubicina (EPI), sin embargo, debido a sus efectos citotóxicos, resaltando la cardiotoxicidad, nuevos agentes y formas de administración están siendo desarrollados, con el objetivo de reducir los efectos adversos y potenciar la capacidad antineoplásica. La nano-oncología tiene destaque en el desarrollo de nuevas tecnologías como liposomas, nanopartículas de metales y polímeros, además del desarrollo reciente de farmacogenética y farmacogenómica en el ámbito veterinario. El objetivo de esta revisión se basa en alinear la excelente capacidad antineoplásica de las antraciclinas asociada a nuevos agentes, tecnologías y formas de administración y su aplicabilidad y estatus en la medicina de animales de compañía.

El objetivo de esta tesis es diseñar sistemas multifuncionales que combinen funciones de diagnóstico y terapia, o teranósticos, a base de nanopartículas magnéticas (NPMs) de óxido de hierro (magnetita/maghemita) para su potencial aplicación en patologías oncológicas.Para ello se realizó un trabajo experimental que involucró la optimización de las metodologías de síntesis de las NPMs y la posterior incorporación secuencial de los distintos componentes, en conjunto con las caracterizaciones y ensayos tendientes a evaluar su funcionalidad en cada etapa. En primer término, se estudiaron las vías de síntesis de NPMs de manera de conseguir un control sobre las propiedades fisicoquímicas, y de la estabilidad de NPMs en suspensión acuosa.Se modificó la superficie de las NPMs con ácido fólico (AF) de manera de proporcionar a las NPMs selectividad para acumularse en células tumorales debido a que el receptor de folatos se encuentra sobreexpresado en células de varios tipos de cáncer. En una etapa posterior, se cargaron las NPMs modificadas con AF con fármacos oncológicos para impartir la función terapéutica. La Doxorubicina (Doxo) es uno de los agentes quimioterapéuticos más efectivos usados en el tratamiento de varios tipos de cáncer. A pesar de su gran uso, varios efectos secundarios se encuentran asociados a la distribución sistémica de este fármaco una vez administrado. Estos efectos secundarios están relacionados con la necesidad de administrar dosis elevadas del fármaco debido a la escasa selectividad y eficacia asociada con su distribución no específica en el cuerpo.Las siguientes instancias del desarrollo de este trabajo de tesis se dedicaron a evaluar las potencialidades de los agentes teranósticos para :(i) direccionamiento mediado por un campo magnético; (ii) actuar como medio de contraste en diagnóstico por imagen mediante resonancia magnética (RMI), (iii) ejercer su acción terapéutica.En el Capítulo I se introducen los conceptos básicos sobre nanotecnología, nanociencia y nanomateriales. Se describen en mayor detalle las razones por las cuales se seleccionaron las NPMs para el desarrollo de este trabajo de tesis.Dentro del conjunto de NPMs se puntualiza en las de óxido de hierro, en particular, magnetita (MAG, Fe3O4). Los métodos de síntesis de este óxido de hierro son brevemente reseñados, profundizando en la técnica de co-precipitación. Además se describen las diferentes estrategias de estabilización y funcionalización del núcleo magnético.Se resumen las aplicaciones de las NPMs en biomedicina. En este sentido, se describen las ventajas de las mismas como herramientas de diagnóstico, al actuar como agentes de contraste en RMI. También se muestran las formas de vectorización de fármacos mediante el empleo de NPMs y se enuncian las habilidades de las nanoformulaciones descriptas para actuar como agentes teranósticos.Finalmente se enumeran el objetivo general y los objetivos específicos, así como la hipótesis planteada en esta tesis.En el Capítulo II se describen los reactivos empleados y las técnicas de caracterización aplicadas a las diferentes nanoformulaciones junto con el tratamiento necesario de las muestras en cada caso.En el Capítulo III se dedicó al estudio de las metodologías de síntesis, estabilización y control de la estabilidad de las NPMs de MAG. Se describen los resultados obtenidos al emplear dos métodos de síntesis: co-precipitación y su variante reducción-precipitación con el fin de seleccionar una metodología adecuada para la obtención de NPMs de MAG en función de las aplicaciones propuestas. En base a los resultados, se seleccionó la técnica de co-precipitación como la más adecuada, y se incluyó un estudio exhaustivo de las variables experimentales asociadas a dicha técnica con el propósito de conseguir un control de las propiedades fisicoquímicas. Este análisis involucró el estudio de los mecanismos que conducen a la formación de las NPMs de MAG así como una completa caracterización y los ensayos necesarios para evaluar la estabilidad, en términos de la evolución del diámetro hidrodinámico (DH) en función del tiempo de almacenamiento en suspensión acuosa. En el Anexo I se informan los resultados que complementan a este capítulo.En el Capítulo IV se estudió la incorporación de un ligando selectivo, la vitamina B9 ó AF, a la superficie de MAG, previamente funcionalizadas con 3-aminopropiltrietoxisilano (APTS). Para ello se evaluaron dos metodologías: la adsorción simple del AF y el anclaje covalente mediado por carbodiimida. Se combinaron los datos experimentales obtenidos con estudios teóricos. Esto permitió adquirir conocimientos acerca del mecanismo de interacción AF- MAG@APTS y corroborar la disponibilidad del grupo selectivo del AF posterior a su incorporación a la superficie de MAG@APTS. En una segunda instancia, se estudió la estabilidad de las nanoformulaciones obtenidas de acuerdo a dos criterios: (i) evolución del DH en función del tiempo de almacenamiento en dispersión acuosa y (ii) estudio de la capacidad de retención del AF incorporado. Finalmente, se incluye un estudio tendiente a predecir el comportamiento de las nanoformulaciones en un medio que simula el plasma sanguíneo en términos de osmolaridad, pH y contenido de proteína.En el Capítulo V se presentan y discuten los ensayos realizados para proveer a las nanoformulaciones de la acción terapéutica necesaria para constituir un agente teranóstico. La carga de la droga se realizó mediante adsorción superficial, explorando la influencia de diferentes parámetros asociados a dicho procedimiento. Se evaluó la liberación de Doxo in vitro mediante la implementación de una metodología que intenta simular la ruta que debería atravesar la nanoformulación una vez inyectada, vía intravenosa, en el torrente sanguíneo hasta su acumulación en el tumor.En el Capítulo VI se investigó la habilidad de las NPMs, presentadas en los Capítulos IV y V, para ser guiadas magnéticamente al exponerlas a un campo magnético externo mediante ensayos in vitro. Se propuso el empleo de un sistema de flujo continuo acoplado a un espectrofotómetro Uv-Visible, con el objetivo de monitorear la disminución del contenido de NPMs de la dispersión estudiada como consecuencia de la retención de las mismas por acción de un imán de neodimio colocado en el sitio blanco. En este capítulo, se analizó además, la capacidad de las nanoformulaciones como agentes de contraste. Se determinó la eficiencia de contraste de cada formulación, comparando los valores obtenidos con los correspondientes a agentes de contrastes comerciales.En el Capítulo VII se incluyen ensayos in vitro, empleando una línea celular de cáncer colorrectal (CCR), con el fin de evaluar la capacidad del nanoteranóstico preparado de inhibir el crecimiento celular, a través de la internalización y la posterior liberación de droga en forma intracelular. En este mismo capítulo, se presentan, como complemento, los resultados correspondientes al estudio de la biocompatibilidad de las mismas nanoformulaciones utilizando un modelo animal de zebrafish. En el Anexo II se informan los resultados que complementan a este capítulo.Finalmente, en el Capítulo VIII, se puntualizan las conclusiones generales abordadas a partir de los resultados obtenidos y analizados en cada uno de los capítulos. Se definen además, los lineamientos de la proyección de futuros trabajos. The aim of this thesis is to design multifunctional nanosystems combining the diagnostic and therapy or theranostics, based on magnetic nanoparticles (MNPs) of iron oxide (magnetite/maghemite) for their potential application in the treatment of oncological pathologies. To this end, an experimental work involving the optimization of MNPs synthetic procedures followed by a sequential incorporation of different components was performed. The synthesis of MNPs was carefully studied in order to achieve a control on their physicochemical properties and stability in aqueous suspension. The folate receptor is overexpressed in several types of tumor cells. Therefore, MNPs surface was modified with folic acid (FA) to provide them selectivity and affinity towards tumor cells. At a later stage, MNPs modified with FA were loaded with an oncological drug aiming to impart them therapeutic function. Doxorubicin (Doxo) is one of the most effective and used chemotherapeutic agents for the treatment of many types of cancer. In spite of this, several side effects are associated with the systemic distribution of this drug once administrated. These unwanted effects are related to large drug dosage, poor selectivity and low efficiency associated to the non specific distribution of drugs in the body. The following instances comprising this work were devoted to evaluate the capabilities of the theranostic agents concerning: (i) in vitro magnetic targeting, (ii) diagnostic as contrast agent for imaging magnetic resonance (MRI); (iii) therapeutic functions. In Chapter I, the fundamental concepts regarding the nanotechnology, nanoscience and nanomaterials are introduced. The abilities of MNPs to these kinds of applications are emphasized, justifying their selection for the development of this thesis. Magnetite (MAG, Fe3O4) was employed to formulate the MNPs. The methods of synthesis are briefly reviewed, highlighting the co-precipitation technique. Besides, different stabilization and functionalization strategies of the magnetic core are described. The applications of MNPs in biomedicine are summarized. Their capabilities as contrast agents in RMI, and target drug delivery are presented, as well as their potential as theranostic agents. Finally, the hypothesis followed by the general and specific objectives is defined. Chapter II describes all reagents and solvents employed in this work. Besides, the techniques used for the nanoparticles characterizations are described together with preparative treatment of the samples for each one. In Chapter III, the study of the synthesis methodologies, and stabilization of MAG are presented. Two methods of obtention are described; co-precipitation and its reduction-precipitation, both were evaluated in order to select a suitable methodology for achieving MAG. The co-precipitation technique was chosen based on the reached results. An exhaustive study of the experimental conditions associated to this methodology was included. This analysis involved the study of MAG formation mechanisms as well as a complete structural and surface characterization. The necessary tests to evaluate the stability, in terms of the evolution of the hydrodynamic diameter (HD) as a function of the storage time in aqueous suspension were performed. Complementary results are reported in Annex I. In Chapter IV the incorporation of FA to MAG surface, previously modified with APTS, was studied aiming to provide selectivity towards folate receptors. To do this, two methodologies were evaluated: simple adsorption and covalent linkage. The obtained experimental data were combined with theoretical studies to gain knowledge about the possible mechanisms to FA-MAG@APTS linkage. These data also provided evidence regarding the availability of the selective FA group after its incorporation into the MAG@APTS surface. The stability of the obtained nanoformulations was studied based on two criteria: (i) the evolution of the HD as a function of the storage time in aqueous dispersion and (ii) the study of the FA retention. Finally, a study tending to predict the behavior of nanoformulations in a medium simulating blood plasma in terms of osmolarity, pH and albumin content was developed. In this sense, the aggregation trend and the nanosystems stability were the analyzed parameters. In Chapter V, the assays devoted to provide the nanoformulations with therapeutic action are presented and discussed. The loading of the drug (Doxo) was carried out by simple adsorption. The influence of different parameters associated with the reaction was explored. The release of Doxo was analyzed by implementing an original procedure to simulate the pathways followed by MNPs once intravenously administered. In Chapter VI, the magnetic target ability of MNPs presented in Chapters IV and V, was in vitro investigated. To achieve this, a novel continuous flow system was fabricated to quantify the amount of MNPs retained in the magnet site in an environment mimicking the bloodstream. On the other hand, the efficiency of the nanosystems as selective contrast agents in MRI was analyzed using a clinical equipment. Chapter VII includes in vitro tests, using a human colorectal cancer cell line (CCR). The evaluated parameters were the MNPs internalization, cellular viability and the therapeutic action of the MNPs loaded Doxo. On the other hand, the results corresponding to biocompatibility studies of the same nanoformulations in vivo are presented. To this end an animal model, zebrafish (Danio rerio), was implemented. Complementary results are reported in Annex II. Finally, Chapter VIII lists the overall conclusions of this investigation work and establishes the guidelines for the future works. Fil: Azcona, Pamela Liliana. Autor; . Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Bahía Blanca. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Bahía Blanca. Universidad Nacional del Sur. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Bahía Blanca; Argentina

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Treatment protocols in Oncology experienced massive changes in recent decades which have contributed to improve the morbidity and mortality of cancer. However, these advances were often achieved at the expense of significant side effects. The authors describe a case of a 62 year old woman with Follicular non-Hodgkin’s Lymphoma who develops a toxic Myocarditis due to Doxorubicin. Anthracyclines cardiotoxicity is an established irreversible complication. There are a few measures that shall be taken into account in order to supervise, prevent and treat these patients.

El cáncer de mama es una enfermedad compleja y heterogénea en la que los pacientes pueden presentar síntomas similares y padecer la misma enfermedad por razones genéticas completamente diferentes. Los factores que contribuyen a esta heterogeneidad incluyen la variación en el genoma de cada paciente, las diferencias en el origen y la naturaleza de la célula tumoral y los eventos genéticos que contribuyen a la progresión del tumor. La recaída en cáncer de mama es una de las mayores causas de morbilidad en pacientes que desarrollan la enfermedad y, entre ellas, entre un 15-20% poseerán tumores de mama triple negativo (TN). La mortalidad de pacientes con cáncer de mama TN es considerablemente mayor si se compara con otros tumores mamarios, siendo complicado predecir respuestas individuales al tratamiento. Estos datos resaltan la necesidad de nuevas estrategias que integren información tanto clínica, como genética y molecular para poder predecir respuestas individuales a fármacos o la progresión de la enfermedad. En la presente tesis doctoral se ha realizado el estudio del estado de la región 11q23.3 y se ha identificado el biomarcador TRIM29, presente en dicha región. Se ha estudiado el estado del gen, la función de TRIM29 en líneas celulares de cáncer de mama, su relación en la proliferación, migración y la resistencia a tratamientos mediante Doxorubicina. Para llevar a cabo los objetivos propuestos realizamos diferentes experimentos basados en técnicas de biología molecular, celular y técnicas bioinformáticas. Para la hibridación mediante Hibridación Fluorescente in situ (FISH), se elaboraron sondas no comerciales a partir del marcaje de Cromosomas Artificiales Bacterianos (BACs), con la finalidad de visualizar el estado de la región genómica de interés. De un stock de 59 líneas celulares, obtuvimos DNA, RNA, y proteína, con el fin de estudiar el estado de la región génica y la expresión de TRIM29 a nivel de mensajero y proteína. Se seleccionaron las lineas celulares con diferente expresión de TRIM29 y se modificó su expresión con la finalidad de estudiar los efectos tanto a nivel funcional como para observar si variaba la co-expresion con genes relacionados positivamente. Por último, a nivel celular, estudiamos las diferencias en migración, proliferación y resistencia frente a los tratamientos, entre las líneas control y las modificadas. Además, se elaboraron Tissue Microarray (TMAs) de parafinas de 97 tumores de cáncer de mama para comprobar la expresión de expresión de TRIM29 en los diferentes subtipos grácias a los marcadores de clasificación estudiados en pacientes. Breast cancer is a complex and heterogeneous disease where the patitets present the same syntomphs and suffer the same disease, but due to different genetic reasons. Some factors that contribute to this heterogeneity include patient genome variation, differences between the origin and the nature of the tumoral cell, and tumor progression due to genomic changes. Breast cancer recurrence is one of the biggest morbility causes in patients that suffer the disease, and 15-20% of them will develop triple negative breast cancer tumors (TN). Comparing it with other tumor subtypes, the mortality of patients harbouring TN tumors is higher, in part, due to the difficulty of getting personalized drugs. These data show the need to look for new drug strategy, where clinical, genetics and molecular data could be integred and compared. The main objetive in this Thesis is to analyze the genomic status of 11q23.3 chromosomal region and the gene TRIM29 that mapped at this region as a candidate biomarker of breast cancer proliferation and agressivenes but also as a of therapeutic response both in breast cancer cell lines and patients. To accomplish the objectives proposed, we will perform different experiments based in molecular biology, celular and bioinformatic techniques. In order to perform the fluorescence in situ hybridization (FISH), non-commercial probes where done by using labelled BACs. Starting from samples of DNA, RNA and protein of 59 cell lines, we will study the status of TRIM29 region and TRIM29 mRNA and protein expression level. Moreover, we have 600 DNA breast cancer patients and controls collection, where we will be able to study alterations in TRIM29 region, and we will try to relate the gain or the deletion with the different subtypes of breast cancer. Besides, Tissue Microarray (TMA) of 97 breast cancer patients will be used to observe the expression of TRIM29 in the different subtypes according to the inmunohistochemycal subtype classification markers. Finally, to observe the biological implications of the biomarker, we will modify the expression of TRIM29 in TN breast cancer cell lines, who do not express the gene, but also in those who overexpress it. Once we get modified cell lines, we will study the differences in TRIM29 and related genes expression, migration, proliferation and drug treatment resistance between control and modified cell lines.

The interaction of doxorubicin (DX) with model polynucleotides poly(dG-dC)·poly(dG-dC) (polyGC), poly(dA-dT)·poly(dA-dT) (polyAT), and calf thymus DNA has been studied by several spectroscopic techniques in phosphate buffer aqueous solutions. UV-vis, circular dichroism, and fluorescence spectroscopic data confirm that intercalation is the prevailing mode of interaction, and also reveal that the interaction with AT-rich regions leads to the transfer of excitation energy to DX not previously documented in the literature. Moreover, the DX affinity for AT sites has been found to be on the same order of magnitude as that reported for GC sites.

Background. Prostate cancer is the most prevalent cancer in men worldwide. Advanced diseases are commonly treated with androgen deprivation therapy however patients progress into castration-resistant prostate cancer, which is the most aggressive and lethal form of prostate cancer. In these patients, chemotherapy is not effective due the onset of drug resistance mediated by P-glycoprotein p (Pgp) overexpression, consequently, the prognosis is poor. Materials and methods. We developed synthetic doxorubicins, containing NO and H2S-releasing groups (DR6 and CC2790A) that showed an high cytotoxicity on in vitro model of doxorubicin-resistant prostate cancer cells (DU-145). DU-145 cells were injected (4*106 for animal) in nude mice (Nude-Foxn1nu/Foxn1+). Animals were divided in to four groups and treated for three weeks with vehicle, doxorubicin, DR6 and CC2790A (5mg/kg) respectively. During and after treatment animal weight, tumor volume, drugs accumulation in the tumors, the percentage of apoptotic cells, the presence of nytrotyrosine residues and SH groups in the tumors and the left ventricular wall thickness were evaluated. Results and discussion. DR6 and CC2790A induced a reduction of 60% of tumor volumes, while doxorubicin didn't exert any effect. The drugs auto-fluorescence revealed an high accumulation of our drugs within the tumor masses. In fact DR6 and CC2790A, as opposed of doxorubicin, increased the presence of apoptotic cells in both the inner and the outer part of the tumors. The treatment with DR6 and CC2790A increased the presence of nytrotyrosine and SH groups in the tumor masses respectively, suggesting a possible mechanism of Pgp inhibition. Regarding the cardio-toxic side effects, doxorubicin caused two deaths during treatment and significantly increased the left ventricular wall thickness. On the contrary, the treatment with DR6 and CC2790A did not show either macroscopic or microscopic evidences of toxicity. Conclusion. DR6 and CC2790A are potential novel therapeutic strategies against chemoresistant prostate cancer combining efficacy with reduced cardiovascular side effects. By proposing an innovative strategy to reverse chemotherapy resistance, our study suggests a new tool against androgen independent prostate cancer, aiming at ameliorating the prognosis and improving the quality of life of a significant proportion of patients.

Tese de mestrado em Biologia Molecular e Genética, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2017 Submitted by Cristina Manessiez (camanessiez@fc.ul.pt) on 2018-01-15T15:58:14Z No. of bitstreams: 1 ulfc120818_tm_Carina_Ramos.pdf: 1194447 bytes, checksum: c3b974c87c190c7b7b108a6516b1dd13 (MD5) Made available in DSpace on 2018-01-15T15:58:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ulfc120818_tm_Carina_Ramos.pdf: 1194447 bytes, checksum: c3b974c87c190c7b7b108a6516b1dd13 (MD5) Previous issue date: 2017

[ES] El cáncer de mama representa el segundo cáncer más común en el mundo, el cáncer más frecuente entre las mujeres y la quinta causa de muerte por cáncer. Un subtipo de cáncer de mama, conocido como cáncer de mama triple negativo (TNBC), afecta entre el 10-20% de las pacientes, y tiene un mal pronóstico. El TNBC no responde a la terapia hormonal o a terapias dirigidas a los receptores HER2, y tiene mayor probabilidad de ser invasivo. A pesar de los grandes esfuerzos para tratar el cáncer, ha habido muy poca mejora en los terapéuticos contra el cáncer en las últimas décadas. El campo de la nanomedicina se ha convertido en una aproximación prometedora para el tratamiento, diagnóstico, monitorización y control de sistemas biológicos, con el potencial de tener un gran impacto en el tratamiento del cáncer. Las estrategis nanomédicas actuales incluyen la aplicación de una combinación de nanotecnología y química polimérica, en la que el fármaco es dispersado en la nanopartícula polimérica o se conjuga al esqueleto del polímero. Estas estructuras se conocen como “polímeros terapéuticos” y comparten muchas características con otros fármacos macromoleculares, pero con características interesantes adicionales que pueden mejorar el tratamiento. Estas incluyen mayor solubilidad del fármaco, mayor vida media del fármaco en plasma, menos efectos secundarios y menor excreción renal. Además, pueden ser multivalentes, dado que pueden llevar más de un fármaco en la misma estructura, y por tanto se puede suministrar una dosis mayor al paciente. Los tratamientos de combinación tienen el potencial de mejorar la respuesta al tratamiento, minimizar el desarrollo de resistencia y minimizar eventos adversos y, por tanto, la aplicación de agentes terapéuticos en combinación se ha convertido en la primera estrategia para tratar cánceres resistentes a fármacos. En este proyecto se han caracterizado cinco líneas celulares con el fin de hacer un diseño racional de un conjugado polímero-fármaco para cada línea. Por otro lado, se ha estudiado el efecto de una terapia de combinación en dos líneas celulares representativas del cáncer de mama triple negativo. La combinación estudiada fue doxorubicina, la cual es un fármaco quimioterapéutico que frena o para el crecimiento de las células cancerosas mediante el bloqueo de un enzima llamado topoisomerasa 2, y fasudil, un potente inhibidor de Rho-kinasa, del cual se ha demostrado que inhibe la motilidad de las células tumorales y la metástasis y que modifica la morfología de las células tumorales e inhibe el crecimiento independiente de anclaje. También se ha estudiado el efecto de un conjugado polímero-fármaco para el tratamiento de las dos mismas líneas celulares anteriormente mencionadas, en el que fasudil ha sido el fármaco conjugado., [EN] Breast cancer represents the second most common cancer in the world, the most frequent cancer among women, and the fifth cause of death from cancer overall. A subtype of breast cancer, known as triple negative breast cancer (TNBC), affects between the 10-20% of the patients and suffers from a poor prognosis. TNBC does not respond to hormonal therapy or therapies that target HER2 receptors and is more likely to be invasive. Despite huge efforts to treat cancer, there has been very little actual improvement in cancer therapeutics over recent decades. The field of nanomedicine has developed into a promising approach for the treatment, diagnosis, monitoring and control of biological systems, with the potential to making a huge impact in cancer treatment. Polymer Therapeutics can be considered one of the first described nanomedicines and share many characteristics with other macromolecular drugs, but bearing additional interesting features that may enhance cancer treatment. These include enhanced drug solubility, enhanced drug half-life in plasma, fewer secondary or side effects, and lower renal excretion. Also they present a bioresponsive covalent linker between the drug and the polymer carrier which offer a greater drug pharmacokinetics control not only at cellular level but also systemically. Furthermore, polymer therapeutics can be multivalent, given that more than one drug can be attached to a polymer, and therefore a higher dose can be given to the patient. Combination treatments have the potential to further improve treatment response, minimize development of resistance, and minimize adverse events and, therefore, the application of therapeutic agents in combination has become the primary strategy to treat drug resistant cancers. In this project five cell lines have been characterized in order to better design a polymer-drug conjugate for each one. Otherwise, the effect of a combination therapy has been studied on two TNBC cell lines. The combination studied was doxorubicin, which is a chemotherapy drug that slows or stops the growth of cancer cells by blocking an enzyme called topoisomerase 2, and fasudil, a potent Rho-kinase inhibitor that has been shown to inhibit tumor cell motility and metastasis and to modify tumor cell morphology and inhibit anchorage-independent growth. Furthermore, the effect of a polymer-drug conjugate, where fasudil was the drug conjugated, has been studied for the treatment of the same two TNBC cell lines.

Entre los diferentes subtipos de cáncer de mama se encuentra el triple negativo, denominado así porque las células tumorales de este subtipo presentan baja expresión o carecen de receptores de estrógenos, receptores de progesterona, y receptores del factor de crecimiento epidérmico tipo II (HER2). Actualmente no existe una diana específica para el tratamiento de este tipo de cáncer de mama, caracterizado por ser muy agresivo, presentar alto riesgo de metástasis, un alto índice de recurrencia, y una bajo índice de supervivencia. Debido a la falta de dianas moleculares específicas, el tratamiento comúnmente utilizado es la quimioterapia. Dentro de los diferentes agentes quimioterápicos, se encuentra la doxorubicina, una antraciclina que produce disrupción del DNA y muerte celular. Sin embrago, un gran porcentaje de las pacientes triple negativas tratadas con antraciclinas presentan enfermedad residual en los tres años posteriores al tratamiento, además de un incremento en el riesgo de mortalidad. Los mecanismos de quimiosensibilidad y quimioresistencia a la doxorubicina todavía no están claros, por lo que el estudio de las vías de regulación y posibles dianas específicas podría optimizar la respuesta a este tratamiento. En este sentido, los microRNAs (miRNAs) surgen como un nuevo peldaño de regulación del cáncer y respuesta a tratamiento. En este trabajo de investigación analizamos los niveles de expresión de miRNAs en líneas celulares de cáncer de mama con subtipo molecular triple negativo (MDA-MB-231 y MDA-MB-468) y luminal A (MCF-7), tras el tratamiento con doxorubicina. Los resultados nos permiten establecer grupos de miRNAs que cambian tras el tratamiento y que pueden predecir una respuesta diferencial al fármaco. Además, mediante herramientas bioinformáticas, estudiamos la posible interacción entre los miRNAs y sus potenciales dianas. Finalmente nos centramos en la línea celular triple negativa MDA-MB-231 y en la familia de miRNAs-449, puesto que todos sus miembros se sobre-expresan tras el tratamiento. De manera paralela trabajamos con una línea celular triple negativa resistente a doxorubicina (MDA-MB-231R) donde medimos la expresión tanto de la familia de miRNAs-449 como de sus dianas, y encontramos diferencias significativas respecto de las líneas triples negativas sensibles al fármaco. Las pruebas funcionales (tanto de sobreexpresión como de inhibición de esos microRNAs) demuestran que esta familia regula vías de respuesta al fármaco relacionadas con apoptosis y/o ciclo celular a través de la interacción con sus dianas génicas. Por otra parte, realizamos estudios de viabilidad y ciclo celular, con el objetivo de analizar el posible papel de estos miRNAs en la respuesta a la doxorubicina a través de la des-regulación del ciclo celular. Además medimos la expresión de esta familia de miRNAs y de sus dianas en pacientes de cáncer de mama triple negativo tratadas con antraciclinas. En conjunto, los resultados obtenidos indican que esta familia de miRNAs puede mediar, al menos en parte, la respuesta al fármaco, y que su sobre- o infra- expresión conducen a cambios en la sensibilidad o la resistencia al tratamiento respectivamente.

Dentro de los compuestos con amplio interés en terapia anticancerosa se encuentran las antraciclinas, destacando la doxorubicina, la daunorubicina y la epirubicina. Estos fármacos son ampliamente usados en la clínica, ya que poseen propiedades anticancerígenas que ayudan a combatir diferentes tipos de cánceres, entre los que se incluyen tumores hematológicos y tumores sólidos. Se ha comprobado que la capacidad anticancerosa de las antraciclinas está íntimamente relacionada a la interacción de estos fármacos con la doble hélice de ADN, donde la estructura de las antraciclinas juega un papel fundamental. Así pues, la posterior inhibición de la enzima topoisomera-II, así como la formación de radicales libres constituyen algunos de los efectos anticancerígenos más importantes asociados a estos fármacos. No obstante, a pesar de su capacidad anticancerígena, el uso de las antraciclinas en terapia antineoplásica se encuentra limitado debido a sus efectos adversos, entre los que se destaca fundfundamentalmente la cardiotoxicidad. Esta revisión bibliográfica resume la capacidad anticancerígena de estos fármacos, así como sus aplicaciones en terapia anticancerosa y sus posibles efectos adversos. Universidad de Sevilla. Grado en Farmacia

Tese de doutoramento em Biociências, na especialidade de Toxicologia, apresentada ao Departamento de Ciências da Vida da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra Um tumor é constituído por diferentes tipos de células, entre as quais as células estaminais tumorais. Células estaminais tumorais apresentam características únicas como rápida proliferação, plasticidade e pluripotência, tornando-as de elevado interesse clínico. As células estaminais tumorais são assim apontadas como sendo células iniciadoras de tumores bem como responsáveis da reincidência da doença. É também consensual que as células estaminais tumorais são mais resistentes às terapias convencionais, como a quimioterapia e radioterapia, quando comparando com a população heterogénea de células tumorais normais. Este trabalho pretendeu esclarecer as características desta subpopulação de células estaminais tumorais e o que as tornam mais resistentes à morte celular quando comparando com as células mais diferenciadas. O modelo celular que usámos, células P19 de carcinoma embrionário tem como vantagem a utilização de uma só linha celular, podendo-se obter células P19 estaminais de carcinoma (P19SCs) ou células P19 de carcinoma mais diferenciado (P19dCs) que nos permitirão investigar diferentes resultados observados relativamente ás terapias cancerigenas. Como tal, pretendemos verificar as diferenças fisiológicas mitocondriais bem como a sua capacidade de resistir e detectar danos de DNA, factores que contribuem para a resistência à morte celular das P19SCs quanto comparadas com as P19dCs. A mitocôndria está ligada a diversos processos celulares para além do seu papel na produção de energia. Neste trabalho, a mitocôndria demonstrou ser crucial nos processos celulares de heterogeneidade, de auto-renovação e de diferenciação, processos chaves no potencial tumorogénico das células cancerígenas. De facto, existe uma relação entre o metabolismo e o destino celular escolhido. As células alteraram as suas preferências metabólica, bem como a proliferação, auto-renovação e diferenciação a fim de minimizar o stress, manter um potencial estaminal máximo e estimularem a sobrevivência. P19SCs demonstraram ser essencialmente glicolíticas no processo de obtenção de energia e apresentaram mitocôndrias de características distintas. Quando forçadas a mudar o seu metabolismo energético para um metabolismo mais oxidativo, um processo de diferenciação é iniciado com consequente redução da proliferação celular. Neste trabalho as drogas quimioterapêuticas cisplatina, etoposídeo e doxorubicina foram utilizadas como agentes de danos de DNA, de modo a estudarmos a resistência das células estaminais cancerígenas, bem como esclarecer que vias podem estar envolvidas nesta resistência descrita na literatura. Com o nosso trabalho verificámos que cada uma destas drogas têm diferentes tipos de efeitos nas células P19SCs e nas P19dCs. De facto, as células mais diferenciadas parecem ser mais afectadas por todas as drogas (mais danos de DNA) em que o mecanismo de apoptose dependente da via das caspases se encontra activo. As P19SCs tratadas com doxorubicina parecem igualmente afectadas quando comparando com as P19dCs, demonstrando que, contrariamente ás outras duas drogas testadas, a doxorubicin provoca danos mais severos, até mesmo para as P19SCs. Nas P19SCs tratadas com cisplatina que não apresentam danos de ADN de cadeia dupla (mais severos) e que estão presentes nas células mais diferenciadas, vias como paragem no ciclo celular, activação da proteína PARP-1 envolvida na reparação celular, bem como a activação do mecanismo de autofagia (mecanismos não observados nas células mais diferenciadas), contribuem para a resistência destas aos danos de ADN provocados pela cisplatina (maioritariamente danos de cadeia simples). Para além destas vias, um mecanismo de diferenciação e manutenção do potencial de pluripotência pode também estar associado ao mecanismo de resistência. Nas P19SCs tratadas com etoposídeo que não apresentam danos de ADN de cadeia dupla (mais severos) detectados nas P19dCs, apesar da paragem do ciclo celular ser igual em ambas os tipos de células estudadas, a expressão da proteina PARP-1 bem como o mecanismo de autofagia estar activo contribuem para a resistência destas aos danos de ADN provocados pelo etoposídeo. Aliás a resistência das células estaminais ao etoposídeo pode passar pela manutenção do potencial de pluripotência. Em conclusão podemos afirmar que as P19SCs e as P19dCs reagem de modo diferente a cada umas das drogas, e que estas diferenças podem justificar e esclarecer a resistência das células estaminais tumorais a um dos tratamentos mais utilizados no cancro, a quimioterapia. Cancer stem cells (CSCs) are amongst the heterogeneous group of cells constituting tumors. CSCs present unique characteristics such as their high proliferative ability, plasticity and pluripotency, making these cells clinically relevant. In recent years, CSCs have been pointed out as tumor initiators and as responsible for disease recurrence. Moreover, is also consensual that CSCs are more resistant to conventional anti-cancer therapies, namely chemotherapy and radiotherapy, when compared with other cells constituting the tumor. This work was designed to clarify the characteristics that turn this subpopulation of cells more resistant to cell death when compared to their differentiated counterparts. To achieve this, we used P19 embryonic cancer cells that constitute a great model as it allows the study to be performed with a single cell line from which one can obtain both P19 cancer stem cells (P19SCs) and P19 differentiated cancer cells (P19dCs). By working with these P19 cell groups, we intended to investigate the distinct outcomes when applying different anti-cancer therapies. In this regard, our study focused on the identification of the main mitochondrial physiological alterations between P19dCs and P19SCs, as well as the characterization of each cell group capacity to resist and detect DNA damage. This knowledge comes with high relevance as together these attributes are thought to contribute to CSCs resistance to cell death. In addition to their role in energy production, mitochondria have been associated with important roles in different cell processes. Along this work, this organelle was shown to be crucial in heterogeneity cell processes, self-renewal, and differentiation, all of which contribute for the tumorigenic potential of cancer cells. Our results support the existence of a link between metabolism and cell faith. Cells were shown to alter their metabolic preferences, proliferation as well as selfrenewal and differentiation in order to minimize stress, maintain a maximum stemness potential and stimulate survival. P19SCs exhibited a more glycolytic metabolism and mitochondria from this cell group had particular characteristics that, when forced to an oxidative metabolism, leads to the initiation of a differentiation process resulting in a reduction of cell proliferation. The study of CSCs resistance to chemotherapeutic drugs was performed with cisplatin, etoposide and doxorubicin aiming the characterization and clarification of the pathways involved in the resistance described in the literature. Interestingly, the obtained results revealed that each one of the drugs used in the study hads different effects in P19SCs when compared to P19 cells differentiated with retinoic acid. In fact, differentiated cells were more affected by the drugs used as these cells present more DNA damage, in which caspase-dependent apoptosis pathway was activated. P19SCs were similarly affected to doxorubicin treatment when compared to P19dCs, revealing that in contrast to the other drugs used, cell damage induced by doxorubicin may be too severe impairing P19SCs resistance ability. Nevertheless, in contrast with more differentiated cells, P19SCs treated with cisplatin did not present double strand DNA damage, highly severe. Furthermore, mechanisms such as cell cycle arrest, PARP-1 activation, which is associated with cell repair, and autophagy activation, were not observed in P19dCs in contrast to P19SCs suggesting that the described mechanisms may contribute for the later cell group resistance to cisplatin-induced DNA damage. Additionally, the maintenance of a pluripotency potential or even a diferentiation processess might also be related with P19SCs resistance to cisplatin.. Similarly to our observations for cisplatin, etoposide treatment did not result in double strand DNA damage in P19SCs, however these cells showed identical cell cycle arrest pattern to their differentiated counterparts. Despite this similarity, P19SCs have higher PARP-1 expression, which together with autophagy activation might explain the observed resistance to DNA damage upon treatment with etoposide. Additionally, the maintenance of a pluripotency potential might also be related with P19SCs resistance to this drug. In summary, we conclude that P19SCs operate differently when subjected to distinct treatments and when compared to P19dCs. Overall, our observations allow for a better knowledge of the mechanism involved in cancer stem cell resistance to chemotherapeutics as it allows the understanding of the described resistance of cancer stem cells to anti-cancer treatments applied. FCT - SFRH/BD/66138/2009

Dissertação de mestrado em Bioengenharia, Breast cancer is the most frequently diagnosed cancer and the leading cause of cancer death among females worldwide, with an estimated 1.7 million new cases and 521,900 deaths in 2012. Conventional treatments, such as chemotherapy and radiotherapy, continue to be the base of cancer therapy. These types of treatments non-specifically target any dividing cells, which in the case of chemotherapy, results in an indiscriminate drug distribution and severe toxicity for patients associated to a poor distribution and penetration of the drugs. To solve this problem and improve patient’s lifestyle, it is of utmost importance the development of new targeted therapies that eventually eliminate only cancer cells. This work aimed to develop a phage-based nanoparticle that will be used as a carrier for cytotoxic drugs in order to decrease drugs concentration in situ. To achieve this goal, the M13 filamentous bacteriophage was genetically modified to display, on its surface, HIV-Tat cell-penetrating peptides, which allows the internalization of the phage particles towards breast cancer cells. Genetically modified phages were then conjugated with the doxorubicin anti-carcinogenic drug, which was expected to result in a lower, controlled and in situ cytotoxic payload. Despite M13 phage has been genetically modified with success and proved to penetrate the cells, it appears to have no enhanced cytotoxic activity when compared to the free drug effect. In the future the phages obtainded in this work should be genetically modified with a sequencence encoding for a recognition peptide to discriminate between cancerous and healthy cells, thereby creating a targeted cytotoxic particle., O cancro da mama é o cancro mais frequentemente diagnosticado e a principal causa de morte por cancro entre as mulheres em todo o mundo, tendo sido estimados cerca de 1,7 milhões de novos casos e 521,900 mortes em 2012. Os tratamentos convencionais, como a quimioterapia e a radioterapia, continuam a ser a base terapêutica deste tipo de doença. Contudo, estes tipos de tratamentos não são específicos tendo como alvo todas as células em divisão, sendo que, no caso da quimioterapia, há uma distribuição e penetração indiscriminada de drogas altamente citotóxicas, resultando na deteriorazação física dos pacientes. Para resolver este problema e melhorar o estilo de vida do paciente, têm vindo a desenvolver-se novas terapias direcionadas, com o objectivo de eliminar apenas as células cancerosas. Este trabalho tem como objectivo desenvolver uma nanopartícula, à base de bacteriofagos, de forma a transportar drogas citotóxicas e diminuir a sua concentração in situ. Para atingir este objetivo, o bacteriofago filamentoso M13 foi geneticamente modificado, com o propósito deste exibir o péptido de internalização celular HIV-Tat à sua superfície, através da técnica de phage display. De seguida os fagos genéticamente modificados foram químicamente conjugados com um fármaco anticancerígeno, a doxorrubicina, sendo assim esperado um payload citotóxico mais baixo e controlado, no local do tumor. Apesar do fago ter sido genéticamente modificado com sucesso e ter mostrado internalizar nas células tumorais de cancro de mama, este parece não ter qualquer actividade citotóxica quando comparado com o efeito da droga livre. No futuro o fago construido neste trabalho deverá ser geneticamente modificado com a sequencia de um peptido de reconhecimento de forma a discriminar entre celulas cancerígenas e saudáveis, criando assim uma particula citotóxica direcionada.

Existe una importante variabilidad interindividual en la respuesta a los medicamentos que condiciona que no sea fácil predecir la efectividad o seguridad de un fármaco en un paciente concreto. La Farmacogenética (PGt) estudia el vínculo entre las variaciones en la secuencia de ADN de un paciente y su respuesta al tratamiento farmacológico. La variación de un único nucleótido puede tener consecuencias dramáticas, de modo que la identificación de variantes que alteren la función o expresión de las proteínas implicadas en la farmacocinética o farmacodinamia y su efecto final sobre la respuesta es el objetivo de la PGt. El Cáncer de Mama (CM) es el tipo de cáncer más frecuente en mujeres. A pesar de que la farmacoterapia ha avanzado enormemente, la quimioterapia clásica basada en antraciclinas y taxanos sigue siendo fundamental en el tratamiento del CM en diferentes estadios. Los taxanos son sustratos de enzimas del citocromo P 450, así como de la glicoproteína P. Las antraciclinas también son sustrato de estos transportadores, pero son metabolizadas por acción de carbonil reductasas y aldoketoreductasas. En varios trabajos se han puesto de manifiesto asociaciones entre variantes en los genes que codifican para proteínas implicadas en estos procesos y la toxicidad/respuesta a antraciliclinas y taxanos. Además, existe un segundo grupo de genes implicado tanto en el mecanismo de acción como en la toxicidad de taxanos y antraciclinas. Se trata de genes implicados en la generación de estrés oxidativo, reparación del ADN y la respuesta antioxidante, como NOS3 o SOD2. Hasta el momento se ha estudiado muy poco la implicación de este grupo de genes en la toxicidad y en la respuesta de taxanos y antraciclinas. En este estudio se incluyeron 157 pacientes con diagnóstico histológico de CM que iban a iniciar tratamiento antineoplásico basado en antraciclinas (doxorubicina, epirubicina) y taxanos (docetaxel, paclitaxel) y logramos identificar variantes genéticas relacionadas con las principales toxicidades de estos fármacos, así como con la respuesta patológica completa en pacientes con tratamiento neoadyuvante. En concreto, la neutropenia estuvo asociada con ciertas variantes de NOS3 (gen que codifica para la óxido nítrico sintasa y está relacionado con los niveles de óxido nítrico) en mujeres tratadas con docetaxel y filgrastim. Este mismo gen se relacionó con la neutropenia febril y con la neutropenia en pacientes con doxorubicina y en tratamiento con ambos antineoplásicos. ABCB1, gen que codifica para la glicoproteína P, se asoció con la diarrea en pacientes con docetaxel, con un menor riesgo para aquellas con variantes relacionadas con una menor actividad de la bomba. La neurotoxicidad es una de las reacciones adversas de los taxanos con mayores consecuencias a largo plazo. En este trabajo encontramos la asociación de varios genes implicados en la generación de estrés oxidativo con neurotoxicidad en pacientes tratadas con paclitaxel. En concreto ERCC1, que interviene en procesos de reparación del ADN, y SOD2 que codifica para la superóxido dismutasa. La mielosupresión y las reacciones adversas gastrointestinales son las más importantes toxicidades de epirubicina. En el grupo de pacientes en tratamiento con FEC, dos SNPs en el gen que codifica para uno de los principales enzimas responsables del metabolismo de epirubicina, CBR3, se asociaron con mayor riesgo de anemia, así como SNPs en ABCB1 y la UGT se asociaron con reacciones adversas gastrointestinales. En el contexto del tratamiento neoadyuvante, la respuesta patológica completa (RPc) es un marcador subrogado de respuesta para la predicción de resultados a largo plazo, como la supervivencia global. En este trabajo, 4 polimorfismos fueron seleccionados como predictores de la RPc, destacando dos SNPs en ABCB1 que suponen una menor actividad en la bomba y, por tanto, una menor expulsión de fármaco de la célula. Así, en una cohorte de pacientes en tratamiento con antraciclinas y taxanos hemos encontrado asociaciones con la respuesta/toxicidad de la QT tanto en genes implicados en el transporte/metabolismo de los fármacos, como genes implicados en los procesos de generación de estrés oxidativo y respuesta antioxidante. Siendo este el primer trabajo que establece relaciones entre este segundo grupo de genes y la respuesta al tratamiento con taxanos en esquemas exentos de platinos. There is a significant interindividual variability in drug response, so predicting the effectiveness or safety of a drug in a particular patient is not easy. Pharmacogenetics (PGT) studies the association between changes in DNA sequence and drug response. Changes in only a single nucleotide may have dramatic consequences, so identifying genetic variants that alter the function or expression of proteins involved in the pharmacokinetics or pharmacodynamics and the final effect on response is the aim of the PGT. Breast Cancer (BC) is the most common type of cancer in women. Despite great advances in drug therapy, classical chemotherapy based on anthracyclines and taxanes remains central in the treatment of BC at different stages. Taxanes are substrates of cytochrome P 450 and P-glycoprotein. Anthracyclines are also substrates of these transporters but are metabolized by carbonyl reductases and aldoketoreductasas. Several studies have shown associations between variants in genes encoding proteins involved in these processes and toxicity / response to antraciclines and taxanes. In addition, a second group of genes has been proposed because its implications in both mechanisms of action and toxicity. These genes are involved in the generation of oxidative stress, DNA repair and antioxidant response (like NOS3 or SOD2). So far very little has been studied about the involvement of this genes in the response to taxanes and anthracyclines. In this study, 157 patients with histological diagnosis of CM that were going to recieve cancer treatment based on anthracyclines (doxorubicin, epirubicin) and taxanes (docetaxel, paclitaxel) were included. And we could identify genetic variants associated with the major toxicities of these drugs, as well as associated with pathological complete response in patients with neoadjuvant treatment. Specifically, neutropenia was associated with variations in NOS3 (gene encoding for nitric oxide synthase and related to the levels of nitric oxide) in women treated with docetaxel and filgrastim. This gene was also associated with febrile neutropenia and neutropenia in patients treated with doxorubicin and with both antineoplastic. ABCB1 gene, which encodes for P-glycoprotein, was associated with diarrhea in patients with docetaxel, with a lower risk for those carrying variants associated with lower pump activity. Neurotoxicity is one of the major adverse events of taxanos, with long-term consequences. In this study, we found the association of several genes involved in the generation of oxidative stress with neurotoxicity in patients treated with paclitaxel. Specifically, ERCC1, involved in DNA repair processes, and SOD2 encoding superoxide dismutase. Myelosuppression and gastrointestinal adverse reactions are the most important toxicities of epirubicin. In the group of patients treated with this drug, two SNPs in the gene encoding one of the key enzymes responsible for metabolism of epirubicin, CBR3, were associated with increased risk of anemia, and SNPs in ABCB1 and UGT were associated with gastrointestinal adverse reactions. In the context of neoadjuvant treatment, pathological complete response (PCR) is a surrogate marker of response for predicting long-term outcomes, such as overall survival. In this paper, 4 polymorphisms were selected as predictors of the PCR, including two SNPs in ABCB1, with less activity in the pump and therefore lower drug expulsion of the cell. Thus, in a cohort of patients treated with anthracyclines and taxanos, we have found associations with response and toxicity of chemotherapy in genes involved in the transport / metabolism of drugs, and also in genes involved in oxidative stress and antioxidant response. This is the first report that establishes associations between this second group of genes and response to treatment with taxanes in platinum-free schemes.

Dissertação de Mestrado em Biologia Molecular apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra. Doxorubicin (DOX), a potent and broad-spectrum antineoplastic agent, causes a cumulative dose-dependent cardiomyopathy of late-onset that may ultimately lead to congestive heart failure. The mechanisms responsible for the delayed nature of DOX cardiotoxicity remain poorly understood. Since DOX induces a persistent depression in cardiomyocyte gene expression patterns, it is reasonable to hypothesize that a “toxicity memory” is being formed by means of epigenetic modulation. To test this hypothesis, eight week-old male Wistar rats (n = 6 per group) were administered 7 weekly injections with DOX (2 mg kg−1) or equivalent volume of saline solution and sacrificed two weeks after the last injection. We assessed gene expression patterns by qPCR, global DNA methylation by ELISA and proteome lysine acetylation status by Western blot in cardiac tissue from saline and DOX-treated rats. We show for the first time that DOX treatment decreases global DNA methylation in a cardiac-specific fashion. These differences were accompanied by alterations in mRNA expression of multiple functional gene groups. Doxorubicin disrupted cardiac mitochondrial biogenesis, as demonstrated by reduced mtDNA levels and altered transcript levels for multiple mitochondrial genes encoded by both nuclear and mitochondrial genomes. Transcription of genes involved in lipid metabolism and epigenetic modulation were also disturbed. Western blotting analyses indicated a differential protein acetylation pattern in cardiac mitochondrial fractions of DOX-treated rats. Additionally, DOX treatment increased the activity of histone deacetylases. Overall, the results presented in this thesis support previous observations showing that DOX impairs cardiac mitochondrial function and induces a switch in substrate metabolism. These results are also consistent with the interplay between mitochondrial dysfunction and epigenetic alterations in the persistent nature of DOX-induced cardiotoxicity. One possibility is that DOX may modulate gene expression patterns via alterations to the epigenetic landscape, which could be related to a disturbance in metabolite availability. A doxorubicina (DOX), um potente fármaco antineoplástico com um amplo espectro de acção, causa uma cardiomiopatia cumulativa, dose-dependente que em última instância pode levar a insuficiência cardíaca. Os mecanismos responsáveis por esta condição ainda não são conhecidos. Como a DOX induz uma depressão persistente nos padrões de expressão genética em cardiomiócitos, podemos teorizar que a DOX imprime uma “memória tóxica” por meio de modulação epigenética. Para testar esta hipótese, ratos machos Wistar Han com oito semanas de idade (n = 6 por grupo) receberam oito injecções subcutâneas semanais de DOX (2 mg kg−1) ou de um volume equivalente de solução salina, sendo sacrificados duas semanas após a última injecção. O nosso trabalho identificou padrões de expressão genética por qPCR, metilação global de DNA por ELISA e o padrão de acetilação de lisinas no proteoma por Western blot em tecido cardíaco. Mostramos pela primeira vez que a DOX diminui os níveis de metilação global de DNA no tecido cardíaco. Este efeito foi acompanhado por alterações na expressão de mRNAs de vários conjuntos funcionais de genes. A DOX alterou a biogénese mitocondrial cardíaca, como identificado por uma redução dos níveis de mtDNA e alterações dos níveis de transcriptos de múltiplos genes mitocondriais codificados por ambos os genomas (nuclear e mitocondrial). A transcrição de genes envolvidos no metabolismo de lípidos e em modulação epigenética também foi alterada. Análises por Western blot revelaram um padrão de acetilação proteica diferente em fracções mitocondriais de animais tratados com DOX. Adicionalmente, o tratamento com DOX aumentou a actividade enzimática de deacetilases de histonas. Colectivamente, os resultados apresentados nesta tese suportam observações anteriores que mostram que a DOX perturba a função mitocondrial e induz uma substituição no substrato metabólico preferencial no coração, sendo também consistentes com a nossa hipótese de que uma acção recíproca entre disfunção mitocondrial e alterações epigenéticas é um factor importante na natureza persistente da toxicidade induzida pela DOX. Uma possível explicação é a de que a DOX modula os padrões de expressão genética através de alterações na paisagem epigenética, o que pode ser consequência de uma perturbação na disponibilidade de metabolitos.

Crude extract of the heartwood of Auxemma oncocalyx (A. oncocalyx) and its main component i.e., Oncocalyxone A (onco A), have elevated antioxidant and anti-tumoral activity, but studies on the action of these drugs regarding folliculogenesis are lacking. The aim of this study was to evaluate the effect of A. oncocalyx and onco A on the in vitro culture of isolated secondary follicles and on the in vitro maturation of oocytes from caprine antral follicles grown in vivo. Isolated secondary follicles were randomly distributed in six groups; the non-cultured control was immediately fixed upon isolation. The remaining follicles were cultured for 7 days in ?-MEM+ alone (control) or supplemented with DMSO, doxorrubicin, A. oncocalyx or onco A. After culture, follicles were evaluated for antrum formation, growth rate, apoptosis (TUNEL) and cellular proliferation (PCNA), as well as gene expression of Bcl2 and Bax. Additionally, cumulus oocyte complexes (COCs) were aspirated and allocated into five treatments for in vitro maturation: control, cultured only in maturation base medium (TCM 199+); or supplemented with DMSO; DXR; A. oncocalyx or onco A. After in vitro maturation, oocyte chromatin configuration and viability were assessed. After 7 days of culture, there was a reduction (P < 0.05) in the percentage of morphologically intact follicles, antrum formation, growth rate and number of PCNA positive granulosa cells in DXR treatment compared to the other treatments. In the DXR treatment a higher percentage (P < 0.05) of TUNEL positive follicles and higher (P < 0.05) relative BAX:BCL2 mRNA ratio’s were observed. After in vitro maturation of the COCs DXR, A. oncocalyx and onco A treatments had a greater (P < 0.05) percentage of abnormal oocytes and a lower (P < 0.05) percentage of viable oocytes as compared with the control group. However, only DXR and onco A treatments increased (P < 0.05) the percentage of alive oocytes with abnormal chromatin configuration. There were no differences in maturation rates between the control group and DXR, A. oncocalyx and onco A treatments. In conclusion, under our culture conditions, A. oncocalyx and onco A do not exhibit a toxic effect on isolated secondary follicles and on maturation rates of COCs recovered from antral follicles, however, these drugs negatively affected the COCs viability. Thus, the use of culture biotechnologies as an in vitro secondary follicle culture and in vitro oocyte maturation toxicity testing are appropriated methods to evaluate the possible effects of drugs in folliculogesis. O extrato da Auxemma oncocalyx (A. oncocalyx) e seu componente, Oncocalyxona A (onco A), possui atividade antitumoral, podendo afetar a fertilidade. Entretanto, estudos sobre a ação dessas substâncias em relação à foliculogênese caprina são desconhecidos. O objetivo desse estudo foi avaliar o efeito da A. oncocalyx e onco A no cultivo in vitro de folículos secundários isolados (Experimento 1) e na maturação in vitro (MIV) de oócitos de folículos antrais caprinos crescidos in vivo (Experimento 2). Folículos secundários isolados foram distribuídos em seis grupos, em que o controle não-cultivado foi imediatamente fixado em paraformaldeído 4%. Os folículos restantes foram cultivados durante 7 dias em ?-MEM+ sozinho (controle) ou suplementado com DMSO, doxorrubicina (DXR), A. oncocalyx ou onco A. Após o cultivo, os folículos foram avaliados quanto à formação de antro, taxa de crescimento, apoptose (TUNEL) e proliferação celular (PCNA), bem como a expressão dos genes BCL2 e BAX. Além disso, os complexos cumulus-oócitos (CCOs) foram aspirados e distribuídos em cinco tratamentos para MIV: o controle em meio de maturação (TCM 199+), e os demais tratamentos suplementados com DMSO, DXR, A. oncocalyx ou onco A. Depois da MIV, a configuração da cromatina e viabilidade oocitária foram avaliadas. Após 7 dias de cultivo, observou-se redução na percentagem de folículos morfologicamente intactos, na formação de antro, na taxa de crescimento e no número de células PCNA positivas (P < 0,05). Depois do cultivo, no tratamento DXR foi observada maior percentagem de folículos TUNEL positivos (P < 0,05) e também aumento na taxa de RNAm BAX: BCL2 (P < 0,05). Após MIV dos CCOs, nos tratamentos com DXR, A. oncocalyx e onco A, observou-se maior (P < 0,05) percentagem de oócitos anormais e menor de oócitos viáveis quando comparados ao grupo controle (P < 0,05). No entanto, apenas nos tratamentos DXR e onco A aumentou a percentagem de oócitos viáveis com configuração da cromatina anormais (P < 0,05). Não houve diferenças nas taxas de maturação entre o grupo controle e os tratamentos DXR, A. oncocalyx e onco A. De acordo com nossas condições de cultivo, pode-se concluir que a A. oncocalyx e onco A não apresentaram efeitos tóxicos sobre folículos secundários isolados e as taxas de maturação dos CCOs recuperados a partir de folículos antrais. No entanto, estas substâncias afetam negativamente a viabilidade oocitária. Assim, o uso de biotecnologias como o cultivo de folículos secundários in vitro e MIV de oócitos para testes de toxicidade são métodos apropriados para avaliar possíveis efeitos das drogas na foliculogênese.

Although doxorubicin (DOX) has been widely investigated for treatment of different types of cancer, its poor cellular uptake and intracellular release still limit its further clinical applications (1). Due to their favourable characteristics, including the well-defined architecture, multivalency, and modifiable surface functionality, poly(amidoamine) (PAMAM) dendrimers have been extensively investigated for biomedical applications (2). However, most of the dendrimers are nondegradable, consequently resulting in high toxicity and uncontrollable drug release with limited release efficiency, which limits their further application in delivery of therapeutic agents (3). Low generation dendrimers are less expensive, possess a low number of defects and are more biocompatible than those of high generation. In this work degradable dendrimer nanoclusters were prepared by crosslinking of low generation PAMAM dendrimers (Generation 3, G3) using N, N’- cystamine-bis-acrylamide (CBA) as a disulphide containing cross linker. The synthesized G3-CBA was then PEGylated using methoxyl poly(ethylene glycol) carboxylic acid (m-PEG-COOH) (MW 2000 g/mol) for further improvement of the colloidal stability, which can be also helpful for prolonging the circulation period as well as reducing their toxicity, immunogenicity and antigenicity. The resulting G3-CBA-PEG dendrimers were characterised using Nuclear Magnetic Resonance (NMR), Fourier Transform Infra-Red Spectroscopy (FTIR), and Dynamic Light Scattering (DLS) to confirm the structure of G3-CBA and their PEGylated form (G3-CBAPEG). UV-Visible Spectroscopy technique was also performed to study the encapsulation of drug in the synthesized dendrimer nanoclusters. DOX, as a model drug was loaded into the resulting G3-CBA-PEG to obtain drug-loaded nanosystems (G3-CBA-PEG/DOX), which have been tested for anticancer drug delivery, concerning their drug release properties and anticancer cytotoxicity and cellular uptake through evaluation against CAL-72 cells (an osteosarcoma cell line). The results indicate that G3-CBA-PEG/DOX presented a pH and redox sensitive drug release in a sustainable way. The G3-CBA-PEG showed a reduced cytotoxicity than G3 dendrimers. G3-CBA-PEG/DOX presented a comparable anticancer cytotoxicity as compared with G3/DOX. The merits of the low generation PAMAM dendrimers, such as good cytocompatibility, sustained pH- and redox- dual cell responsive release properties, and improved anticancer activity, make them a promising platform for the delivery of other therapeutic agents beyond DOX. A doxorrubicina (DOX) tem sido amplamente investigada para o tratamento de diferentes tipos de cancro. Contudo, a sua má internalização e libertação celular limitam ainda novas aplicações clínicas (1). Dadas as suas características favoráveis, onde se incluem a arquitectura bem definida, multivalência e possibilidade de modificação da superfície (funcionalização), os dendrímeros de poli(amidoamina) (PAMAM) têm sido amplamente investigados para aplicações biomédicas (2). No entanto, a maioria dos dendrímeros não são degradáveis, resultando numa alta toxicidade e libertação descontrolada do fármaco o que limita a sua eficiência de libertação e posterior aplicação na entrega de agentes terapêuticos (3). Neste trabalho prepararam-se dendrímeros PAMAM biodegradáveis por reticulação de dendrímeros PAMAM de baixa geração (Geração 3, G3) usando cistaminabisacrilamida (CBA) como um agente de reticulação contendo dissulfureto. Estes dendrímeros são mais baratos, apresentam um baixo índice de defeitos e são mais biocompatíveis que os de alta geração. O G3-CBA sintetizado foi posteriormente modificado com polietileno glicol (PEG) utilizando o m-PEG-COOH (MW 2000) para camuflá-lo do sistema imunitário do hospedeiro ou para uma imunogenicidade reduzida e antigenicidade. A modificação com o PEG também ajuda a aumentar o tamanho hidrodinâmico da droga o que proporciona um aumento do tempo de circulação, reduzindo a depuração renal. Os dendrímeros G3-CBA-PEG resultantes foram caracterizados por Ressonância Magnética Nuclear (RMN), Espectroscopia de Infra-vermelho com Transformada de Fourier (FTIR), Dispersão Dinâmica de Luz (DLS) e por espectroscopia de UV-Visível para confirmar a polimerização do G3-CBA, a modificação com o PEG do G3-CBA-PEG, para medir o tamanho hidrodinâmico do nano-cluster e para caracterizar e medir o encapsulamento de doxorrubicina em G3-CBA-PEG. A DOX, como um fármaco modelo, foi encapsulada no G3-CBA-PEG para obter nanosistemas (G3-CBA-PEG/DOX). Estes foram posteriormente testados em células CAL-72 (linha celular de osteosarcoma) para entrega deste fármaco anticancerígeno, considerando as suas propriedades de libertação, citotoxicidade e internalização celular. O sistema G3-CBA-PEG/DOX revelou uma libertação controlada do fármaco que era dependente do pH e das condições de oxidação-redução. O G3-CBA-PEG exibiu uma citotoxicidade inferior vi à dos dendrímeros G3 e o sistema G3-CBA-PEG/DOX apresentou uma citotoxicidade anticancerígena comparável à do G3/DOX. Os atributos dos dendrímeros PAMAM de baixa geração, a boa citocompatibilidade, a capacidade de reposta celular e a libertação do fármaco controlada e dependente do pH e das condições de oxidação-redução, e atividade anticancerígena melhorada, fazem deles uma promissora plataforma para entrega de outros agentes terapeuticos além da DOX.

Dissertação de mestrado em Bioquímica, apresentada ao Departamento de Ciências da Vida da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra. Doxorubicin (DOX) is a widely prescribed and effective anti-cancer agent. The clinical use of DOX has been associated mainly with a cumulative and dosespecific cardiotoxicity that involves the development of congestive heart failure. DOX-induced delayed cardiomyopathy may occur or be aggravated through the decrease of cardiac progenitor cells pool in juvenile patients. In fact, has been reported that, DOX progressively decreases the pool of cardiac progenitor cells which combined with oxidative damage can lead to a progressive decrease in cardiomyocyte number. Oxidative stress is in fact a major event responsible for many alterations observed in normal cardiac cell function during DOX toxicity. Increased ROS generation induces alterations in ion homeostasis, alterations in iron metabolism, disruption of calcium homeostasis and mitochondrial dysfunction. DOX-induced free radical formation leads to pathological alterations in lipids, proteins, nucleic acids and biomolecules which can result in the mobilization of apoptotic machinery and consequent caspase activation. Autophagy may act as a compensatory mechanism that can control cell damage and restore energy homeostasis during DOX cardiac toxicity. If autophagy becomes uncontrolled this might lead cardiomyocyte to apoptosis, resulting in increased DOX toxicity. Because of the importance of DOX on anti-cancer therapy, new compounds that can inhibit the toxicity are needed. Berberine (BER) is a natural compound used in traditional chinese medicine that besides it cardioprotective properties, can modulate DOX-induced cardiotoxicity. The objective of this work is to understand if BER can modulate cell death and autophagy in H9c2 cells treated with DOX. To understand the effect of BER on DOX-induced cell death and autophagy, H9c2 cells were pre-treated with BER 48 hours before DOX administration (24 hours). Cell viability, caspases and cathepsins activity, mitochondria-lysosome co-localization and autophagy markers were measured in this work. Our results showed that BER inhibit DOX-induced caspases 9 and 3- like activation. In addition, BER appeared to inhibit autophagy in cells treated withDOX. Moreover, BER was unable to prevent DOX-induced mitochondrial alterations. Nevertheless, mitochondrial biogenesis markers were upregulated by BER in the presence of DOX. Although several mitochondrial alterations were not prevented by BER, apoptosis and autophagy were decreased by that alkaloid. Although more studies are needed, this combination could translate in future therapeutic strategies to allow the use of higher cumulative doses in DOX- cancer chemotherapy, proven that BER does not impair DOX anti-cancer efficacy. A Doxorubicina (DOX) é um fármaco eficaz contra lesões neoplásticas globalmente prescrito. O uso prolongado da DOX tem sido associado a cardiotoxicidade que é dependente da dose utilizada e da sua acumulação no coração. A acumulação tecidual da DOX tem sido relacionada com o desenvolvimento de falha cardíaca congénita. A Cardiomiopatia induzida pela DOX que anos depois do último tratamento poderá ocorrer ou ser agravada devido à diminuição da quantidade de células progenitoras cardíacas em pacientes de idade pediátrica. Sabe-se que a DOX leva ao decréscimo progressivo da quantidade de células cardíacas progenitores presentes no coração o que combinado com o dano oxidativo pode levar à diminuição da quantidade de cardiomiócitos. O stresse oxidativo é o maior evento responsável pelas alterações na função normal em células cardíacas saudáveis quando exposta à toxicidade da DOX. O aumento da produção de espécies reactivas de oxigénio leva a alterações no metabolismo do ferro, alterações na homeostase iónica e à disfunção mitocondrial. A formação de radicais livres e o aumento do stresse oxidativo leva a sérias alterações nos lípidos, nos ácidos nucleicos e em biomoléculas importantes que resultam em acumulação de danos celulares e à mobilização de maquinaria apoptótica que culmina na activação de caspases. A autofagia pode actuar então como um mecanismo compensatório de controlo de danos celulares e de recuperação da homeostase energética durante a cardiotoxicidade induzida pela DOX. No entanto, se o fluxo autofágico se torna descontrolado pode levar ao desencadeamento de outros processos de morte celular, podendo agravar o desenvolvimento de cardiomiopatias. Tornou-se então importante a procura de novos compostos que inibissem a toxicidade provocada pela DOX, devido à sua importância clinica no tratamento contra o cancro. A Berberina, composto natural muito utilizado na medicina tradicional chinesa, apresenta propriedades cardioprotectoras que parecem modular a cardiotoxicidade provocada pela DOX. O objectivo deste trabalho foi perceber em que se a BER consegue modular a morte celular e a autofagia em cardiomioblastos H9c2 tratados com DOX. Para perceber o seu efeito, as células H9c2 foram pré-tratadas com BER 48 horasantes da administração com DOX (24 horas). Foi avaliado o efeito da BER na viabilidade celular; na actividade de caspases e catepsinas; na co-localização entre mitocôndrias e lisossomas; e em marcadores de autofagia. Os nossos resultados mostraram que a BER conseguia inibir a activação das caspases 3 e 9 provocada pelo tratamento com DOX em células H9c2. A BER também pareceu capaz de inibir a autofagia em células tratadas com DOX. A BER, no entanto, não pareceu induzir capaz de prevenir as alterações mitocondriais provocadas pela DOX. Apesar disso, os marcadores de biogénese mitocondrial estavam aumentados em células tratadas com BER e DOX. Em suma, a BER não preveniu as alterações mitocondriais, apesar de ter prevenido a apoptose e autofagia. É interessante continuar a avaliar este efeito da BER e não é de descartar a hipótese da combinação de BER e DOX poder ter novas aplicações terapêuticas, permitindo o uso da DOX em doses cumulativas mais elevadas no tratamento contra o cancro, desde que não afecte a eficácia anti-neoplásica da DOX.

Los gliomas malignos representan una de las formas más agresivas de los tumores del sistema nervioso central (SNC). De acuerdo con la clasificación de los tumores cerebrales de la Organización Mundial de la Salud (OMS), los astrocitomas han sido categorizados en cuatro grados, determinados por la patología subyacente. Es así como los gliomas malignos (o de alto grado) incluyen el glioma anaplásico (grado III) así como el glioblastoma multiforme (GBM, grado IV),estos últimos los más agresivos con el peor pronóstico (1). El manejo terapéutico de los tumores del SNC se basa en la cirugía, la radioterapia y la quimioterapia, dependiendo de las características del tumor, el estadio clínico y la edad (2),(3), sin embargo ninguno de los tratamientos estándar es completamente seguro y compatible con una calidad de vida aceptable (3), (4). En general, la quimioterapia es la primera opción en los tumores diseminados, como el glioblastoma invasivo y el meduloblastoma de alto riesgo o con metástasis múltiple, pero el pronóstico en estos pacientes es muy pobre (2),(3). Solamente nuevas terapias dirigidas (2) como las terapias anti-angiogénicas (4); o terapias génicas muestran un beneficio real en grupos limitados de pacientes con defectos moleculares específicos conocidos (4). De este modo, se hace necesario el desarrollo de nuevas terapias farmacológicas para atacar los tumores cerebrales. Frente a las terapias los gliomas malignos son con frecuencia quimioresistentes, y esta resistencia parece depender de al menos dos mecanismos: en primer lugar, la pobre penetración de muchas drogas anticáncer a través de la barrera hematoencefálica (BBB: Blood Brain Barrier), la barrera del fluido sangre-cerebroespinal (BCSFB: Blood-cerebrospinal fluid barrier) y la barrera sangre-tumor (BTB: blood-tumor barrier). Dicha resistencia se debe a la interacción de la droga con varios transportadores o bombas de eflujo de droga ABC (ABC: ATP-binding cassette) que se sobre expresan en las células endoteliales o epiteliales de estas barreras. En segundo lugar, estos transportadores de eflujo de drogas ABC propios de las células tumorales confieren un fenotipo conocido como resistencia a multidrogas (MDR: multidrug resistance), el cual es característico de varios tumores sólidos. Este fenotipo también está presente en los tumores del SNC y su papel en gliomas es objeto de investigación (5). Por consiguiente el suministro de medicamentos a través de la BBB es uno de los problemas vitales en los tratamientos de terapia dirigida. Estudios recientes han demostrado que algunas moléculas pequeñas utilizadas en estas terapias son sustratos de la glicoproteína P (Pgp: P-gycoprotein), así como también de otras bombas de eflujo como las proteínas relacionadas con la resistencia a multidrogas (MRPs: multidrug resistance-related proteins (MRPs) o la proteína relacionada con cáncer de seno (BCRP: breast-cancer resistance related protein)) que no permiten que las drogas de este tipo alcancen el tumor (1). Un sustrato de Pgp y BCRP es la DOXOrubicina (DOXO), un fármaco utilizado en la terapia anti cáncer, el cual es muy eficaz para atacar las células del tumor cerebral in vitro, pero con un uso clínico limitado por la poca entrega a través de la barrera hematoencefálica (BBB) y por la resistencia propia de los tumores. Por otra parte las células de BBB y las células del tumor cerebral tienen también proteínas superficiales, como el receptor de la lipoproteína de baja densidad (LDLR), que podría utilizarse como blanco terapéutico en BBB y tumores cerebrales. Es asi como la importancia de este estudio se basa en la generación de estrategias terapéuticas que promuevan el paso de las drogas a través de la barrera hematoencefalica y tumoral, y a su vez, se reconozcan mecanismos celulares que induzcan el incremento en la expresión de los transportadores ABC, de manera que puedan ser utilizados como blancos terapéuticos.Este estudio demostró que el uso de una nueva estrategia basada en el “Caballo de Troya”, donde se combina la droga DOXOrubicina, la cual es introducida dentro de un liposoma, salvaguarda la droga de manera que se evita su reconocimiento por parte de los transportadores ABC tanto de la BBB como de las células del tumor. La construcción del liposoma permitió utilizar el receptor LDLR de las células asegurando la entrada a través de la BBB y hacia las células tumorales a través de un proceso de endocitosis. Este mecanismo fue asociado al uso de estatinas o drogas anticolesterol las cuales favorecieron la expresión de LDLR y disminuyeron la actividad de los transportadores ABC por nitración de los mismos, incrementando la eficiencia de nuestro Caballo de Troya. Por consiguiente demostramos que el uso de una nueva estrategia o formulación denominada ApolipoDOXO más el uso de estatinas favorece la administración de fármacos a través de la BBB, venciendo la resistencia del tumor y reduciendo los efectos colaterales dosis dependiente de la DOXOrubicina. Además esta estrategia del "Caballo de Troya", es un nuevo enfoque terapéutico que puede ser considerado como una nueva estrategia para aumentar la eficacia de diferentes fármacos en varios tumores cerebrales y garantiza una alta eficiencia incluso en un medio hipóxico,característico de las células cancerosas, donde la expresión del transportador Pgp se vió aumentada. Teniendo en cuenta la relación entre algunas vías de señalización reconocidas como moduladores de la actividad de Pgp, este estudio presenta no solo la estrategia del Caballo de Troya, sino también otra propuesta terapéutica relacionada con el uso de Temozolomide más DOXOrubicina. Esta estrategia demostró que el temozolomide logra penetrar la BBB por que interviene en la via de señalización de la Wnt/GSK3/β-catenina, la cual modula la expresión del transportador Pgp. Se demostró que el TMZ disminuye la proteína y el mRNA de Wnt3 permitiendo plantear la hipótesis de que la droga al disminuir la transcripción del gen Wnt3 en células de BBB, incrementa la activación de la vía fosforilando la β-catenina y conduciendo a disminuir la β-catenina nuclear y por tanto su unión al promotor del gen mdr1. Con base en los resultados este estudio permitió el reconocimiento de tres mecanismos básicos relacionados con la expresión de los transportadores ABC y asociados a las estrategias empleadas: el primero fue el uso de las estatinas, el cual condujo a la nitración de los transportadores disminuyendo su actividad por la via del factor de transcripción NFκB; el segundo a partir del uso del temozolomide, el cual metila el gen de Wnt3 reduciendo la actividad de la via de señalización de la la β-catenina, disminuyendo la expresión del transportador Pgp. El tercero consistió en la determinación de la relación entre el eje RhoA/RhoA quinasa como un modulador de la via (no canónica) GSK3/β-catenina. Se demostró que la proteína quinasa RhoA promovió la activación de la proteína PTB1, la cual al fosforilar a GSK3 indujo la fosforilación de la β-catenina, lo cual dio lugar a su destrucción por el proteosoma, evitando su unión al promotor del gen mdr1 y por tanto reduciendo su expresión. En conclusión las estrategias propuestas en este trabajo incrementaron la citotoxicidad de las células tumorales al aumentar la permeabilidad no solo de la barrera hematoencefálica, sino también de la propia barrera tumoral. Igualmente, la estrategia del “Caballo de Troya” podría ser útil para la terapia de otras enfermedades asociadas al sistema nervioso central. Por otra parte estos estudios indican que el reconocimiento de mecanismos asociados a la expresión de los transportadores ABC podría constituir una herramienta clave en el desarrollo de nuevas terapias anticáncer. Malignant gliomas represent one of the most aggressive forms of Central Nervous System (CNS) tumors. According to the WHO classification of brain tumors, astrocytomas have been categorized into four grades, determined by the underlying pathology. Malignant (or highgrade) gliomas include anaplastic glioma (WHO grade III) as well as glioblastoma multiforme (GBM; WHO grade IV). These are the most aggressive brain tumors with the worst prognosis (1). The therapeutic management of CNS tumors is based on surgery, radiotherapy and chemotherapy, depending on the characteristics of the tumor, the clinical stage and age (2), (3), however none of the standard treatments is completely safe and compatible with an acceptable quality of life (3), (4). Chemotherapy is the first choice in disseminated tumors, like invasive glioblastoma, high-risk medulloblastoma or multiple metastasis, but the prognosis in these patients is very poor (2),(3). New targeted therapies (2), anti-angiogenic therapies (3), (4) or gene therapies show a real benefit only in limited groups of patients with known specific molecular defects (4). Thereby, the development of new pharmacological therapies for brain tumors is mandatory. Malignant gliomas are frequently chemoresistant and this resistance seems to depend on at least two mechanisms: first, the poor penetration of many anticancer drugs across the blood-brain barrier (BBB), the blood-cerebrospinal fluid barrier (BCSFB) and the blood-tumor barrier (BTB), due to their interaction with several ATP-binding cassette (ABC) drug efflux transporters that are overexpressed by the endothelial or epithelial cells of these barriers. Second, ABC drug efflux transporters in tumor cells confer multidrug resistance (MDR) on several other solid tumors; they are present on CNS tumors too and their role in gliomas is under investigation (5). Drug delivery across the blood-brain barrier (BBB) is one of the vital problems in targeted therapy treatments. Recent studies have shown that some small molecules used in these therapies are substrates of Pglycoprotein (Pgp), as well as other efflux pumps like multidrug resistance-related proteins (MRPs) and breast-cancer resistance related protein (BCRP), which extrude several anticancer drugs and will not allow drugs to reach the tumor (1). DOXOrubicin (DOXO), a drug widely used in anti-cancer therapy, is a substrate of Pgp and BCRP, and it is very effective to attack the vitro brain tumor cells, but has a limited clinical use for its low delivery across BBB and the resistance of tumors. On the other hand BBB cells and brain tumor cells also have surface proteins, such as Low Density Lipoprotein Receptor (LDLR), which could be used as a therapeutic target. The importance of this study is based on the generation of therapeutical strategies to promote the passage of drugs through the BBB and the intratumoral accumulation, and at the same time, on the analysis of cellular mechanisms that induce increased expression of ABC transporters, to be used as therapeutic targets. In this work we demonstrated that the use of a new strategy based on the "Trojan horse", which combines DOXOrubicin introduced into a liposome, could safeguards the drug to prevent its recognition by the ABC transporters in both the BBB and the tumor cells. The construction of liposome allowed using the LDLR receptor cells as docking receptor, ensuring the entrance through the BBB and into the tumor cells through a process of endocytosis. This mechanism was associated with the use of statins, anti-cholesterol drugs which favoured the expression of LDLR and decreased the activity of ABC transporters, increasing the efficiency of our Trojan horse. Accordingly, I demonstrated that the use of a new DOXOrubicin liposomal formulation mimicking LDLs, called ApolipoDOXO, further favors drug delivery through the BBB, overcoming the resistance of tumor and reducing the side effects of DOXOrubicin dose. In addition this strategy can be considered as a new strategy to increase the effectiveness of different drugs in several brain tumors and ensures high efficiency even in a hypoxic environment, characteristic of cancer cells, where the expression of Pgp transporter was increased. Taking advantage of another signaling pathway recognized as a modulator of Pgp activity this study presents not only the strategy of the Trojan horse, but also a second therapeutic proposal related to the use of Temozolomide plus DOXOrubicin. This strategy showed that temozolomide (TMZ) penetrated the BBB in a way involved the Wnt/GSK3/β-catenin signaling pathway, which modulates the expression of Pgp transporter. It was demonstrated that the TMZ reduces Wnt3 protein and mRNA allowing raising the hypothesis that this drug decreases Wnt3 gene transcription in BBB cells, decreasing β-catenin pathway activation by its phosphorylation, reducing β-catenin nuclear translocation and binding to the promoter of the mdr1 gene. Taking together the results of this study allowed the recognition of three basic mechanisms related to the down-regulation of Pgp and associated strategies: the first was the use of statins, which led to the transporter nitration decreasing its activity by NFκB pathway; the second one was based on the use of temozolomide, which by methylating Wnt3 gene reduces the activity of the β-catenin signaling pathway, decreasing the expression of Pgp transporter; the third one consisted on the cross-talk between the Wnt/GSK3/β-catenin axis and the Wnt/RhoA/RhoA kinase as a modulator of mdr1 transcription: we demonstrated that RhoA protein kinase promoted the activation of the protein PTB1, which by phosphorylating GSK3 induced phosphorylation of β-catenin, priming it for destruction by the proteasome, avoiding the binding to the promoter of the mdr1 gene and therefore reducing Pgp expression. In conclusion, the therapeutic startegies proposed in this work increased the cytotoxicity of tumour cells by increasing permeability not only in the BBB, but also in tumor barrier. Also, the "Trojan horse" strategy could be useful for the therapy of other diseases associated with the central nervous system. On the other hand, these studies indicate that recognition of mechanisms associated with the expression of ABC transporters could be a key tool in the development of new anti-cancer therapies.

Revisada la evidencia observamos que la eficacia es similar para Topotecan, Doxorubicina liposomal y Gemcitabina en cáncer de ovario platino-resistente. Respecto a la seguridad se evidencia que Doxorubicina liposomal tiene un perfil de seguridad similar en relación a Gemcitabina. Sin embargo, por cada paciente tratado con Doxorubicina liposomal se dejaría de tratar a 05 pacientes con Gemcitabina. Por lo expuesto, el Equipo Técnico recomienda no incluir al medicamento Doxorubicina liposomal en cáncer de ovario platino-resistente en la Lista Complementaria de Medicamentos para tratamiento de enfermedades neoplásicas al PNUME vigente. Revisada la evidencia observamos que la eficacia es similar para Doxorubicina liposomal y Paclitaxel en sarcoma de Kaposi. Respecto a la seguridad se evidencia que Doxorubicina liposomal tiene un perfil de seguridad similar en relación a Paclitaxel. Sin embargo, por cada paciente tratado con Doxorubicina liposomal se dejaría de tratar a 06 pacientes con Paclitaxel. Por lo expuesto, el Equipo Técnico recomienda no incluir al medicamento Doxorubicina liposomal en sarcoma de Kaposi en la Lista Complementaria de Medicamentos para tratamiento de enfermedades neoplásicas al PNUME vigente.

Dissertação de mestrado em Biologia Celular e Molecular ,apresentada ao Departamento Ciências da Vida da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra Os glioblastomas são os tumores cerebrais mais comuns, recorrentes e com uma alta taxa de mortalidade, principalmente devida à ineficácia das terapias usadas que incluem a combinação de cirurgia, radioterapia e quimioterapia. Os resultados insatisfatórios obtidos com o uso da quimioterapia atual, como a carmustina e a temozolomida, são fortemente atribuídos à resistência adquirida pelo tumor mediada principalmente pela glicoproteína-P e pela enzima metil-guanina metil-transferase (MGMT). A doxorubicina (DOX) mostrou ser eficaz contra alguns tumores periféricos e gliomas malignos em estudos in vitro. No entanto, não é possível o seu uso para o tratamento de glioblastomas visto que este fármaco não atravessa a barreira hematoencefálica (BHE) devido à sua baixa lipofilicidade e elevado peso molecular. Também o metotrexato (MTX) é usado desde há muito tempo como um potente fármaco anticancerígeno mas também apresenta dificuldade em atravessar a BHE, sendo necessário uma administração sistémica em doses elevadas e potencialmente tóxicas a nível periférico, para se atingir uma dose efetiva no cérebro. Uma vez que as vias de administração dos fármacos quimioterapêuticos são tecnicamente difíceis e dolorosos para os pacientes, são necessários métodos mais práticos e seguros. Desta forma, e tendo em conta a capacidade que a metanfetamina (MET) possui para aumentar transitoriamente a permeabilidade da BHE, o objetivo deste trabalho foi avaliar se a MET interferia com os efeitos da DOX ou MTX, analisando especificamente a viabilidade celular, migração, quimiotaxia e ciclo celular. Os resultados deste trabalho demonstraram que a MET na concentração de 1 μM não interfere na viabilidade, migração ou ciclo celular das células de glioblastoma humano, a linha celular U-118. Da mesma forma, esta droga não alterou os efeitos na viabilidade celular, migração, quimiotaxia e no ciclo celular induzidos por DOX ou MTX. Contudo, a MET por si só conseguiu diminuir a quimiotaxia das células de glioblastoma, sendo este efeito semelhante ao que foi induzido pela DOX ou MTX quando administrados individualmente. No que diz respeito ao efeito da DOX, este fármaco levou a uma diminuição da viabilidade celular, migração e quimiotaxia assim como a uma paragem no ciclo celular na fase G2 e a uma diminuição na expressão da ciclina A. Também o MTX diminuiu a viabilidade, migração e quimiotaxia das células deglioblastoma, do mesmo modo que afetou o seu ciclo celular levando a uma paragem das células na fase S. Em suma, podemos concluir que a DOX e o MTX têm um efeito tóxico nas células de glioblastoma e que a METH, a uma concentração que aumenta a permeabilidade das células endoteliais, não interfere com o efeito da DOX ou MTX. Deste modo, consideramos que esta abordagem merece ser alvo de um estudo mais aprofundado de forma a melhor esclarecer o uso da MET como uma abordagem terapêutica em situações de tumores cerebrais. Glioblastomas are the most common primary tumors of the brain with a high recurrence and mortality rate justified by the ineffectiveness of current therapeutics that include combinations of surgery, radiotherapy and chemotherapy. The unsatisfactory results with current chemotherapeutic agents, such as carmustine and temozolomide, have been strongly attributed to tumor cell resistance mainly mediated by P-glycoprotein and the enzyme methylated DNA-protein cysteine methyltransferase (MGMT). Doxorubicin (DOX) showed to be effective against some peripheral tumors and malignant glioma tumors in vitro. However, it is not possible to use DOX for the treatment of glioblastomas since it cannot cross the blood-brain barrier (BBB) due to its low lipophilicity and high molecular weight. Also, methotrexate (MTX) has been used for long time as a potent anticancer agent but also shows limitations to cross the BBB. Consequently, to achieve an effective dose of MTX in the brain, high and potential toxic doses of MTX should be administered systemically. Since the conventional administration routes for chemotherapy drugs delivery are difficult and painful for the patients, more practical and safe delivery methods are needed. In this way, due to the ability of methamphetamine (METH) for transiently increase BBB permeability, the aim of the present work was to evaluate whether METH could interfere with DOX and MTX effects, focusing particularly on the cellular viability, migration, chemotaxis and cell cycle of glioblastoma cells. Our results demonstrated that 1 μM METH did not interfere in U-118 glioblastoma cell viability, migration and cell cycle. In the same way, METH did not alter the effects induced by DOX or MTX on cell viability, migration, chemotaxis and cell cycle. However, METH by itself impaired the glioblastoma cells chemotaxis, having similar effects to those observed with DOX or MTX alone. Regarding DOX effects in glioblastoma cells, this drug was able to decrease cell viability, migration and chemotaxis and led to a cell cycle arrest at G2 phase and to a decrease on cyclin A expression. Similarly, MTX induced a decrease in glioblastoma cell viability, migration and chemotaxis and a cell cycle arrest in the S phase. Overall, we can conclude that both DOX and MTX have a toxic effect in glioblastoma cells and that METH, in a concentration that increases endothelial cellspermeability, does not interfere with DOX or MTX effect. Thus, we consider that this approach should be explored in order to clarify the use of METH as a therapeutic approach involving brain tumors.

"La S-adenosilmetionina (indicata con l'acronimo AdoMet o SAM) è uno dei composti più versatili in natura; essa infatti esplica. una serie di azioni biochimiche tra le quali le più note sono quelle relative alla biosintesi delle poliammine e alle reazioni di. transmetilazione (1). In conseguenza dei molteplici e complessi ruoli dell'AdoMet, sono stai attribuiti alla molecola una serie di. effetti farmacologici fra i quali l'azione antiinfiammatoria, antidepressiva e analgesica (1).. . Nell' ultimo decennio è stato dimostrato che la AdoMet possiede proprietà antiproliferative. Infatti il composto di solfonio. inibisce la risposta proliferativa in cellule di carcinoma del colon (2,3) e del fegato (1), ed è pro-apoptotica in cellule di. epatocarcinoma agendo sull'espressione di Bcl-xs (4). . . Partendo dai dati presenti in letteratura, lo scopo del nostro lavoro è quello di studiare l'effetto antiproliferativo della AdoMet su. alcune linee di carcinoma della mammella e la sua interazione farmacologica con farmaci antitumorali quali Sorafenib,. Doxorubicina e Panobinostat (LBH). . . Il sistema sperimentale utilizzato è rappresentato dalle linee cellulari MDA-MB436, MDA-MB468, MDA-MB231, CG5 e MCF-. 7. I test di vitalità cellulare sono stati condotti mediante saggi MTT dopo trattamento con i singoli farmaci o le combinazioni. farmacologiche. I dati ottenuti sono stati poi elaborati con un programma dedicato, il CalcuSyn (Chou e Talalay, Biosoft,. Oregon, USA) che partendo dai risultati sperimentali di inibizione proliferativa, ha consentito di valutare i diversi gradi di effetto. sinergico. La valutazione dell'apoptosi e dello stress ossidativo è stata effettuata mediante analisi citofluorimetrica dopo doppia. marcatura delle cellule con Annessina-V e ioduro di propidio e dopo trattamento con idroetidina, rispettivamente. La valutazione. dell'autofagia è stata effettuata con marcatura con monodandilcadaverina e valutazione citofluorimetrica della fluorescenza. associata.. . I risultati ottenuti hanno dimostrato il maggiore effetto sinergico in seguito a trattamento combinato con SAM-Doxorubicina. sulle linee cellulari CG5 e MCF-7. Tali effetti avvenivano in parallelo ad un potenziamento dell'apoptosi, stress ossidativo e. autofagia. I risultati ottenuti evidenziano l'importanza dell'effetto sinergico della SAM con la Doxorubicina nella regolazione. della proliferazione cellulare del carcinoma mammario.. "

The adherence of molecules to surfaces is used in a wide scope of technological applications. In this work we study the attachment of molecules onto porous silica glass surface obtained from a Vycor glass, after glassglass phase separation and leaching of the soluble phase with water. Nitrogen adsorption at 77 K was used for the determination of the specific surface area (BET area) and pore size distribution on the leached glass. The adherence onto the glass surface, of model molecules methylene blue (MB) and eosine yellow (EY), with positive and negative electrical charges respectively, was studied. The adsorption kinetics was determined from aqueous solutions using UV-VIS spectroscopy. It was found that the silica glass surface as prepared in of glass was found for methylene blue, and almost null adsorption for eosine yellow. First principles calculations were performed using the Density Functional Theory in order to model the interaction between both molecules and the glass surface. Fil: Rivera Figueroa, Edison. Comisión Nacional de Energía Atómica. Gerencia del Area de Energía Nuclear. Instituto Balseiro; Argentina. Universidad Nacional de Cuyo; Argentina Fil: Prado, Miguel Oscar. Comisión Nacional de Energía Atómica. Gerencia del Area de Energía Nuclear. Instituto Balseiro; Argentina. Comision Nacional de Energia Atomica. Centro Atomico Bariloche; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina Fil: Nuñez, Matias. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Comision Nacional de Energia Atomica. Centro Atomico Bariloche; Argentina. Universidad Nacional de Cuyo; Argentina

Dissertação para a obtenção do Grau de Mestre em Engenharia Química e Bioquímica O objectivo do presente trabalho é produzir nanopartículas de PLGA com Doxorubicina pelo método de extracção/evaporação por solvente e estudar o efeito dos parâmetros de síntese sobre as características das nanopartículas utilizando o desenho de experiências do composto central e o programa Statistica para a análise de resultados. Foram escolhidas como variáveis dependentes o tamanho da partícula, o potencial zeta (Z), o carregamento de fármaco e o rendimento de produção e como variáveis independentes a concentração de emulsificante (PVA), o volume de emulsificante e o tempo de sonicação. As nanopartículas produzidas nas condições experimentais dadas pelo desenho de experiências, caracterizadas relativamente ao tamanho por DLS, morfologia por SEM, carregamento de fármaco e rendimento, apresentam uma forma esférica e uma superfície lisa. Foram construídas as curvas de superfície para cada variável dependente utilizando o programa Statistica tendo os resultados mostrado que as variáveis independentes com maior efeito nas variáveis dependentes são o volume e a concentração de PVA. Com o objectivo de produzir partículas com valores elevados de Z e de carregamento de fármaco com tamanhos entre 120-140nm (A) ou 100-120nm (B), foram seleccionados com base nos gráficos de superfície os valores das variáveis independentes 15 ml; 3%(P/V);60s e 4ml;3%(P/V);60s, respectivamente. Nestas condições, as nanopartículas A produzidas apresentaram um tamanho de 125 nm, um Z=-11.3mV, um carregamento de fármaco entre 10.23%-12.58% (mg/mg) e um rendimento entre 53.8%-59.0%, sendo o Z e o rendimento ligeiramente superiores aos valores esperados. As nanopartículas B apresentaram um tamanho de 100 nm, um Z=-9.5mV, um carregamento de fármaco entre 19.44%-21.52% (mg/mg) e um rendimento próximo de 26.2%, sendo o rendimento ligeiramente inferior ao valor esperado. Os perfis de libertação de Doxorubicina apresentam uma cinética de 1ª ordem, característica de um processo de difusão, seguida de uma cinética de ordem zero, característica de um processo de degradação.

Tese de mestrado em Bioquímica, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2011 Submitted by Teresa Boa (tdboa@fc.ul.pt) on 2013-05-16T09:37:45Z No. of bitstreams: 1 ulfc103887_tm_Daniela_Grácio.pdf: 1724855 bytes, checksum: 0c5f5d17e480c8286966024ef3b57111 (MD5) Made available in DSpace on 2013-05-16T09:37:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ulfc103887_tm_Daniela_Grácio.pdf: 1724855 bytes, checksum: 0c5f5d17e480c8286966024ef3b57111 (MD5) Previous issue date: 2011

Clusterina è una proteina da stress ampiamente espressa nei tessuti e nei fluidi umani. Tuttavia vi sono poche informazioni riguardo alla sua funzione nei linfomi. In questo lavoro dimostriamo che la sua espressione in linee cellulari di linfoma di Hodgkin aumenta in risposta a diversi stimoli tra cui doxorubicina, interferon-gamma ed alte dosi di raggi X. La sua forma circolante è dosabile nel siero di pazienti affetti da linfoma di Hodgkin e sembra essere correlata con la persistenza del tessuto neoplastico ipercaptante dopo due cicli di chemioterapia. Clusterin is a molecular chaperon widely studied in cancers of epithelial origin. On the contrary, the information available on its functions in lymphomas are still quite poor. Here we demonstrate clusterin up-regulation in Hodgkin lymphoma derived cell lines as caused by doxorubicin, interferon-gamma and high doses of X-rays. We also present preliminary data on the quantitation of secretory clusterin in sera from Hodgkin lymphoma patients. The preliminary data show a correlation between the persistence of hypercaptating neoplastic mass and the increase in circulating clusterin.

Canine hemangiosarcoma has an aggressive biological behavior, with less than 10% of dogs being alive at 12 months. Treatment of choice consists of surgery followed by adjuvant doxorubicin-based chemotherapy. We prospectively compared adjuvant doxorubicin and dacarbazine (ADTIC) to the traditional doxorubicin and cyclophosphamide (AC) treatment, aiming at determining safety and assessing whether this regimen prolongs survival and time to metastasis (TTM). Sixteen dogs were enrolled; following staging work-up 9 were treated with AC and 7 with ADTIC. Dogs treated with ADTIC tended to have a longer TTM (p=0.094) compared to the dogs treated with AC (365 versus 90 days) and to survive longer (p=0.066; 480 versus 90 days). Both protocols were well tolerated, with no need for dose reduction or increased interval between treatments. ADTIC was well tolerated and seemed to prolong TTM and survival time in dogs with biologically aggressive hemangiosarcoma, especially if not metastatic at presentation.

Fil: Lettieri, Carolina N. Universidad Nacional del Nordeste. Facultad de Medicina; Argentina. Fil: Stoyanoff, Tania Romina. Universidad Nacional del Nordeste. Facultad de Medicina; Argentina. Fil: Aguirre, María Victoria. Universidad Nacional del Nordeste. Facultad de Medicina; Argentina. Fil: Cerdera, Verónica. Universidad Nacional del Nordeste. Facultad de Medicina; Argentina. Fil: Brandan, Nora Cristina. Universidad Nacional del Nordeste. Facultad de Medicina; Argentina. Doxorubicína (Adriamicina) es un antibiótico antraciclino citotóxico utilizado en la regresión de enfermedades neoplásicas diseminadas. Se une a los ácidos nucleicos, presumiblemente por una intercalación específica del núcleo antraciclino planar con el ADN de doble hélice y se caracteriza por inhibir el repliegue y la acción de las ADN polimerasas. Esta droga altera también la funcionalidad de las membranas celulares así como de las proteínas plasmáti­cas. Posee efecto citotóxico sobre células malignas, así como efectos tóxicos colaterales sobre diferentes órganos entre los que se destaca mielosupresión, cardio y nefrotoxicidad1,2. Se han desarrollado varios estudios de injuria renal inducida por Doxorubicína en modelos experimentales con el fin de elucidar su fisiopatología1,2. En general, muestran un periodo de estabilidad y luego desarrollan proteinuria, hipertensión arterial, elevación de la creatininemia. La biopsia renal evidencia glomérulos esclerosados y acumu­lación de material amorfo3,4. Estas alteraciones llevan a una disminución progresiva de la función renal5,6. La evolución hacia la fibrosis renal y la atrofia tubular son componentes inevitables de la patogénesis tubulointersticial que acom­paña a la toxicidad renal por Doxorubicína, como en la mayoría de las enfermedades renales progresivas.

Las nanopartículas de polibutil-cianoacrilato se sintetizaron mediante polimerización por dispersión y se caracterizaron mediante espectroscopía 1H-NMR, calorimetría diferencial de barrido y microscopía electrónica de transmisión. Se estudiaron propiedades de las partículas tales como el tamaño y el potencial zeta, y la influencia de la concentración y el tipo de estabilizador en el tamaño de las partículas. También se estudió la influencia de factores de polimerización tales como la concentración de monómero, la temperatura y el tiempo de polimerización en el tamaño y la distribución de las partículas, y su efecto en la eficacia de captura de las nanopartículas, utilizando clorhidrato de doxorubicina (DH) como fármaco modelo. Las concentraciones elevadas de monómero dieron lugar a la formación de partículas de mayor tamaño con distribución de tamaño bimodal y amplia y aumentaron la captura del fármaco. La polimerización a baja temperatura dio lugar a la formación de partículas más pequeñas, mientras que a temperatura elevada (60 °C) se produjo aglomeración y se redujo la captura del fármaco. Los tiempos de polimerización elevados no mostraron tener mucha influencia en el tamaño de las partículas, pero aumentaron la captura del fármaco. Se realizó la carga del fármaco en las nanopartículas mediante técnicas de incorporación y adsorción y se determinó la captura del fármaco. Las nanopartículas cargadas mediante técnicas de incorporación y adsorción mostraron una liberación rápida de fármaco en 0,001 N HCl. La liberación de fármaco en ambos tipos de nanopartículas siguió la ecuación de Higuchi. También se intentó establecer una correlación crítica entre las propiedades de las partículas y el comportamiento de la liberación de fármaco, así como subrayar su importancia en diversas facetas de la administración de fármaco., Poly(butyl cyanoacrylate) nanoparticles were synthesized by dispersion polymerization and characterized by 1H-NMR spectroscopy, differential scanning calorimetry and transmission electron microscopy. Particle properties such as zeta potential and size, and the influence of concentration and type of stabilizer on particle size were studied. The influence of polymerization factors such as monomer concentration, polymerization time and temperature on the particle size and distribution, and their effect on entrapment efficiency of the nanoparticles was studied, using doxorubicin hydrochloride (DH) as a model drug. High monomer concentrations lead to the formation of larger particles with broad and bimodal size distribution, and increased the drug entrapment. Polymerization at low temperatures resulted in smaller particles, and agglomeration was found at high temperature (60°C), with reduced drug entrapment. High polymerization times did not show much influence on particle size, but increased the drug entrapment. Drug loading into nanoparticles was carried out by incorporation and adsorption techniques, and drug entrapment was determined. The nanoparticles loaded by incorporation and adsorption techniques showed rapid drug release in 0.001N HCl. Drug release from both types of nanoparticles followed Higuchi equation. An attempt was also made to critically correlate the particle properties and drug release behavior and emphasize its importance in various facets of drug delivery., Este trabajo ha sido financiado por la University Grants Commission (UGC) de la India.

BACKGROUND: Combination chemotherapy yields better response rates which do not always lead to a survival advantage. The aim of this study was to investigate whether the reported differences in the efficacy and toxicity of monotherapy with doxorubicin (DOX) versus combination therapy with cisplatin (CDDP) in endometrial adenocarcinoma lead to significant advantage in favour of the combination. PATIENTS AND METHODS: Eligible patients had histologically-proven advanced and/or recurrent endometrial adenocarcinoma and were chemo-naïve. Treatment consisted of either DOX 60 mg/m(2) alone or CDDP 50 mg/m2 added to DOX 60 mg/m2, every 4 weeks. RESULTS: A total of 177 patients were entered and median follow-up is 7.1 years. The combination DOX-CDDP was more toxic than DOX alone. Haematological toxicity consisted mainly of white blood cell toxicity grade 3 and 4 (55% versus 30%). Non-haematological toxicity consisted mainly of grade 3 and 4 alopecia (72% versus 65%) and nausea/vomiting (36 % versus 12%). The combination DOX-CDDP provided a significantly higher response rate than single agent DOX (P