Search

Baeyer-Villiger monooxygenases catalyze oxidations that are of interest for biocatalytic applications. Among these enzymes, phenylacetone monooxygenase (PAMO) from Thermobifida fusca is the only protein showing remarkable stability. While related enzymes often present a broad substrate scope, PAMO accepts only a limited number of substrates. Due to the absence of a substrate in the elucidated crystal structure of PAMO, the substrate binding site of this protein has not yet been defined. In this study, a structural model of cyclopentanone monooxygenase, which acts on a broad range of compounds, has been prepared and compared with the structure of PAMO. This revealed 15 amino acid positions in the active site of PAMO that may account for its relatively narrow substrate specificity. We designed and analyzed 30 single and multiple mutants in order to verify the role of these positions. Extensive substrate screening revealed several mutants that displayed increased activity and altered regio- or enantioselectivity in Baeyer-Villiger reactions and sulfoxidations. Further substrate profiling resulted in the identification of mutants with improved catalytic properties toward synthetically attractive compounds. Moreover, the thermostability of the mutants was not compromised in comparison to that of the wild-type enzyme. Our data demonstrate that the positions identified within the active site of PAMO, namely, V54, I67, Q152, and A435, contribute to the substrate specificity of this enzyme. These findings will aid in more dedicated and effective redesign of PAMO and related monooxygenases toward an expanded substrate scope.

Herontwerpen van Baeyer–Villiger monooxygenases voor synthetische applicaties (korte samenvatting) In het veld van biokatalyse worden enzymen toegepast om chemische reacties te katalyseren, die kunnen leiden tot efficiëntere en milieuvriendelijkere processen. Tegenwoordig is het mogelijk om eigenschappen van enzymen aan te passen met behulp van “protein engineering” methodes. Het onderzoek dat beschreven wordt in dit proefschrift, focust zich voornamelijk op het modificeren van fenylaceton monooxygenase (PAMO), een enzym dat behoort tot de Baeyer–Villiger monooxygenase familie, tot een efficiëntere biokatalyst. Allereerst, is er geprobeerd om de coenzym en substraatspecificiteit aan te passen door plaats-gerichte mutagenese. Dit resulteerde in gematigde verbeteringen van de enzymeigenschappen, maar niettemin verbeterde het onze kennis over dit type enzymen. Door het beperkte succes van onze experimenten, hebben we de focus verlegd naar alternatieve methodes en hebben we gekozen voor het ontwikkelen van een activiteitsassay om mutant collecties te kunnen screenen. Deze nieuwe activiteitsassay is gebaseerd op het gebruik van een tweede enzym dat gekoppeld is aan de activiteit van PAMO en kon worden toegepast op het screenen van een grote hoeveelheid enzym varianten. Met behulp van gedetailleerde kennis over het actieve centrum van het enzym, het katalytisch mechanisme dat voortkomt uit structurele studies, modeleren, kinetische analyses en karakterisatie van varianten is het mogelijk geworden om banken te ontwerpen van hoge kwaliteit, terwijl efficiënte screeningsmethodes het mogelijk maken om verbeterde varianten te herkennen. Deze aanpak is succesvol gebleken voor PAMO en kan worden toegepast in het herontwerpen of aanpassen van andere (Baeyer–Villiger) monooxygenases, mede doordat de ontwikkelde screeningsmethode generiek is voor NADPH-verbruikende enzymen.

Baeyer-Villiger monooxygenases catalyze the oxidation of carbonylic substrates to ester or lactone products using NADPH as electron donor and molecular oxygen as oxidative reactant. Using protein engineering, kinetics, microspectrophotometry, crystallography, and intermediate analogs, we have captured several snapshots along the catalytic cycle which highlight key features in enzyme catalysis. After acting as electron donor, the enzyme-bound NADP(H) forms an H-bond with the flavin cofactor. This interaction is critical for stabilizing the oxygen-activating flavin-peroxide intermediate that results from the reaction of the reduced cofactor with oxygen. An essential active-site arginine acts as anchoring element for proper binding of the ketone substrate. Its positively charged guanidinium group can enhance the propensity of the substrate to undergo a nucleophilic attack by the flavin-peroxide intermediate. Furthermore, the arginine side chain, together with the NADP(+) ribose group, forms the niche that hosts the negatively charged Criegee intermediate that is generated upon reaction of the substrate with the flavin-peroxide. The fascinating ability of Baeyer-Villiger monooxygenases to catalyze a complex multistep catalytic reaction originates from concerted action of this Arg-NADP(H) pair and the flavin subsequently to promote flavin reduction, oxygen activation, tetrahedral intermediate formation, and product synthesis and release. The emerging picture is that these enzymes are mainly oxygen-activating and "Criegee-stabilizing" catalysts that act on any chemically suitable substrate that can diffuse into the active site, emphasizing their potential value as toolboxes for biocatalytic applications.