Search

International audience; MAP6 proteins were first described as microtubule-stabilizing agents, whose properties were thought to be essential for neuronal development and maintenance of complex neuronal networks. However, deletion of all MAP6 isoforms in MAP6 KO mice does not lead to dramatic morphological aberrations of the brain but rather to alterations in multiple neurotransmissions and severe behavioural impairments. A search for protein partners of MAP6 proteins identified Tctex1 - a dynein light chain with multiple non-microtubule-related functions. The involvement of Tctex1 in calcium signalling led to investigate it in MAP6 KO neurons. In this study, we show that functional Cav 2.2/N-type calcium channels are deficient in MAP6 KO neurons, due to improper location. We also show that MAP6 proteins interact directly with both Tctex1 and the C-terminus of Cav 2.2/N-type calcium channels. A balance of these two interactions seems to be crucial for MAP6 to modulate calcium signalling in neurons.

Neurons contain an abundant subset of highly stable microtubules that resistdepolymerizing conditions such as exposure to the cold. The early and adult neuronalmicrotubule-associated proteins STOP (Stable Tubule Only Polypeptide), which areregulated by Ca2+/calmodulin and Ca2+/calmodulin-dependent kinase II (CaMKII), are themain effectors responsible for neuronal microtubule stability. STOP phosphorylation byCaMKII, a key enzyme in synaptic plasticity, abolishes its ability to bind microtubules. STOPnull mice exhibit synaptic abnormalities in the glutamatergic synapses of hippocampus,with depleted synaptic vesicle pools and defects in both short-term and long-term synapticplasticity. These synaptic defects are associated with severe behavioral disorders.At first, to continue studies concerning the synaptic presence of STOP protein and itsregulation by phosphorylation, we studied the cellular localization of phosphorylated STOPin primary cultures of hippocampal neurons : phosphorylated STOP staining is concentratedin spike-like structures in dendrites and in submembrane domains at branching points, andco-localizes with cortical actin at these sites. We also found that STOP and phosphorylatedSTOP co-sedimented with F-actin in vitro. Phosphorylated STOP is distributed in clustersand partially overlapp with pre- and post-synaptic markers. Phosphorylation of STOP byCaMKII is a candidate mechanism for its translocation from microtubules to synapticstructures such as cortical actin.In the second part of this work, to understand the synaptic function of STOP, welooked for neuronal partners in vivo by a yeast two-hybrid system. Three partners proteinswere shown to interact with N-STOP : the protein Tctex1 (T-complex testis expressed 1), alight chain of the molecular motor dynein implicated in loading cargos for retrogradetransport along microtubules and also implicated in neurite outgrowth and trafficking ofneuronal voltage-gated calcium channels (VGCCs) at presynaptic compartments ; theprotein Arc (Activity-regulated cytoskeletal-associated protein), implicated in post-synapticplasticity mechanisms ; the protein Nsg2 (Neuron-specific gene 2) with a specificlocalization at the Golgi apparatus in neurons and of unknow function.Then, we focused on Tctex1 and confirmed the interaction with STOP by colocalization in mammalian cells, by co-immunoprecipitation using overexpressed proteins incellular extracts, and by bioluminescence resonance energy transfer (BRET) technique. Wealso characterised the interaction site of Tctex1 on STOP using deletion mutants. Tctex1interacts with STOP on its carboxy-terminal domain, more precisely on a microtubulebinding module.If Tctex1 have an unique role in determining sorting and trafficking of VGCCs associatedwith release of neurotransmitter and synaptic transmission, we have shown that thesuppression of its partner STOP leads to a two-fold reduction in the neuronal Ca2+ currentdensity, with a decrease of channels immunostaining in neuritic processes. The suppressionof STOP is also related to abnormal neuronal retrograd transport, which permits toassociate STOP with the driving function of the cytoplasmic dynein.By interacting with a pannel of different partners with different features, STOP proteinsprobably functions as an integrator in the structural and functional synaptic organization., Les neurones contiennent une abondante population de microtubules stables résistantà la dépolymérisation induite par le froid. Cette stabilité est induite par l’association desmicrotubules avec deux effecteurs majeurs régulés par le complexe Ca2+/calmoduline et laCaM Kinase II : les isoformes E- et N-STOP (Early et adult Neuronal Stable Tubule OnlyPolypeptide). La phosphorylation de la protéine STOP par la CaMKII, enzyme clé de laplasticité synaptique, inhibe notamment sa capacité à lier les microtubules. L’invalidationdu gène stop chez la souris entraîne une dérégulation des synapses glutamatergiques del’hippocampe, avec diminution massive de la densité des vésicules pré-synaptiques et unealtération des mécanismes de plasticité synaptique à court et à long terme. Ces défautssynaptiques sont associés à des troubles sévères du comportement chez les souris STOP-/-.Dans un premier temps, afin de poursuivre les travaux concernant la présence de laprotéine STOP à la synapse et sa régulation par phosphorylation, nous avons étudié lalocalisation cellulaire de la STOP phosphorylée dans des cultures primaires de neuronesd’hippocampe : elle se trouve enrichie spécifiquement au niveau des spicules dendritiqueset des points de branchements axonaux et co-localise avec le réseau d’actine cortical sousmembranaire. Nous avons également montré que la STOP co-sédimente avec l’actine Fpolymérisée in vitro, quelle que soit sa régulation par la CaMKII. STOP phosphorylée colocalise partiellement avec des marqueurs pré- et post-synaptiques. La phosphorylation deSTOP par la CaMKII permet donc sa dissociation du réseau microtubulaire et sa relocalisation vers des structures synaptiques comme le cytosquelette cortical d’actine.Dans la deuxième partie de ce travail, afin de recueillir des informations susceptiblesde caractériser la fonctionnalité de la STOP à la synapse, nous avons identifié despartenaires neuronaux in vivo par la technique du double-hybride chez la levure. Trois deces partenaires potentiels ont été confirmés : la protéine Tctex1, à la fois chaîne légère dumoteur moléculaire dynéine assurant le choix des cargos lors du transport rétrograde lelong des microtubules mais également impliquée dans la croissance neuritique etl’adressage au bouton synaptique de canaux calciques sensibles au voltage, la protéine Arc,élément clé de l’élément post-synaptique impliqué dans des mécanismes de plasticitésynaptique, et la protéine Nsg2 localisée spécifiquement à l’appareil de Golgi des cellulesneuronales et de fonction indéterminée pour le moment.Nous nous sommes ensuite focalisés plus particulièrement sur le partenaire Tctex1 enconfirmant l’interaction avec la STOP par des expériences de co-localisation parimmunofluorescence dans des cellules de mammifères, de co-immunoprécipitation à partirde lysats de cellules transfectées, de transfert d’énergie par résonance de bioluminescence(BRET). Par l’emploi de mutants délétés, le site d’interaction de STOP avec Tctex1 a étéciblé au niveau de sa partie carboxy-terminale, et plus précisément dans un module deliaison aux microtubules.Si Tctex1 est indispensable à l’acheminement de canaux calciques nécessaires à l’exocytosede neurotransmetteurs et donc à la transmission synaptique, nous avons également montréque l’absence de son partenaire STOP entraînait une réduction de la densité de courantscalciques transitant à travers des canaux spécifiques de la neurotransmission, couplée àune diminution du nombre total des canaux dans les prolongements neuritiques. L’absencede STOP est également responsable d’un défaut du transport rétrograde neuronal, ce quipermet de relier la STOP à la fonctionnalité motrice de la dynéine cytoplasmique.En interagissant avec une multitude de partenaires différents aux fonctionnalités biendistinctes, les protéines STOP exerceraient très probablement un rôle intégrateur dansl’organisation fonctionnelle de la synapse.

Neurons contain an abundant subset of highly stable microtubules that resistdepolymerizing conditions such as exposure to the cold. The early and adult neuronalmicrotubule-associated proteins STOP (Stable Tubule Only Polypeptide), which areregulated by Ca2+/calmodulin and Ca2+/calmodulin-dependent kinase II (CaMKII), are themain effectors responsible for neuronal microtubule stability. STOP phosphorylation byCaMKII, a key enzyme in synaptic plasticity, abolishes its ability to bind microtubules. STOPnull mice exhibit synaptic abnormalities in the glutamatergic synapses of hippocampus,with depleted synaptic vesicle pools and defects in both short-term and long-term synapticplasticity. These synaptic defects are associated with severe behavioral disorders.At first, to continue studies concerning the synaptic presence of STOP protein and itsregulation by phosphorylation, we studied the cellular localization of phosphorylated STOPin primary cultures of hippocampal neurons : phosphorylated STOP staining is concentratedin spike-like structures in dendrites and in submembrane domains at branching points, andco-localizes with cortical actin at these sites. We also found that STOP and phosphorylatedSTOP co-sedimented with F-actin in vitro. Phosphorylated STOP is distributed in clustersand partially overlapp with pre- and post-synaptic markers. Phosphorylation of STOP byCaMKII is a candidate mechanism for its translocation from microtubules to synapticstructures such as cortical actin.In the second part of this work, to understand the synaptic function of STOP, welooked for neuronal partners in vivo by a yeast two-hybrid system. Three partners proteinswere shown to interact with N-STOP : the protein Tctex1 (T-complex testis expressed 1), alight chain of the molecular motor dynein implicated in loading cargos for retrogradetransport along microtubules and also implicated in neurite outgrowth and trafficking ofneuronal voltage-gated calcium channels (VGCCs) at presynaptic compartments ; theprotein Arc (Activity-regulated cytoskeletal-associated protein), implicated in post-synapticplasticity mechanisms ; the protein Nsg2 (Neuron-specific gene 2) with a specificlocalization at the Golgi apparatus in neurons and of unknow function.Then, we focused on Tctex1 and confirmed the interaction with STOP by colocalization in mammalian cells, by co-immunoprecipitation using overexpressed proteins incellular extracts, and by bioluminescence resonance energy transfer (BRET) technique. Wealso characterised the interaction site of Tctex1 on STOP using deletion mutants. Tctex1interacts with STOP on its carboxy-terminal domain, more precisely on a microtubulebinding module.If Tctex1 have an unique role in determining sorting and trafficking of VGCCs associatedwith release of neurotransmitter and synaptic transmission, we have shown that thesuppression of its partner STOP leads to a two-fold reduction in the neuronal Ca2+ currentdensity, with a decrease of channels immunostaining in neuritic processes. The suppressionof STOP is also related to abnormal neuronal retrograd transport, which permits toassociate STOP with the driving function of the cytoplasmic dynein.By interacting with a pannel of different partners with different features, STOP proteinsprobably functions as an integrator in the structural and functional synaptic organization., Les neurones contiennent une abondante population de microtubules stables résistantà la dépolymérisation induite par le froid. Cette stabilité est induite par l’association desmicrotubules avec deux effecteurs majeurs régulés par le complexe Ca2+/calmoduline et laCaM Kinase II : les isoformes E- et N-STOP (Early et adult Neuronal Stable Tubule OnlyPolypeptide). La phosphorylation de la protéine STOP par la CaMKII, enzyme clé de laplasticité synaptique, inhibe notamment sa capacité à lier les microtubules. L’invalidationdu gène stop chez la souris entraîne une dérégulation des synapses glutamatergiques del’hippocampe, avec diminution massive de la densité des vésicules pré-synaptiques et unealtération des mécanismes de plasticité synaptique à court et à long terme. Ces défautssynaptiques sont associés à des troubles sévères du comportement chez les souris STOP-/-.Dans un premier temps, afin de poursuivre les travaux concernant la présence de laprotéine STOP à la synapse et sa régulation par phosphorylation, nous avons étudié lalocalisation cellulaire de la STOP phosphorylée dans des cultures primaires de neuronesd’hippocampe : elle se trouve enrichie spécifiquement au niveau des spicules dendritiqueset des points de branchements axonaux et co-localise avec le réseau d’actine cortical sousmembranaire. Nous avons également montré que la STOP co-sédimente avec l’actine Fpolymérisée in vitro, quelle que soit sa régulation par la CaMKII. STOP phosphorylée colocalise partiellement avec des marqueurs pré- et post-synaptiques. La phosphorylation deSTOP par la CaMKII permet donc sa dissociation du réseau microtubulaire et sa relocalisation vers des structures synaptiques comme le cytosquelette cortical d’actine.Dans la deuxième partie de ce travail, afin de recueillir des informations susceptiblesde caractériser la fonctionnalité de la STOP à la synapse, nous avons identifié despartenaires neuronaux in vivo par la technique du double-hybride chez la levure. Trois deces partenaires potentiels ont été confirmés : la protéine Tctex1, à la fois chaîne légère dumoteur moléculaire dynéine assurant le choix des cargos lors du transport rétrograde lelong des microtubules mais également impliquée dans la croissance neuritique etl’adressage au bouton synaptique de canaux calciques sensibles au voltage, la protéine Arc,élément clé de l’élément post-synaptique impliqué dans des mécanismes de plasticitésynaptique, et la protéine Nsg2 localisée spécifiquement à l’appareil de Golgi des cellulesneuronales et de fonction indéterminée pour le moment.Nous nous sommes ensuite focalisés plus particulièrement sur le partenaire Tctex1 enconfirmant l’interaction avec la STOP par des expériences de co-localisation parimmunofluorescence dans des cellules de mammifères, de co-immunoprécipitation à partirde lysats de cellules transfectées, de transfert d’énergie par résonance de bioluminescence(BRET). Par l’emploi de mutants délétés, le site d’interaction de STOP avec Tctex1 a étéciblé au niveau de sa partie carboxy-terminale, et plus précisément dans un module deliaison aux microtubules.Si Tctex1 est indispensable à l’acheminement de canaux calciques nécessaires à l’exocytosede neurotransmetteurs et donc à la transmission synaptique, nous avons également montréque l’absence de son partenaire STOP entraînait une réduction de la densité de courantscalciques transitant à travers des canaux spécifiques de la neurotransmission, couplée àune diminution du nombre total des canaux dans les prolongements neuritiques. L’absencede STOP est également responsable d’un défaut du transport rétrograde neuronal, ce quipermet de relier la STOP à la fonctionnalité motrice de la dynéine cytoplasmique.En interagissant avec une multitude de partenaires différents aux fonctionnalités biendistinctes, les protéines STOP exerceraient très probablement un rôle intégrateur dansl’organisation fonctionnelle de la synapse.