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This work was dedicated to study how a variant of estrogen receptor α, ERα36, acts in initiation and progression of breast cancer. In the laboratory, his expression in testicular cancer was shown to stimulate cell proliferation in vitro and in vivo after environmental pollutant exposure. The compounds studied, the alkylphenols, are endocrine disruptors, interfering with normal estrogen signaling. Gene interaction network modelling from retrospective analysis of breast cancer samples showed that ERα36 expression was correlated with the expression of cell migration markers, typical of tumor progression. In vitro ERα36 overexpression and in a unique mouse Knocked In model, expressing ERα36 in the mammary gland, showed that ERα36 is sufficient to alter epithelial phenotype of normal breast cells. Alkylphenols exposure, that stimulated ERα36 endogenous expression, increased cellular alterations and contributed to transgenerational acquisition of properties related to neoplastic transformation. Analysis of this multidisciplinary project were based on biological expertise, mathematics and bioinformatic tools. These results enabled to highlight for the first time the potential role of ERα36 in tumor initiation and confirmed his involvement in breast cancer progression. Finally, we showed that exposure to environmental doses of alkylphenolsduring the perinatal period can lead to transgenerational modification of mammary gland differentiation under ERα36control and eventually may increase breast cancer risk., Durant ma thèse, j’ai étudié l’implication d’un variant du récepteur aux oestrogènes α, ERα36, dans l’initiation et la progression du cancer du sein. Au laboratoire, son expression dans les cancers testiculaires avait été montrée comme étant inductrice de la prolifération cellulaire in vitro et in vivo après une exposition à un mélange de polluants environnementaux, considérés comme perturbateurs endocriniens oestrogéno-mimétique : les alkylphénols.Une analyse rétrospective d’échantillons de tumeurs mammaires a montré, par la modélisation de réseaux d’interactions géniques, que l’expression d’ERα36 était corrélée avec l’expression de marqueurs de migration cellulaire, caractéristiques de la progression tumorale. La surexpression d’ERα36 par transfection in vitro et dans un modèle unique de souris Knocked In exprimant ERalpha36 dans la glande mammaire ont montré qu’ERα36 estsuffisant pour altérer le phénotype épithélial des cellules mammaires saines. Une exposition aux alkylphénols qui stimulent son expression endogène accentue les altérations cellulaires observées et contribue à l’acquisition transgénérationnelle de propriétés relatives à une transformation tumorale.Les analyses de ce projet pluridisciplinaire se sont appuyées sur des expertises biologiques, mathématiques et bioinformatiques et ont permis de mettre en évidence pour la première fois le rôle potentiel d’ERα36 dans l’initiation tumorale et de confirmer son implication dans la progression du cancer du sein. Enfin, nous avons montré que l’exposition à des doses environnementales d’alkylphénols lors de la période de périnatalité peut conduire à unemodification transgénérationnelle de la différenciation de la glande mammaire sous le contrôle d’ERα36 et ainsi augmenter le risque de cancer mammaire.

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In vitro and in vivo epidemiological studies showed that the exposure of men to endocrine disruptors triggers the initiation and the progression of the testis cancer (Beiki et al., 2010). The fetal exposure to these products is able to alter the differentiation of germ cells in the timing of their development during the fetal life. The aim of our study was to determine the role of an endocrine disruptor mix on the proliferation of seminoma cells TCam-2. We also identified the pathways involved. In this study, we focused on the estrogen-like effects of an alkylphenol mixture called M4 (4-tert-octylphenol and 4-nonylphenol): in vitro we measured the proliferation of TCam-2 seminoma cells after M4 exposure and in vivo, we measured the tumor growth of NT2/D1 cells xenografted into Nude mice. The results highlighted the implication of ER[alpha]36 receptor, a truncated isoform of ER[alpha], in the response to the alkylphenol mixture M4. This mixture stimulates the cell proliferation of testicular cancer cells and the expression of the ER[alpha]36 receptor. These effects are mediated by CREB phosphorylation via the PI3K-ER[alpha]36-dependant pathway, and end by downregulation of Dnmt3 genes, thus limiting the level of DNA methylation. Therefore ER[alpha]36 appears to be a promising therapeutic target for testis cancer treatment, L’incidence des cancers testiculaires a fortement augmenté au cours des 50 dernières années. Des études épidémiologiques in vitro et in vivo, ont montré que l’exposition des hommes aux perturbateurs endocriniens est impliquée dans l’initiation et la progression du cancer du testicule (Beiki et al., 2010). L’exposition fœtale à ces produits pourrait provoquer des altérations de la différenciation des cellules germinales (CGs) au cours leur développement pendant la vie fœtale. Au cours de cette thèse, nous nous sommes intéressés à déterminer le rôle des perturbateurs endocriniens œstrogéno-mimétiques en mélange sur la prolifération des cellules séminomateuses TCam-2. Nous avons identifié les voies de signalisation impliquées dans la réponse à ces produits. Nous nous sommes focalisés sur les effets d’un mélange d’alkylphénols appelé M4 (4-tert-octylphénol et le 4-nonylphénol), in vitro sur la prolifération des cellules séminomateuses TCam-2, et in vivo sur la croissance de tumeurs obtenues à partir des cellules de carcinome embryonnaire NT2/D1 xénogreffées chez la souris Nude. Dans notre étude, nous avons mis en évidence l’implication d’ER[alpha]36, une isoforme tronquée du récepteur ER[alpha], dans la réponse au mélange d’alkylphénols, M4. Ce mélange stimule la prolifération des cellules du cancer testiculaire et l’expression du récepteur ER[alpha]36. Ces effets sont médiés par la phosphorylation de CREB via la voie PI3K-ER[alpha]36-dépendante, et aboutissent à la diminution de l’expression des gènes de la famille Dnmt3, limitant le niveau de méthylation de l’ADN. ER[alpha]36 pourrait donc constituer une cible thérapeutique dans le traitement des cancers testiculaires

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Au cours de mon doctorat puis de mes différents stages post-doctoraux, j'ai développé des approches de physiologie et génomique comparatives pour identifier et caractériser des médiateurs moléculaires impliqués dans le contrôle de la prolifération des cellules eucaryotes en réponse aux variations de l'environnement. Je me suis également attachée, dans des modèles biologiques divers, à replacer les mécanismes moléculaires et cellulaires étudiés dans un contexte plus général de physiologie de l'organisme. Depuis ma nomination en tant que Maître de Conférences à l'Université Nancy 1, je me suis focalisée sur l'influence des hormones stéroïdes sur la prolifération et la différenciation normale ou pathologique des cellules germinales. Le projet de recherche que je souhaite développer s'articule autour de 3 mots-clefs : tumeurs hormono-sensibles, perturbateurs endocriniens, voie non conventionnelle de signalisation oestrogénique. Le premier axe renferme un projet concernant les effets d'un mélange d'alkylphénols sur l'initiation et la progression tumorale dans un modèle de cancer testiculaire d'origine germinale puis de cancer mammaire, in vitro et in vivo. Le but est de caractériser le rôle éventuel de ERa36 dans ces processus afin de valider cette forme du récepteur des oestrogènes comme marqueur d'exposition aux perturbateurs endocriniens dans les cellules hormono-. Le second axe s'inscrit dans un objectif à plus long terme qui sera de valider ERa36 comme marqueur prédictif de réponse aux traitements anti-tumoraux dans les cancers hormono-sensibles et en particulier dans le cancer du sein.

National audience; Breast cancer is the main cause of cancer-induced morbidity and mortality in women. Breast tumors are usually classified according to their ERa66 status. Such a classification led to the use of endocrine therapeutic agents against ER-positive tumors [ER+]. Nevertheless, numerous therapeutic failures are observed due to unclear resistance mechanism. ERa66 was considered as the unique functional estrogen receptor in hormone sensitive breast tumor until the recent identification of membrane bound new estrogen receptors: the G protein coupled estrogen receptor (GPER) and the 36kDa ERa splice variant (ERa36). Surprisingly, ERa36 stimulates cell proliferation in response to tamoxifen treatment and could therefore be involved in the acquired resistance to this compound. Moreover, a high ERa36 expression level correlates with a short term survival for ERa66-negative patients as well as enhanced tumorigenesis and metastatic potential of triple-negative cells in vitro. The aim of our project was to improve the classification of so-called "ER-positive" breast tumors by taking into account the key role of ERa36 and GPER in the control of non genomic estrogen response and metastatic potential. We set up a retrospective study, performed on hundreds of breast tumor samples, in order to better define the field of acceptance of [ER+] versus [ER-] classification and to help the clinicians choosing the best therapeutic compounds. We addressed two main questions: 1- Are ERa36 and GPER predictive markers of therapeutic response in ER-positive tamoxifen-treated patients [ER+,TAM+]? 2- Is a high ERa36 or/and GPER expression level of poor prognosis because these receptors stimulate tumor progression and metastatic potential? ERa36, GPER and metastatic marker expressions were measured by real-time PCR in almost 100 [ER+,TAM] as well as 60 triple-negatives [ER-,TAM-] tumor samples. Then, we performed statistical analyses between gene expression levels and clinical parameters (grade, survival, treatment). Modeling of the potential relationship between the genes tested using nonlinear correlation analyses, Bayesian inference and transfer entropy computation led to the characterization of complex network connecting non genomic estrogen signaling and metastatic process. Hence, ERa36 expression is strongly related to GPER, Snail1, Vim and MMP9A in [ER+, TAM+] samples. This suggests that, after tamoxifen treatment, ERa36 may stimulate the metastatic potential of [ER+] tumor in vivo. Such a model will be first tested in vitro in hormone-dependent or triple negative cell lines. Taken together, the results from this project should lead to (i) a better understanding of the breast tumor hormone sensitive status, (ii) a validation of new predictive markers of response in order to improve therapeutic orientation, (iii) the potential discovery of new therapeutic targets in triple-negative tumors.

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National audience; Au cours des trente dernières années, les observateurs constatent un doublement des cas de cancer testiculaire chez les jeunes adultes dans les pays industrialisés. Ces altérations semblent dues à l'exposition à des xénobiotiques d'origines diverses, regroupés sous l'appellation de perturbateurs endocriniens. Chez les individus exposés dès la vie fœtale à des composés chimiques analogues possédant une activité estrogénique ou anti-androgénique, on observe un arrêt ou une modification du processus de différenciation des cellules germinales qui peuvent conduire au développement de pré-carcinome in situ (CIS). Notre hypothèse est que, chez le jeune adulte, sous l'effet de stéroïdes et de perturbateurs endocriniens, les cellules de CIS prolifèrent et forment des tumeurs testiculaires.

Background Seminoma, originated from carcinoma in situ cells (CIS), is one of the main causes of cancer in young men. Postpubertal development of these testicular germ cell tumors suggests a hormone-sensitive way of CIS cell proliferation induction probably stimulated by lifelong exposure to endocrine disruptors. In a first step to understand the mechanisms underlying the deleterious effects of endocrine disrupting compounds on germ cells, we aimed to decipher the estrogen-dependent transduction pathways in TCam2 cells. Then, we began to assess the effects of a [4tert-octyl + 4-nonylphenol] mix on testicular germ cell tumors in vitro and in vivo. Material and methods In this study, we used the unique seminoma TCam-2 cell line which do not express the canonical ER66 estrogen receptor but ERα36, a truncated isoform retaining the DNA-binding, partial dimerisation and ligand-binding domains and a specific C-term 27 aa sequence. Cells were exposed to either estradiol at concentrations in the range of those detected in an adult human testis or to a [4tert-octyl + 4-nonylphenol] mix used at low doses - i.e. those found in food and drinking water. In vitro, we performed cell proliferation assays, siRNA- or shRNA-directed knockdown, microarray-directed gene targeting and signaling pathways identification after short term (1h) or mid-term (24h or 48h) treatment. We also addressed the question of TCam-2 derived tumor growth in xenografted Nude mice treated with the [4tert-octyl + 4-nonylphenol] mix. Results We demonstrate in vitro that estradiol and the alkylphenol mix trigger TCam-2 cell proliferation through ER36-dependent pathways. We establish that estradiol can activate GPER-cAMP/PKA signaling pathway. Stable ERα36 knockdown indicates that ERα36 is (i) necessary for cell proliferation (ii) a downstream target of estradiol-activated GPER/PKA/CREB pathway, (iii) required for estradiol-dependent EGFR expression. The [4tert-octyl + 4-nonylphenol] mix signaling pathway is clearly ER36 dependent but seems to be partially non-estrogenic. Finally, we show that the [4tert-octyl + 4-nonylphenol] mix stimulates tumor growth in TCam-2 xenografted Nude mice. Conclusions Our results highlight the functional role of ERα36 in context of seminoma cell proliferation and the importance of testing ERα36 in vivo as a possible marker for endocrine disruptor susceptibility.