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Lipases are enzymes that catalyze the hydrolysis of triacylglycerols, releasing fatty acids that can be associated with the spoilage of many foods. On the other hand, lipases of microbial origin present desirable characteristics to be used in several biotechnological applications and are considered versatile biocatalysts, acting in a variety of chemical reactions. The objective of this work was to evaluate, through a literature review, the impact of bacterial lipases on the quality of dairy products and the biotechnological potential of these enzymes. Psychrotrophic bacteria isolated from refrigerated raw milk commonly secrete heat resistant lipases, a problem for the dairy industry, as they resist heat treatments used and remain in the finished dairy product. Fatty acids released during lipolysis contribute to the strong, rancid, soapy taste of dairy products, making them unacceptable to the consumer. However, when this activity is controlled, lipases act in the development of desirable sensory attributes. For example, in some cheeses that mature for a long time, lipolytic activity is essential for the development of characteristic flavors. In addition, lipases have great potential for biotechnological application, including in the degradation of polyurethanes, representing an advantage for the industry. Therefore, lipases can cause defects in dairy products, but they are also of great industrial interest when their activity is explored. Las lipasas son enzimas que catalizan la hidrólisis de los triacilgliceroles, liberando ácidos grasos que pueden estar asociados con el deterioro de muchos alimentos. Por otro lado, las lipasas de origen microbiano presentan características deseables para ser utilizadas en varias aplicaciones biotecnológicas y se consideran biocatalizadores versátiles, actuando en una variedad de reacciones químicas. El objetivo de este trabajo fue evaluar, mediante una revisión de la literatura, el impacto de las lipasas bacterianas en la calidad de los productos lácteos y el potencial biotecnológico de estas enzimas. Las bacterias psicrotróficas aisladas de la leche cruda refrigerada comúnmente secretan lipasas resistentes al calor, un problema para la industria láctea, ya que resisten los tratamientos térmicos utilizados y permanecen en el producto lácteo terminado. Los ácidos grasos liberados durante la lipólisis contribuyen al sabor fuerte, rancio y jabonoso de los productos lácteos, lo que los hace inaceptables para el consumidor. Sin embargo, cuando se controla esta actividad, las lipasas actúan en el desarrollo de atributos sensoriales deseables. Por ejemplo, en algunos quesos que maduran mucho tiempo, la actividad lipolítica es fundamental para el desarrollo de sabores característicos. Además, las lipasas tienen un gran potencial para aplicaciones biotecnológicas, incluida la degradación de poliuretanos, lo que representa una ventaja para la industria. Por tanto, las lipasas pueden provocar defectos en los productos lácteos, pero también son de gran interés industrial cuando se explora su actividad. Lipases são enzimas que catalisam a hidrólise de triacilgliceróis, com liberação de ácidos graxos que podem estar associadas com a deterioração de muitos alimentos. Por outro lado, as lipases de origem microbiana apresentam características desejáveis para serem utilizadas em diversas aplicações biotecnológicas e são consideradas biocatalisadores versáteis, atuantes numa variedade de reações químicas. O objetivo deste trabalho foi avaliar, por meio de revisão da literatura, o impacto de lipases bacterianas na qualidade de produtos lácteos e o potencial biotecnológico dessas enzimas. Bactérias psicrotróficas isoladas do leite cru refrigerado, comumente secretam lipases termorresistentes, um problema para a indústria laticinista, pois resistem aos tratamentos térmicos utilizados e permanecem no produto lácteo acabado. Os ácidos graxos liberados durante a lipólise contribuem para o sabor forte, rançoso e de sabão dos produtos lácteos, tornando-os inaceitáveis pelo consumidor. No entanto, quando esta atividade é controlada, as lipases atuam no desenvolvimento de atributos sensoriais desejáveis. Por exemplo, em alguns queijos de maturação prolongada a atividade lipolítica é essencial para o desenvolvimento de sabores característicos. Além disso, as lipases apresentam grande potencial de aplicação biotecnológica, inclusive na degradação de poliuretanos, configurando vantagem para a indústria. Portanto, as lipases podem causar defeitos nos produtos lácteos, mas também são de grande interesse industrial quando sua atividade é explorada.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Universidade Federal de Goiás, Universidade Federal do Mato Grosso, Universidade Federal do Mato Grosso do Sul, Universidade Federal da Grande Dourados— Programa em Rede Multi-Institucional do Pró-Centro-Oeste de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biodiversidade, 2018. O solo do Cerrado tem sido foco de poucos estudos, especificamente sua diversidade microbiana. O solo é um habitat com alta diversidade de microrganismos e, portanto, pode ser fonte para a prospecção de enzimas industriais. A identificação de novos genes pela abordagem metagenômica levou à descoberta de novas atividades enzimáticas. As enzimas lipoliticas são produzidas principalmente por microorganismos, frequentemente bactérias, e desempenham um papel vital em iniciativas comerciais. A fim de isolar genes putativos de lipase, foi realizado um screening com tributirina em uma biblioteca metagenômica de solo de Cerrado. De 6.720 clones avaliados contendo um inserto de mediana de 8 Kb, foram isolados três com atividade lipolítica e dezoito seqüências codificantes foram preditas. LipX e lipY se agruparam a enzimas da família IV lipolítica, relacionados com lipase de Pseudomonas sp. (AAC38151), Cupriavidus necator (AAC 41424) e Moraxella sp. (CAA37862). LipW apresentou semelhanças estruturais com uma enzima lipolítica de Pseudomonas fluorescens e 28% de identidade de sequência, no mesmo ramo de quatro lipases / esterases da bactéria Moraxellaceae. Além disso, a tríade catalítica Ser-Asp-His foi localizada no motivo G-X-S-M-G-G, similar a outras lipases da família V. A purificação da lipX revelou uma proteína recombinante de 35 kDa, e da lipY revelou uma proteína recombinante de 32 kDa como previsto pelos dados de sequenciamento. O peso molecular estimado do LipW foi de 29 kDa, os parâmetros moleculares puderam ser associados ao monômero do lipW em correspondência com o seu MW teórico, como também se observou no gel de SDS-PAGE. A atividade enzimática foi observada de pH 3,0 a 10,0, com atividade ótima em pH 7,5,0-9,5 para lipX, pH 8,0-9,5 para lipY e em pH 9,0-9,5 para lipW. Dentro da faixa de temperatura de 25°C-95°C, a atividade máxima foi observada a 55°C para lipX, 60°C para lipY e 40°C para lipW. Os resultados da comparação entre o lipX com o algoritmo BLAST e o banco de dados de proteínas (PDB) exibiu 41% de identidade com mutante G84S EST2 de Alicyclobacillus acidocaldarius [PDB 2HM7] e dobra α/βhydrolase da família sensível ao hormônio IV Esterase/Lipase. Com os resíduos catalíticos: Ser156, Asp259 e His289 localizados entre o domínio α/β e o domínio helicoidal. O Ser156 está localizado no motivo de consenso GDSAGG, e também foi visto no alinhamento de sequência de lipX com outros membros da família IV. LipY tem uma tríade catalítica formada por Ser143, Glu237 e His267. LipY também contém um domínio CAP (Met1–Val45) além do domínio catalítico (Gln46–Arg306). O Ser143 catalítico está localizado no motivo GXSAG semi-conservado onde, em vez de Asp (GDSAG), o mais comum, há outro resíduo de carga negativa, Glu (GESAG). LipX e lipY contêm motivo HGG conservado, que está envolvido na formação do canal oxianionico. Juntos, os espectros de CD UV distante e a estrutura do modelo 3D baseada na modelagem por homologia indicam que a estrutura secundária lipX, Y e W consistia em α-hélice (~45%) e estruturas de folha-β (~15%), o que é consistente com a estrutura secundária predominantemente α-hélice da família α/β-hidrolase de esterases. A combinação de propriedades estruturais e funcionais demonstra que a abordagem metagenômica de ambientes nativos é adequada para descobrir novas enzimas lipolíticas com aplicação biotecnológica. The Brazilian Cerrado soil has been focus of very few studies about its microbial diversity. Soil is a habitat with high diversity of microorganisms, thus can be a source for the prospection of industrial enzymes. The identification of new genes through the metagenomic approach has led to the discovery of novel enzyme activities. Lipases are mainly produced by microbes, most frequently bacterial, and play a vital role in commercial ventures. In order to isolate putative lipase genes, Cerrado soil metagenomic library was screened with tributyrin. From 6,720 clones evaluated with 8 Kb DNA size, three with lipolytic activity were isolated, and eighteen coding sequences were predicted. LipX and lipY clustered with lipolytic enzymes from family IV, closely related to a lipase from Pseudomonas sp. (accession number AAC38151), Cupriavidus necator (accession number AAC 41424) and Moraxella sp. (accession number CAA37862). LipW showed structural similarities with a Pseudomonas fluorescens lipolytic enzyme, and 28% sequence identity in the same branch as four lipases/esterases from Moraxellaceae bacteria. In addition, the Ser-Asp-His catalytic triad was localized in the G-X-S-M-G-G motif, similar to other family V lipases. The purification of lipX revealed a 35-kDa recombinant protein and lipY revealed a 32-kDa recombinant protein as predicted by the sequence data. Estimated molecular weight of LipW was 29 kDa, molecular parameters could be associated to the lipW monomer in correspondence with their theoretical MW, as also observed in the SDS-PAGE gel. Enzyme activity was observed from pH 3.0–10.0, with optimal activity at pH 7.5.0–9.5 for lipX, pH 8.0–9.5 for lipY and at pH 9.0–9.5 for lipW. Within the temperature range of 25°C–95°C, maximum activity was observed at 55°C for lipX, 60°C for lipY and 40°C for lipW. The results from the comparison of the lipX with BLAST algorithm against protein data bank (PDB) exhibited 41% identity with G84S EST2 mutant from Alicyclobacillus acidocaldarius [PDB 2HM7] and α/βhydrolase fold from the IV Esterase/Lipase hormone sensitive Family. With the catalytic residues: Ser156, Asp259 and His289 located between α/β domain and the helical domain. The Ser 156 is located in the consensus motif GDSAGG, as also showed in the sequence alignment of lipX with other members of related Family IV. LipY has a catalytic triad formed by Ser143, Glu237, and His267. LipY also contains a CAP domain (Met1–Val45) besides catalytic domain (Gln46–Arg306). The catalytic Ser143 is located in the semi-conserved GXSAG motif where instead of Asp (GDSAG), the most common; there is another negative-charged residue, Glu (GESAG). LipX and lipY contain a conserved HGG motif, which is involved in the formation of the oxyanion hole. Together, the far-UV CD spectra and 3D model structure based on homology modeling indicate that lipX,Y and W secondary structure consisted of α-helix (~45%) and β-sheet (~15%) structures, which is consistent with the predominantly α-helix secondary structure of the α/β-hydrolase family of esterases. The combination of structural and functional proprieties demonstrates that metagenomic approach of native environments is suitable for discovering novel lipolytic enzyme with biotechnological application.

Biocatalysts have advantages over classical catalysts employed in the various chemical processes, such as their specificity in particular. Lipolytic enzymes are biocatalysts with wide application in hydrolysis and synthesis reactions. By means of gel chromatography, the enzyme complex with lipase activity was partially purified from the latex of the jaca (Artocarpushyllus L.). It was found that said complex is formed by proteins with molecular weight of 63,105,120, 136,176 and 209 kDa in native conditions, estimating 10 bands with molecular weights ranging from 24 to 106 kDa by electrophoresis in SDS-PAGE; the lipolytic activity was detected in plates with agar, by means of the hydrolysis of the substrates tributyrin and olive oil, using purple bromocresol and rhodamine B as indicator respectively. A greater activity of the enzymatic complex was observed when p Nitrophenyl acetate (p-NFA) was used as a substrate, with an optimal temperature of 70 ° C YpH optimum of 8. The lipolytic complex follows a typical Michaelis-Menten kinetic. The estimated values ​​of Km and Vmax in the hydrolysis of p-NFA, were 1,083 mM and 833.33 U / mg, respectively. It was found that I retain the lipolytic activity after exposure to solvents such as methanol, ethanol and hexane. The results obtained suggest that the catalytic properties found in the lipolytic complex could be useful as a biotechnological tool in various applications. Los biocatalizadores presentan ventajas frente a los catalizadores clásicos empleados en los diversos procesos químicos, tal como su especificidad en particular. Las enzimas lipolíticas son biocatalizadores con amplia aplicación en reacciones de hidrólisis y síntesis. Mediante cromatografía en gel se purificó parcialmente el complejo enzimático con actividad de lipasa a partir del latex de la jaca (Artocarpushyllus L.). Se encontró que dicho complejo está formado por proteínas con peso molecular de 63,105,120, 136,176 y209 kDa en condiciones nativas, estimando 10 bandas con pesos moleculares que van de 24 a 106 kDa por electroforesis en SDS-PAGE; la actividad lipolítica fue detectada en placas con agar, por medio de la hidrólisis de los sustratos tributirina y aceite de olivo, utilizando purpura de bromocresol y rodamina B como indicador respectivamente. Se observo una mayor actividad del complejo enzimático al utilizar como sustrato al p-Nitrofenil acetato (p-NFA), con una temperatura optima de 70°C YpH optimo de 8. El complejo lipolítico sigue una cinética típica de Michaelis-Menten. Los valores estimados de Km y Vmax en la hidrólisis del p-NFA, fueron de 1.083 mM y 833.33 U/mg, respectivamente. Se encontró que conservo la actividad lipolítica después de su exposición a solventes como metanol, etanol y hexano. Los resultados obtenidos sugieren que las propiedades catalíticas encontradas en el complejo lipolítico podrían ser útiles como herramienta biotecnológica en diversas aplicaciones.

Fungos endofíticos provenientes de sementes oleaginosas interagem fisiologicamente com seu hospedeiro e, para isto, dependem de inúmeros metabólitos como as enzimas lipolíticas. As reações de esterificação entre álcoois e ácidos orgânicos catalisadas por enzimas lipolíticas podem ser utilizadas na produção de ésteres, os quais são usados como flavor em alimentos, bebidas, fármacos e cosméticos. O objetivo do presente trabalho foi isolar e selecionar fungos endofíticos de sementes de baru (Dipteryx alata), cacau (Theobroma cacao L.), jerivá (Syagrus romanzoffiana) e macaúba (Acrocomia aculeata), potencialmente produtores de enzimas lipolíticas aplicáveis na área de alimentos. Foram isolados 16 fungos filamentosos endofíticos a partir de sementes oleaginosas, dentre os quais três apresentaram halos de hidrólise em meio seletivo contendo óleo de oliva, sendo estes fungos provenientes de sementes de baru, macaúba e jerivá (B1, M6 e J4) com Índice de Atividade Enzimática (IAE) 3,82; 1,89 e 1,28, respectivamente. O fungo isolado da semente de jerivá se destacou nos valores de atividade lipolítica (1,2 U.L-1) avaliada pelo teste de hidrólise de pNPP e foi identificado molecularmente como Fusarium sp. O preparado bruto enzimático contendo enzima lipolítica (PBE) produzido por esse fungo foi capaz de promover a conversão de ácido acético e ácido butírico em acetato de butila e butirato de butila por esterificação (87,96% e 31,87% de taxa de conversão, respectivamente) em 24 h. A partir da otimização da reação de síntese do acetato de butila foi possível produzir este éster com 87,25% de taxa de rendimento em ¼ do tempo com 0,9 g de enzima e 200 mmol.L-1 de ácido acético e butanol. A detecção e identificação do acetato de butila sintetizado foram realizadas por meio de cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas. Esse trabalho permitiu verificar o potencial de uso de enzimas lipolíticas de Fusarium sp. isolado de jerivá na síntese de acetato de butila, um éster com aroma de abacaxi, utilizado na indústria de alimentos. Estudos de purificação, imobilização e capacidade de reação de esterificação com outros substratos podem levar a futuras aplicações biotecnológicas desta enzima lipolítica. Endophytic fungi from oilseed plants physiologically interact with their host and, therefore, depend on numerous metabolites such as lipolytic enzymes. The esterification reactions between alcohols and organic acids catalyzed by lipolytic enzymes can be used in the manufacture of esters which are used as flavor in foods, beverages, pharmaceuticals and cosmetics. The present work aimed to isolate and select endophytic fungi from baru (Dipteryx alata), cocoa (Theobroma cacao L.), jerivá (Syagrus romanzoffiana) and macaúba (Acrocomia aculeata) seeds, that are potential producers of lipolytic enzymes applicable in the food area. Sixteen endophytic filamentous fungi were isolated from oilseeds, three of them showed hydrolysis halo in selective medium containing olive oil. These fungi were from baru, macaúba and jerivá seeds (B1, M6 and J4) with enzymatic activity index (EAI) 3.82; 1.89 and 1.28, respectively. The isolated fungus from jerivá seed stood out for its lipase activity values (1.2 U.L-1) evaluated by pNPP hydrolysis test and was identified molecularly as Fusarium sp. The lipolytic enzyme produced by this fungus was able to promote the synthesis of butyl acetate and butyl butyrate by esterification (conversion rates of 87.96% and 31.87%, respectively) for 24 h. It was possible to produce this ester with a yield rate of 87.25% in a quarter of the time with 0.9 g of enzyme and 200 mmol.L-1 of acetic acid and butanol, from the optimization of butyl acetate synthesis reaction. The confirmation of synthesized butyl acetate were performed by gas chromatography-mass spectrometry. This work has shown potential use of lipolytic enzymes from Fusarium sp. isolated from jerivá in synthesis of butyl acetate, an ester with pineapple flavor, used in the food industry. Studies of purification, immobilization of this enzyme and its esterification reaction with other substrates may lead to future biotechnology applications of this lipolytic enzyme.

Submitted by Fabiano Jucá (fjuca@unicentro.br) on 2017-06-26T12:50:15Z No. of bitstreams: 1 MICHAEL WILIAN GUIMARÃES.pdf: 2010475 bytes, checksum: 2a5b9b5f801aa01bea2c0addfb0513b8 (MD5) Made available in DSpace on 2017-06-26T12:50:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 MICHAEL WILIAN GUIMARÃES.pdf: 2010475 bytes, checksum: 2a5b9b5f801aa01bea2c0addfb0513b8 (MD5) Previous issue date: 2016-02-26 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES The soil from Araucaria forest had been the focus of few studies about its microbial diversity. The soil is a habitat that exhibits a large microbial diversity. Thus, it can be explored as a source of microorganisms that produce enzymes of industrial interest. Among of variousenzymes existent, the lipases (triacylglycerol-acid-hydrolases E.C.3.1.1.3) are extensively used, due to the wide range of reactions that they catalyze, as the total or partial hydrolysis of triacylglycerols (TAG), reactions of esterification, transesterification and inter-esterification of lipids. Therefore, the present study aimed to isolate different fungal strains from fragments of Araucaria Forest and evaluate the potential of lipase production by the fungi isolated. From the selection of the best producer strain, the Design Plackett-Burman was used, in order to select the variables that affect this process. After, the Central Composite Rotatable Design (CCRD) applicable to Response Surface Methodology (RSM) was employed, in order to establish the best conditions for the lipase production, using the castor bean waste as substrate. Finally, the enzyme produced under optimum conditions were biochemically characterized. The fungal isolation was conducted using the dilution series technique, allowing the achievement of 65 fungal strains. The lipase production capacity was verified in 17 of studied strains, in which a Trichoderma strain was the best producer. Tween 80, CaCl2, NH4Cl and yeast extract were selected as the variables that affect the lipase production process by Trichoderma sp. For this reason, these same variables were considered in DCCR. Under optimized conditions, the levels of lipases reached 64 U mL-1. Through the biochemical characterization, it was possible stablished that Trichoderma sp. lipases showed optimal activity in neutral pH, at 30 °C. In relation to the effect of various ions and substances on the lipase activity, 0.2 mM Na+2 activated these enzymes. In addition, an activator effect was verified in the presence of Triton X-100 surfactant. Among distinct organics solvents evaluated, only 1% toluene presented an activator effect on the produced enzymes. The results obtained in this study reveal the potential use of the castor bean waste as substrate for the lipase production. The employment of this waste on microbial enzymes production is very interesting, since economic and environmental benefits could be obtained from its uses. In addition, the screening studies presented here offer news perspectives, in order to promote the appreciation as well the rational exploration of Araucaria Forest fragments, priority areas for the Brazilian biodiversity conservation. O solo da Floresta Ombrófila Mista tem sido o foco de poucos estudos sobre sua diversidade microbiana. O solo é um habitat que apresenta uma ampla diversidade microbiana. Desta forma, pode ser explorado como uma fonte de microrganismos produtores de enzimas de interesse industrial. Dentre as diversas enzimas existentes, as lipases (triacilglicerol-acil-hidrolases E.C.3.1.1.3) são muito utilizadas, em virtude da grande gama de reações que podem catalisar, como a hidrólise total ou parcial de triacilgliceróis (TAG), além de reações de esterificação, transesterificação e interesterificação de lipídios. Diante disto, o presente estudo objetivou isolar diferentes linhagens fúngicas a partir de solo de remanescentes de Floresta Ombrófila Mista e avaliar o potencial de produção de lipases pelos fungos isolados. A partir da seleção da melhor linhagem produtora, o delineamento Plackett-Burman foi empregado, a fim de selecionar as variáveis que mais afetam este processo. Posteriormente, o Delineamento Central Composto Rotacional (DCCR) aplicável à Metodologia de Superfície de Resposta (RSM) foi empregado, no intuito de se estabelecer as condições ótimas para a produção dessas enzimas, utilizando a torta de mamona como substrato. Por fim, as lipases produzidas sob condições otimizadas foram bioquimicamente caracterizadas. O isolamento dos fungos foi realizado empregando-se a técnica de diluição sucessiva, permitindo a obtenção de 65 linhagens fúngicas. A capacidade de produção de lipases foi evidenciada em 17 das linhagens avaliadas, destacando-se como melhor produtor uma linhagem de Trichoderma sp. As variáveis concentração de Tween 80, CaCl2, NH4Cl e extrato de levedura foram selecionadas como as que mais afetam o processo de produção de lipases por Trichoderma sp. Por esta razão, estas mesmas variáveis foram consideradas no DCCR. Após a otimização, os níveis de produção atingidos corresponderam a 60,70 U/mL. Por meio da caracterização bioquímica realizada, constatou-se que as lipases de Trichoderma sp. apresentam atividade ótima em pH neutro e a 30 °C. Em relação ao efeito de diversos íons e substâncias sobre a atividade lipásica, verificou-se que o Na+2 na concentração de 0,2 mM promoveu a ativação destas enzimas. Ainda, um efeito ativador foi observado em presença do surfactante Triton X-100. Dentre os distintos solventes orgânicos avaliados apenas o tolueno a 1% ativou as enzimas produzidas. Os resultados obtidos neste trabalho revelam o potencial de utilização da torta de mamona como substrato para a produção de lipases. O emprego deste resíduo para a produção de enzimas microbianas se mostra bastante interessante, visto que tantos benefícios econômicos quanto ambientais poderão ser obtidos a partir de sua utilização. Em adição, os estudos de bioprospecção aqui apresentados oferecem novas perspectivas, a fim de promover a valorização bem como a exploração racional dos remanescentes de Floresta Ombrófila Mista, áreas prioritárias para a conservação da biodiversidade brasileira.