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Escherichia coli productora de toxina Shiga (STEC) es un patógeno transmitido por alimentos, responsable de causar el Síndrome urémico hemolítico (SUH) en humanos a través de su principal factor de virulencia, la toxina Shiga tipo 1 o 2 (Stx1, Stx2). Stx es liberada por STEC después de colonizar y adherirse al epitelio colónico, atraviesa la barrera epitelial y causa daños en diferentes órganos blancos, principalmente riñón y cerebro. El 10 al 15% de los casos registrados de infecciones por STEC progresan a SUH, y las causas de esta susceptibilidad aún no están esclarecidas. En el presente trabajo, determinamos que la infección con E. coli O157:H7, el serotipo de STEC más frecuentemente asociado al SUH, aumentó significativamente los niveles de endocitosis, citotoxicidad y translocación a través de la barrera intestinal de Stx2 mediante diversos mecanismos. Además, al evaluar la influencia de los metabolitos derivados de la actividad mucolítica de la microbiota comensal sobre la virulencia de STEC, encontramos que los monosacáridos NAG y NANA tienen la capacidad de aumentar el perfil virulento de la misma con respecto a otros 3 azúcares evaluados, aportando evidencias acerca de la interacción hospedero-microbiota-patógeno en la incidencia del SUH. Por otra parte, pudimos optimizar las variables de procesamiento y determinamos la capacidad neutralizante de la actividad de Stx2 in vitro y de la patogenicidad de STEC in vivo de una formulación de calostro bovino hiperinmune pasteurizado y secado por aspersión como potencial tratamiento preventivo del SUH. Shiga toxin producing-Escherichia coli (STEC) is a foodborne pathogen responsible for causing hemolytic uremic syndrome (HUS) in humans, being its main virulence factor is Shiga toxin type 1 or type 2 (Stx1, Stx2) and its variants. Stx released by STEC after adhering and colonizing to the colonic epithelium causes damage to different target organs after crossing the epithelial barrier, mainly the kidney and brain. Only 10 to 15% registered cases of STEC infections progress to HUS, and the causes of this susceptibility are still unclear. In the present work, we determined that infection with E. coli O157:H7 strain, the serotype most frequently associated with HUS, significantly increased the levels of Stx2 endocytosis, cytotoxicity and translocation through the intestinal barrier through various mechanisms. In addition, when assessing the influence of the commensal microbiota mucolytic activity derived metabolites on the virulence profile of STEC, we found that the monosaccharides NAG and NANA had the ability to increase its virulent profile compared to the other 3 sugars evaluated, providing evidence about the host-microbiota-pathogen interaction in the incidence of HUS. On the other hand, we optimized the processing variables of a formulation of pasteurized and spray-dried hyperimmune bovine colostrum and determined the neutralizing capability of Stx2 activity in vitro and STEC pathogenicity in vivo as a potential preventive treatment for HUS. Fil: Garimano, Nicolás Ezequiel. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

La hormona liberadora de corticotropina (CRH) ejerce un rol central en la respuesta neuroendocrina y comportamental al estrés, dirigiendo la activación del eje hipotálamo- hipófisis-adrenal y actuando como neuromodulador en el sistema nervioso central. Su desregulación se relaciona con desórdenes psiquiátricos y con el inicio de procesos neurodegenerativos. Nuestro objetivo es definir las vías de señalización de CRH por el receptor CRHR1 y los componentes moleculares involucrados, con potencial relevancia terapéutica en desórdenes ligados a estrés. CRHR1 es un GPCR clase B que se encuentra generalmente acoplado a proteína Gs, por lo que su activación promueve el aumento intracelular del segundo mensajero AMP cíclico (AMPc) y la consecuente activación de diversas cascadas de señalización. Hasta el momento, la vía de las MAP quinasas (MAPKs) fue la más estudiada río abajo de este receptor. En trabajos previos hemos descripto que el CRHR1 activa mecanismos dependientes de proteína G y otros dependientes de la endocitosis, los cuales se evidencian en la activación bifásica de la MAPKs ERK1/2 en la línea celular hipocampal murina HT22 que expresa el receptor de CRH tipo 1 (HT22-CRHR1). Hemos demostrado además que existen dos fuentes de AMPc asociadas a la activación del CRHR1, que involucran no solo a las adenilil ciclasas transmembrana (tmACs) sino también a la adenilil ciclasa soluble (sAC). Ambas fuentes participan en la fase aguda de activación de ERK1/2 pero solo sAC es esencial para la activación sostenida de esta quinasa. Como se ha descripto recientemente para un grupo de GPCRs, el CRHR1 activado continúa señalizando luego de su internalización. Akt es una serin/treonin quinasa presente en la mayoría de los tejidos, cuya actividad media procesos celulares diversos como el crecimiento, la proliferación y el metabolismo. En el cerebro, la vía de Akt tiene implicancias en la respuesta a estrés, la neurotransmisión y la plasticidad sináptica. A su vez, se ha descripto que el efecto antidepresivo de numerosas drogas es mediado por la cascada de PI3K-Akt. En este trabajo nos propusimos evaluar si la vía de PI3K-Akt estaba involucrada en la señalización del sistema CRH/CRHR1 y si existía un crosstalk con la ya descripta cascada de MAPKs. En las HT22-CRHR1, Akt se fosforila en respuesta al estímulo de CRH y esta fosforilación es dependiente del pool de AMPc generado por la sAC. Sin embargo, esta activación no depende de los efectores clásicos de AMPc (PKA y EPACs) sino que parece estar mediada por la proteína quinasa Src. En base al estado de fosforilación de diversos sustratos pudimos determinar que el Akt fosforilado (pAkt) es funcional en estas células. El perfil de activación de Akt resultó ser opuesto al de ERK1/2 lo cual sugería una posible conexión entre estas vías. La inhibición farmacológica de MEK no tuvo efecto sobre la activación de Akt, mientras que inhibir tanto PI3K como Akt disminuyó los niveles de ERK1/2 fosforilado (pERK1/2) en respuesta a CRH. Por el contrario, la inhibición de la vía PI3K-Akt llevó a un aumento de la respuesta global de AMPc mediada por CRH y de CREB fosforilado (pCREB). Teniendo en cuenta que la activación de Akt solapa temporalmente con la segunda fase de activación de ERK1/2 que es dependiente de la endocitosis, evaluamos los niveles de pAkt en células en las que la internalización fue bloqueada. Determinamos que al igual que para ERK1/2, la endocitosis del CRHR1 es crucial para la fosforilación de Akt. Mediante el análisis de colocalizaciones entre el receptor y marcadores de distintos compartimentos de vesículas y organelas de membrana, exploramos la identidad de las estaciones por las que transita el CRHR1 luego de su internalización. CRHR1 activado se detecta en endosomas tempranos (Rab5+), de reciclado (Rab11+) y en un compartimento sintaxina-6 positivo. CRHR1 colocaliza además, con los efectores de Rab5 APPL1 y EEA1. En HT22-CRHR1 silenciadas establemente mediante el uso de shRNAs, la depleción de APPL1 disminuyó los niveles de pAkt sin afectar la fosforilación de ERK1/2 en respuesta a CRH, mientras que la pérdida de EEA1 tuvo el efecto contrario. Estos resultados indican que la vía de PI3K-Akt se activa río abajo del CRHR1 en un contexto neuronal y que existe un crosstalk entre Akt y ERK1/2. Por otra parte, el hecho de que la fosforilación de Akt sea dependiente de la internalización del receptor y de la proteína endosomal APPL1, refuerza la idea de que el CRHR1 activado señaliza desde compartimientos intracelulares. Corticotrophin releasing hormone (CRH) plays a key role in the regulation of neuroendocrine, autonomic, and behavioral response to stress. In the central nervous system it drives hypothalamic-pituitary-adrenal axis activation and can act as a neuromodulator. Dysregulation of the CRH/CRHR1 system is crucial in the pathogenesis of disorders like anxiety and depression. Our aim is to characterize signaling pathways downstream CRH-activated CRHR1 with potential therapeutic value in stress-related disorders. CRHR1 is a class B GPCR that signals mainly by Gs coupling, leading to an increase of cyclic AMP (cAMP) and the activation of multiple signaling cascades. Up to date the MAPKs pathway has been the most studied downstream of this receptor. We have previously described that CRHR1 activates G protein-dependent and receptor endocytosis-dependent mechanisms evidenced as a biphasic ERK1/2 activation in the mouse hippocampal cell line HT22 stably expressing CRHR1 (HT22-CRHR1). We have shown that upon stimulation, CRHR1 engages separate cAMP sources, involving the soluble adenylyl cyclase (sAC) in addition to transmembrane adenylyl cyclases. Both sources participate in the acute activation of ERK1/2, but only sAC activity is essential for the sustained phospho-ERK1/2 (pERK1/2) phase. Moreover, we demonstrated that CRHR1 continues to generate cAMP from endocytic compartments, uncovering a link between sAC and endosome based GPCR signaling. Akt is a central serine/threonine kinase expressed in almost all cell types throughout the body which regulates several cellular processes such as cell growth, proliferation, and metabolism. In the brain, Akt pathway has significant functional impact on stress responses, neurotransmission, and synaptic plasticity. PI3K-Akt signaling has also been implicated in the etiology of mood disorders as well as in the antidepressant-like effects of various psychiatric drugs. In this work we wanted to assess whether the PI3K-Akt pathway was involved in CRH/CRHR1 signaling and if there was a crosstalk with the MAPKs cascade. In HT22-CRHR1 cells, Akt was phosphorylated downstream activated CRHR1 in a cAMP-dependent manner. However, this activation did not rely on classic cAMP effectors (PKA and EPACs) but seems to be mediated by Src kinase. Phosphorylated Akt (pAkt) was active as evidenced by the phosphorylation state of substrates. pAkt profile was opposite to that of pERK1/2 which suggested a possible crosstalk between these pathways. Inhibition of MEK had no effect on Akt activation, whilst pharmacological inhibition of either PI3K or Akt diminished pERK1/2 levels in response to CRH. On the contrary, PI3K-Akt inhibition appeared to increase CRH-mediated cAMP response and CREB phosphorylation. Given that Akt activation temporally overlapped with the endocytosis-dependent phase of ERK1/2 activation, we evaluated pAkt levels in cells where internalization had been blocked and found that CRHR1 endocytosis is indeed required for Akt phosphorylation. Next, we wanted to determine the identity of the endocytic compartments to which CRHR1 transits after internalization. Colocalization analysis between the receptor and several endocytic compartment markers showed that activated CRHR1 transits to early (Rab5+) and recycling (Rab11+) endosomes, as well as to a syntaxin-6 positive compartment. CRHR1 also colocalized with two Rab5 effectors, APPL1 and EEA1. APPL1 silencing by shRNAs lead to a decrease in pAkt levels without affecting ERK1/2 activation, whereas EEA1 depletion had the opposite effect. These results indicate that PI3K-Akt pathway is activated downstream CRHR1 in a neuronal context and that there is a crosstalk between Akt and ERK1/2. Moreover, Akt phosphorylation dependent on receptor internalization and endosomal APPL1, reinforces the idea of CRHR1 signaling from endosomes. Fil: dos Santos Claro, Paula Ayelén. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

La mucopolisacaridosis tipo IIIB (MPS IIIB), o síndrome de Sanfilippo tipo B, es un trastorno de almacenamiento lisosomal autosómico recesivo causado por deficiencia en la actividad de la enzima lisosomal α-N-acetilglucosaminidasa (NAGLU), provocando la acumulación del glicosaminoglicano heparán sulfato (HS). Los pacientes que padecen esta enfermedad presentan principalmente alteraciones a nivel del sistema nervioso central, además de anomalías en otros órganos y tejidos. Actualmente, no existen terapias aprobadas para este trastorno, por lo que diferentes alternativas terapéuticas están siendo evaluadas. La terapia de reemplazo enzimático (TRE) permite la reducción de los sustratos acumulados en el lisosoma a través del suministro de proteínas recombinantes producidas en diferentes sistemas de expresión. La TRE ha sido aprobada para 11 enfermedades lisosomales, para las cuales se han utilizado sistemas de expresión como células de mamífero, plantas y animales. A la fecha, la enzima NAGLU recombinante solo ha sido producida de forma exitosa en células de ovario de hámster chino (CHO). Para el caso de microorganismos como las levaduras aún no se ha obtenido esta enzima recombinante de forma activa empleando este sistema de expresión. Sin embargo, este sistema de expresión ha sido ampliamente usado para la expresión de proteínas de origen humano para terapia, debido a que presenta ventajas como su fácil manipulación y bajo costo de producción, su capacidad de realizar modificaciones postraduccionales similares a la proteína nativa humana y la posibilidad de obtener la proteína de forma extracelular, lo cual favorece los procesos de purificación. En el presente estudio se evaluó la producción de la enzima NAGLU recombinante en la levadura metilotrófica Komagataella phaffii (Pichia pastoris) GS115 como sistema de expresión. La cepa fue transformada con el vector pPICZαA-NAGLU, el cual permite la expresión del gen NAGLU bajo el control del promotor AOX1. La presencia del inserto fue verificada por PCR en diez clones obtenidos en medio suplementado con zeocina. La expresión de la proteína recombinante fue inicialmente evaluada a escala de 10 mL, y aquellos clones que presentaron mayor actividad fueron usados para producir la proteína a escala de 100 mL, escala en la cual dos clones mostraron valores de actividad de 0,074 U/mL y 0,121 U/mL después de 72 horas de inducción. El clon con mejor actividad a 100 mL fue escalado a 400 mL mostrando una actividad de 0,187 U/mL a las 72 horas de cultivo. Finalmente, el extracto crudo fue clarificado a través de diferentes poros de membrana, concentrado y diafiltrado para ser purificado por medio de cromatografía de afinidad. Las fracciones recolectadas mostraron actividades entre 0,195 – 0,242 U/mL, y la presencia de la proteína fue verificada mediante SDS-PAGE y western-blot. Las fracciones fueron desalinizadas, concentradas y diafiltradas en citrato de sodio obteniendo una actividad específica de 0,438 U/mg. Posteriormente, la enzima recombinante NAGLU purificada se usó para realizar ensayos in-vitro empleando fibroblastos de pacientes MPS IIIB. Los resultados mostraron que la proteína fue capturada en un proceso mediado por receptores manosa y manosa-6-fosfato, permitiendo la reducción de la masa lisosomal. Estos resultados representan la primera evidencia de la posibilidad de emplear la levadura K. phaffii como sistema de expresión para la producción de NAGLU humana recombinante, como potencial herramienta para el estudio y continuo desarrollo de una TRE para pacientes con MPS IIIB. Mucopolysaccharidosis type IIIB (MPS IIIB), or Sanfilippo syndrome type B, is an autosomal recessive lysosomal storage disorder caused by a deficiency in the activity of the lysosomal enzyme α-N-acetylglucosaminidase (NAGLU), causing the accumulation of glycosaminoglycan heparan sulfate. (HS). Patients with this disease mainly present alterations in the central nervous system, in addition to abnormalities in other organs and tissues. Currently, there are no approved therapies for this disorder, so different therapeutic alternatives are being evaluated. Enzyme replacement therapy (ERT) allows the reduction of accumulated substrates in the lysosome through the delivery of recombinant proteins produced in different expression systems. ERT has been approved for 11 lysosomal diseases, for which expression systems such as mammalian cells, plants and animals have been used. To date, the recombinant NAGLU enzyme has only been successfully produced in Chinese hamster ovary (CHO) cells. In the case of microorganisms such as yeast, this recombinant enzyme has not yet been actively obtained using this expression system. However, this expression system has been widely used for the expression of proteins of human origin for therapy, due to the fact that it has advantages such as its easy manipulation and low production cost, its ability to carry out post-translational modifications similar to the native human protein and the possibility of obtaining the protein extracellularly, which favors purification processes. In the present study, the production of the recombinant NAGLU enzyme was evaluated in the methylotrophic yeast Komagataella phaffii (Pichia pastoris) GS115 as an expression system. The strain was transformed with the vector pPICZαA-NAGLU, which allows the expression of the NAGLU gene under the control of the AOX1 promoter. The presence of the insert was verified by PCR in ten clones obtained in medium supplemented with zeocin. The expression of the recombinant protein was initially evaluated at a 10 mL scale, and those clones that presented higher activity were used to produce the protein at a 100 mL scale, a scale in which two clones showed activity values ​​of 0.074 U / mL and 0.121 U / mL after 72 hours of induction. The clone with the best activity at 100 mL was scaled to 400 mL showing an activity of 0.187 U / mL at 72 hours of culture. Finally, the crude extract was clarified through different membrane pores, concentrated and diafiltered to be purified by means of affinity chromatography. The collected fractions showed activities between 0.195 - 0.242 U / mL, and the presence of the protein was verified by SDS-PAGE and western-blot. The fractions were desalted, concentrated and diafiltered in sodium citrate obtaining a specific activity of 0.438 U / mg. Subsequently, the purified recombinant enzyme NAGLU was used for in-vitro assays using fibroblasts from MPS IIIB patients. The results showed that the protein was captured in a process mediated by mannose and mannose-6-phosphate receptors, allowing the reduction of the lysosomal mass. These results represent the first evidence of the possibility of using the yeast K. phaffii as an expression system for the production of recombinant human NAGLU, as a potential tool for the study and continuous development of an ERT for patients with MPS IIIB. Magíster en Ciencias Biológicas Maestría https://scholar.google.com/citations?view_op=list_works&hl=es&user=0CyKr24AAAAJ&gmla=AJsN-F5LiSvdzJrKtp8FT_7I-wZKXL7f941lL-kMTPbLcWvJKmRwRG9Uc1PozdpElSjbAvfr6IuqVciTs91hk95G50yGDXaNrbDG4OMcjR7xEGI-qjK5iYpvyLiIDJRStscx0iXVvUWvRI2NobP4mSU2bVLwEmcnzA

EI IRP (por Immediately Releasable Pool), es un grupo de vesículas secretorias cuya exocitosis está altamente acoplada al estímulo debido a su estrecha asociación con canales de Ca²+ voltaje dependientes (CCVD). Sabemos por resultados previos, que entre un 40 y un 50% de IRP es exocitado por la aplicación de un potencial de acción (PAs), y que dicha exocitosis es seguida por una endocitosis rápida dinamina-dependiente totalmente compensatoria, ligada a un proceso rápido de recuperación de este pool vesicular. Por otro lado, la exocitosis completa de IRP (inducida por un pulso cuadrado de voltaje de 50 ms), es seguida también por un proceso endocítico que solamente compensa un 50% de la exocitosis previa, pero no sabemos nada acerca del mecanismo subyacente. En una primera parte de este trabajo de tesis nos propusimos estudiar la participación de la GTPasa dinamina en la endocitosis, al liberar gradualmente IRP en células cromafines murinas. Para ello, estimulamos con un protocolo compuesto por pulsos despolarizantes de duración creciente: PAS (5 ms) y pulsos cuadrados (SQPS) de 5, 10, 25, y 50 ms (SQP5-50ms). Nuestros resultados mostraron que si bien la dinamina es esencial en la endocitosis evocada por PAs, a medida que la fracción exocitada aumenta, este proceso se vuelve insensible a diferentes inhibidores de la actividad de esta proteína. Esto indica que al liberar completamente IRP se activa un proceso endocítico dinamina-independiente. Observamos, además, que la velocidad de esta endocitosis independiente de dinamina se correlaciona con la entrada de Ca²+, estimada como la integral debajo de la curva de corriente de Ca2+. Por otro lado, la aplicación de distintos inhibidores de la proteína quinasa C (PKC) disminuyeron la magnitud y la velocidad de la endocitosis dinamina-independiente, y el tratamiento con PMA (un activador de PKC) aumentó significativamente la amplitud de este proceso endocítico. Por lo tanto concluimos que dicha endocitosis dinamina-independiente es un proceso Ca2+ dependiente regulado por PKC. En la segunda parte de la Tesis, evaluamos el efecto de dos mutaciones de la dinamina-2, A618T y S619L, relacionadas con el desarrollo de la miopatía centronuclear, cuyos efectos sobre la exocitosis y endocitosis en células cromafines son desconocidos. La expresión de estas mutantes no modificó la exocitosis de IRP para ninguno de los estímulos evaluados. Sin embargo, inhibió significativamente a la endocitosis evocada por PAs, sin afectar a aquella provocada por SQP50ms, lo cual es coherente con la predominancia de la endocitosis dinamino-dependiente en el primer tipo de estímulo. Finalmente, estímulos más potentes, que exocitan cantidades de vesículas marcadamente mayores que IRP, promueven una endocitosis lenta identificada previamente por otros autores como un mecanismo clatrina dependiente, que es a su vez dependiente de dinamina. Coherentemente, este proceso resultó muy sensible a ambas mutantes. Por otro lado, la exocitosis de cantidades grandes de vesículas, inducida por pulsos despolarizantes prolongados o la aplicación del agonista nicotínico DMPP por 10 s, resultó inhibida significativamente en presencia de A618T y S619L. Este resultado, sumado a la falta de efecto que se observó previamente para estímulos de corta duración, sugiere que estas mutantes podrían estar alterando la provisión de vesículas a la membrana. De hecho, al analizar la distribución de vesículas secretorias por medio de microscopía confocal, observamos que la recuperación de las vesículas en las proximidades de la membrana plasmática, luego de un estímulo que induce exocitosis, se vio afectada negativamente en presencia de A618T y S619L. Llamativamente, se observó una marcada disminución en la formación de novo de F-actina cortical en células expresando las mutaciones, pero no en la condición control. Es esperable que esta disrupción en la formación de F-actina cortical tenga un efecto directo en el tráfico de vesículas a la membrana y, por lo tanto, en la recuperación de la población vesicular liberable y en la exocitosis inducida por estímulos potentes. Por otro lado, está demostrado que la F-actina participa en prácticamente todos los mecanismos de endocitosis conocidos. Por lo tanto, la alteración de la dinámica del citoesqueleto de F-actina cortical puede ser un denominador común a todos los efectos causados por A618T y S619L. Sin embargo, el mecanismo por el cual A618T y S619L producen este efecto sobre la F-actina, aun es una interrogante que queda por ser elucidada. IRP (for Immediately Releasable Pool), is group of secretory vesicles whose exocytosis is highly coupled to stimuli due to its tight association to voltage-dependent calcium channels (VDCC). Previous results from our lab showed that between 40 and 50% of IRP is exocyted by the application of an action potential-like stimuli (PAs), and that exocytosis is followed by a fast dynamin-dependent fully compensatory endocytosis, linked to a fast replenishment process of this vesicular pool. On the other hand, the complete exocytosis of IRP (induced by a 50 ms voltage squared pulse), is also followed by an endocytotic process that compensates only 50% of the previous exocytosis, however we do not know anything about its underlying mechanism. In the first part of this Thesis work we set to study the involvement of dynamin GTPase in the endocytosis evoked, when IRP was gradually depleted, in mouse chromaffin cells. For this, we applied a stimulation protocol compound by depolarizing pulses of crescent duration: PAs (5 ms) and squared pulses (SQPs) of 5, 10, 25 and 50 ms (SQP5-50ms). Our results showed that although dynamin is essential in the endocytosis evoked by PAs, as the exocyted fraction increases, the endocytotic process becomes insensitive to the application of different inhibitors of the activity of this GTPase. This indicates that, the fully release of IRP, activates a dynamin-independent endocytotic process. We also observed that the rate of this dynamin-independent endocytosis correlates with the influx of Ca²+, estimated as the integral of the values below the calcium currents curves. On the other hand, the application of different inhibitors of the protein kinase C (PKC). diminished the magnitude and rate of the dynamin-independent endocytosis, and the treatment with PMA (a PKC activator), significantly increased the amplitude of this endocytotic process. We therefore conclude that this dynamin-independent endocytosis is a Ca²+ dependent process, which is regulated by PKC. In the second part of this Thesis work, we evaluated the effect of two dynamin-2 mutations. A618T y S619L, related with the development of the centronuclear myopathy disease, whose effects over the exocytosis and endocytosis in chromaffin cells are unknown. The expression of these mutations did not modify the IRP exocytosis, for any of the stimuli applied. However, A618T and S619L significantly inhibited the evoked by PAs, but no for SQP50ms, which is coherent with the predominance of the dynamin-dependent endocytosis associated with the first stimulus. Finally, more potent stimuli, which exocyte larger amounts of vesicles than IRP, promote a slow endocytosis, previously identified by other authors as a clathrin-dependent mechanism, which is also dynamin-dependent. Coherently, this process resulted to be very sensitive to the expression of both mutations. On the other hand, the exocytosis of large amounts of vesicles, induced by prolonged depolarizing pulses or by the application of the nicotinic agonist DMPP for 10 s, was significantly inhibited in the presence of A618T and S619L. This result, in addition to the lack of effect observed previously when short stimuli duration was applied. suggest that this mutations could be altering the provision of vesicles to the plasma membrane. In fact, when we analyzed the distribution of secretory vesicles by confocal microscopy, we observed that the recovery of vesicles located nearby the plasma membrane, after a stimulation that induced exocytosis, was negatively affected in presence of A618T and S619L. Strikingly, a marked decrease in the novo formation of cortical F-actin was observed in cells expressing these mutations, but not in control cells. It is expected that this disruption, in the formation of cortical F actin, has a direct effect on vesicle trafficking to the plasma membrane and, therefore, in the recovery of the releasable vesicle population and exocytosis, induced by potent stimulation. On the other hand, it has been demonstrated that F-actin participates in practically all known endocytotic mechanisms. Therefore, the alteration of the cortical actin cytoskeleton dynamics could be a common denominator for all of the effects caused by A618T and $619L. However, the underlying mechanism by which A618T and S619L produced this effect over F-actin is a question that remains to be elucidated. Fil: Bayonés, Lucas. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

El pool de vesículas inmediatamente liberables (IRP) es un pool vesicular que se libera frente a pulsos despolarizantes de corta duración debido a su proximidad a los canales de Ca2+. [fórmula aproximada, revisar la misma en el original]. En esta tesis estudiamos los mecanismos asociados a la recuperación del IRP luego de que este es deprimido por exocitosis en células cromafines adrenales. Nuestros resultados muestran que la recuperación del IRP presenta dos componentes cinéticos, con constantes temporales de ~1 s y ~10 s respectivamente. Mientras que el aumento del Ca2+ citosólico basal hace desaparecer el componente rápido y acelera al lento, la disminución del Ca+2 basal (por agregado de concentraciones crecientes de BAPTA) genera el efecto inverso, acelerando el componente rápido y anulando al lento. La presencia y velocidad del componente rápido a su vez se correlacionó con un proceso de endocitosis rápida, tanto cuando se modificó el Ca2+ citosólico basal, como cuando se afectó directa-mente la endocitosis con un anticuerpo anti-dinamina. Dado que observamos que la disminución en la concentración del Ca2+ citosólico basal se asociaba a un aumento de la densidad de la actina-F cortical, postulamos que dicha proteína podría estar involucrada en los cambios observados en la endocitosis y la recuperación de IRP con el Ca2+. El pretratamiento de nuestras células con el despolimerizante de actina citochalasyn-D logró revertir los aumentos observados en las velocidades de endocitosis y recuperación alcanzadas a alta concentración (4 mM) de BAPTA. A partir de los resultados descriptos arriba postulamos que a bajas concentraciones basales de Ca2+ la actina-F cortical se encuentra altamente agregada, favoreciendo la endocitosis rápida, que sería la primera etapa de un proceso rápido de recuperación de IRP. Esto es coherente con las observaciones de otros autores (ver Introducción) respecto a que los niveles bajos de Ca2+ citosólico y la actina-F cortical promueven un proceso de kiss-and-run. Dichos resultados apoyan la idea de que la remodelación de la actina-F cortical en forma Ca2+ dependiente es un elemento importante en la regulación de las características del ciclado de vesículas densas secretorias. The immediately releasable pool (IRP) is composed of ready releasable vesicles sensitive to short depolarizations because of their proximity to voltage-dependent calcium channels. In this thesis we studied the mechanisms involved in IRP recovery after depletion in adrenal chromaffin cells. Our results showed that IRP recovery presents two kinetic components, with time constans of ~1 s y ~10 s respectively. While high cytosolic Ca2+ concentrations abolished the rapid component and accelerated the slower one, low Ca2+ (attained by addition of increasing concentrations of intracellular BAPTA) provoked the opposite effect, inhibiting the slow component and accelerating the rapid one. There was also a positive correlation between the rapid component of recovery with a fast endocytosis process. This correlation was observed when the cytosolic Ca2+ was modified or when endocytosis was inhibited with an anti-dynamin antibody. Finnally, we found that the decrease in cytosolic Ca2+ concentration is associated with cortical F-actin aggregation, and postulated that this effect can explain in part the changes observed in endocytosis and IRP recovery. In fact, the effects produced by high cytosolic (4 mM) BAPTA concentration on endocytosis and IRP recovery kinetics were reverted by application of cytochalasin-D, an actin-F depolymerizing drug. We propose that the elevated aggregation of cortical F-actin at low basal cytosolic Ca2+ concentrations facilitates fast endocytosis, which would be the first stage of a rapid mechanism of IRP recovery. These results support the idea that the remodeling of cortical F-actin in a Ca2+ dependent manner would be an important element in the regulation of the dynamics of dense secretory vesicles cycling. Fil: Montenegro, Mauricio Norman. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Tesis (Doctor en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2020 La endocitosis es un proceso crucial para todas las células ya que les permite incorporar material desde el espacio extracelular y controlar la disponibilidad de proteínas transmembrana en la membrana plasmática (MP). Después de ser internalizadas por endocitosis las proteínas cargo se transportan a los endosomas y luego a los lisosomas/vacuolas donde son degradadas o pueden ser recicladas de nuevo a la MP siguiendo la vía de transporte retrógrado desde los endosomas al aparato de Golgi, donde son incorporadas nuevamente a la vía secretora. En la levadura, la endocitosis seguida de reciclado a la MP resulta en una distribución polarizada de las proteínas , que se concentran en la membrana de la célula hija. De acuerdo al modelo canónico, la selección de proteínas transmembrana para ser internalizadas por endocitosis mediada por vesículas cubiertas de clatrina involucra la presencia de señales en los dominios citoplásmicos de las proteínas cargo. Estas señales son reconocidas por distintos receptores o adaptadores que forman parte de la cubierta proteica y es mediante esta interacción que las proteínas cargo transmembrana son concentradas en los sitios de la MP donde inicia la endocitosis. En este trabajo de tesis hemos estudiado la influencia de la geometría del dominio transmembrana (TMD) en la endocitosis de proteínas con solo un paso transmembrana. Utilizando TMDs quiméricos mostramos que la geometría del TMD actúa como un determinante de transporte a nivel de la MP. Particularmente, demostramos que un TMD largo con una mitad exoplásmica conformada por aminoácidos voluminosos resulta en una señal de polaridad y endocitosis en Saccharomyces cerevisiae. Una búsqueda bioinformática en el proteoma de este organismo modelo identificó varias proteínas con un hemi- MD exoplásmico largo y voluminoso, lo que nos permitió validar nuestros resultados utilizando TMDs endógenos de levadura. Por otro lado, también demostramos que un hemi- TMD exoplásmico largo y voluminoso es funcional como señal de endocitosis en células de mamífero en cultivo. Además, realizamos diferentes análisis para comprender cómo proteínas con un hemi-TMD exoplásmico largo y voluminoso resultan endocitadas. Encontramos que la internalización de las mismas es afectada de forma indirecta por la ubiquitin ligasa Rsp5. Por otro lado, mostramos que la geometría de los TMD s determina la partición de los mismos a diferentes dominios lipídicos in vivo. La identificación de este novedoso determinante de endocitosis dado por la geometría del TMD muestra una nueva forma mediante la cual las proteínas cargo pueden ser reconocidas e incluidas en la vía endocítica. Esta forma se basa en un principio fundamental diferente de las señales endocíticas previamente conocidas y, por lo tanto, agrega nuevas perspectivas sobre el mecanismo de endocitosis. 2023-06-01 Bigliani, Gonzalo. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina. Valdez Taubas, Javier. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Química Biológica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; Argentina. Touz, María Carolina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Investigación Médica Mercedes y Martín Ferreyra; Argentina. Alvarez, Cecilia Inés. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Bioquímica Clínica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; Argentina. Ambroggio, Ernesto Esteban. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; Argentina. Aguilar, Pablo S. Universidad de Buenos Aires. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias; Argentina.

La glicoproteína de membrana M6a se encuentra asociada a enfermedades neuropsiquiátricas como la depresión, la esquizofrenia y fallas en el aprendizaje. Se ha descripto que contribuye positivamente en la extensión de neuritas, el crecimiento axonal la formación de filopodios/espinas y el mantenimiento de las sinapsis. M6a posee cuatro pasos de transmembrana, dos bucles extracelulares, uno mayor (EC2) y uno menor (EC1) y los extremos citoplasmáticos hacia el interior celular. Dos cisteínas presentes en su EC2, que forman un puente disulfuro, mostraron ser esenciales para el reconocimiento antigénico del anti-M6a-mAb. Este anticuerpo fue descripto como neutralizante porque ha sido capaz de bloquear la extensión de neuritas mediada por M6a. Por otro lado, se ha determinado, por coinmunoprecipitación, que M6a interactúa directa o indirectamente con clatrina. Sin embargo, el mecanismo preciso por el cuál M6a se internaliza y se recicla aún no ha sido dilucidado. En este trabajo, utilizando ensayos in vitro controlados estudiamos la inmunointernalización de M6a mediada por el anti-M6a-mAb. Observamos que luego de una hora de tratamiento parte de M6a se endocita y disminuyen significativamente el número de sinapsis en neuronas de hipocampo. Cuando los niveles de M6a en la superficie celular se reestablecen, observamos que el número de sinapsis recobra sus valores normales. La internalización de M6a involucra a endosomas tempranos revestidos de clatrina. Probablemente ésta ocurra por la asociación entre la proteína adaptadora 2 y el “motivo basado en tirosina” 251YEDI254 ubicado en el extremo C-terminal de M6a. Luego de su endocitosis, M6a es dirigida hacia endosomas tempranos característicos, Rab5- y EEA1-positivos. Posteriormente es dirigida o bien hacia la membrana a través de endosomas Rab11 positivos o bien hacia la vía degradativa mediada por endosomas Rab7 y LAMP-1 positivos. Nuestros resultados muestran que los niveles de M6a en la superficie celular neuronal modifican la formación y mantenimiento de las sinapsis, sin alterar los niveles de proteicos de las proteínas sinápticas estudiadas (sinaptofisina y el receptor de alta afinidad por glutamato, N-metil-D-aspartato receptor tipo 1). Este mecanismo novedoso podría ser relevante durante el desarrollo neuronal, el podado sináptico y/o podría estar involucrado en diversos desórdenes neurológicos en donde la sinapsis se encuentra comprometida. The neuronal glycoprotein M6a has been associated with psychiatric disorders such as, depression, learning disabilities and schizophrenia. In cultured neurons, M6a positively contributes to neurite extension, axon guidance, filopodia/spine outgrowth, and synapse formation. The endocytic processes of neuronal membrane proteins are linked to the differentiation, growth, signalling and plasticity of neurons. However, the roles of M6a and the precise mechanisms through which M6a internalizes and recycles back to the neuronal membrane are unknown. Here, by using a controlled in vitro assay, we showed whether M6a is endocytosed, the number of synapses in hippocampal neurons decreases. When re-establishing the levels of M6a at the cell surface, the number of synapses returned to its normal values. M6a internalization involves clathrin-coated pits, probably by the association between the adaptor protein 2 and the 251YEDI254 “tyrosinebased” motif located within the C-tail of M6a. Upon endocytosis, M6a is sorted to early endosome antigen 1- and Rab5-positive endosomes and, then sorted back to the cell surface via Rab11-positive endosomes or to degradation via Rab7 and, finally LAMP-1- positive endosomes. Our results demonstrated that the levels of M6a at the cell surface modified the formation/maintenance of synapses, without altering the protein levels of synaptophysin or N-methyl-D-aspartate receptor type-1. This novel mechanism might be relevant during neuronal development, pruning and/or many of the mental disorders in which the number of synapses is affected. Fil: Garcia, Micaela Daiana. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas. Universidad Nacional de San Martín. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas; Argentina

The exocytosis of hormone-filled vesicles in adrenal chromaffin cells is triggered by localized Ca²⁺ gradients that develops after the activation of voltage-dependent Ca²⁺ channels. To reach the fusion competent state the vesicles go through a variety of maturation steps, including the mobilization through the cytoskeleton, the docking to membrane, and the priming of the exocytotic molecular machinery. However, the fusion readiness of vesicles will also depend on their proximity to the Ca²⁺ source. The immediately releasable pool is a small group of ready–to-fuse vesicles, whose fusion is tightly coupled to Ca²⁺ entry through channels. Recent work indicates that such a coupling is not produced by a random distribution between parts, but is the result of a specific interaction of secretory vesicles with P/Q-type Ca²⁺ channels. The immediately releasable pool is able to sustain with high efficiency the secretion triggered by brief depolarizations applied at low frequencies, like action potentials at basal conditions in adrenal chromaffin cells., La exocitosis de las vesículas secretorias en células cromafines adrenales es disparada por gradientes de Ca²⁺ localizados que se desarrollan a partir de la activación de canales de Ca²⁺ voltaje dependiente. Para poder fusionarse a la membrana, las vesículas deben pasar primero por una serie de etapas madurativas que incluyen el transporte por el citoesqueleto, el anclado a la membrana y el priming de la maquinaria exocítica. Sin embargo, la eficiencia con que la vesícula se fusiona depende también de su proximidad con la fuente de Ca²⁺ calcio. El pool inmediatamente liberable es un pequeño grupo de vesículas maduras cuya fusión está altamente acoplada a la entrada de Ca²⁺ por canales. Trabajos recientes indican que este acople no se explica por una distribución aleatoria entre las partes, sino a través de una interacción específica de la vesículas secretorias con los canales de Ca²⁺ de tipo P/Q. El pool inmediatamente liberable es capaz de sostener con alta eficiencia la secreción inducida por despolarizaciones cortas aplicadas a bajas frecuencias, tal como el disparo de potenciales de acción en condiciones basales en células cromafines., Sociedad Argentina de Fisiología

[ES] El sistema endocannabinoide (eCB) y el sistema esfingosina-1-fosfato (S1P) son sistemas de señalización implicados en multitud de procesos fisiológicos y patológicos. Concretamente en el cerebro ambos sistemas regulan la actividad neuronal. Dada la similitud de ambos sistemas a varios niveles se ha postulado que estos interaccionan de alguna forma. En este trabajo se presentan las evidencias existentes hasta la fecha de que existe dicha interacción entre sistemas en el cerebro murino. Adicionalmente, realizamos estudios de competición de radioligandos del receptor de endocannabinoides CB1 contra ligandos sin marcar del subtipo de receptor de esfingosina-1-fosfato S1P1 (tanto en homogeneizados como en cortes de cerebro). Nuestros resultados concuerdan con aquellos publicados hasta la fecha, y apoyan la hipótesis de una interacción entre los sistemas al menos a nivel de ligando.

Resumen El síndrome urémico hemolítico (SUH) está definido por la tríada de anemia hemolítica microangiopática, trombocitopenia e insuficiencia renal aguda. En Argentina constituye la primera causa de insuficiencia renal aguda en pediatría. Aproximadamente, del 2% al 4% de los pacientes mueren durante la fase aguda de la enfermedad, y solo un tercio del 96% restante que sobrevive lo hace con secuelas renales, como la persistencia de la proteinuria. Un individuo adulto sano filtra alrededor de 5000 mg/día de proteínas, si bien la excreción en orina es escasa (150 mg/día). La escasa cantidad de proteínas excretadas indica la presencia de un mecanismo de reabsorción a nivel del túbulo proximal. Por lo tanto, la reabsorción tubular renal desempeña un papel muy importante ya que, ante una función glomerular normal, es el principal mecanismo encargado de evitar la depleción proteica corporal. Desde hace aproximadamente 30 años se sabe que la albúmina es reabsorbida en el túbulo proximal. La reabsorción proteica se produce por un mecanismo de endocitosis mediada por el receptor dependiente de clatrina y por endocitosis de fase líquida. Clásicamente se ha descrito que el mecanismo básico del daño renal en el SUH típico y en el atípico es una microangiopatía trombótica, pero de diferentes causas. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que la fisiopatología de esta enfermedad es más compleja de lo que se creía, ya que la alteración tubular que surge va a evolucionar en fallas en el mecanismo de endocitosis de proteínas que se suman a las eliminadas por las alteraciones a nivel de la barrera de filtración glomerular. Abstract Hemolytic uremic syndrome (HUS) is defined by the triad of hemolytic anemia microangiopathic, thrombocytopenia and acute renal failure. In Argentina it constitutes the first cause of acute renal failure in Pediatrics. Approximately 2-4% of patients die during the acute phase of the disease, and only a third of the remaining 96% survive with renal sequelae, such as the persistence of proteinuria. A healthy adult filters around 5000 mg/day of proteins, with an excretion in urine of 150 mg/day. The little quantity of proteins excreted indicates the presence of a reabsorption mechanism at the level of the proximal tubule. Therefore, the tubular reabsorption plays a very important role since it is the main mechanism responsible for preventing the depletion of protein. For approximately 30 years, it has been known that albumin is reabsorbed in the proximal tubule. Protein reabsorption occurs by a clathrin-dependent receptor mediated endocytosis mechanism and by fluid phase endocytosis. The basic mechanism of renal damage in typical and atypical HUS has been described as a thrombotic microangiopathy, but of different causes. However, the pathophysiology of this disease is more complex than what was believed since the emerging tubular alteration will ewvolve into failures of the protein endocytosis mechanism that are added to the alterations at the level of the glomerular filtration barrier.

Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2017 Resumen: La sialidasa asociada a membranas Neu3 está involucrada en el catabolismo de glicoconjugados, especialmente de gangliósidos, e interviene en numerosos procesos biológicos tales como diferenciación, proliferación, migración y adhesión celular, regulando principalmente vías de transducción de señales. Dado que el mecanismo de asociación de Neu3 con membranas biológicas no se conoce, uno de los objetivos de este trabajo fue proveer más información sobre ese aspecto. Se encontró que Neu3 localiza principalmente en membrana plasmática, y también en endomembranas de compartimientos endosomales. Utilizando diferentes metodologías se demostró que el extremo C-terminal de la proteína está expuesto hacia el lado citosólico, y que otra porción de Neu3 está expuesta hacia el espacio extracelular, sugiriendo que la sialidasa posee las características de una proteína transmembrana. Sin embargo, análisis in silico y modelado molecular predijeron que la sialidasa no contiene segmentos α-hélices transmembrana en su secuencia, y que comparte la estructura de β-propeller, típica de las sialidasas virales y bacterianas. En la búsqueda de modificaciones post-traduccionales de Neu3, se encontró que la misma está S-acilada, y dado que la S-acilación está restringida al lado citosólico de las membranas, este descubrimiento apoya la idea de que la sialidasa contiene un dominio expuesto al citosol. Aunque aún queda por determinar exactamente cómo esta enzima atraviesa la bicapa lipídica, la primera parte de este estudio provee una nueva visión sobre la topología de Neu3 y se discuten algunas posibles configuraciones. Por otro lado, se estudiaron aspectos funcionales de la enzima no descriptos con anterioridad, como ser su participación en eventos endocíticos. Se observó que células que sobreexpresan Neu3 endocitan menos transferrina (Tf), un típico ejemplo de molécula que ingresa a la célula por endocitosis mediada por clatrina (CME). Dicha disminución en la endocitosis de Tf se observó también en células con reducido nivel de expresión de glicoesfingolípidos, sugiriendo que el efecto observado es independiente de la acción de Neu3 sobre gangliósidos. La disminución en la internalización de Tf, como así también de otras moléculas que ingresan por CME, pudo ser explicada debido a una distribución subcelular alterada del adaptador de clatrina AP-2, el cual se observó formando agregados en células que sobreexpresan Neu3. Por el contrario, clatrina, el fosfoinosítido PIP2 y caveolina mostraron una distribución normal. En conjunto estos resultados sugieren un rol específico de Neu3 en CME. Abstract: Membrane-bound sialidase Neu3 is involved in the catabolism of glycoconjugates, especially gangliosides, and plays crucial roles in numerous biological processes, such as differentiation, proliferation, migration and cell adhesion, regulating transmembrane signaling. Since the mechanism of its association with membranes is still not completely understood, the aim of this work was to provide further information regarding this aspect. Human Neu3 was found to be associated with the plasma membrane and endomembranes from endosomal compartments, and it was not released from the lipid bilayer under conditions that typically release peripheral membrane proteins. By different experimental approaches, it was demonstrated that its C-terminus is exposed to the cytosol while another portion of the protein is exposed to the extracellular space, suggesting that Neu3 possesses the features of a transmembrane protein. However, in silico analysis and homology modeling predicted that the sialidase does not contain any α-helical transmembrane segment and shares the same β-propeller fold typical of viral and bacterial sialidases. Additionally, it was found that Neu3 is S-acylated, and since this post-translational modification is restricted to the cytosolic side of membranes, this finding strongly supports the idea that Neu3 may contain a cytosolic-exposed domain. Although it remains to be determined exactly how this sialidase crosses the lipid bilayer, the first part of this study provides new insights about membrane association and topology of Neu3. On the other hand, some previously unknown functional aspects of the enzyme, such as its involvement in endocytic events, were studied in this work. The ectopic expression of Neu3 led to a drastic decrease in the internalization of transferrin (Tf), the archetypical cargo for clathrin-mediated endocytosis (CME). This reduction was still observed in cells with reduced expression of glycosphingolipids, suggesting that the observed effect is independent of Neu3 activity toward gangliosides. This decrease in the internalization of Tf and also of other molecules entering by CME could be explained by an altered subcellular distribution of the clathrin adaptor AP-2, which was observed to be aggregated in cells overexpressing Neu3. In contrast, clathrin, the phosphoinositide PIP2 and caveolin showed a normal distribution. Together these results suggest a specific and novel role of Neu3 in CME. Fil: Rodríguez Walker, Macarena. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina Fil: Daniotti, José Luis. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Química Biológica; Argentina. Fil: Genti de Raimondi, Susana Del Valle. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Bioquímica Clínica; Argentina. Fil: Genti de Raimondi, Susana del Valle. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; Argentina. Fil: Alvarez, María Elena. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Química Biológica; Argentina. Fil: Alvarez, María Elena. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; Argentina. Fil: Touz, María Carolina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Investigación Médica Mercedes y Martín Ferreyra; Argentina. Fil: González-Baró, María del Rosario. Universidad Nacional de La Plata; Argentina. Fil: González-Baró, María del Rosario. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de La Plata "Prof. Dr. Rodolfo R. Brenner"; Argentina.

Single point mutations or variations in the expression of the gene encoding theneuronal glycoprotein M6a have been associated with psychiatric disorders such as Alzheimer, depression and schizophrenia. In cultured neurons, M6a positivelycontributes to neurite extension, axon guidance, filopodia/spines outgrowth andsynapses formation. Endocytic processes of the neuronal membrane proteins arelinked to differentiation, growth, signalling and neuronal plasticity. However, the precise mechanism in which M6a internalize and recycle back to the neuronal membrane and its roles are unknown. Here we show, by using controlled in vitro assay, that if 40 % of M6a is endocytosed drastically decreased the number of synapses in hippocampal neurons at 15 days in culture. By re-establishing the levels of M6a at cell surface, up to more than 80 %, the number of synapses returned to its normal values. Furthermore, M6a internalization involves cathrin-coated pits probably by the association between the adaptor protein 2, AP-2, with the 251YEDI254 ?tyrosine based? motif located within M6a C-tail. Upon endocytosis, M6a sorted to EEA1 and Rab5 positive endosomes and afterwards can be sorted back to cell surface via Rab11 positive endosomes or conducted to degradation via Rab7 and finally LAMP-1 positive endosomes. Our results demonstrated that the levels of M6a at the cell surface modified the formation/maintenance of the synapses without altering the protein levels ofsynaptophysin and N-methyl-D-aspartate receptor type-1 (NMDA-R1). This novelmechanism might be relevant during the neuronal development, pruning and/or in many mental disorders in which the number of synapses are affected Fil: García, Micaela Diana. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas ; Argentina Fil: Formoso, Karina. Universidad Catolica Argentina; Argentina Fil: Aparicio, Gabriela Inés. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas ; Argentina Fil: Frasch, Alberto Carlos C.. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas ; Argentina Fil: Scorticati, Camila. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas ; Argentina

Tesis doctoral, 192 páginas, figuras y tablas, [EN] Lafora progressive myoclonic epilepsy (LD) is a rare disease characterized by neurodegeneration, epilepsy and theaccumulation of polyglucosans in different tissues, known as Lafora bodies. At the moment, there is a limited knowledge on the molecular bases of the disease and there is no available treatment, which leads to the death of patients within 10 years after the onset of the first symptoms. Until now, mutations in two genes that could explain the basis of the disease in 92% of the cases: EPM2A, encoding phosphatase dual laforin, and EPM2B, encoding malin, an E3-ubiquitin ligase. Both proteins interact forming a complex able to ubiquitinate different substrates. Recently, the involvement of the complex in several pathways has been demonstrated. However, there has been little advance in the understanding of the molecular bases underlying one of the most important features of the disease: epilepsy. For this reason, the aim of this thesis was to attempt to understand this process. The most part of the studies analyzing the epilepsy in LD focused on the analysis of the neural systems. However, recent studies suggest that an impairment of the astrocytes due to existing neuroinflamation could contribute to the triggering and/or the development of epilepsy and other neurological diseases. For this reason, our efforts have been focused on the study of the main excitatory neurotransmitter homeostasis, glutamate, in cellular and animal models of LD., The mentioned homeostasis depends on the correct functioning of the astrocytic cells and their deregulation contributes significantly to an increase in neural hyperexcitability and death. In this work, an alteration of the main astrocytic glutamate transporter, GLT-1, has been identified. This transporter is responsible of 90% of extracellular glutamate uptake. Therefore, a decrease in the activity of GLT-1 leads to an increase in synaptic glutamate, contributing to the hyperexcitability. Primary astrocytes from cortex of mice deficient in Epm2a or Epm2b genes, models of LD, show a decrease in the amount of GLT-1 located at the cell surface, which is correlated to a lower capacity of these cells to take glutamate up. This change in the subcellular localization is regulated by changes in the ubiquitination of the transporter, which is increased in the presence of overexpressed laforin-malin complex. Finally, we demonstrated that mouse models for LD present a reduced capacity to uptake glutamate compared to the control group, using in vivo microdialysis. Hence this thesis presents evidences of a deregulation in the homeostasis of the glutamate transporter GLT-1 in animals and cells models for LD and suggests that this alteration could contribute to epilepsy in LD., [ES] La epilepsia mioclónica progresiva de tipo Lafora (LD) es una enfermedad rara caracterizada por neurodegeneración, epilepsia y acumulación de poliglucosanos en diferentes tejidos, denominados cuerpos de Lafora. Por el momento, existe un conocimiento limitado de las bases moleculares de la enfermedad y todavía no se dispone de un tratamiento adecuado, lo que lleva a la muerte de los pacientes 10 años después del debut de los primeros síntomas.Hasta la fecha se han identificado mutaciones en dos genes que explicarían la base de la enfermedad en un 92% de los casos: EPM2A, que codifica la fosfatasa dual laforina, y EPM2B, que codifica una E3-ubicuitina ligasa. Ambas proteínas interaccionan formando un complejo capaz de ubicuitinar diferentes sustratos.Recientemente se ha demostrado la afectación de varias vías en la enfermedad de Lafora. Sin embargo, se ha avanzado poco en la comprensión de las bases moleculares que subyacen a una de las características más importantes de la enfermedad: la epilepsia. Por eso, la finalidad de esta tesis ha sido tratar de comprender este proceso. Hasta la fecha, la mayor parte de estudios realizados analizando la epilepsia en la enfermedad de Lafora se han centrado en analizar los sistemas neurales. No obstante, estudios recientes sugieren que una afectación de los astrocitos debido a la neuroinflamación existente podría contribuir al desarrollo de la epilepsia. Por ese motivo, nuestros esfuerzos han ido dirigidos al estudio de la homeostasis del principal neurotransmisor excitatorio, el glutamato, en modelos celulares y animales de la enfermedad de Lafora. Dicha homeostasis depende del correcto funcionamiento de las células astrocitarias y su desregulación contribuye significativamente a un aumento de la hiperexcitabilidad y la muerte neuronal., En este trabajo se ha identificado una desregulación del principal transportador de glutamato astrocitario, GLT 1. Dicho transportador es el responsable de la captación del 90% del glutamato extracelular, por lo que una disminución de la actividad de GLT-1 provoca un aumento del glutamato sináptico, favoreciendo la hiperexcitabilidad. Astrocitos primarios procedentes de corteza de ratón deficientes en el gen Epm2a o Epm2b muestran una disminución de la cantidad de GLT-1 expresada en la superficie celular, que se correlaciona con una menor capacidad de estas células para captar glutamato. Este cambio en la localización subcelular está regulado por cambios en la ubicuitinación del transportador, que se encuentra aumentada en presencia de laforina-malina sobreexpresada. Por último, se ha demostrado que los ratones modelo para LD presentan una capacidad disminuida para captar glutamato respecto a los controles, utilizando microdiálisis in vivo.Por lo tanto, esta tesis presenta evidencias de una desregulación de la homeostasis del transportador de glutamato GLT-1 en células y animales modelo para LD y sugiere que esta alteración podría contribuir a la epilepsia presente en LD., Para la realización de esta tesis doctoral, María del Carmen Muñoz Ballester ha disfrutado de una ayuda para la Formación de Profesorado Universitario (FPU) (FPU12-00383), del Ministerio de Educación, Cultura y Deporte. El trabajo se ha llevado a cabo en el grupo U742 del CIBERER-Instituto de Salud Carlos III (IP, P. Sanz) enmarcado dentro de los siguientes proyectos de investigación: – Programa Nacional de Biomedicina. Proyecto SAF2011-27442. “Bases moleculares de la fisiopatología de la epilepsia mioclónica progresiva de tipo Lafora. Identificación de nuevos sustratos del complejo laforina-malina” Años 2012-2014. Investigador Principal: Dr. Pascual Sanz. Centro: Instituto de Biomedicina de Valencia (CSIC), Valencia. – Programa Nacional de Biomedicina. Proyecto SAF2014-54604-C3-1-R. “Buscando una terapia para la epilepsia mioclónica progresiva de Lafora” Años 01/01/2015-31/12/2017. Investigador Principal: Dr. Pascual Sanz. Centro: Instituto de Biomedicina de Valencia (CSIC), Valencia.

Although the majority of PD cases are idiopathic, the identification of diseasecausing mutations helps in our understanding of the molecular mechanisms involved in neuronal demise. Mutations in LRRK2 (leucine-rich repeat kinase 2) are found associated with both sporadic and familial Parkinson´s disease (PD). LRRK2 is a multidomain protein characterised by kinase and GTPase activities, with pathogenic mutations localized to both catalytic domains. There is a significant body of evidence correlating altered catalytic activity with cytotoxicity. However, early cellular LRRK2- mediated events which eventually lead to cellular demise remain poorly understood. LRRK2 has been implicated in autophagic and endosomal trafficking pathways in vitro and in vivo, even though the mechanism(s) remain unclear. This thesis describes work towards addressing how pathogenic LRRK2 may cause cellular dysfunction linked to PD pathogenesis, with emphasis on autophagy and endosomal trafficking deficits. First, mutant LRRK2 was found to cause a block in autophagic flux through a pathway involving NAADP (nicotinic acid adenine dinucleotide phosphate)-sensitive channels in acidic late endosomal/lysosomal structures. Pathogenic LRRK2 was found to cause a partial increase in lysosomal pH, and decreased cell survival in the presence of protein aggregation-induced stress. Since autophagy and endocytosis share late endosomes/lysosomes as common end-points, the effect of mutant LRRK2 on endocytosis was evaluated. Pathogenic LRRK2 was found to cause deficits in both early and late events of receptor-mediated endocytosis, including a delay in receptor trafficking out of late endosomes, which become aberrantly elongated. Rab7 is a small GTPase involved in various endosomal trafficking processes, including late endosomal-lysosomal trafficking and retromer-mediated trafficking between late endosomes and the trans-Golgi network. The effects on receptor trafficking could be rescued when overexpressing constitutively active Rab7 or Rab7L1, as well as the Rab7-interacting proteins dynamin2/CIN85, which localize to late endosomes and regulate degradative receptor trafficking. Pathogenic LRRK2 expression was associated with a decrease in Rab7 activity. Alltogether, the present results highlight an important role for pathogenic LRRK2 in deregulating several endolysosomal membrane trafficking events, which may underlie early cellular pathogenesis in PD., Tesis Univ. Granada. Programa Oficial de Doctorado en: Biomedicina Regenerativa

Epithelial tissues undergo extensive remodeling during embryonic development. Recent studies have revealed that, in a number of developmental processes, epithelial remodeling is associated with pulsations of individual cell surface areas and cortical actomyosin flows. During Drosophila dorsal closure, the amnioserosa (AS), a contractile tissue covering the dorsal region of the embryo, shows contractile pulsations and regular actomyosin flows during the reduction of its apical surface area. The biophysical mechanism driving these shape pulsations as well as the role of contractile actomyosin waves in epithelial contraction and dorsal closure still remains unclear. In this project, we developed a biophysical model for cell shape oscillations that is based on intrinsic properties of the cell: cortex turnover, active contractility by force producing molecules and cell elasticity. We show that coupling these three key ingredients is sufficient for generating stable oscillations. Further, within this framework we were also able to generate waves by coupling the oscillating units and introducing a diffusion term to account for exchange of force producing molecules between the units. Next, we investigated the role for these contractile actomyosin waves in tissue remodeling. We developed a novel technique that allowed us to apply mechanical stretch on the AS tissue and study the response of cells to such stress. With this method, we were able to arrest the pulsatile contractions and actomyosin flows in AS cells. We show that this arrest is associated with the relocalisation of actin and myosin from the medial region of the cells towards the adherens junctions to maintain junction integrity upon stretch. This relocalisation of myosin directly correlates with the junctional strain and does not occur in cells that have excessive membrane material as a consequence of endocytosis inhibition. In the latter case, cells continue pulsing and seem to be “insensitive” to stretch. Upon stretch release, myosin relocalises to the medial area of the cell and pulsations resume. This indicates that cells can switch between two states depending on tension: one in which cells exhibit shape oscillations associated with contractile actomyosin pulses and waves, and the other where cell shape is stabilised with myosin preferentially localised at the cell junctions. Further, following release from long duration ( >10mins ) stretch application, cell junctions were highly wrinkled. Strong and consistent localisation of myosin waves at these regions led to straightening and reduction of junctional lengths. Moreover, during dorsal closure, AS cells constantly reduce their areas while maintaining junctions of consistent thickness and length relative to area. This is not the case where endocytosis is blocked or myosin activity is down-regulated. Our results not only shed light on fundamental physical properties of the actomyosin cortex, in particular they also indicate a role of myosin contractile waves in junctional remodeling during AS cell constriction., Los tejidos epiteliales llevan a cabo una remodelación extensiva durante el desarrollo embrionario. Estudios recientes han revelada que, en un sinnumero de procesos de desarrollo embrionario, la remodelación epitelial se asocia con pulsaciones de áreas en células individuales y con flujos corticales de actomiosina. Durante el cierre dorsal de Drosophila, la amnioserosa (AS), un tejido contractil que cubre la región dorsal del embrión, se observan pulsaciones contráctiles en células individuales y flujos regulares de actomiosina durante la reducción de la superficial apical celular. Al día de hoy, no se conoce el mecanismo biofísico que produce estas pulsaciones celulares ni y el papel que tienen las oscilaciones contráctiles de actomiosina en el epitelio del cierre dorsal embrionario. En este proyecto, se desarrolló un modelo biofísico para entender estas oscilaciones celulares. El modelo se basa en propiedades intrínsecas de la célula como la rotación de la corteza celular, la contractilidad activa mediante moléculas productoras de fuerza y la elasticidad celular. Utilizando éste modelo, se muestra que acoplando estas tres propiedades clave es suficiente para generar oscilaciones celulares estables. Además, dentro de este marco, se han generado oscilaciones mediante el acoplamiento de varias unidades oscilantes y la introducción de un término de difusión para considerar el intercambio de moléculas productoras de fuerza entre las unidades. A continuación, se investigó el papel de estas oscilaciones contráctiles de actomiosina en la remodelación de tejidos. Como resultado, se desarrolla una técnica innovadora que permite aplicar extensión mecánica al tejido de AS y estudiar la respuesta celular ante tal estrés. Con este método, se pueden detener las pulsaciones contráctiles y los flujos de actomiosina en células de la AS. Se muestra que este arresto celular está asociado con la relocalización de actina y miosina de la región central de las células hacia las uniones adherentes intercelulares para mantener su integridad durante la extension epitelial. Esta relocalización de miosina se correlaciona directamente con la tensión en uniones intercelulares y no ocurre en células en las que el reciclaje cellular a través de endocitosis se ha bloqueado. El resultado es un exceso en la acumulación de membrana plasmática en células oscilantes que no responden a la extension epitelial. Tras liberar al tejido de la extension epithelial, la miosina se relocaliza a la área central de las células y las pulsaciones continuan. Esto indica que las células pueden cambiar entre dos estados según la tension aplicada: uno dónde las células muestran oscilaciones asociadas con pulsaciones contráctiles de actomiosina, y otra donde la forma celular se establece con la localización preferente de miosina en las uniones intercelulares. Además, tras liberar el tejido de una extensión de alta duración (>10mins), las uniones intercelulares sufrieron corrugaciones. La localización consistente de oscilaciones de miosina en las regions corrugadas, resulta en una extension y reducción en la longitud de las uniones intercelulares. Además, durante el cierre dorsal, las células de la AS reducen sus areas constantemente, mientras mantienen uniones intercelulares de espesor consistente y longitud relativa a su área. Esto no es el caso cuando la endocitosis se bloquea o la actividad de miosina se reduce. Nuestros resultados no solo muestran las propiedades fundamentales de la corteza cellular de actomiosina, también indican el papel de oscilaciones contráctiles de miosina en la remodelación de uniones intercelulares durante la constricción de la AS.

Epithelial tissues undergo extensive remodeling during embryonic development. Recent studies have revealed that, in a number of developmental processes, epithelial remodeling is associated with pulsations of individual cell surface areas and cortical actomyosin flows. During Drosophila dorsal closure, the amnioserosa (AS), a contractile tissue covering the dorsal region of the embryo, shows contractile pulsations and regular actomyosin flows during the reduction of its apical surface area. The biophysical mechanism driving these shape pulsations as well as the role of contractile actomyosin waves in epithelial contraction and dorsal closure still remains unclear. In this project, we developed a biophysical model for cell shape oscillations that is based on intrinsic properties of the cell: cortex turnover, active contractility by force producing molecules and cell elasticity. We show that coupling these three key ingredients is sufficient for generating stable oscillations. Further, within this framework we were also able to generate waves by coupling the oscillating units and introducing a diffusion term to account for exchange of force producing molecules between the units. Next, we investigated the role for these contractile actomyosin waves in tissue remodeling. We developed a novel technique that allowed us to apply mechanical stretch on the AS tissue and study the response of cells to such stress. With this method, we were able to arrest the pulsatile contractions and actomyosin flows in AS cells. We show that this arrest is associated with the relocalisation of actin and myosin from the medial region of the cells towards the adherens junctions to maintain junction integrity upon stretch. This relocalisation of myosin directly correlates with the junctional strain and does not occur in cells that have excessive membrane material as a consequence of endocytosis inhibition. In the latter case, cells continue pulsing and seem to be “insensitive” to stretch. Upon stretch release, myosin relocalises to the medial area of the cell and pulsations resume. This indicates that cells can switch between two states depending on tension: one in which cells exhibit shape oscillations associated with contractile actomyosin pulses and waves, and the other where cell shape is stabilised with myosin preferentially localised at the cell junctions. Further, following release from long duration ( >10mins ) stretch application, cell junctions were highly wrinkled. Strong and consistent localisation of myosin waves at these regions led to straightening and reduction of junctional lengths. Moreover, during dorsal closure, AS cells constantly reduce their areas while maintaining junctions of consistent thickness and length relative to area. This is not the case where endocytosis is blocked or myosin activity is down-regulated. Our results not only shed light on fundamental physical properties of the actomyosin cortex, in particular they also indicate a role of myosin contractile waves in junctional remodeling during AS cell constriction., Los tejidos epiteliales llevan a cabo una remodelación extensiva durante el desarrollo embrionario. Estudios recientes han revelada que, en un sinnumero de procesos de desarrollo embrionario, la remodelación epitelial se asocia con pulsaciones de áreas en células individuales y con flujos corticales de actomiosina. Durante el cierre dorsal de Drosophila, la amnioserosa (AS), un tejido contractil que cubre la región dorsal del embrión, se observan pulsaciones contráctiles en células individuales y flujos regulares de actomiosina durante la reducción de la superficial apical celular. Al día de hoy, no se conoce el mecanismo biofísico que produce estas pulsaciones celulares ni y el papel que tienen las oscilaciones contráctiles de actomiosina en el epitelio del cierre dorsal embrionario. En este proyecto, se desarrolló un modelo biofísico para entender estas oscilaciones celulares. El modelo se basa en propiedades intrínsecas de la célula como la rotación de la corteza celular, la contractilidad activa mediante moléculas productoras de fuerza y la elasticidad celular. Utilizando éste modelo, se muestra que acoplando estas tres propiedades clave es suficiente para generar oscilaciones celulares estables. Además, dentro de este marco, se han generado oscilaciones mediante el acoplamiento de varias unidades oscilantes y la introducción de un término de difusión para considerar el intercambio de moléculas productoras de fuerza entre las unidades. A continuación, se investigó el papel de estas oscilaciones contráctiles de actomiosina en la remodelación de tejidos. Como resultado, se desarrolla una técnica innovadora que permite aplicar extensión mecánica al tejido de AS y estudiar la respuesta celular ante tal estrés. Con este método, se pueden detener las pulsaciones contráctiles y los flujos de actomiosina en células de la AS. Se muestra que este arresto celular está asociado con la relocalización de actina y miosina de la región central de las células hacia las uniones adherentes intercelulares para mantener su integridad durante la extension epitelial. Esta relocalización de miosina se correlaciona directamente con la tensión en uniones intercelulares y no ocurre en células en las que el reciclaje cellular a través de endocitosis se ha bloqueado. El resultado es un exceso en la acumulación de membrana plasmática en células oscilantes que no responden a la extension epitelial. Tras liberar al tejido de la extension epithelial, la miosina se relocaliza a la área central de las células y las pulsaciones continuan. Esto indica que las células pueden cambiar entre dos estados según la tension aplicada: uno dónde las células muestran oscilaciones asociadas con pulsaciones contráctiles de actomiosina, y otra donde la forma celular se establece con la localización preferente de miosina en las uniones intercelulares. Además, tras liberar el tejido de una extensión de alta duración (>10mins), las uniones intercelulares sufrieron corrugaciones. La localización consistente de oscilaciones de miosina en las regions corrugadas, resulta en una extension y reducción en la longitud de las uniones intercelulares. Además, durante el cierre dorsal, las células de la AS reducen sus areas constantemente, mientras mantienen uniones intercelulares de espesor consistente y longitud relativa a su área. Esto no es el caso cuando la endocitosis se bloquea o la actividad de miosina se reduce. Nuestros resultados no solo muestran las propiedades fundamentales de la corteza cellular de actomiosina, también indican el papel de oscilaciones contráctiles de miosina en la remodelación de uniones intercelulares durante la constricción de la AS.

El estradiol-β-D-glucuronido (E17G) es un metabolito endógeno del estradiol cuyos niveles plasmáticos aumentan durante el embarazo, habiendo sido postulado como responsable de la patogénesis de la colestasis intrahepática que ocurre en las mujeres susceptibles embarazadas. La administración de E17G a ratas hembras produce una colestasis dosis-dependiente, aguda y reversible, afectando las fracciones dependientes e independientes de sales biliares del flujo biliar. nuestro grupo demostró que la alteración secretora bibliar inducida por E17G en la rata es críticamente dependiente de la endocitosis de transportadores hepatocelulares canaliculares claves para la formación de bilis, como Bsep Mrp2. Asimismo demostramos que este fenómeno está mediado por la activación de varias vías de señalización intracelular, como aquellas dependientes de REα-cPKC-ERK1/2, PI3K-Akt-p38MAPK y GPR30-AC-PKA. Sin embargo, el mecanismo involucrado en la endocitosis de los transportadores canaliculares es desconocido, y su esclarecimiento representa el objetivo principal de esta tesis. En una primera etapa, y ante la necesidad de contar con un modelo hepatocelular polarizado para el estudio de estos mecanismos, hemos validado el cultivo primario de hepatocitos de rata en sándwich de colágeno (CPHS) para el estudio de drogas que afectan la formación de bilis a través de la inducción de endocitosis de transportadores canaliculares. Tratando los CPHS con los agentes coléstasico E17G y taurolitocolato, así copmo con el compuesto colerético y anticolestásico DBAMPc, demostramos la utilidad de este modelo in vitro para detectar y cuantificar cambios en la secreción canalicular tanto de tipo colestásico como colerético, así como los cambios en la localización intracelular de transportadores canaliculares causales de dichas alteraciones funcionales. En la segunda etapa, el uso de inhibidores especificos de las vías endocíticas depenmdientes de clatrina y de caveolinas en duplas aisladas de hepoatocitos aportó evidencia preelimiar que E17G induce la endocitosis de Bsep y Mrp2 por un mecanismo dependiente de clatrina. Se obtuvo evidencia adicional de este mecanismo en hígados aislados y perfundidos, donde un inhibidor especifico de esta vía endocítica, monodansilcadaverina, previno la caída en el flujo biliar y la excreción biliar de sustrato de Bsep y Mrp2, así como la endocitosis de dichos transportadores evaluada por microscopía confocal. A modo confirmatorio de la dependencia de clatrina en la endocitosis de estos transportadore inducida por E17G, observamos que el bloque de esta vía mediante knock-down por RNA interferente de la expresión de AP2 (componente clave de la maquinaria endocítica dependiente de clatrina) en CPHS, llevó a una prevención completa de la función de transporte y de la endocitosis Bsep y Mrp2. En forma adicional, demostramos que E17G altera la localización de membrana de estos transportadores (originalmente enriquecidos en microdominois raft, ricos en colesterol y caveolina), llevando a un enriquecimiento de los mismos en microdominios canaliculares ricos en clatrina (no rafts), desde donde puede producirse la endocitosis dependiente de la misma. Por ultimo, como una primera aproximación a la identificación de los blancos celulares de aquellas proteínas quinasas activadas por E17G que conducen en última instancia a la endocitosis dependiente de clatrina de los transportadores canaliculares, se realizaron estudios de fosfoproteómica para identificar proteínas que modifiquen su grado de fosforilación frente al tratamiento con este estrógeno. Esto llevo a la identificación de numerosas proteínas que incrementan su fosforilación por E17G, dejando abierta así la posibilidad de realizar experimentos tendientes a evaluar su posible rol como intermediarios entre las vías de señalización pro-colestásicas y el proceso final de endocitosis de transportadores canaliculares conducente a la alteración colestásica. Fil: Miszczuk, Gisel Sabrina. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Fisiología Experimental (IFISE-CONICET); Argentina

En esta tesis se estudiaron los mecanismos asociados con la exocitosisvesicular altamente acoplada al estímulo, su recuperación, y su mantenimientofrente a la aplicación de potenciales de acción a bajas frecuencias deestimulación, propias del estado basal de estas células. En primer lugar, seevidenció que frente a la aplicación de un estímulo que simula un potencial deacción se libera un grupo de ≈ 8 vesículas, al que denominamos ETAP (porexocytosis triggered by action potential). Este pool vesicular está incluido en elpool inmediatamente liberable (IRP, ≈ 25 vesículas), y su exocitosis depende enun 50% de fuentes de Ca2+ extracelulares y en un 50% de un mecanismoindependiente del influjo de Ca2+. Mientras que IRP recupera lentamente (τ ≈ 7 s)luego de ser deprimido, ETAP presenta una rápida cinética de recuperación (τ ≈ 0.7 s). Esta recuperación depende de dos procesos: (i) transferencia devesículas desde pooles vesiculares río arriba, y (ii) una endocitosis rápidadependiente de dinamina y altamente acoplada a la exocitosis precedente. En lasegunda parte de esta tesis se investigó el mecanismo de exocitosisindependiente del influjo Ca2+ mencionado previamente. Utilizandodespolarizaciones cuadradas de 100 ms (máxima respuesta), se determinaron lasiguientes características para dicho fenómeno: (i) independencia de fuentesextracelulares e intracelulares de Ca2+; (ii) dependencia de la proteína SNAREsinaptobrevina; (iii) dependencia sigmoidea con el voltaje aplicado; (iv) losresultados sugieren que el sensor de voltaje sería el canal de Ca2+ tipo P/Q, yque interaccionaría con la maquinaria exocitótica a través de la secuenciasynprint. En resumen, los resultados muestran que un potencial de acción induceuna exocitosis altamente acoplada y sincrónica al estímulo que es dependienteen parte de un mecanismo activado por Ca2+ y en parte de otro activadodirectamente por voltaje. Finalmente, demostramos que esta exocitosis, graciasa su rápida velocidad de recuperación vesicular, es capaz de mantener lasecreción de manera continua a frecuencias basales fisiológicas. In resting conditions, chromaffin cells fire action potentials at frequenciesof 0.2-0.5 Hz, while under stress the frequency increases to 10-15 Hz. In thisthesis we studied the mechanisms involved in the development and maintenanceof exocytosis in response to the application of action potentials, individually andat low frequencies. In first place, we showed that the application of a stimulus thatresembles a single action potential induced the release of a group of ≈ 8 vesiclesthat we defined as “exocytosis triggered by action potential” (ETAP). Our resultsshow that this pool is part of the immediately releasable pool (IRP ≈ 25 vesicles),and its exocytosis depends 50% on extracellular Ca2+ sources and 50% on amechanism that is independent of Ca2+ influx. While IRP refilling is slow (τ ≈ 7 s)after depletion, ETAP showed a fast kinetic of recovery (τ ≈ 0.7 s). This recoverydepends on two processes: (i) vesicular transference from upstream pools, and (ii) a fast dynamin-dependent endocytotic process, which is tightly coupled to theprecedent exocytosis. In the second part of this thesis we investigated the Ca2+-independent exocytotic mechanism previously mentioned. Using squaredepolarizations pulses of 100 ms (maximal response), the followingcharacteristics were determined for this phenomenon: (i) independence onexternal and internal Ca2+ sources; (ii) dependence on the SNARE proteinsynaptobrevin; (iii) sigmoidal dependence with the voltage applied; (iv) the resultssuggest that the voltage sensor could be the P/Q type Ca2+ channel, which caninteract with the exocytotic machinery through its synprint sequence. In summary,our results show that an action potential induces an exocytotic response highlycoupled, and synchronous with the stimuli, which depends in part on amechanism activated by Ca2+ and in part on other mechanism activated directlyby voltage. Finally, we demonstrated that this exocytosis, due to its fast vesicularrecovery, is able to maintain the secretion under the application of actionpotentials at basal physiological frequencies. Fil: Moya Díaz, José. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

El virus dengue (DENV) es un grave problema para la salud pública por su reemergencia en las últimas décadas, ya que en la actualidad casi la mitad de la población mundial se encuentra en riesgo de infección. A pesar de la creciente incidencia de DENV en el mundo, y en América en particular, al presente no hay quimioterapia específica para el tratamiento de la enfermedad. Las etapas iniciales que conducen a la entrada del virus a la célula son una alternativa atractiva como estrategia antiviral para bloquear el comienzo de la infección. Sin embargo, se ha demostrado que la entrada de DENV es un proceso muy complejo que depende de distintos factores virales y celulares, que a su vez afectan la susceptibilidad antiviral frente a agentes que interfieren con la interacción inicial virus-célula. El presente trabajo de tesis se propuso estudiar la entrada del virus dengue 3 (DENV-3) a células de mamífero y sus posibles implicancias en la terapia antiviral, analizando la acción inhibitoria de carragenanos. Mediante la utilización de inhibidores farmacológicos y moleculares de las diferentes vías endocíticas celulares se demostró que la entrada infecciosa de DENV-3 cepa H87 a células Vero y A549 ocurre por una vía endocítica no clásica, independiente de clatrina, dependiente de pH ácido y dinamina, con una participación parcial de caveolas. Asimismo, se demostró por primera vez en estos sistemas celulares la coexistencia de vías infectivas y no infectivas para la entrada de DENV, situación que podría disminuir la eficiencia de la infección. El tráfico intracelular luego de la entrada de DENV-3 presentó características propias de los virus de penetración tardía hasta completar el proceso de fusión y desnudamiento viral. La evaluación de la dependencia con clatrina para la entrada de DENV-3 a otras líneas celulares humanas, tales como células HepG2, U937 y K562, mostró una respuesta variable según la línea celular. También los resultados fueron variables en la infección a células U937 en presencia o ausencia de anticuerpos contra DENV. Respecto de la actividad antiviral, los carragenanos λ e ι fueron potentes inhibidores de DENV-3, con valores de índice de selectividad (relación citotoxicidad / actividad antiviral) mayores a 1000, excepto en la infección mediada por anticuerpos. El blanco de ambos compuestos fue la entrada del virus a la célula, interfiriendo con la adsorción viral y la internalización de la nucleocápside a partir de los endosomas. La caracterización de la vía de entrada de DENV-3 y de la actividad antiviral de compuestos que bloquean eventos tempranos en la multiplicación del virus aporta conocimientos para dilucidar los mecanismos que regulan la infección viral así como optimizar el diseño y utilización de nuevas terapias antivirales que sean protectoras ante los cuatro serotipos de DENV, de modo de evitar la progresión a las formas severas y letales de la enfermedad. The reemergence of dengue virus (DENV) in the last decades is a serious threat for public health, since at present almost half the world population is at risk of infection. Instead of the increasing DENV incidence worldwide, and particularly in America, there is no specific chemotherapy for treatment of the disease. The initial stages leading to virus entry into the host cell represent an attractive antiviral strategy for chemotherapy to suppress the beginning of infection. However, DENV entry appears to be a very complex process regulated by several celland virus-dependent factors that may also affect antiviral susceptibility to agents blocking the initial virus-cell interaction. The aim of the present study was to study the entry of dengue 3 (DENV-3) into mammalian cells and the possible relationship with antiviral susceptibility, analyzing the inhibitory action of carrageenans. By using chemical and molecular inhibitors of different endocytic pathways, it was demonstrated that the infectious entry of DENV-3 strain H87 into Vero and A549 cells occurs by a non-classical clathrin-independent endocytosis pathway, which depends on the acid endosomal pH and dynamin, and is partially-mediated by caveolae. Results show for the first time in these cell systems the simultaneous coexistence of infective and non-infective routes for DENV entry into the cell, a phenomenon that may reduce the efficiency of infection. The intracellular trafficking of DENV-3 after uptake was typical of a late-penetrating virus to achieve fusion and viral uncoating. The influence of the clathrin pathway in DENV-3 infective entry in other mammalian cell lines of human origin, such as HepG2, U937 and K562 cells, was also evaluated demonstrating that variable entry pathways are employed depending on the host cell. Furthermore, the entry into U937 cells also when infection occurred in the presence of non neutralizing antibodies. Next, the antiviral susceptibility of DENV-3 to entry inhibitors was evaluated. Both λ and ι carrageenans were potent inhibitors of DENV-3, with selective index values (ratio cytotoxicity / antiviral activity) higher than 1000. However, no inhibition was detected in antibody-mediated infection. The target of these compounds was virus entry by dual blockade of virus adsorption and internalization of the nucleocapsid from the endosomes. The characterization of the entry pathway of DENV-3 and the antiviral activity of compounds that block early events in virus multiplication cycle provides information to elucidate the mechanisms responsible of virus infection as well as to optimize the design of new antiviral therapies protective against the four DENV serotypes, in order to prevent progression to severe and lethal forms of disease. Fil: Piccini, Luana Erica. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

El virus Junín (JUNV) es el agente etiológico de la fiebre hemorrágica argentina (FHA), una enfermedad zoonótica que afecta el área central de la Pampa húmeda de la República Argentina. Distintos mecanismos de endocitosis son utilizados en las infeccionesvirales. En la línea celular Vero, el complejo glicoproteico presente en los viriones es elresponsable de las interacciones iniciales con el receptor celular de transferrina 1 (TfR1) yla entrada a la célula es por endocitosis mediada por vesículas recubiertas de clatrina. Envarias familias de virus envueltos, su entrada y diseminación pueden estar mediadas porlectinas de tipo C. Las mismas son proteínas transmembrana tipo 2, constituyen una ampliafamilia de receptores que reconocen estructuras específicas de carbohidratos presentes enpatógenos y se encuentra presente principalmente en células dendríticas inmaduras,macrófagos y células endoteliales. Una de ellas, DC-SIGN posee un rol importante en losestadios iniciales de la respuesta inmune, reconoce estructuras internas ramificadas demanosas y posee funciones de receptor para varios virus. DC-SIGN se compone por undominio extracelular de reconocimiento a carbohidratos (DRC) que une residuos concarbohidratos de alta manosa y una cola citoplasmática con motivos conservados dedileucinas (LL) y un cluster triacídico (EEE). Debido a que JUNV presenta proteínasaltamente glicosiladas, y que en los estadíos de la infección temprana interactuaría concélulas dendríticas y otras del sistema inmune, en este trabajo se estudió la interacción de JUNV con DC-SIGN y el mecanismo endocítico asociado a la misma. Los resultadosdemuestran que DC-SIGN actúa como un auténtico receptor para JUNV en las células que laexpresan y que la entrada a las mismas es a través de endocitosis utilizando vesículasrecubiertas de clatrina con dependencia de colesterol y filamentos de actina corticalesintactos. Junin Virus (JUNV) is a member of the Arenaviridae family and the etiologic agent of Argentine Hemorrhagic fever (AHF), a zoonotic illness affecting the farming land of Argentina. Several endocytic pathways are used during viral infections. In Vero cell line, theglycoprotein complex present in virions is responsible of interaction with Transferrinreceptor type I (TfR1) and internalization is clathrin mediated. Entry and dissemination ofseveral envelope viruses are mediated by C-type lectins. These are transmembraneproteins that are expressed in immature dendritic, macrophages and endothelial cells,integrating a family of receptors which recognize specific carbohydrates present inpathogens. One of them, Dendritic Cell-Specific ICAM-3 Grabbing Nonintegrin (DC-SIGN)has an important role during the initial stages of the immune response, recognizes highmannose residues and is considered as a receptor for several viruses. DC-SIGN is composedby an extracellular carbohydrate recognition domain (CRD) and a cytoplasmic tailcontaining conserved motives as dileucine (LL) and triacidic cluster (EEE). As JUNVpresents highly glycosylated proteins and that during initial steps of the infection, JUNVwould interact with dendritic cells and others belonging to the immune system, in thiswork we studied the interaction between JUNV and DC-SIGN and the entry pathwayassociated with this. Taken together our results demonstrate that DC-SIGN is a realreceptor for JUNV and that the main entry pathway involved is clathrin mediatedendocytosis and it depends on cholesterol and intact cortical actin filaments. Fil: Forlenza, María Belén. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

"Los virus representan una versión microscópica del caballo de Troya, en la que hacen uso de procesos celulares para poder entrar a la célula e infectarla. La endocitosis es uno de estos procesos que los virus han aprovechado para poder ser internalizados. En esta revisión se presentan las distintas vías de endocitosis conocidas hasta el momento, así como ejemplos de distintos virus que utilizan cada ruta para ingresar a la célula."

Fil: Sampayo, Rocío Guadalupe. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

[EN] The plasma membrane contains a wide spectrum of transporter proteins, each responsible for a facet of the cell’s nutritional and signalling requirements. Thus, the membrane is subject to extensive remodelling allowing the cell to rapidly respond to extracellular conditions. Membrane transporters selectively receive post-translational modifications, marking them as cargo; ubiquitylation being fundamental in this role. The ART (arrestin related trafficking adaptors) family of proteins mediate the interaction of Rsp5, a HECT ubiquitin ligase, with specific membrane proteins to bring about membrane remodelling in response to extracellular cues. TORC1 is a central regulator of growth has been implicated in membrane remodelling modification of the activity of Npr1, an effector kinase responsible for signal transduction to the ARTs. Art3, a member of the ART family, has been identified as a substrate of Npr1; however, its role in membrane remodelling mechanisms is yet unclear. This project centres on the exploration of the protein-protein interaction using a series of techniques including bimolecular fluorescence complementation, the yeast-two-hybrid assay and affinity purification using a glutathione S-transferase fusion protein. The effect of a range of TORC1 activity-modifying conditions on the interaction was also analysed., [ES] La membrana plasmática contiene un amplio espectro de proteínas transportadoras, cada una responsable de una faceta de los requerimientos nutricionales y señalizadores de la célula. Por tanto, la membrana está sujeta a una remodelación extensiva permitiéndo a la célula responder de forma veloz a condiciones extracelulares. Los transportadores sufren modificaciones post-traduccionales de forma selectiva marcándoles como cargos; la ubiquitilación es fundamental en este papel. La familia ART (arrestin related trafficking adaptors) media la interacción con Rsp5, una ubiquitina-ligasa de la familia HECT, con proteínas de membrana específicas para promover la remodelación de la membrana en respuesta a estímulos extracelulares. TORC1 es un regulador central del crecimiento y está implicado en la remodelación de la membrana plasmática mediante la modulación de la actividad de Npr1, la quinasa responsable de la transducción de señales desde TORC1 a los ARTs. Art3, otro miembro de la familia ART, se ha mostrado como sustrato de Npr1. Sin embargo, su papel en los mecanismos de remodelación de la membrana no está claro todavía. Este trabajo se centra en la exploración de la interacción proteína-proteína utilizando una serie de técnicas, incluyendo doble híbrido y la purificación por afinidad de proteínas de fusión a glutatión-S-transferasa. El efecto de condiciones modificadoras de la actividad de TORC1 sobre la interacción también se estudió.

Los arenavirus son virus envueltos con genoma ARN segmentado cuyo ciclode replicación tiene polaridad bisentido. La entrada a las células blanco se realiza víaendocitosis mediada por receptor y posterior fusión dependiente de pH. Una vezque la nucleocápside se encuentra en el citoplasma se expresan 5 proteínasestructurales. La proteína mayoritaria asociada a la nucleocápside se denomina NP. A partir de un único precursor glicoproteico (GPC), se obtienen dos glicoproteínasvirales denominadas GP1 y GP2 y el péptido señal (SP), los cuales conforman lasestructuras claviformes encontradas en la envoltura viral. En este trabajo se estudiaron aspectos de la interacción virus-célula huésped,caracterizando el rol de distintas proteínas celulares en los eventos tempranos delciclo de multiplicación de los arenavirus Tacaribe (TCRV) y Junín (JUNV). Debido aque TCRV no utiliza el receptor de transferrina humano (hTfR) para entrar en lascélulas, se utilizo un modelo de células que expresan diferencialmente el TfR y seanalizaron las vías de entrada utilizadas por el virus. Para ello, se utilizaroninhibidores farmacológicos de las diferentes vías endocíticas (dependiente declatrina, colesterol, dinamina, acidificación endosomal y macropinocitosis) y seconfirmaron los resultados obtenidos utilizando construcciones dominantesnegativas unidas a GFP de proteínas involucradas en cada una de ellas. Estosexperimentos permitieron caracterizar que en aquellas líneas que no expresan elhTfR, la vía endocítica principal de entrada es la dependiente de clatrina, dinamina yacidificación endosomal mientras que en las células que si expresan dicho receptor,la vía principal es la macropinocitosis. La endocitosis del virus mediada por la unión a un receptor celular puededesencadenar diferentes señales intracelulares para beneficiarse de procesoscelulares. En este trabajo estudiamos la participación de la autofagia durante lainfección con JUNV en un modelo de células humanas. Se analizó la distribución dela proteína LC3 sobreexpresada (marcador de la vía de la autofagia), se utilizaroninhibidores farmacológicos y células con el gen Atg 5 mutado (esencial para laactivación de la vía convencional de la autofagia). Los resultados obtenidospermitieron determinar que esta vía se activa desde el inicio de la infección ypermanece activa hasta 24 hs post-infección. Los hallazgos presentados en este trabajo no sólo aportan conocimientosbásicos sobre los pasos iniciales del ciclo de replicación de estos arenavirus, sino queademás permite desarrollar nuevos blancos antivirales contra JUNV. Arenavirus are enveloped viruses with a segmented RNA genome whichreplication cycle has a bisense polarity. The entry into the target cell depends on areceptor mediated endocitosis and a subsequent fusion pH dependant. Once thenucleocapsid is in the cytoplasm, 5 structural proteins are expressed. The majoritynucleocapsid associated protein it is called NP. From one glycoprotein precursor (GPC), two glycoproteins are obtained called GP1 and GP2 and the signal peptide (SP) which they shape the claviforme structures found in the viral envelope. In this work, interactions virus-host cells were studied, characterizing the rollof different cellular proteins in the early stage of the Tacaribe (TCRV) and Junin (JUNV) Areniavirus multiplication cycle. Since TCRV does not use the humantransferrine receptor (hTfR) to enter the cells, a model with a differential expressionof the TfR was used and the pathways used by the virus were analyzed. In order todo that, pharmacological inhibitors of the different endocytic pathways (dependenton clathrin, cholesterol, dinamin, endosomal acidification and macropinocytosis)were used and the results obtained were confirmed using dominant negative tagged GFP constructions involved in each one of them. These experiments allowed us tocharacterize that in those cells that do not express the hTfR, the main endocyticpathway used by TCRV is the one dependent on clathrin, dinamin and endosomalacidification, while in those cells expressing this receptor, the main pathway is demacropinocytosis. Receptor mediated endocytosis used by the virus can unleash differentintracellular signals in order to exploit different cellular processes. In this work westudied the autophagy involvement during the infection in a human cell line model. The distribution of the protein LC3 overexpressed (an autophagic marker) wasanalyzed. Pharmacological inhibitors of this pathway and Atg 5 gen mutated cells (essential for the conventional autophagy activation) were also used. Resultsobtained allow us to determine that this pathway is activated from the early steps ofinfection and remains active up to 24 hs post-infection. The findings presented in this work not only provides basic knowledge aboutthe initial steps of these arenavirus replication cycles, but also allows to develop newantiviral targets against JUNV. Fil: Suyay Roldán, Julieta. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Fil: Carro, Ana C. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Fil: Carro, Ana C. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Departamento de Química Biológica; Argentina At present, a high proportion of world population is at risk of infection with dengue virus (DENV), a pathogen causing either a mild febrile illness or more severe forms of disease, with 2.5 % mortality. Although DENV represents a serious health problem worldwide, no specific chemotherapy or vaccine is currently available. Virus entry is an attractive antiviral strategy to block initiation of infection. For DENV, the mode of entry into the host cell has been studied only in fibroblastic or epithelial cell lines, derived from mammals or mosquitoes, with controversial results. In the present study, the entry of DENV into human myeloid cell lines, a model more representative of the natural infection, was analyzed as well as the relationship between mode of entry and antiviral susceptibility to sulfated polysaccharides. By using biochemical inhibitors of endocytic routes, infectivity titrations by plaque formation, viral RNA determinations by quantitative RT/PCR, fluorescence and electron microscopy, a clathrin, and dynamin, mediated endocytosis was demonstrated for entry of both serotypes DENV 2 strain NGC and DENV 1 strain Hawaii into human myelomonocytic U937 and erithroleukaemic K562 cell lines. When both cells were infected with DENV 2 in the presence of nonneutralizing anti DENV antibodies, conditions which allow an enhancement of infection in vitro and lead to severe forms of disease in vivo, the route of entry was clathrin mediated or not, according to the receptor FcR involved in the infective process. Furthermore, the antiviral activity in both cell systems of carrageenan, a sulfated polysaccharide known to inhibit DENV 2 adsorption and uncoating in Vero cells, was also evaluated. A relationship between antiviral susceptibility to carrageenan and the type of receptor employed for antibody-mediated entry was observed. Finally, studies about the cholesterol dependence for DENV infection have shown that the envelope cholesterol is a critical factor in the fusion process for DENV entry whereas cell membrane cholesterol is not involved. The characterization of the mode of entry in myeloid cells and the role of viral cholesterol contributes to the knowledge of factors involved in DENV infection and the design and usage of new and more effective antiviral therapies. Actualmente, casi la mitad de la población mundial se encuentra en riesgo de contraer virusdengue (DENV), agente patógeno que puede causar una infección aguda febril autolimitada o progresara formas más severas de enfermedad, con una tasa de mortalidad de 2,5 %. A pesar de representar ungrave problema para la salud pública, no existen vacunas ni quimioterapias disponibles para DENV. Laentrada del virus a la célula huésped es una interesante estrategia antiviral ya que permite bloquear elcomienzo de la infección viral. En el caso de DENV, sólo se ha estudiado hasta el presente el modo deentrada en líneas celulares epiteliales o fibroblásticas de mamíferos y de mosquito, con resultadoscontroversiales. El presente trabajo de tesis se enfocó en el estudio del mecanismo de entrada de estepatógeno a células mieloides humanas, más representativas de la infección natural, y la implicancia quepudiese tener en la quimioterapia antiviral. Mediante la utilización de inhibidores químicos de lasdistintas vías endocíticas, medida de infectividad por formación de placas, determinaciones de RNAviral por RT PCR en tiempo real y técnicas de microscopía de fluorescencia y electrónica, se demostróque los dos serotipos DENV 1 cepa Hawaii y DENV 2 cepa NGC utilizan una vía clásica de endocitosisdependiente de clatrina y dinamina para entrar en células humanas U937, de origen monocítico, yK562, de origen ertitroleucémico. En la infección de ambas células en presencia de anticuerpos noneutralizantes anti DENV, condiciones en que hay incremento de la infección in Vitro y puedenexplicarse las formas más severas de la enfermedad in vivo, se observó que DENV 2 utiliza diferentesvías de entrada, mediadas o no por clatrina, según el receptor Fc R involucrado en el proceso. Tambiénse evaluó en los mismos sistemas la actividad antiviral del carragenano , polisacárido sulfatado queinhibe la adsorción e internalización de DENV 2 en células Vero, encontrándose también una relaciónentre la susceptibilidad antiviral y el tipo de receptor empleado para la entrada mediada poranticuerpos. Finalmente, se realizó un estudio de la dependencia de colesterol para la infección conDENV, concluyendo que el contenido adecuado de colesterol en la envoltura viral, no así en lamembrana celular, sería determinante para lograr la fusión de ambas membranas y alcanzar unainfección productiva. La caracterización de la vía de entrada en células mieloides y el rol del colesterolviral aporta nueva información para comprender los factores involucrados en la infección de DENV yfavorecer el diseño y utilización de nuevas terapias antivirales más efectivas.

Desde que se establecen las sinapsis hasta que son plenamente maduras, experimentan diversos cambios. En el terminal presináptico, a nivel morfológico se produce un rellenado progresivo del número de vesículas sinápticas que modificará las propiedades funcionales de las sinapsis. La disponibilidad de vesículas es necesaria mantener la neurotransmisión en períodos de actividad y la endocitosis es el mecanismo encargado de reformar las vesículas que han sido previamente liberadas. Sin embargo, es >1000 veces más lenta que la exocitosis, convirtiéndose en el factor limitante de la neurotransmisión. Además, en el contexto in vivo, las sinapsis están rodeadas de otros tipos celulares, como la glía, que pueden sentir y modificar las propiedades sinápticas mediante la secreción de factores. En esta tesis, se ha empleado un sistema de microcultivos conocidos como single-cell microcultures (SCM) establecidos a partir de neuronas del ganglio cervical superior de rata. Así, una neurona única crece formando contactos sinápticos colinérgicos con ella misma, siendo a su vez presináptica y postsináptica y permitiendo el registro de la actividad sináptica con un sólo electrodo. Además, como las neuronas se desarrollan en ausencia de glía, se puede estudiar el efecto de factores gliales sobre la neurotransmisión, añadiéndolos al medio de cultivo. Tras el registro de las neuronas, se realiza un estudio correlativo de microscopía de inmunofluorescencia ó microscopía electrónica. Los resultados de esta tesis demuestran que las sinapsis pueden establecerse y desarrollarse en ausencia de glía. Tras el comienzo de la neurotransmisión (.13 d.i.v.), las sinapsis son inmaduras y presentan una disminuida respuesta sináptica, una marcada depresión a corto plazo y un reducido tamaño de los depósitos de vesículas de liberación. Con la maduración se producen cambios debido al incremento de los depósitos de vesículas. In vitro, los cambios ocurren en las mismas sinapsis que se establecieron inicialmente, ya que no se observan variaciones en el número de contactos sinápticos. Sin embargo, in vivo el número de sinapsis que se forman en un principio es superior a aquéllas que finalmente se consolidan y maduran. Es decir, existe un proceso de refinado y eliminación sináptica que debe desencadenarse por factores externos. En esta tesis se ha encontrado que Secreted protein acidic and rich in cystein (SPARC), una proteína matricelular de origen glial secretada durante el desarrollo, es capaz de ejercer un efecto dosis dependiente sobre el desarrollo sináptico. 10 nM desencadena un proceso de eliminación sináptica, mediante una endocitosis masiva de la superficie plasmática y la generación de cuerpos endosomales degradados vía lisosomal. Los resultados se corroboran in vivo, inyectando la proteína en la cola del renacuajo de Xenopus tropicalis provocando la eliminación de las uniones neuromusculares. Paralelamente, en SCMs plenamente funcionales, se ha observado que una intensa actividad también favorece la reducción de la cantidad y la calidad de las vesículas sinápticas, que se manifiesta en una incapacidad para mantener la neurotransmisión. Asumiendo que la endocitosis mediada por clatrina es el principal mecanismo de reciclaje de las sinapsis, y clatrina es la proteína más específica del mecanismo, se estudió el comportamiento de esta proteína durante períodos de estimulación. Se observó que clatrina sale de las sinapsis hacia las regiones perisinápticas. Usando lentivirus para reducir la expresión de clatrina (shRNA), se observaron resultados funcionales similares a los obtenidos en períodos de alta estimulación: una reducción del número de vesículas y un menor contenido de neurotransmisor. Este fenotipo fue rescatado dializando clatrina exógena purificada en la pipeta de registro. Así, clatrina y SPARC, son factores importantes para el desarrollo y la plena funcionalidad de las sinapsis., The required mechanisms that regulate synaptic maturation are not deeply known, although the presynaptic changes such as a high number of synaptic vesicles and the grouping of these at the active zone, are well-characterized features. It is believed that these changes are mediated by neurotrophins or glial molecules. After the synaptogenic period, non-functional synapses tend to disappear. Although, the factors involved in synapses elimination are not known, it is suggested that glia triggers it. In functional neurons, to maintain communication, synapses must recycle their released vesicles with high efficiency. In this process mainly participates the clathrin-mediated endocytic machinery, but the consequences of this are poorly understood. Thus, in this dissertation, synaptic plasticity has been studied based on the degree of maturity and the effect of endocytosis capacity. We made use of a cholinergic microculture model, called Single-cell microculture (SCM) established from rat superior cervical ganglion neurons in the absence of glia. SCMs provide a good model to study synaptic function because a given neuron is both presynaptic and postsynaptic. Furthermore, SCMs permit to study the effect of glial factors on neurotransmission, by adding them on the culture medium. We have found that SPARC, a secreted protein by glia during development, triggers a cell-autonomous program of synapse elimination in SCMs. The loss of synaptic contacts is associated to the formation of retracted axon terminals, containing multivesicular bodies and secondary lysosomes. The biological relevance of culture results is supported by injecting the tail of Xenopus tropicalis tadpoles with SPARC. Swimming is severely impaired, caused by the massive elimination of neuromuscular junctions. On the other hand, we have found that the amount of clathrin in a presynaptic terminal is not fixed. During stimulation, clathrin moves out of synapses as a function of stimulus strength and neurotransmitter release probability. Correlative functional and morphological experiments show that presynaptic synaptic transmission is compromised if clathrin levels fall by 20% after clathrin heavy chain knock down using RNAi. However, synaptic depression reverts after dialysis of exogenous clathrin, thus compensating RNAi-induced depletion. Together, our results show that clathrin levels and SPARC actively affect synaptic plasticity during development.

[spa] La clatrina es una molécula evolutivamente conservada que envuelve las membranas que se endocitan desde la membrana plasmática y aquellas que se mueven entre la red trans-Golgi (TGN) y los endosomas de las células eucariotas, en las principales vías celulares reguladas secretoras y endocíticas. Muchas proteínas que interactúan con clatrina han sido identificadas, pero en algunos casos se desconoce la relevancia funcional de estas interacciones. Entre ellas, la interacción de la clatrina con la calmodulina, dos proteínas esenciales evolutivamente conservadas, fue detectada in vitro hace décadas pero no se sabe si interactúan in vivo y cuál es el significado funcional de esta interacción. La calmodulina es un sensor de calcio que juega un papel importante la regulación de una amplia variedad de proteínas y rutas de señalización importantes en todos los organismos eucariotas. Es importante destacar que también se ha visto implicada en la endocitosis, el tráfico de membranas y la fusión de endosomas. Sin embargo, muchas de las dianas de calmodulina y los mecanismos por los que la calmodulina regula eventos específicos de transporte de membranas son desconocidos. En esta Tesis se aborda el estudio de la interacción clatrina-calmodulina, cuyo significado funcional no se ha estudiado hasta el momento, utilizando la levadura Saccharomyces cerevisiae como sistema modelo. En el estudio, revelamos que las cadenas pesada y ligera de clatrina se unen a calmodulina no sólo in vitro sino también en levadura, probablemente de una forma dependiente de calcio. Además, describimos un sitio de unión a calmodulina que no estaba previamente caracterizado, en el extremo C-terminal de la cadena pesada de clatrina, e identificamos mutaciones puntuales en calmodulina que alteran específicamente su interacción con la clatrina. Por último, aportamos pruebas que respaldan una función específica de la interacción clatrina-calmodulina en el transporte retrógrado desde los endosomas al TGN., [eng] Clathrin is an evolutionary conserved molecule that coats membranes endocytosed from the plasma membrane and those that move between the trans-Golgi network (TGN) and endosomes of eukaryotic cells. It also plays roles in early stages of mitosis, cytokinesis, chromosome alignment and in certain phagocytic events. At the cellular level, clathrin is required for major regulated secretory and endocytic pathways, which transport proteins, lipids, soluble factors, and extracellular ligands between the plasma membrane and the intracellular compartments. In multicellular organisms clathrin is involved in numerous specialized pathways of physiological relevance, such as the production of morphogen gradients, the formation of secretory granule, antigen presentation by the immune system, virus maturation, the control of glucose homeostasis, or synaptic vesicle generation. Many proteins that interact with clathrin have been identified. In some cases the functional relevance of these molecular interactions remains unknown. Among those, the clathrin-calmodulin interaction is probably one of the most striking examples since it involves two evolutionary conserved essential proteins and it was detected in vitro decades ago. However, it was not clarified whether clathrin and calmodulin interacted in vivo and what was the functional significance of this interaction. The calcium sensor calmodulin plays an important role regulating a wide variety of proteins and important signaling pathways in all eukaryotes. It modulates the activity of key regulatory enzymes, ion pumps and proteins implicated in motility and it has essential roles in mitosis. Importantly, it has also been found to be implicated in endocytosis, membrane traffic and endosome fusion. Nevertheless, most targets of calmodulin and the mechanisms by which calmodulin regulates specific membrane transport events are mainly unknown. The objective of this Thesis is to address the study of the clathrin-calmodulin interaction, whose functional significance has not been studied thus far, using the yeast Saccharomyces cerevisiae as a model system. S. cerevisiae has proven to be an extremely versatile organism for studying many cellular processes, because of the ease of combining biochemical analyses with genetic studies and live imaging in this organism and the evolutionary conservation of most essential eukaryotic cellular processes and proteins involved. In this study, we reveal that the clathhrin heavy and light chains bind calmodulin not only in vitro but also in yeast, most likely in a calcium-dependent manner. Further, we describe a not-previously­characterized calmodulin binding site at the C-terminus of the clathrin heavy chain, and identify calmodulin point mutations that specifically disrupt their interaction with clathrin. Finally, we provide evidence supporting a specific role of the clathrin-calmodulin interaction in the retrograde transport from endosomes to the TGN.

RESUMEN: La endocitosis es un proceso por el cual la célula introduce moléculas, y lo hace englobándolas en una invaginación de la membrana citoplasmática, formando una vesícula que termina por desprenderse de la membrana para incorporarse al citoplasma. La endocitosis de receptores como consecuencia de la acción de compuestos químicos puede ser estudiada, como una respuesta biológica con implicaciones farmacológicas. Para este tipo de estudio se hace imprescindible el desarrollo de una herramienta que permita evaluar de forma cuantitativa la formación de vesículas o endosomas. Durante este trabajo presentaremos una herramienta virtual o simulador, que simula imágenes del proceso de endocitosis en célula viva y además dicho simulador nos servirá para comparar distintos métodos de análisis de imagen con el objetivo de seleccionar el mejor de todos ellos y aplicarlo a un algoritmo de cuantificación de endosomas ya implementado en [1]. ABSTRACT: Endocytosis is a process used by cells to introcue molecules. The cells includes the molecules in an invagination of the plasma membrane, forming a vesicle that eventually detaches from the membrane to enter the cytoplasm. Receptor endocytosis as a consequence of the action of chemical compounds can be studied as a biological response to pharmacological implications. For this type of study it is essential to develop a tool to assess quantitatively the formation of vesicles or endosomes. In this paper we present a virtual tool or simulator, which simulates images of endocytosis in living cells. we will use the simulator to compare different methods of image analysis in order to select the best one and apply it to the quantification algorithm of endosomes implemented in [1]. Grado en Matemáticas

[ES] Para mantener la viabilidad celular, las células necesitan adaptarse a los cambios en el medio. La endocitosis de transportadores de membrana mediada por ubiquitinación, juega un papel importante en este proceso ya que, proporciona el mecanismo para eliminar proteínas transportadoras de la membrana celular. Arrestin-related Trafficking Proteins (ARTs) son importantes reguladores de la endocitosis en levadura. Estas facilitan la ubiquitinación de proteínas diana por la E3 ubiquitina ligasa, Rsp5. Otro posible mecanismo de regulación de la composición proteica de la membrana, previo a la endocitosis de transportadores, es la regulación transcripcional. En un estudio previo de nuestro grupo, se observo un incremento en la expresión del transportador de glucosa de alta afinidad Hxt6 en cepas mutantes art4 y art7 al cambiar la fuente de carbono. En trabajo que se presenta, se midió la actividad del promotor de HXT6 en la cepa silvestre y en los mutantes art4 y art7 bajo la presencia de diferentes fuentes de carbono, para determinar si los cambios previamente observados en la expresión del transportador de alta afinidad Hxt6 se deben a una regulación transcripcional. Por otra parte, se pretendió observar diferencias en el fenotipo tanto de mutantes para art4 y art7 como en cepas que sobreexpresan los genes ART4 y ART7 cuando son cultivadas con diferentes fuentes de carbono. Además, se intentó determinar mediante western blot, diferencias en la expresión de estas proteínas cuando se cultivaban en medios con diferente fuente de carbono y siempre bajo el control de su propio promotor., [CA] Per mantindre la viabilitat cel·lular, les cèl·lules necessiten adaptar-se als canvis en l’entorn. La endocitosis de transportadors de membrana mitjançant ubiquitinació, juga un paper important en aquest procés ja que, proporciona el mecanisme per a eliminar proteïnes transportadores de la membrana cel·lular. Arrestin-related Trafficking Proteins (ARTs), son importants reguladors de l’endociticis en llevat. Estes faciliten l’ubiquitinació de proteïnes diana mitjançant la E3 ubiquitina lligasa, Rsp5. Altre possible mecanisme de regulació de la composició proteica de la membrana, previ a l’endocitosi de transportadors, es la regulació transcripcional. En un estudi previ d’aquest grup, es va observar un increment en l’expressió del transportador de glucosa d’alta afinitat Hxt6 en soques mutants art4 y art7 al canviar la font de carboni. En el treball que aquí es presenta, es va mesurar l’activitat del promotor HXT6 en la soca silvestre y en els mutants art4 y art7.baix la presencia de diferents fonts de carboni, per tal de determinar si els canvis prèviament observats en l’expressió del transportador Hxt6 es deuen a una regulació transcripcional. Per altra banda, es pretengué observar diferencies al fenotip tant de mutants art4 y art7 com en soques que sobreexpresaven aquestos gens quan son cultivades en diferents fonts de carboni. A més a més, es va intentar determinar mitjançant western blot, diferencies en la expressió de estes proteïnes quan eren cultivades en medis de cultiu amb diferent font de carboni y sempre baix el control del seu propi promotor., [EN] To maintain cell viability, cells need to adapt to changes in the environment. The endocytosis of membrane transporters mediated by ubiquitination, plays an important role in this process since, it provided the mechanism to remove transporter proteins from the cell membrane. Arrestin-related Trafficking Proteins (ARTs) are important regulators of endocytosis in yeast. Those facilitate the ubiquitination of target proteins by the E3 ubiquitin ligase, Rsp5. Another possible regulation mechanism of membrane protein composition, prior to endocytosis of transporters is transcriptional regulation. In a previous study from our group, was observed an increase in the expression of high-affinity glucose transporter Hxt6 in mutant strains art4 and art7 when changing the carbon source. In the work presented, the HXT6 promoter activity in the wild type strain and in mutant art4 and art7 was measured under the presence of different carbon sources, to determine if the changes previously observed in the expression of high-affinity transporter Hxt6 were due to transcriptional regulation. On the other hand, was intended to observe differences in the phenotype of both mutants art4 and art7 and in strains over expressing genes ART4 and ART7 when are cultivated with different carbon sources. In addition, we attempted to determine by Western blot, differences in expression of these proteins when were grown in media with different carbon source and always under the control of its own promoter.

La activación del receptor GABAA durante un breve período de tiempo (5-10minutos) por GABA, en neuronas de corteza cerebral de rata, induce horas más tarde unareducción en la interacción entre los sitios de unión de GABA y benzodiacepinas, llamadadesacoplamiento, en ausencia de cambios en el número de receptores. El objetivo delpresente trabajo fue estudiar el mecanismo molecular del desacoplamiento inducido por GABA. Nuestros resultados sugieren que el desacoplamiento inducido por GABA estáasociado a una reducción en el porcentaje de receptores GABAA conteniendo la subunidadα3. Por otro lado, los resultados de nuestros experimentos indicarían que eldesacoplamiento está también mediado por un aumento en el grado de fosforilación de lasubunidad γ2 del receptor. Por lo tanto, el desacoplamiento sería el resultado de al menosdos mecanismos regulatorios que actuando en forma conjunta producen una alteraciónadaptativa en la función del receptor GABAA. Si bien no se conocen las vías deseñalización intracelulares activadas, es posible que un aumento en la internalización delreceptor GABAA inducido por GABA represente la señal que desencadenaría los procesosresponsables del desacoplamiento. GABAA receptor activation during a brief period of time (5-10 minutes) by GABA, inrat cerebral cortical neurons, induces hours later a reduction in the interaction between GABA and benzodiazepine binding sites, named uncoupling, in the absence of changes inreceptor number. The aim of the present work was to study the molecular mechanism of GABA-induced uncoupling. Our results suggest that GABA-induced uncoupling is associated with a reduction inthe percentage of α3-containing GABAA receptors. On the other hand, results from ourexperiments might indicate that uncoupling is also mediated by an enhancement in thephosphorylation degree of γ2 receptor subunit. In conclusion, uncoupling would be theresult of at least two regulatory mechanisms that act together to produce an adaptivealteration of the GABAA receptor function. The intracellular signaling pathways areunknown, however, a GABA-induced increase in GABAA receptor internalization couldprovide a signal that triggers the processes responsible for uncoupling. Fil: Gutiérrez, María Laura. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

El consumo de etanol durante la gestación puede inducir una serie de alteraciones graves en el desarrollo del feto, la manifestación más extrema da lugar al Síndrome Alcohólico Fetal (SAF). La exposición prenatal al alcohol es la causa conocida y, además evitable, más importante de retraso mental en el mundo occidental. Además de déficits cognitivos, los niños con SAF presentan múltiples anomalías estructurales en el sistema nervioso central, como reducción de la masa cerebral, y a nivel celular, daños en la migración neuronal, en el proceso de formación de espinas dendríticas y establecimiento de sinapsis. En la actualidad, los mecanismos moleculares implicados en la teratogénesis inducida por el etanol siguen sin esclarecerse. En el presente estudio empleamos neuronas de hipocampo en cultivo primario que se expusieron crónicamente, durante 14 días in vitro, a una dosis moderada de etanol (30 mM). Se analizaron los efectos del etanol sobre el citoesqueleto, y se demostró que el tratamiento disminuía los niveles de actina y tubulina polimerizadas, así como el número y la distribución de los microtúbulos en las dendritas. Los efectos observados podían estar relacionados con la alteración de múltiples proteínas implicadas en las vías de señalización mediadas por las Rho GTPasas (Rac1, Cdc42 y RhoA), que son las principales moléculas reguladoras del citoesqueleto. El tratamiento reducía los niveles de las tres GTPasas, y afectaba la cantidad de las formas activas (unidas a GTP) de Rac1 y Cdc42, así como la de varias proteínas involucradas en dichas vías. La exposición crónica a niveles bajos de alcohol, alteraba la densidad de las espinas maduras y la proporción de los diferentes tipos morfológicos de espinas. Estos efectos, se producían entre la primera y segunda semana de cultivo, y podrían estar causados por la alteración en el equilibrio G-actina/F-actina, causado por los cambios en los niveles de diferentes factores que regulan la organización de la actina filamentosa, que desempeña un papel central en la formación, maduración, y plasticidad de las espinas dendríticas. Otra diana clave en la toxicidad del etanol en neuronas, y estrechamente ligada al citoesqueleto, podría ser el tráfico intracelular. Para evaluar esta posibilidad estudiamos el efecto del etanol sobre la endocitosis, y los elementos y moléculas que participan en el tráfico intracelular (aparato de Golgi, retículo endoplásmico y proteínas motoras). El tratamiento reducía la endocitosis de la albúmina, la cual es degradada en los lisosomas, y producía un desfase en la cinética de captura y reciclaje de la transferrina. Esto podría estar causado por las alteraciones observadas en los niveles de varias moléculas implicadas en las vías endocíticas (proteínas adaptadoras, estructurales y Rab GTPasas). Cabe destacar que el alcohol afectaba notablemente la estructura del aparato de Golgi El efecto tóxico del etanol sobre los orgánulos y las vías que regulan el tráfico intracelular y la dinámica del citoesqueleto, podrían afectar a procesos esenciales para el desarrollo del sistema nervioso, como neuritogénesis, elongación del axón, sinaptogénesis y migración neuronal, conduciendo finalmente a las graves enfermedades mentales descritas en niños expuestos prenatalmente al etanol.

According to the classification of placental types among animals, the transfer of iron through the placenta can occur via: absorption connected to transferin through the outer surface of the trophoblast in direct contact with circulating maternal blood; absorption of the erythrocytes by the chorionic epithelium in direct contact with accumulation of blood extravased from haemotophagous areas; absorption by the chorionic epithelium in direct contact with iron enriched secretions from the endometrial glands and absorption by extravasations of the blood in the maternal-fetal surface and the subsequent phagocytosis of the erythrocytes by trophoblast cells described in bovine, small ruminants, canine and feline. The function of erythrophagocytosis observed after the extravasation of blood in the maternal-fetal interface is undefined in several species. Possibly, the iron is transferred to the fetus through the trophoblastic erythrophagocytosis in the hemophogous area of the placenta and also in the endometrial glands. In this literature survey, new methods of studies regarding placental transfer involving iron and other nutrients necessary for survival and maintenance of embryonic fetus to birth are proposed.De acordo com a classificação dos tipos de placenta existentes entre os animais e em relação com a passagem de substâncias pela barreira inter-hemática, a transferência de ferro pode ser realizada através da: absorção de ferro ligado a transferrina através da superfície externa do trofoblasto em contato direto com o sangue materno circulante; absorção de eritrócitos pelo epitélio coriônico em contato direto com acúmulos de sangue materno extravasado em áreas hematófagas, absorção de ferro pelo epitélio coriônico em contato direto com secreções ricas em ferro provenientes de glândulas endometriais e fagocitose dos eritrócitos pelas células trofoblásticas, a qual foi descrita em bovinos, pequenos ruminantes, caninos e felinos como hematomas placentários ou áreas hemófogas. A função da eritrofagocitose observada após o extravasamento de sangue na interface materno-fetal é indefinida em várias espécies. Possivelmente, o ferro é transferido para o feto através da eritrofagocitose trofoblástica na área hemophogous da placenta e também nas glândulas endometriais. Após o levantamento desta revisão bibliográfico são propostos novos métodos de estudos sobre o transporte placentário envolvendo além do Ferro outros nutrientes necessários a sobrevivência e manutenção embrionária fetal até o nascimento.

S. cerevisiae (budding yeast) is particularly powerful to study the relation between the molecular mechanisms of actin regulation and its biological significance due to its powerful molecular and genetic methods, well-established biochemical techniques, and development of live cell imaging and immuno-electron microscopy. Further, budding yeast has a simple cytoskeleton but the molecular mechanisms controlling its remodeling are conserved from yeast to mammals. Interestingly, a dynamic actin cytoskeleton is mandatory for endocytosis in S. cerevisiae. In this organism the formation of the primary endocytic profiles in yeast occurs concomitant with the assembly of a complex actin structure (the endocytic actin module), which includes the actin nucleator Arp2/3 complex. Consistent with observations indicating that the myosin-I Myo5 in complex with the WIP homolog Vrp1 is a major Arp2/3-dependent actin nucleating promoting factor (NPF) driving productive membrane invagination, our laboratory has demonstrated that the C-terminal domain of Myo5 immobilized on the surface of Sepharose beads induces assembly of the endocytic actin module in the presence of yeast extracts. Analysis of the in vitro actin assembly assay demonstrated that Myo5 is phosphorylated by the casein kinase CK2 at the serine 1205 during the assay. In this study, we have characterized the CK2 activity that phosphorylates Myo5 at the C-terminus and investigated the functional significance of this phosphorylation in vivo and in vitro. Our results indicate that a non-tetrameric and particulate-associated CK2 activity that includes the catalytic subunit Cka2 but not Cka1 or the regulatory subunits Ckb1 and Ckb2 phosphorylates Myo5 S1205. Our results also indicate that this phosphorylation event down-regulates the assembly of complex actin structures in vitro and slows down the internalization process and the dissociation of the myosin from the plasma membrane in vivo. The Cka2-mediated phosphorylation at Myo5 S1205 does not seem to regulate the affinity of the NPF for the Arp2/3 complex but rather down-regulates the interaction of Myo5 with its co-activator Vrp1. This phosphorylation also increases directly or indirectly the binding of the myosin to the endocytic coat components Sla1 and Pan1 and to the syndapin Bzz1, suggesting that the phosphorylation event occurs late during the maturation of the endocytic invagination. Finally, our data suggest that Cka2 have endocytic targets other than Myo5 and that its activity might also regulate early steps during the assembly of the endocytic coat., La levadura S. cerevisiae es un organismo modelo muy utilizado para estudiar los mecanismos moleculares que regulan el citoesqueleto actina y su función biológica, ya que los mecanismos moleculares que controlan la organización del citoesqueleto de actina están conservados, por lo que muchos de los descubrimientos realizados en S. cerevisiae son aplicables también en eucariotas superiores. Una de las principales funciones biológicas de la actina en S. cerevisiae es la formación de una vesícula endocítica. En este organismo, la formación de los perfiles endocíticos primarios ocurre de forma simultánea con el ensamblaje de una estructura de actina compleja (módulo de actina) que incluye al complejo nucleador de actina Arp2/3. Diferentes estudios indican que la miosina-I Myo5 junto su co-activador Vrp1 activan al complejo Arp2/3 produciendo la elongación del perfil endocítico. Nuestro laboratorio ha demostrado que el dominio C-terminal de Myo5 inmovilizado en la superficie de bolas de sefarosa induce el ensamblaje del módulo de actina en presencia de extracto de levadura. El análisis del ensayo demostró además que Myo5 está fosforilada por la quinasa CK2 en la S1205. En este estudio hemos caracterizado la actividad CK2 que fosforila a Myo5 en la S1205 y hemos investigado el significado funcional de dicha fosforilación in vivo e in vitro. Nuestros resultados indican que una actividad CK2 asociada a partículas, que incluye la subunidad catalítica Cka2 pero no Cka1 ni las subunidades reguladoras Ckb1 y Ckb2 fosforila la S1205 de Myo5. Esta fosforilación perturba la interacción entre Myo5 y su co-activador Vrp1, regulando negativamente la formación de las estructuras de actina complejas in vitro, y consistentemente, disminuyendo la velocidad de la internalización endocítica in vivo. Además, nuestros resultados también sugieren que Cka2 seguramente tiene otras dianas además de Myo5, y que su actividad podría regular otras fases iniciales durante la formación de la vesícula endocítica.

La mastitis bovina es considerada una de las enfermedades de mayor relevancia en la ganadería lechera a nivel mundial. Esta patología se caracteriza por una respuesta inflamatoria de la glándula mamaria de origen multifactorial, ocasionada principalmente por infecciones bacterianas.

En la actualidad casi la mitad de la población mundial se encuentra en riesgo de infección con dengue, resultando la enfermedad viral transmitida por artrópodos de mayor importancia en todo el mundo. A pesar de la creciente incidencia de este virus, al momento no existen vacunas o quimioterapia antiviral disponibles. Dado que el conocimiento del ciclo de multiplicación viral es indispensable como punto de partida para el diseño de agentes quimioterapéuticos, el presente trabajo de tesis se propuso estudiar los pasos iniciales de la infección con DENV: el mecanismo de entrada a la célula huésped. Nuestro estudio se centralizó en el análisis in vitro de los factores celulares involucrados en la internalización, transporte intravesicular y desnudamiento del virus y la influencia del tipo de célula (mamífero o insecto), cepa y serotipo viral sobre dichos procesos. Mediante el uso combinado de inhibidores químicos y moleculares, medidas de infectividad y técnicas de microscopía electrónica y de fluorescencia demostramos que la entrada del serotipo DENV-1 en células Vero ocurre por endocitosis dependiente de clatrina, mientras que la entrada del serotipo DENV-2 tiene lugar por un mecanismo no clásico independiente de clatrina, caveolas y lipid-rafts, pero dependiente de dinamina. Al extender nuestro estudio a otros sistemas celulares (C6/36 HT y A549) encontramos que la endocitosis de DENV-1 y DENV-2 ocurre por un mecanismo clásico dependiente de clatrina. Por lo tanto, estos resultados demuestran por primera vez que un mismo serotipo viral puede utilizar diferentes vías de entrada en líneas celulares de distinto origen, y que a su vez, distintos serotipos virales pueden utilizar vías de entrada alternativas en un mismo tipo celular. Asimismo, observamos que en todos los sistemas celulares analizados, la entrada de DENV ocurre con dependencia de la exposición de los viriones a pH ácido. Esto implica un tránsito de las partículas virales en compartimentos endosomales hasta el momento en que se dispara la fusión entre la membrana viral y la membrana de la vesícula transportadora. Encontramos que los viriones son primeramente transportados hacia endosomas tempranos para luego continuar hasta endosomas tardíos o endosomas de reciclaje dependiendo de características propias de cada cepa viral. Por lo tanto, los hallazgos presentados en este trabajo no sólo aportan conocimientos básicos sobre los pasos iniciales del ciclo de replicación de este importante patógeno humano, sino que además proveen una nueva perspectiva para encarar el desarrollo racional de agentes antivirales para esta enfermedad de creciente reemergencia global. At present, nearly half of the world population is at risk of dengue infection, resulting in the arthropod-borne viral disease of major importance worldwide. Despite the increasing incidence of this virus, there are no vaccines or antiviral chemotherapy available. Since knowledge of the viral multiplication cycle is essential as a starting point for the design of chemotherapeutic agents, this thesis aimed to examine the initial steps of DENV infection: the mechanism of virus entry into the host cell. Our study was centered in the in vitro analysis of the cellular factors involved in the internalization, intravesicular transport and penetration of the virus and the influence of the cell type (mammalian or insect), strain and serotype in these processes. Through the combined use of chemical and molecular inhibitors, infectivity assays and electron and fluorescence microscopy techniques we show that the entry of the serotype DENV-1 in Vero cells occurs by clathrin-mediated endocytosis, while entry of DENV-2 takes place by a nonclassical mechanism independent of clathrin, caveolae and lipid-rafts, but dependent on dynamin. By extending our study to other cell systems (C6/36 HT and A549) we found that endocytosis of DENV-1 and DENV-2 occurs by a classical clathrin-dependent mechanism. Therefore, these results demonstrate for the first time that the same serotype may use diverse pathways in cell lines of different origin, and in turn, different serotypes can use alternative entry pathways in the same cell line. We also observed that in all cell systems analyzed by us, the entry of DENV occurs with dependence of exposure of the virions to acidic pH. This implies a transport of viral particles in endosomal compartments until fusion between the viral membrane and the membrane of the carrying vesicle is triggered. We found that virions are first transported to early endosomes and then continue to late endosomes or recycling endosomes depending on characteristics of each viral strain. Therefore, the findings presented here not only provide basic knowledge about the initial steps of the replication cycle of this important human pathogen, but also provide a new perspective to address the rational development of antiviral agents against this re-emerging global disease. Fil: Acosta, Eliana Gisela. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

La señalización por insulina comprende una compleja cascada de eventos que llevan a la regulación del metabolismo de la glucosa y al crecimiento celular. Fallas en la respuesta a insulina conducen a diabetes mientras que en ciertos tipos de cáncer se encontraron aumentos en la actividad de esta vía se señalización. En mamíferos el gen del receptor de insulina (IR) adquirió un exón adicional junto con la capacidad de procesarlo alternativamente originando dos isoformas, IR-A e IR-B. En esta tesis se presenta el desarrollo de herramientas que permitieron visualizar procesos celulares in vivo por técnicas de microscopía. Esto permitió estudiar la endocitosis de las dos isoformas del IR en células individuales en respuesta a insulina y al factor de crecimiento similar a la insulina II (IGF-II). Una mayor internalización para el IR-A que para el IR-B en respuesta a ambos ligandos fue demostrada. Esto condujo a estudiar la señalización río abajo del receptor observando que la insulina desencadena una cascada mitogénica a través del IR-A y una predominantemente metabólica a través del IR-B. Cuando el estudio se extendió al IGF-II, pudo mostrarse que un mismo receptor sea mitogénico (IR-A) o metabólico (IR-B) se comporta diferente en respuesta a un ligando mitogénico (IGF-II) o metabólico (insulina). La existencia de los híbridos IR-A/IR-B en la membrana fue estudiada generando una quimera del IR capaz de ser modificada extracelularmente y que actúa como dominante negativo selectivo del efecto mitogénico. Esto permitió detectar los dímeros en membrana, analizar su formación y estudiar la señalización diferencial de cada isoforma. Por microscopía de fuerza atómica se midió la interacción molecular entre la insulina y cada IR mostrando que la misma es mayor para el IR-A. Se propone a la dinámica de internalización como el mecanismo responsable de la señalización diferencial de las dos isoformas del IR en respuesta a un mismo ligando. Se plantea un modelo de activación diferencial donde el IR-A se activa más y de forma más sostenida internalizándose más rápido, activando así la vía mitogénica desde los endosomas. Por otro lado, la isoforma B se internaliza de forma más lenta, permitiendo mayor señalización desde la membrana, reclutando moléculas efectoras de esta vía, gatillando la fosforilación de Akt, regulando la actividad de enzimas metabólicas. Insulin signalling comprises a complex cascade of events playing a key role in the regulation of glucose metabolism and cellular growth. Failures in its function lead to diabetes and disregulations of these pathways were described in many cancer types. In mammals, the insulin receptor (IR) gene acquired an additional exon together with the ability to alternatively skip it in a developmental and tissue-specific manner leading to two isoforms, IR-A and IR-B. This thesis presents the design and development of different tools which allow the visualization of cellular processes in vivo by microscopy. This strategy allowed the study of endocytosis in individual cells after insulin and insulin like growth factor II (IGF-II) binding. The quantitative study revealed a higher rate of endocytosis of IR-A than IR-B induced by both ligands. These differences leaded to study the downstream signaling. It was possible to demonstrate that insulin triggers a mitogenic cascade via IR-A and a more metabolic signaling through IR-B. The study of IGF-II showed that each receptor behaves differently upon activation by a mitogenic ligand (IGF-II) or a metabolic one (insulin). The existence of IR-A/IR-B hybrids in the plasma membrane was studied in this thesis by the generation of an IR chimera that could be modified at the cell surface. This chimera showed behaviour of a selective dominant negative of the mitogenic effect. It was possible to detect the dimers in the plasma membrane, analyze their formation and study the isoform differential signaling. Atomic force microscopy was used to measure the molecular interaction between each IR and insulin. Single molecule force spectroscopy showed that interaction of insulin with IR-A is stronger than with IR-B. This thesis proposes the internalization dynamics as a responsible mechanism for the differential signaling of IR isoforms. By this model, IR-A gets activated and internalized faster triggering mitogenic cascade from the endosomes. On the other hand, IR-B is internalized in a slower manner allowing a higher signaling from the membrane, recruiting effector molecules, triggering Akt phosphorylation, regulating metabolic enzymes and GLUT4 translocation to the plasma membrane. Fil: Giudice, Jimena. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Instituto de Investigaciones Agropecuarias y Forestales. Facultad de Biología. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Facultad de Agrobiología. Facultad de Químico Farmacobiología. Programa Institucional de Maestría en Ciencias Biológicas Bovine mastitis is considered one of the most important diseases in dairy farming worldwide. This condition is characterized by an inflammatory response of the mammary gland of multifactorial origin, mainly caused by bacterial infections. Staphylococcus aureus is the prevalent isolates pathogen most often in cases of mastitis (> 70%), it has the characteristic of being a facultative intracellular pathogen, invading epithelial cells by a mechanism of endocytosis. In a previous study it showed that the bovine prolactin (bPRL, 5 ng / ml) stimulates endocytosis of S. aureus (ATCC 27543) by bovine mammary epithelial cells (CBSS), and together with the infection, regulates elements of the response innate immune in CBSS. The expression of these elements depends on the activation of the transcription factor NF-kB, and has recently been shown to activate NF-kB bPRL factor in bovine mammary epithelium regulating the expression of proinflammatory cytokines. However, activation of this transcription factor is regulated by the PRL during the infectious process with S. aureus is itself known. Based on the above, the objective of this study was to determine the regulation of signaling pathway NF-kB during endocytosis of S. aureus in bovine mammary epithelial cells stimulated with bPRL. The results showed that the bPRL induces activation of NF-kB in the CBSS. While S. aureus inhibits nuclear translocation of this factor, even in bPRL (5 ng / ml), which promotes the endocytosis of the bacteria. Regarding the regulation of expression of elements of the innate immune response, the data showed that bPRL (5 ng / ml) induces the expression of mRNA of TNF-a, TAP, iNOS, besides NO production in the CBSS. La mastitis bovina es considerada una de las enfermedades de mayor relevancia en la ganadería lechera a nivel mundial. Esta patología se caracteriza por una respuesta inflamatoria de la glándula mamaria de origen multifactorial, ocasionada principalmente por infecciones bacterianas. Staphylococcus aureus es el patógeno prevalente que se aísla con mayor frecuencia en casos de mastitis (> 70%), éste posee la característica de ser un patógeno facultativo intracelular, invadiendo a las células epiteliales por un mecanismo de endocitosis. En un trabajo previo se demostró que la prolactina bovina (bPRL, 5 ng/ml) estimula la endocitosis de S. aureus (ATCC 27543) por células epiteliales mamarias bovinas (CEMB), y en conjunto con la infección, regula elementos de la respuesta inmune innata en las CEMB. La expresión de estos elementos depende de la activación del factor transcripcional NF-kB, y recientemente se ha demostrado que la bPRL activa al factor NF-kB en el epitelio mamario bovino regulando la expresión de citocinas proinflamatorias. Sin embargo, se desconoce sí la activación de este factor de transcripción es regulado por la PRL durante el proceso infeccioso con S. aureus. Con base en lo anterior, el objetivo del presente trabajo fue determinar la regulación de la vía de señalización de NF-kB durante la endocitosis de S. aureus en células de epitelio mamario bovino estimuladas con bPRL. Los resultados mostraron que la bPRL induce la activación de NF-kB en las CEMB. Mientras que S. aureus inhibe la translocación nuclear de este factor, aún en presencia de bPRL (5 ng/ml), lo cual favorece la endocitosis de la bacteria. Con respecto a la regulación de la expresión de elementos de la respuesta inmune innata, los datos mostraron que la bPRL (5 ng/ml) induce la expresión de los mRNA de TNF-a, TAP, iNOS, además de la producción de NO en las CEMB.

El proceso de reciclado de las vesículas sinápticas es una característica integral de la función presináptica y determina su habilidad para mantener la liberación del neurotransmisor durante una actividad repetitiva. En esta tesis, caracterizamos el reciclado de las vesículas sinápticas en el terminal neuromuscular de ratón y estudiamos su regulación por los canales de calcio dependiente de voltaje (CCDV), específicamente el canal de calcio tipo L, y por el neuromodulador adenosina. Para desarrollar este trabajo, utilizamos indicadores fluorescentes tipo FM para marcar la membrana de las vesículas sinápticas y técnicas electrofisiológicas para cuantificar la liberación de las vesículas sinápticas. En el terminal neuromuscular de ratón, determinamos que el reciclado vesicular es regulado por el nivel de actividad neuronal. La estimulación a alta frecuencia produce la movilización de dos pooles funcionales de vesículas sinápticas que difieren en su disponibilidad de liberación. En base a esta característica, definimos estos pooles como pooles vesiculares de liberación rápida o lenta. Por otro lado, evidenciamos que la duración de la estimulación a alta frecuencia determina un reciclado vesicular selectivo y secuencial hacia estos pooles vesiculares funcionales. El influjo de calcio a través de los CCDV tiene un papel clave en la señalización neuronal durante el proceso de la neurotransmisión, coordinando el reciclado de las vesículas sinápticas. En este trabajo presentamos evidencias directas que vinculan al CCDV tipo L con la regulación del reciclado vesicular. Hemos confirmado la funcionalidad de CCDV tipo L durante estadios plásticos del terminal neuromuscular. Es decir, observamos la participación de estos canales únicamente durante períodos de actividad neuronal sostenida e intensa. Se demostró que el influjo de calcio a través del CCDV tipo L promueve la endocitosis y la recuperación de las vesículas sinápticas hacia el pool vesicular de liberación rápida, regulando la eficiencia sináptica durante la actividad neuronal intensa. La adenosina es un neuromodulador bien establecido en la unión neuromuscular de ratón. En ausencia del efecto de la adenosina endógena sobre los receptores A1, evidenciamos un incremento en la exocitosis vesicular y en el tamaño del pool de reciclado vesicular, y un direccionamiento de reciclado vesicular hacia el pool de liberación rápida. Debido a que la adenosina y el bloqueo del CCDV tipo L presentaron un efecto similar sobre el reciclado vesicular, una hipótesis plausible fue que la adenosina a través de un efecto inhibitorio sobre el CCDV tipo L afectaría el reciclado vesicular. A través de evidencias experimentales esta hipótesis fue rechazada. En base a las similitudes observadas en el reciclado vesicular, es factible suponer que tanto la adenosina como el bloqueante del CCDV tipo L inhiben un mecanismo común. The recycling of synaptic vesicles is an integral property of presynaptic function and it determines its ability to sustain neurotransmitter release during repetitive activity. In this thesis, we characterized vesicular recycling at mouse neuromuscular terminal and studied its regulation by voltage dependent calcium channels (VDCC), in particular the L-type calcium channel, and by the neuromodulator adenosine. We used FM fluorescent dyes in order to label synaptic vesicle membrane and electrophysiological techniques to quantify vesicle release. We found that vesicle recycling at mouse neuromuscular terminal is regulated by the level of neuronal activity. High frequency stimulation mobilizes two functional synaptic vesicle pools that differ in their release availabilities. Based on this characteristic, we defined these pools as the fast release pool and the slow release pool. On the other hand, we found that the duration of the high frequency stimulation produces selective and sequential vesicle recycling to these functional vesicle pools. Calcium influx through VDCC plays a key role in neuronal signaling during neurotransmission since it coordinates vesicle recycling. In this thesis, we show direct evidence that relate the L-type VDCC to vesicle recycling regulation. We have confirmed the L-type VDCC functionality during the plastic phase of the neuromuscular terminal. In other words, these channels participate only during intense and sustained neuronal activity. We demonstrate that calcium influx through L-type VDCC promotes endocytosis and vesicle retrieval towards the fast release vesicle pool, regulating synaptic efficiency during intense neuronal activity. Adenosine is a well known neuromodulator at the mouse neuromuscular junction. In the absence of the effect of endogenous adenosine on A1 receptors, we found an increase of the amount of vesicle exocytosis and the size of the vesicle recycling pool. In addition, we found out that vesicles are preferentially recycled under this condition to the fast release pool. Since both the addition of adenosine and an L-type VDCC blocker give rise to a similar effect on vesicle recycling, we hypothesized that adenosine produce an inhibitory effect on the L-type VDCC, affecting vesicle recycling. However, our experimental evidence allows rejecting this hypothesis and suggests that both adenosine and the L-type VDCC blocker inhibit the same mechanism. Fil: Perissinotti, Paula Patricia. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

El virus Junín (JUNV), agente etiológico de la fiebre hemorrágica argentina, es un miembro de la familia Arenaviridae. Es un virus envuelto de genoma ARN segmentado cuyo ciclo de replicación ha sido caracterizado en varios aspectos. La entrada a las células blanco se realiza vía endocitosis mediada por receptor y posterior fusión dependiente de pH. Una vez que la nucleocápside se encuentra dentro del citoplasma se expresan 5 proteínas estructurales, mediante una estrategia de codificación ambisentido. La proteína mayoritaria asociada a la nucleocápside es denominada NP. A partir de un único precursor glicoproteico (GPC), se obtienen dos glicoproteínas virales denominadas GP1 y GP2 y el péptido señal (SP). Estos conforman las estructuras claviformes encontradas en la envoltura viral. Se desconocen hasta el momento los mecanismos detallados y las estructuras celulares involucradas en los eventos tempranos del ciclo de replicación viral. En este trabajo se estudiaron aspectos de la interacción virus-célula huésped, caracterizando el rol de distintas proteínas celulares en los eventos tempranos del ciclo de multiplicación del JUNV. En primer lugar se analizó la vía de entrada utilizada por el JUNV para ser endocitado en las células, así como también se estudiaron las proteínas celulares esenciales para este proceso. Con este fin se utilizaron plásmidos que expresan proteínas dominantes negativas, encontrándose que es esencial la Eps-15 y dinamina en el proceso de endocitosis, mientras que las proteínas Rab5 y Rab7 juegan un rol esencial en el paso posterior a la internalización y previo a la fusión. Luego se estudio la interacción del virus con las principales redes del citoesqueleto: los microfilamentos y los microtúbulos. Se utilizaron compuestos capaces de despolimerizar o estabilizar específicamente cada una de estas redes. La internalización del virus disminuyó de manera dosisdependiente en presencia de compuestos que alteraban la integridad de los microfilamentos o estabilizaban los microtúbulos. El tropismo de los virus está regulado por la interacción entre factores celulares y virales durante la transmisión, diseminación y replicación en el huésped. La unión del virus a receptores de superficie específicos determina la susceptibilidad de las células a ser infectadas. La entrada y diseminación de diferentes familias virales puede ser mediada por lectinas de tipo C, como DC-sign o L-sign. Por este motivo se estudió si estas actúan en la infección con el JUNV. Para esto se utilizaron células relativamente no permisivas a la infección por JUNV como las células CHO, las cuales al expresar transientemente las lectinas DC-sign o L-sign fueron infectadas por el JUNV de forma altamente eficiente. Fue demostrado que las células 3T3, que en su forma salvaje no permiten la infección del JUNV, se vuelven permisivas al mismo al expresar de forma estable estas lectinas, y esta interacción es específica lo cual fue demostrado al bloquear la infección con anticuerpos específicos contra las lectinas o el compuesto mannan. Actualmente no hay tratamiento para las fiebres hemorrágicas, por lo que existe una necesidad crítica de desarrollar terapias efectivas para tratar los brotes anuales y contrarrestar su potencial uso como armas biológicas. Todos los virus causantes de fiebres hemorrágicas infectan preferencialmente monocitos, macrófagos y células dendríticas durante las etapas tempranas de la enfermedad. Es por este motivo que estas células representan un blanco potencial en el tratamiento de las fiebres hemorrágicas. Junín virus (JUNV), the etiological agent of argentine hemorrhagic fever, is a member of the Arenaviridae family. The viral cycle multiplication of this RNA virus has been characterized in different aspects. The entrance in the target cells is performed by receptor-mediated endocytosis following pH dependant fusion step. Once the nucleocapsids are within the cytoplasm the ambisense strategy allows expression of five structural proteins. The major nucleocapsid associated protein is named NP. As a result of the glycoprotein precursor synthesis and after its maturation, two glycoproteins and a signal peptide are obtained. These components, named GP1, GP2 and SP, form the claviform structures found in the viral envelope. At this moment, the detailed mechanisms and cellular structures involved in the early steps of the virus replication cycle are not known although. In this work the interaction between virus and host cells was studied, characterizing the role of cellular proteins in early events of virus replication cycle. It was first evaluated the way of entry used by JUNV to entry host cells and the proteins involved in this process. With this end, plasmids that express dominant negative mutants were used, demonstrating that EPS-15 and dynamin were key proteins in this step, while Rab5 and Rab7 were essential in a step after entry prior to fusion. Then the interaction between JUNV and the main components of the cytoskeleton was evaluated. Compounds that specifically disrupt or stabilized microfilaments or microtubules were used. Virus entry was extremely reduced in a dose dependent way in the presence of compounds that depolimerized microfilaments or stabilized microtubules. Target cell tropism of enveloped viruses is regulated by interactions between viral and cellular factors during transmission, dissemination, and replication within the host. Binding of viral envelope glycoproteins to specific cellsurface receptors determines susceptibility to viral entry. The entry and dissemination of viruses in several families can be mediated by C-type lectins such as DC-sign and L-sign. Results from transduction with JUNV pseudovirus show that infection of relatively non-permissive CHO cells was markedly enhanced when we over expressed DC-sign or L-sign. Experiments using non-permissive mouse 3T3 cells showed that they become permissive to JUNV pseudovirus transduction when they stable express DC-sign, or its homologue L-sign, and that transduction of 3T3 stable expressing DC-sign or L-sign is blocked by anti–DC-sign and/or L-sign antibodies and mannan. Therefore hDC- and hL-sign can act as a novel attachment factors that mediate entry of JUNV. To the date there is no treatment for hemorrhagic fevers, so there is an important requirement to develop specific therapies against annual outbreaks and reduce its potential use as a bioterrorism agent. All hemorrhagic fever viruses infect preferentially monocytes, macrophages and dendritic cells during early stages of the disease. For this reason these cells represent a potential target in the treatment of hemorrhagic fevers. Fil: Martínez, María Guadalupe. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

La existencia de un receptor específico para la albúmina en el cerebro, responsable de la elevada concentración de la albúmina en el cerebro durante los primeros días de vida posnatal y cuya expresión se encuentre regulada durante el desarrollo, se ha postulado durante décadas. Sin embargo, se desconocía todavía la naturaleza del receptor, así como el tipo de endocitosis empleada para la internalización de la albúmina en los astrocitos. En este trabajo, hemos observado que la megalina, la caveolina-1 y la caveolina-2, pero no la clatrina, colocalizan con la albúmina en la membrana plasmática. Además, dado que el silenciamiento de la megalina, de la caveolina-1 y de la caveolina-2, pero no el de la clatrina, reducen la capacidad de la albúmina para unirse a la membrana e internalizarse, se puede concluir que la megalina es el receptor de la albúmina en los astrocitos y que la endocitosis de la albúmina en los astrocitos está mediada por caveolas y no por vesículas recubiertas de clatrina. La internalización de la albúmina en los astrocitos promueve la sintesis del factor neurotrófico ácido oleico, que induce la diferenciación neuronal (aumento de las neuritas y aumento de las proteínas marcadoras de diferenciación axonal, GAP-43, y dendrítico, MAP-2). Dado que el ácido oleico es un ligando y activador de los PPARs, hemos investigado el papel de estos como receptores para el ácido oleico en neuronas. Nuestros resultados muestran que, pese a que las neuronas en cultivo primario expresen las tres isoformas de los PPARs (?,? and ?), solo la activación por ligandos específicos del PPAR?, y no del PPAR? y del PPAR?, induce la diferenciación neuronal. Además, el ácido oleico activa el PPAR? en las neuronas en cultivo. Finalmente, el silenciamiento del PPAR? previene la diferenciación neuronal inducida por el ácido oleico, lo que sugiere que el PPAR? es el receptor del ácido oleico para su efecto neurotrófico en la diferenciación neuronal., The existence of a specific receptor for albumin in the newborn brain, responsible for the high concentrations of albumin in the brain during development and whose expression would be regulated during that period, has been suggested for more than two decades. Nonetheless, the nature of this receptor as well as the mechanism of endocytosis used for albumin uptake in astrocytes was still unknown. In this work, we found that megalin, caveolin-1 and caveolin-2, but nor clathrin, colocalize with albumin in the plasma membrane. In addition, when the expression of megalin, caveolin-1 and caveolin-2 was silenced by siRNA, albumin binding and internalization was strongly reduced. Clathrin silencing had no effect on albumin binding and uptake. These results indicate that megalin is a receptor for albumin in astrocytes and that albumin uptake in astrocytes is mediated by caveolae and not by clathrin-coated vesicles. The uptake of albumin in astrocytes promotes the synthesis oleic acid, a neurotrophic factor for neurons that induce neuronal differentiation (promoting neurite outgrowth and increasing the expression of molecular markers of axonal and dendritic differentiation, GAP-43 and MAP-2, respectively). Since oleic acid is a ligand and activator of PPARs, we investigated PPARs as receptors for oleic acid in neurons. Our results show that, although all PPAR isoforms (?,? and ?) are expressed in neurons from primary culture, only PPAR? activation by specific agonists induced neuronal differentiation, while PPAR? and ? agonists did not modify neuronal differentiation. Besides, our results indicate that oleic acid activates PPAR? in neurons. Finally, the neurotrophic effect of oleic acid is prevented in neurons after PPAR? has been silenced by siRNA, suggesting that PPAR? is the receptor for oleic acid in neurons, mediating its neurotrophic effect.

La mastitis bovina provoca la infl amación de la glándula mamaria y es ocasionada principalmente por Staphylococcus aureus. Presenta una incidencia mayor durante el parto o después de la lactancia, periodos en que la prolactina (PRL) tiene función relevante, aunque se desconoce su participación en la infección. En este trabajo se evaluó in vitro, el efecto de la PRL bovina (1-50 ng/mL) sobre la endocitosis y proliferación intracelular de S. aureus (ATCC 27543) en células epiteliales mamarias bovinas (CEMB). Las CEMB tratadas durante 24 h con 5 ng/mL de bPRL incrementan ~3 veces la endocitosis de S. aureus, además de inducir la proliferación bacteriana. Este efecto fue revertido de manera específi ca tratando las CEMB con IgG anti-bPRL. Las CEMB tratadas con bPRL (5 ng/mL) presentaron mayor endocitosis de S. aureus (~3 veces), pero el número de células infectadas no se modifi có. En conclusión, la presencia de bPRL favorece la endocitosis y la proliferación de S. aureus en las CEMB.