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Tese de Doutoramento em Ciências Veterinárias, Biomedicina O cancro da bexiga é um problema de saúde pública mundial extremamente relevante. Apesar dos avanços registados no seu tratamento, as taxas de morbilidade e mortalidade continuam elevadas, tornando premente a necessidade de novas abordagens terapêuticas. O mammalian target of rapamycin (mTOR) é considerado uma nova e promissora terapia alvo essencialmente devido à sua interferência no desenvolvimento do cancro. O objetivo deste estudo foi analisar a atividade antineoplásica de três inibidores do mTOR (sirolimus, everolimus e temsirolimus), assim como a sua capacidade em aumentar a ação da gemcitabina e da cisplatina, em três linhas celulares tumorais da bexiga humana: 5637(não invasiva), T24 e HT1376 (invasivas). Para atingir os objetivos propostos foi fundamental proceder a uma caracterização mais completa destas linhas celulares por citogenética convencional, hibridação in situ fluorescente, hibridação genómica comparativa por array e multiplex ligation-dependent probe amplification. O efeito do fármaco sirolimus foi testado na linha celular T24; o efeito dos fármacos everolimus, temsirolimus, gemcitabina e cisplatina, isolados e combinados, foram avaliados nas três linhas celulares. Após 72 horas de exposição aos fármacos a proliferação celular, a morfologia celular, os danos no DNA, a distribuição das células pelo ciclo celular, a apoptose e a autofagia foram analisados utilizando o 3-(4,5-dimetiltiazol- 2-il)-2,5 difenil-tetrazólio e a expressão do Ki-67, a coloração Leishman, o terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling e a técnica dos cometas, a citometria de fluxo, o M30CytoDEATH anticorpo e a monodansilcadaverina, respetivamente. Além disso, a expressão do mTOR, do AKT e das suas formas fosforiladas foram analisadas por western blot nas três linhas celulares, após o tratamento com o everolimus e o temsirolimus. In vivo as investigações preliminares com everolimus foram realizadas utilizando o modelo de cancro da bexiga de murganho quimicamente induzido pela N-butil-N-(4-hidroxibutil) nitrosamina. As linhas celulares utilizadas neste estudo representam os dois subtipos mais comuns de cancro da bexiga: a linha celular T24 representa um subtipo FGFR3/CCND1, enquanto as linhas celulares 5637 e HT1376 representam o outro subtipo com o perfil mutacional E2F3/RB1. A linha celular 5637 tem um fenótipo menos agressivo enquanto a HT1376 é ilustrativa de um perfil mais invasivo. No que concerne ao efeito dos fármacos testados, o sirolimus foi eficaz em reduzir a proliferação celular da linha T24. O everolimus induziu uma inibição ligeira da proliferação celular apenas na linha 5637, bem como uma moderada indução de apoptose, danos no DNA e acumulação na fase G0/G1 do ciclo celular. No modelo in vivo o everolimus não interferiu no desenvolvimento das lesões uroteliais. O temsirolimus isolado reduziu significativamente a proliferação celular, provocou uma acumulação das células na fase G0/G1 do ciclo celular, aumentou a apoptose e a autofagia. Estes efeitos ocorreram nas três linhas celulares. Não houve diferenças significativas na expressão do mTOR, AKT e nas suas formas fosforiladas em todas as linhas celulares após a exposição ao everolimus e ao temsirolimus. Em relação à associação de fármacos, o everolimus melhorou significativamente os efeitos da gemcitabina e da cisplatina. Nas três linhas a proliferação celular foi reduzida, ocorrendo a paragem do ciclo celular na fase G0/G1 e o aumento da apoptose e danos no DNA. As linhas celulares 5637 e T24 foram as mais sensíveis à combinação do everolimus e da gemcitabina. Por sua vez, no tratamento combinado do everolimus e da cisplatina, as linhas celulares 5637 e a HT1376 apresentaram os melhores resultados. A resposta foi mais evidente na combinação do temsirolimus, quer com a gemcitabina quer com a cisplatina, do que com o temsirolimus isolado. Ocorreu uma menor proliferação celular, uma paragem do ciclo celular na fase G0/G1 mais evidente e um aumento da apoptose e da autofagia. Observou-se um padrão semelhante ao obtido na conjugação da gemcitabina e da cisplatina com o everolimus, sendo a 5637 e a T24 as linhas celulares mais sensíveis à conjugação do temsirolimus com gemcitabina e as linhas 5637 e HT1376 as que melhor responderam à conjugação do temsirolimus com cisplatina. Verificou-se que a linha celular não invasiva 5637 foi sempre a mais sensível a todos os fármacos. Observou-se igualmente que as combinações com a cisplatina (everolimus mais cisplatina ou temsirolimus mais cisplatina) foram sempre mais eficazes. Em conclusão, demonstrou-se que as linhas celulares utilizadas neste estudo são representativas do cancro da bexiga humana, sendo, portanto, uma ferramenta importante e muito útil na investigação terapêutica destes tumores. O uso individual dos inibidores do mTOR revelou-se pouco eficaz, particularmente nas linhas celulares invasivas T24 e HT1376. Os resultados obtidos na linha não invasiva 5637 sugerem o everolimus e o temsirolimus como terapias alternativas a estudar, em particular nos tumores não invasivos que não respondem às terapêuticas disponíveis. Quando usados em combinação com os fármacos atualmente utilizados (cisplatina e gemcitabina) no tratamento do carcinoma da bexiga, o resultado obtido nas três linhas tumorais foi nitidamente superior. O presente estudo mostra que, dependendo do perfil genético do tumor, as conjugações dos inibidores do mTOR (everolimus e temsirolimus) com a gemcitabina e com a cisplatina podem no futuro ser potenciais regimes terapêuticos no carcinoma da bexiga. Urinary bladder cancer is a relevant worldwide public health problem. Despite treatment advances, morbidity and mortality rates remain high and new approaches are needed. The mammalian target of rapamycin (mTOR) is considered a new promising targeted therapy primarily due to its interference in the development of cancer. The aim of this study was to analyze the antineoplastic effect of three mTOR inhibitors (sirolimus, everolimus and temsirolimus), and their ability to enhance gemcitabine and cisplatin activity, on three human urinary bladder cancer cell lines: 5637 (non-muscle-invasive), T24 and HT1376 (muscle-invasive). To achieve the proposed objectives it was essential to further characterize these cell lines by conventional cytogenetic, fluorescence in situ hybridization, array comparative genomic hybridization and multiplex ligation-dependent probe amplification. The effect of the sirolimus drug was tested on the T24 cell line; the effect of the everolimus, temsirolimus, gemcitabine and cisplatin drugs, alone and in combination, were evaluated in all three cell lines. After 72 hours of drug exposure cell proliferation, cell morphology, DNA damage, cell cycle distribution, apoptosis and autophagy were analysed using the 3-[4,5- dimethyl-2-thiazolyl]-2,5-diphenyltetrazolium and Ki-67 expression, Leishman staining, terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling and comet assay, flow cytometry, M30CytoDEATH antibody and monodansylcadaverine, respectively. Furthermore, the expression of mTOR, AKT and their phosphorylated forms were investigated by western blot on the three cell lines, after everolimus and temsirolimus treatment. In vivo, preliminary investigations with everolimus were also performed using the urinary bladder mouse cancer of chemically induced by N-butyl-N-(4-hydroxybutyl) nitrosamine model. We found that the cell lines used in this study cover the two most common subtypes of urinary bladder cancer: the T24 cell line represents a FGFR3/CCND1 subtype, while the 5637 and the HT1376 represents the E2F3/RB1 pathway mutational profile. The 5637 cell line is representative of a less aggressive phenotype, whereas the HT1376 is illustrative of a more invasive profile. Regarding the effect of the drugs tested, sirolimus was effective in reducing cell proliferation on the T24 cell line. Everolimus induced a slight inhibition of cell proliferation only on the 5637 cell line, and a moderate induction of apoptosis, DNA damage and accumulation in the G0/G1 phase of the cell cycle. In in vivo experiment everolimus did not interfered with the development of urothelial lesions. Temsirolimus, isolated, induced a significant decrease of cell proliferation, caused an accumulation of cells in G0/G1 phase, increased apoptosis and autophagy. These effects occurred on the three cell lines. No significant differences in the expression of mTOR, AKT and their phosphorylated forms were found in all cell lines after everolimus and temsirolimus exposure. Regarding the association of drugs, everolimus significantly improved the effects of gemcitabine and cisplatin: in all cell lines a reduced cell proliferation was observed, with arrest of cell cycle at G0/G1 phase with increased apoptosis and DNA damage. The 5637 and the T24 cell lines were more sensitive to the combination of everolimus and gemcitabine. In turn, for the combined treatment of cisplatin and everolimus, the 5637 and the HT1376 cell lines showed the best results. A more evident response was obtained with temsirolimus in combination with either gemcitabine or cisplatin than with temsirolimus isolated. There was less cell proliferation, a more apparent cell cycle arrest in G0/G1 phase and an increase in apoptosis and autophagy. We observed a pattern similar to that obtained on the combination of everolimus with gemcitabine and cisplatin: the 5637 and the T24 cell lines were more sensitive to the combination temsirolimus with gemcitabine and the cell lines 5637 and HT1376 presented a better response to temsirolimus combination with cisplatin. It was found that the non-muscle-invasive 5637 cell line was always the most susceptible to all drugs. Furthermore, it was also observed that the combined treatments that used cisplatin (everolimus plus cisplatin, or temsirolimus plus cisplatin), were always more effective. In conclusion, it was demonstrated that the cell lines used in this study are representative of human bladder cancer and are therefore an important and useful tool in the research therapy of such tumours. On these cell lines, the mTOR inhibitors used isolated were not highly effective drugs, especially on the muscle-invasive T24 and HT1376. The results obtained on the 5637 non-muscle-invasive cell line suggest everolimus and temsirolimus as alternative therapies to study, particularly in non-invasive tumours that do not respond to available therapies. When used in combination with drugs currently used (cisplatin and gemcitabine) on the treatment of urinary bladder cancer, the results obtained on the three tumour cell lines were clearly superior. The present study shows that, depending on the tumour’s genetic profile, the combinations of mTOR inhibitors (everolimus and temsirolimus) with gemcitabine and cisplatin may be in the future potential therapeutic regimens in bladder carcinoma.

Tese de Doutoramento em Ciências Veterinárias, Ramo Biomedicina O carcinoma da bexiga constitui uma doença frequente com elevado impacto sócioeconómico em todo o mundo, pelo que o uso de modelos pré-clínicos é fundamental na pesquisa de novos tratamentos mais eficazes. Através da utilização de três linhas celulares comerciais humanas (T24, 5637, HT1376) de carcinoma da bexiga e do modelo animal de indução química de lesões uroteliais com recurso à exposição de murganhos ICR à N-butil-N-(4-hidroxibutil) nitrosamina (BBN), foram estabelecidos como objetivos para esta tese: estudar os efeitos in vitro de várias concentrações de cisplatina, malato de sunitinibe e meloxicam; analisar in vitro os efeitos da associação de várias concentrações de malato de sunitinibe com a cisplatina e com o meloxicam; estudar in vivo os efeitos do meloxicam e da infusão do chá verde nas lesões uroteliais do murganho induzidos pela administração da BBN; caracterizar citogeneticamente um carcinoma papilar urotelial de baixo grau de murganho induzido pela BBN. As linhas celulares T24, 5637 e HT1376 foram expostas à cisplatina, ao malato de sunitinibe e ao meloxicam, como drogas isoladas e em diferentes combinações. A proliferação celular, o ciclo celular, a apoptose, os danos no DNA e a autofagia foram avaliados pelos seguintes métodos: 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio, citometria de fluxo, anticorpo M30 CytoDEATH, ensaio do cometa, e colorações monodansilcadaverina e laranja de acridina. Para o estudo da associação de dois fármacos foi calculado o índice de combinação com recurso ao método de Chou e Talalay. No estudo in vivo para a avaliação do efeito do meloxicam, murganhos machos foram expostos à BBN na água de bebida durante 12 semanas, sendo depois administrado durante 6 semanas por via intraperitoneal este fármaco. As lesões uroteliais foram avaliadas pela coloração convencional de hematoxilina e eosina (H&E). Foi estudado o efeito do meloxicam sobre a função hepática e renal. No estudo in vivo do efeito da exposição contínua ao chá verde durante 20 semanas, a administração da BBN foi feita por entubação gástrica durante 10 semanas, sendo caracterizadas, após sacrifício dos animais, as lesões uroteliais por H&E. A constituição cromossómica do carcinoma papilar urotelial de baixo grau do murganho, foi analisada por citogenética convencional e por hibridização in situ por fluorescência. Isoladamente, a exposição aos três fármacos diminuiu significativamente a proliferação celular das linhas celulares de carcinoma da bexiga (p