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Tesis doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de lectura: 12-11-2019, Esta tesis tiene embargado el acceso al texto completo hasta el 12-05-2021, Las terapias actuales contra el cáncer poseen una eficacia limitada debido a la falta de especificidad, a su alta toxicidad y a su limitada capacidad de penetración en los tumores. La capacidad natural de las bacterias para colonizar y alcanzar áreas profundas del tumor las hace potenciales vehículos para la liberación de moléculas terapéuticas de manera eficiente. La biología sintética nos permite la modificación de las bacterias para mejorar la colonización de los tumores, aumentar la especificidad, reducir la toxicidad, y realizar una liberación precisa de moléculas terapéuticas en el interior del tumor. En esta tesis doctoral, la investigación ha sido dirigida a la modificación genética de la bacteria Escherichia coli (E. coli) utilizando biología sintética para conseguir una adhesión e invasión específica de las células tumorales, así como la liberación de una proteína "cargo" de interés en el citoplasma de la célula tumoral. Además hemos investigado la influencia de la motilidad bacteriana durante la adhesión específica a la célula tumoral. Primero, desarrollamos adhesinas sintéticas (SAs) que permiten la adhesión programada de E.coli a células tumorales que expresan el factor de crecimiento epidérmico (EGFR), un receptor tirosina-quinasa sobre-expresado en muchos tumores epiteliales humanos como por ejemplo los carcinomas de vejiga y colon. Las adhesinas sintéticas exponen en la superficie bacteriana un anticuerpo monodominio que se une específicamente a un antígeno expresado en la superficie de la célula tumoral (p.ej. EGFR). Hemos generamos SAs capaces de unir EGFR y se ha demostrado su correcta expresión en la superficie de E. coli tras su integración en el cromosoma bajo el control de un promotor constitutivo. Hemos demostrado que las bacterias modificadas mostraban una adhesión específica a células tumorales humanas de vejiga y colon que expresan EGFR. A continuación se generó la invasión específica de estas células tumorales insertando en el cromosoma de la cepa modificada con SAs, el gen que condifica a la proteína invasina (Inv) de Yersinia pseudotuberculosis bajo el control de un promotor inducible. Además, se testó la expresión de la invasina en combinación con la proteína formadora de poros Listeriolisina O (LLO) de Listeria monocytogenes para producir la liberación de una proteína "cargo" en el citoplasma de las células tumorales. Las adhesinas sintéticas contra EGFR también fueron expresadas en una cepa de E. coli productora de minicélulas, partículas bacterianas no vivas carentes de cromosoma, que pueden representar una alternativa interesante al uso de bacterias vivas frente a tumores. Hemos generado minicélulas expresando SAs que reconocen EGFR y una proteína "cargo" en el citoplasma. Sin embargo, en nivel de adhesión de estas minicélulas a las células tumorales que expresan EGFR fue muy bajo en comparación con las bacterias vivas expresando las mismas SAs. Este resultado nos condujo a estudiar las diferencias entre bacterias y minicélulas que podían explicar su distinto nivel de adhesión y descrubrimos la importancia de la motilidad bacteriana para una adhesión efectiva de E. coli a la célula tumoral diana. Los mutantes de E. coli sin flagelo, o que expresan un flagelo no motil, no se unían a las células tumorales a pesar de expresar las SAs. Esta baja adhesión de las bacterias no motiles no se podía compensar mediante el movimiento de las bacterias en un flujo unidireccional o por centrifugación para forzar el contacto con la célula. Descubrimos que tras un contacto inicial, E. coli debe establecer simultáneamente varios puntos de adhesión con la superficie de la célula diana para crear una adhesión permanente. La rotación flagelar en una sola dirección, a favor de las agujas del reloj o en contra de las agujas del reloj, es suficiente para generar estos movimientos locales y para establecer la adhesión permanente de la bacteria, que se caracteriza por la ausencia de movimiento de la bacteria. También observamos que ni la ruta para sensar superficies mediada por la lipoproteína NlpE, ni la proteína “freno” YcgR, que une el dinucleotido cíclico de guanosina difosfato (cyclic-di-GMP), son requeridas para la adhesión permanente de la bacteria a las células tumorales. Finalmente, hemos extendido nuestras conclusiones obtenidas con E. coli expresando SAs pueden aplicarse a la adhesión de bacterias patógenas a las células del huésped mamífero. Hemos demostrado que el flagelo es necesario para la adhesión mediada por adhesinas naturales presentes en E. coli uropatógenas y en Salmonella enterica sv. typhimurium, Este trabajo ha sido realizado en el Departamento de Biotecnología Microbiana del Centro Nacional de Biotecnología del Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CNB-CSIC), gracias a la financiación recibida de la Fundación “La Caixa”, el Ministerio de Economía y Competitividad (BIO2014-60305-R) y el Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (BIO2017-89081-R).

Tesis Doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de lectura: 26-10-2016, Esta tesis tiene embargado el acceso al texto completo hasta el 26-04-2018, Although most Escherichia coli isolates are harmless commensals of the gastrointestinal tract, some strains have acquired specific virulence factors, like pathogenicity islands, insertion elements (IEs), and prophages (PPs), to become highly adapted pathogens. The enteropathogenic E. coli (EPEC) is an important category of diarrheagenic bacteria causing acute and chronic diarrhea in infants. The hallmark of EPEC infection is the formation of attachment and effacement (A/E) lesion in the intestinal mucosa surface, which is characterized by the intimate attachment of the bacteria to the enterocyte, microvilli effacement, and the formation of actin-pedestal-like structures underneath the attached bacteria. EPEC is endowed of a 35 kb pathogenicity island called the locus of enterocyte effacement (LEE) that contains all the genes necessary for the assembly of a type III secretion system (T3SS) injectisome. Through these injectisome EPEC translocates multiple effector proteins into the host cell to subvert cellular functions in benefit of the infection. The prototype strain E2348/69 of EPEC O127:H6 is endowed of six LEE encoded effectors and 17 non-LEE encoded effectors. We have engineered a set of effector mutant EPEC strains using suicide vectors to delete the whole repertoire of effector genes of this prototype EPEC strain. Genome manipulation did not affect the functionality of the T3SS injectisome. The deletion strategy was based on suicide or termosensitive plasmid integration by homologous recombination and the markerless resolution of co-integrants after I-SceI digestion. We did markerless integration of map, espH and nleC in their original locus in EPEC2 (maintain EspZ and Tir), EPEC1 (maintaining only Tir) and EPEC0 (effector-less) mutant strains. These strains were able to translocate functional effectors from chromosomal expression into HeLa cells. We infected intestinal human biopsies with the effector mutant EPEC strains to identify the effectors necessary for the induction of the A/E lesion in human intestinal tissues. We found that while EPEC2 and EPEC1 mutant strains were able to induce the actin-pedestal formation in HeLa cells in vitro, none of the biopsies infected with these strains had A/E lesion. These results demonstrated that effectors besides Tir and EspZ are essential to induce the A/E lesion formation in intestinal biopsies. We infected intestinal biopsies with several effector mutant EPEC strains and we found that effectors located outside the LEE are essential to induce efficient A/E lesion on human intestinal biopsies. Additionally we found that non-LEE effectors are characterized by having an additive effect to allow the A/E lesion development in these intestinal surfaces and that Efa1/LifA homologous proteins seem to play a major role in this process. Our results with intestinal biopsies strongly suggest that non-LEE effectors are necessary for the efficient formation of A/E lesion in the in vivo situation., Aunque la mayoría de los aislados de Escherichia coli son comensales del tracto gastrointestinal, algunas cepas han adquirido factores de virulencia específicos, como islas de patogenicidad, elementos integrativos (IEs), y profagos (PPs), para convertirse en patógenos altamente adaptados. La cepas de Escherichia coli enteropatógena (EPEC) son una categoría importante de bacterias productoras de diarrea aguda y crónica en niños de corta edad. La característica distintiva de la infección por EPEC es la formación de la lesión llamada de unión y borrado A/E (Attaching and Effacing lesion), que se caracteriza por una unión intima de la bacteria a los enterocitos, la destrucción de las microvellosidades, y la formación de estructuras en forma de pedestales debajo de las bacterias unidas. EPEC está dotada de una isla de patogenicidad de 35 kb llamada LEE (locus of enterocyte effacement) que contiene todos los genes necesarios para ensamblar los inyectisomas del sistema de secreción tipo III (T3SS). A través de estos inyectisomas EPEC transloca proteínas efectoras a la célula huésped para manipular diversas funciones celulares en beneficio de la infección. La cepa prototipo E2348/69 de EPEC O127:H6 tiene seis efectores codificados en la isla LEE y 17 efectores codificados fuera de la isla LEE, llamados genéricamente efectores no-LEE. Hemos construido un grupo de cepas mutantes en efectores de EPEC, utilizando vectores suicidadas para delecionar el repertorio de efectores de la cepa prototipo. La manipulación genómica no afectó la funcionalidad de los inyectisomas del T3SS. La estrategia seguida se basa en el uso de plásmidos suicidas y termosensibles que se integran por recombinación homóloga, seguida de una resolución de los co-integrantes tras digestión con I-SceI, produciendo deleciones libres de marcadores. También hemos realizado una integración libre de marcas de los genes map, espH y nleC en su sitio original en el cromosoma de las cepas mutantes EPEC2 (mantiene EspZ y Tir), EPEC1 (mantiene Tir) y EPEC0 (sin efectores). Las cepas generadas son capaces de translocar desde su expresión cromosómica los efectores individuales de forma funcional a células HeLa. Infectamos biopsias intestinales humanas con las cepas de EPEC mutantes en efectores para identificar los efectores necesarios para inducir la formación de la lesión A/E en tejidos intestinales humanos. Identificamos que mientras las cepas mutantes EPEC2 y EPEC1 inducen la formación de pedestales de actina durante la infección in vitro de células HeLa, ninguna de las biopsias infectadas por estas cepas presentó lesiones A/E. Estos resultados demuestran que otros efectores además de Tir y EspZ son esenciales para inducir la formación de la lesión A/E en las biopsias intestinales. Infectamos biopsias intestinales con varias cepas de EPEC mutantes en efectores y descubrimos que los efectores localizados fuera de la isla LEE son esenciales para inducir eficientemente la lesión A/E en las biopsias intestinales humanas. Además demostramos que los efectores no-LEE se caracterizan por tener un efecto aditivo para permitir el desarrollo de la lesión A/E en estas superficies intestinales y que las proteínas homologas a Efa1/LifA parecen jugar un papel principal en este proceso. Nuestros resultados con biopsias intestinales apoyan un papel de los efectores no-LEE en la formación eficiente de la lesión A/E en la situación in vivo., Este trabajo ha sido realizado en el Departamento de Biotecnología Microbiana del Centro Nacional de Biotecnología del Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CNB-CSIC), gracias a un contrato predoctoral JAE del CSIC y a los fondos de investigación de los proyectos del Ministerio de Economía y Competitividad (BIO2011-26689) del Gobierno de España y del European Research Council (ERC-2012-ADG_20120314).

Tesis doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de lectura: 24-11-2015

Tesis doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología. Fecha de lectura: 16-10-2015

Tesis doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de lectura: 06-11-2015, El principal objetivo de esta tesis ha sido cuantificar y ampliar el conocimiento sobre los diferentes sistemas evolutivos implicados en el control de la tasa adaptativa en los seres vivos, usando para ello la bacteria modelo E. coli. La mutación, la recombinación y la transferencia horizontal de genes son los mecanismos más prominentes de la evolución bacteriana y todos ellos han sido abordados desde diferentes aproximaciones. En la primera parte de la tesis, se valoró el efecto en el incremento de la mutagénesis que producen ciertos tratamientos antibióticos y si este aumento es dependiente de la presencia de RecA, el activador del sistema SOS. Los resultados sugieren que, al menos ocho antibióticos de los trece ensayados, resultan mutagénicos, en la mayoría de los casos por un mecanismo RecA dependiente. Después se presentan los resultados relacionados con la caracterización funcional de dinF, un gen SOS que probablemente codifica una bomba de expulsión de agentes tóxicos. Se demuestró que su sobreexpresión es capaz de mitigar el estrés oxidativo celular, proteger frente a sales biliares e incluso reducir la tasa de mutación en un mutante mutT. En la tercera sección, se cuantificó la frecuencia de recombinación en una colección de cepas naturales, mediante el uso de una herramienta plasmídica construida ad hoc. Los resultados sugieren que la tasa de recombinación es muy diversa y dinámica en E. coli y que las cepas patógenas son más propensas a la recombinación que sus congéneres comensales. En la última parte, se describe un mecanismo de transferencia horizontal de genes mediado por sepiolita, un material arcilloso presente en el pienso animal. Se discuten, además, las potenciales implicaciones con respecto a la diseminación de resistencia a antibióticos y genes de virulencia en el ganado, The main objective of this dissertation was to quantify and enlarge the knowledge about the evolutionary systems that control the adaptive rate in all living beings, using the model bacterium E. coli. In this work, we have tackled in different ways the most recognized mechanisms of bacterial evolution, namely mutation, recombination and horizontal gene transfer, In the first part of the dissertation, the increase on mutagenesis that certain antibiotic treatments produce was quantified, assessing whether this increase is dependent on RecA (the SOS response activator). Our results demonstrate that at least eight out of the thirteen antibiotics tested are mutagenic, the most part by a RecA dependent mechanism. Subsequently, the results concerning the characterization of dinF, an SOS gene that probably codes for a toxic compound efflux pump, are presented. We have demonstrated that its overexpression reduces the intracellular oxidative stress levels, protects against bile salts and is able to reduce the mutation rate of a mutT deficient strain. In the third part, the extent of recombination in natural populations of E. coli, using a plasmidic genetic tool built ad hoc was assessed. Our results suggest that recombination can be very diverse and dynamic in the species. Furthermore, pathogenic strains show greater recombinational potential than their commensal counterparts, suggesting a link between virulence and recombination. In the last section, a new horizontal gene transfer mechanism mediated by Sepiolite, a clay material commonly used in animal feed is described. We discuss the potential implications that this transfer could represent in terms of the spread of antibiotic resistance and virulence genes, Gran parte del trabajo aquí presentado ha sido financiado gracias a los proyectos “Optobacteria: Multianalite automatic system for the detection of drug resistant bacteria” FP7 286998 y (2014) 968889 y REIPI RD12/0015/0012, concedidos al director de esta tesis, el Prof. Jesús Blázquez

Tesis doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Faculta de Ciencias, Departamento de Biología. Fecha de lectura: 03-12-2015, El divisoma, la maquinaria molecular usada por las bacterias para llevar a cabo la constricción de la membrana durante el proceso de división celular, está basado principalmente en una proteína citoplásmica, FtsZ. FtsZ se ensambla desde el proncipio de dicha constricción en forma de anillo (el anillo FtsZ) que es posicionado en el centro de la célula durante la mayor parte del proceso de septación. Sin embargo, FtsZ no se ancla a la membrana citoplásmica por sí misma. En el modelo de bacteria Gramnegativa Escherichia coli, FtsZ necesita de otras proteínas como FtsA y ZipA para su anclaje (Natale, et al., 2013), (Rico, et al., 2013). Además, como FtsZ se encuentra distribuida a lo largo de toda la longitud celular, el ensamblaje del anillo FtsZ requiere de precisos mecanismos de posicionamiento, como son el sistema Min (de Boer, et al., 1989) y el sistema de oclusión por nucleoide (Woldringh, et al., 1991), ambos presentes en E. coli, previenen el ensamblaje del anillo en cualquier sitio que no sea el centro de la célula. Durante el ensamblaje del anillo FtsZ, los polímeros de FtsZ son mantenidos por sus interacciones laterales y estabilizados por un set de proteínas asociadas a FtsZ (Zap) (Huang, et al., 2013). El trabajo presentado en esta Tesis está enfocado en el estudio de FtsZ y de su interacción molecular con la proteína asociada ZapC. En la Sección 1 se estudia el ensamblaje in vitro de FtsZ en presencia de cationes divalentes. Los resultados obtenidos nos han permitido intentar llevar a cabo los ensayos de cristalización de FtsZ de E. coli, los cuales se encuentran descritos en la Sección 2. Durante el proceso de cristalización, se hicieron hasta 16 construcciones diferentes de FtsZ. También FtsZ se intentó cristalizar en complejo con otras proteínas que han sido descritas por interaccionar directamente con FtsZ, el inhibidor MinC y el estabilizador ZapC. En la Sección 3 se describe el estudio de la interacción molecular entre FtsZ y ZapC. Los datos in vitro mostraron que probablemente el C-terminal de FtsZ esté implicado en la interacción con ZapC. La resolución de la estructura cristalina de ZapC revelará que la proteína cristalizó como un dímero. Análisis in vivo mostrarán que aunque ZapC no es una proteína esencial para la división, su sobreexpresión es altamente tóxico para la división. Estudiaremos el rescate de este fenotipo con la inducción de otras proteínas esenciales de división como FtsA y su variante FtsA*, mutante puntual de FtsA Eliminar seleccionado, The divisome, the molecular machinery used by bacteria to effect the membrane constriction during cell division, is most often based on a cytoplasmic protein, FtsZ. FtsZ is assembled from the start of constriction as a ring (the FtsZ-ring) that is positioned at midcell during most of the septation process. However, FtsZ does not attach by itself to the cytoplasmic membrane. In the model Gram-negative Escherichia coli it needs other cell division proteins as FtsA and ZipA for attachment (Natale, et al., 2013, Rico, et al., 2013). Furthermore, as FtsZ is distributed along the bacterial length the assembly of the FtsZ-ring requires dedicated positioning mechanisms, as the Min system (de Boer, et al., 1989) and nucleoid occlusion (Woldringh, et al., 1991), both present in E. coli, to prevent assembly at sites different from the midcell. During FtsZring assembly, FtsZ polymers are maintained by their lateral interactions and stabilize by a set of FtsZ associated proteins (Zap) (Huang, et al., 2013). The work presented in this thesis is focused on the study of FtsZ and its molecular interaction with the associated protein ZapC. In the Section 1, we study the in vitro assembly of FtsZ in the presence of divalent cations. The results led us to attempt the crystallization of the FtsZ protein from E. coli, as we describe in Section 2. During the crystallization process, up to 16 different FtsZ variants were constructed. FtsZ was also assayed in complex with another division proteins that interact directly with FtsZ, namely MinC (inhibitor) and ZapC (stabilizer). Section 3 describes the study of the molecular interaction between FtsZ and ZapC. In vitro data shows that the C-terminal of FtsZ may be involve in the interaction with ZapC. The resolution of the crystal structure of E. coli ZapC shows that the protein crystallized as a dimer. Further in vivo analysis shows that E. coli cells expressing zapC produces aberrant FtsZ-rings and leds to a filamentation phenotype. We have also investigated the rescue of excess ZapC by other cell division protein, FtsA and the gain-of-function mutant FtsA*, Este trabajo ha sido financiado por el programa de Formación de Personal Investigador del Ministerio de Educación y Ciencia

Tesis doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biologia Molecular. Fecha de lectura: 25-04-2014, Among bacteriophages, T7 is one of the most well characterized viruses at both the genetic and structural level. However, the molecular mechanisms by which T7 ejects its genome into bacterial cytoplasm remained unclear. T7 belongs to the Podoviridae family of bacteriophages and presents a short non-contractile tail with six fibers specialized in receptor recognition. As in other podoviruses, the T7 tail is not long enough to cross the envelope of its Gram(-) host. In order to eject the phage genome into the cell, other phage proteins must assist the process. The goal of this thesis is to characterize at structural and functional level, the T7 complexes implicated in the phage infection of Escherichia coli and to describe the mechanism of the process. Using cryo-electron microscopy as well as biochemical and microbiological approaches, we have described the first steps of T7 infection and the main conformational changes in T7 virions during viral genome delivery. The work shown here reveals that T7 particles interact with outer membrane proteins OmpA and OmpF in the adsorption process and LPS from rough strains of E. coli trigger viral DNA ejection in absence of cytoplasmic pressure. Comparison between the 3D reconstruction of the tail complex in the post-ejected conformation, determined by electron microscopy in this thesis, and the 3D model of the tail from infective particles, determined previously in our lab, allowed us to define in detail the conformational changes needed for DNA delivery. The most striking differences are the change in the orientation of the fibers from upwards to downwards conformation and the opening of the ejection channel by untwist of the tail nozzle domain. The results accomplished in this thesis reveal more similarities with the infection of other podoviruses and provide a complete snapshot of T7 infection pathway., El virus T7 es uno de los bacteriófagos más estudiados, tanto a nivel genético como estructural. Sin embargo, todavía no se había caracterizado el mecanismo de infección por el cual T7 introduce su genoma de forma segura en el citoplasma de su bacteria hospedadora. El fago T7 pertenece a la familia Podoviridae y posee una cola corta no contráctil, con seis fibras especializadas en el reconocimiento del receptor. Como en otros podovirus, la longitud de la cola del fago T7 no le permite atravesar la envuelta de su bacteria hospedadora. El objetivo de esta tesis es caracterizar a nivel estructural y funcional los elementos de T7 implicados en la infección de Escherichia coli, así como describir el mecanismo de este proceso. Para la realización de la tesis doctoral se han utilizado técnicas tan diversas y complementarias como la crío-microscopía electrónica, técnicas bioquímicas y técnicas microbiológicas. La integración de la información recogida nos ha permitido describir con detalle los primeros pasos de la infección de T7 así como caracterizar los cambios conformacionales que se producen en las partículas virales tras la eyección de su genoma. Los datos presentados en esta tesis indican que el fago T7 interacciona con las proteína OmpA y OmpF cuando se adsorbe a la envuelta bacteriana y que los LPS de cepas rough de E. coli desencadenan la eyección del genoma viral en ausencia de presión citoplasmática. La comparación entre la reconstrucción tridimensional de la cola de fagos T7 antes y después de la eyección del genoma viral nos ha permitido definir en detalle los cambios conformacionales necesarios para la internalización del genoma. Las diferencias más notables son el cambio en la orientación de las fibras y la apertura del canal de la cola debido a un cambio conformacional en los monómeros de la proteína gp12 que forman el conducto. Los resultados obtenidos en esta tesis doctoral revelan más similitudes entre los complejos implicados en la infección de los podovirus y nos permiten tener una visión completa del mecanismo de infección del fago T7.

Tesis doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de lectura: 12-12-2014, The attaching and effacing (A/E) bacterial pathogens infect the gastrointestinal tract of humans and other mammals after ingestion of contaminated food or water and cause persistent diarrhoea and other important diseases (e.g. haemolytic uremic syndrome, HUS) worldwide. Prototypical A/E pathogens are the enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) and enterohaemorrhagic E. coli (EHEC) strains, which infect humans, as well as the mouse-­‐restricted pathogen Citrobacter rodentium (CR). These pathogens contain a common type III secretion system (T3SS): a macromolecular protein complex (the injectisome) assembled in the bacterial cell envelope that protrudes to the extracellular milieu with a filament of polymerized EspA. The T3SS allows translocation (injection) of a repertoire of bacterial proteins (called effectors) into the cytoplasm of the host enterocytes through the translocon subunits EspB and EspD, which insert in the host cell membrane. The effectors subvert multiple cellular functions and cause the effacement of the intestinal microvilli (A/E lesions) and the disruption of the intestinal epithelial barrier. Among them, the translocated intimin receptor (Tir) inserts in the host cell plasma membrane and is recognised by Intimin (Int), an outer membrane adhesin exposed on the bacterial cell surface. The Int:Tir interaction promotes the intimate attachment of the bacterium to the enterocyte and the polymerization of actin filament bundles (called “pedestals”) underneath the attached bacterium. Effective treatments to combat A/E pathogens are needed, since antibiotics activate the expression of the life-­‐threatening Shiga-­‐like toxins (Stx) from integrated pro-­‐phages, which are present in the more virulent strains -­‐ such as EHEC O157:H7. In this work we have assessed whether single domain antibodies (sdAbs) from camelids (also known as nanobodies or VHHs) binding essential proteins for A/E lesion formation (i.e., EspA, Int, Tir) could act as potential therapeutic agents against EHEC O157:H7 infections if secreted from non-­‐pathogenic E. coli strains. In addition, we have explored the biotechnological use of the filamentous T3SS of the A/E pathogens to inject VHHs and other proteins with therapeutic potential into the cytoplasm of human cells using a non-­‐ pathogenic E. coli K-­‐12 strain, engineered to express functional EPEC injectisomes. We have immunized a dromedary with purified EspA, Int280 and TirM (the protein domains involved in Int:Tir interaction) of EHEC to create a library of VHH genes. Selected VHHs clones from this library were secreted by commensal E. coli K-­‐12 strains carrying the α-­‐haemolysin (HlyA) secretion system and purified from the extracellular medium to characterise their binding and inhibitory properties of Int:Tir interaction in vitro. A high-­‐affinity VHH clone recognising TirM -­‐ named TD4 -­‐ and blocking Int:Tir interaction was found to interfere with the formation of actin pedestals on HeLa cells infected with EHEC. We have demonstrated that TD4 effectively competes with Int280 for the binding of Tir, since it has higher affinity towards TirM and recognises an epitope that overlaps with the necessary residues for the Int:Tir interaction. This VHH showed high specificity towards TirM of EHEC, not binding TirM of EPEC and only weakly with TirM of C. rodentium. With the aim to establish an in vivo mouse model for the evaluation of the A/E inhibition by TD4, we generated a C. rodentium strain expressing EHEC proteins Int, Tir, the multicargo chaperone CesT and the Tir-­‐coupling protein effector TccP. The resulting strain (CR-­‐EHEC) was capable of forming actin pedestals on HeLa cells, colonizing the mouse intestinal tract and inducing crypt hyperplasia, similarly to wild type C. rodentium. Importantly, we confirmed that TD4 also inhibits the formation of actin pedestals on HeLa cells induced by CR-­‐EHEC. These results leave open the possibility of testing the activity of TD4 against the formation of A/E lesions in vivo, which could represent the basis of a future EHEC infection treatment to control the outbreaks of this pathogen. In addition, we have addressed the biotechnological use of the filamentous T3SS of A/E pathogens for the injection of sdAbs and other heterologous proteins of therapeutic potential into the cytoplasm of human cells. The genes encoding the T3SS of EPEC are found in a 35 kb chromosomal island, called the Locus of Enterocyte Effacement (LEE). LEE is organized in various large operons (LEE1 to LEE5) and shorter transcriptional units (e.g. escD) and also contains genes encoding some effectors, their chaperones, transcriptional regulators, a muramidase and intimin. We aimed to engineer the expression of all known necessary genes for the assembly of a functional T3SS (27 genes in EPEC) in a non-­‐pathogenic E. coli strain (e.g. K-­‐12) under the control of the inducible promoter Ptac. We organised these genes in five engineered transcriptional units -­‐ operons eLEE1 to eLEE4 and eEscD -­‐ lacking effectors and transcriptional regulators. These engineered operons were sequentially integrated in specific sites of the genome of E. coli K-­‐12 corresponding with fimbrial and afimbrial adhesins. The resulting non-­‐pathogenic strain, referred to as Synthetic Injector E. coli (SIEC), was demonstrated to express the T3SS genes upon IPTG addition, to assemble functional injectisomes on its envelope and to be able to secrete the translocator proteins EspA, EspB, EspD. Interestingly, we found that the expression of the T3SS genes partially interfered with the assembly of the flagellum in E. coli K-­‐12, which can be explained considering the high identity between components of the T3SS and the flagellum. Lastly, we showed that a SIEC strain carrying an additional engineered operon encoding Int, Tir and CesT (eLEE5), was able to inject Tir to the cytoplasm of HeLa cells and to reproduce the intimate attachment of the bacterium to the host cell and the formation of actin pedestals. These results open the possible biomedical application of SIEC-­‐derived strains to inject proteins of therapeutic potential (e.g. VHHs, enzymes, transcription factors, toxins, effectors) against diverse human diseases (e.g. cancer, chronic inflammation).

Tesis doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Física de la Materia Condensada. Fecha de lectura: 27-06-2014, La bacteria Escherichia coli (E. coli) es uno de los organismos que se utiliza para estudiar la división celular bacteriana dada su fácil reproducción y crecimiento en laboratorios. Esta bacteria, del tipo Gramnegativa, ha sido investigada exhaustivamente en los últimos veinte años intentando entender los mecanismos de su división celular. Muchas de las bacterias Gram-negativas son patógenas por lo que desarrollar nuevos fármacos capaces de controlar su proliferación es importante para curar infecciones. Gracias al meticuloso estudio realizado por varios grupos de investigación, se han identificado las proteínas y genes involucrados en la división celular de E. coli. Un complejo macromolecular constituido por al menos 10 proteínas esenciales, y otras 15 proteínas accesorias, es el responsable de dividir la bacteria. Este complejo de proteínas altamente dinámico, llamado divisoma, debe ensamblarse en el sitio donde se producirá la división de la célula bacteriana. La división se inicia con la formación del proto-anillo. Este anillo lo constituyen polímeros de la proteína FtsZ (el anillo Z) y dos proteínas asociadas a la membrana celular interna: FtsA que interacciona a través de una hélice anfipática, y ZipA que se encuentra integrada a través de una única hélice transmembrana. Dado que FtsZ se halla soluble en el citoplasma bacteriano, los polímeros necesitan interaccionar al menos con FtsA o ZipA para ser anclados a la membrana interna a través de su interacción con el carboxi-terminal de FtsZ. También se han identificado otras proteínas accesorias, aunque no esenciales, que se localizan en el sitio de división y contribuyen a la estabilización del anillo Z antes de iniciarse la constricción de ambas paredes celulares, interna y externa. FtsZ es una proteína capaz de polimerizar uniendo dos monómeros por medio de la incorporación de una molécula de nuclótido GTP. Inmediatamente después de la unión de GTP se produce la hidrólisis del nucleótido en GDP que se intercambia nuevamente por otro GTP manteniendo la unión entre monómeros estable. Esta actividad GTPasa sumada al rápido intercambio de monómeros dentro de un polímero hace que FtsZ muestre in vitro un alto polimorfismo y dinamismo bajo distintas condiciones de polimerización. Mediante técnicas de microscopía, tales como microscopía electrónica o microscopía de fuerzas atómicas, se han observado filamentos simples, dobles, curvos, rectos, circulares, en forma de espiral y planchas de polímeros asociados lateralmente, así como superestructuras del tipo cintas y toroides Dado que FtsZ exhibe in vitro este extenso polimorfismo, las preguntas inmediatas que surgen son ¿cómo se encuentran dispuestos estos polímeros dentro del anillo Z? y ¿cómo es el mecanismo de generación de fuerza necesaria para la constricción de la célula bacteriana? Para responder a estas preguntas se han realizado diversos estudios tanto in vivo como in vitro, y se han propuesto diferentes modelos de organización de los polímeros de FtsZ y de posibles mecanismos generadores de fuerza. Experimentos in vivo han mostrado que mutaciones en ciertos amino ácidos de FtsZ alteran la funcionalidad de la proteína inhibiendo la división de E. coli. Sorprendentemente, todas las mutaciones de FtsZ dirigidas a las zonas de contacto lateral entre polímeros han impedido que la bacteria se divida indicando así la importancia de las interacciones laterales para su división. A partir de datos experimentales in vitro se han propuesto diferentes modelos matemáticos de mecanismos posibles para que los filamentos de FtsZ sean contráctiles. Estos modelos se basan en cambios en la curvatura de la unión entre monómeros debido a la hidrólisis del nucleótido, interacciones laterales o restricciones en la torsión natural del filamento según su anclaje a la membrana. A pesar del extenso trabajo in vitro y del avance de la microscopía de alta resolución in vivo, no se ha llegado a un consenso sobre la disposición de los polímeros de FtsZ dentro del anillo de división así como del mecanismo molecular generador de la fuerza constrictiva. Se han propuesto como aspectos relevantes para la constricción a la curvatura y a las interacciones laterales de los filamentos de FtsZ. En esta tesis nos proponemos explorar in vitro el comportamiento de dos mutantes laterales no funcionales de FtsZ descritos previamente por Shin et al. [Shin et al., 2013], y compararlo con el de la proteína nativa mediante un sistema reconstituido en superficies in vitro. Queremos identificar qué características del comportamiento in vitro de estos dos mutantes puede asociarse a su no funcionalidad in vivo. Para caracterizar el efecto de estas mutaciones disponemos de dos técnicas biofísicas de caracterización en superficie: Microscopía de fuerzas atómicas (AFM) y Microbalanza de cuarzo (QCM). Mediante AFM estudiaremos cómo estas mutaciones laterales de FtsZ afectan la forma y dinamismo de los polímeros en mica, así como la formación de agregados en mica y en bicapas lipídicas ancladas, cuando estos filamentos están unidos a través de ZipA. Con QCM cuantificaremos la interacción de FtsZ y ZipA en bicapas lipídicas ancladas a superficies planas para compararla con las medidas disponibles en solución., Escherichia coli (E. coli) bacterium is one of the organisms used to study bacterial cell division given its easy grow and proliferation in laboratories. This Gram-negative bacterium has been studied extensively during the last two decades aiming to understand the mechanisms of its cell division. Many Gram-negative bacteria are pathogens and to develop new compounds to control their proliferation is important to cure infections. From the meticulous research made by several groups, the proteins and genes involved in E. coli cell division have been identified. A macromolecular complex is the responsible for dividing the bacterial cell, composed by at least 10 essential proteins and other 15 accessory proteins. This highly dynamic protein complex, the divisome, must assemble at the cell division site. The bacterial cell division starts with the formation of a proto-ring. This ring is constituted by polymers of the protein FtsZ (the Z-ring) and two membrane associated proteins: FtsA that interacts through an amphipathic helix, and ZipA a bitopic protein integrated into the membrane with a single transmembrane helix. FtsZ is a cytoplasmic protein, therefore, its polymers need to interact with at least FtsA or ZipA to be anchored to the bacterium inner membrane through their interaction with the C-terminus of FtsZ. Other proteins, although not essential, have been identified to localize at the division site that contribute to stabilize the Z-ring before the constriction of both inner and outer cellular walls begins. FtsZ is a protein able to polymerize by binding two monomers incorporating a molecule of nucleotide GTP. Immediately after the binding of a GTP, the nucleotide is hydrolyzed into GDP and it is interchanged by another GTP molecule stabilizing the bond between monomers. This GTPase activity in addition to a fast exchange of monomers within a polymer makes FtsZ displays a high polymorphism and dynamism in vitro. By means of electron microscopy and atomic force microscopy techniques it has been observed FtsZ single filaments, double, curved, straight, circular, spiral and sheets where polymers are associated laterally, as well as superstructures like ribbons and toroids. Given this extensive FtsZ in vitro polymorphism the immediate questions that arise are how are these polymers arranged within the Zring? and how is the force generating mechanism needed for the constriction of the bacterial cell? To answer these questions several studies have been made in vitro, and different models have been proposed for the organization of the FtsZ polymers and possible force generator mechanisms In vivo experiments have shown that mutations on certain amino acids of FtsZ alter its functionality preventing E. coli bacterium from dividing. Surprisingly, all site-directed mutations to the lateral contact zones between polymers are non-functional indicating the importance of these lateral interactions for bacterial cell division. From in vitro experiments, there have been proposed several mathematical models for the mechanisms in order to have contractile FtsZ polymers. These models are based on changes in curvature induced by the nucleotide hydrolysis, lateral interactions or restrictions on the filament natural torsion depending on its anchoring to the membrane. In spite of the extensive work in vitro and the advance of the high resolution microscopy techniques, there have been no consensus about the arrangement of the FtsZ polymers within the division ring nor the molecular mechanism able to generate the constrictive force. Both lateral interactions and curvature of the FtsZ filaments have been proposed as relevant for constriction. On this thesis we want to explore in vitro the behavior of two non-functional FtsZ lateral mutants early described by Shin et al. [Shin et al., 2013] and compare them with that of the native protein by means of a reconstituted systems on surfaces. We want to identify which characteristics in vitro for these two mutants can be associated to their non functionality in vivo. To characterize the effect of these mutations we will use two biophysical techniques on surfaces: Atomic force microscopy (AFM) and Quartz Crystal Microbalance (QCM). With AFM we will study how these mutations affect the shape and dynamism of the polymers on mica, and the formation of bundles on mica and supported lipid bilayers when these polymers are anchored through ZipA. With QCM we will quantify the interaction between FtsZ and ZipA on planar lipid bilayers comparing them to the reported values in solution

Tesis doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Medicina, Departamento de Medicina. Fecha de lectura: 28 de Junio de 2013

Tesis doctoral inédita. Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de lectura: 19-03-2013

Tesis doctoral defendida en la Universidad Autónoma de Madrid el 20 de abril de 2012. Se ha realizado en el departamento de Química Bioorgánica del Instituto de Química Orgánica General (CSIC), bajo la dirección de los Drs. Eduardo García-Junceda Redondo Alfonso Fernández-MayoralasÁlvarez, dentro del programa de doctorado de Biología Molecular de la Facultad de Ciencias de la Universidad Autónoma de Madrid., Proteoglycans (PGs), including heparan sulfate (HS) forms, are important regulators of tumor progression. In the PGs biosynthetic process, the core protein is synthesized on a ribosomal template and the sugar chains are assembled post-translationally, one sugar at a time, starting with the linkage of xylose to a serine residue of the core protein and followed by galactosydation of the xylosylprotein (Esko et al., 2009). This step is catalized by the xylosylprotein β-1,4-galactosyltransferase 7 (B4GALT7) (Almeida et al., 1999; Okajima et al., 1999a). Hydrophobic xylopyranosides have been previously shown to prime glycosaminoglycan (GAG) synthesis, including GAG-HS forms, acting as a “decoy acceptors” of the B4GALT7 (Kolset et al., 1990). The compound 2-(6-hydroxynaphthyl) β-D-xylopyranoside was show to cause growth inhibition of tumor cells, acting as a potent antiproliferative and anticarcinogen compound. This property was related to this ability to prime the HS synthesis (Mani et al., 1998; 2004). So, the ability of the xylosides to prime the assembly of HS chains —and hence their potential activity as antitumor agents— must be related to their ability to act as acceptors of B4GALT7. To know if the antiproliferative activity of synthetic xylopyranosides is related to their ability to act as "decoy acceptors" of B4GALT7, we have first heterologously expressed the catalytic domain of the human protein in Escherichia coli in a soluble and stable form as a fusion protein with a polihistidine tag. The recombinant protein was purified through homogenity an kinetically characterized. After that we have studied the ability of a variety of synthetic xylopyranoside derivatives to act as substrates or inhibitors of the recombinant enzyme. The xylopiranosides were synthesized as 3-amidopropyl derivatives, containing a common N-(O-xylopyranosyl)-hydoxylpropylamide moiety with a variable group that was selected to compare the effect of their different functional groups on the activity of the xyloside as decoy acceptor. The kinetic parameters for each single compound was obtained, showing a range of catalitic eficiencies that could be related to the structure of their aglycon moieties. Only the xylopyranosides with a voluminous aglicon groups show activity as decoy acceptors. To test if there is a relationship between the catalytic efficiency of the recombinant B4GALT7 with the different xylopyranosides and their antiproliferative activity, we assayed selected xylosides against the human lung carcinoma cell line A549. A representative sample of different xylosides was chosen attending to both their activities as decoy acceptors and their unique structural features. As expected, the xylosides that could not act as acceptor of B4GALT7 shows a lack of antiproliferative activity. The rest of xylopyranosides tested showed IC50 values lower than the reference compound 2-(6-hydroxynaphthyl) β-D-xylopyranoside. A weak correlation between the activity as acceptors of B4GALT7 and activity as antiproliferatives of the xylopyranoside compounds was found. In conclusion, we have shown that it is possible to heterologously express the catalytic domain of the human B4GALT7, soluble and stable enough to undertake in vitro studies with it. This achievement opens the possibility of developing an easy-to-use method to test the activity as decoy acceptors of natural and synthetic xylopyranosides. Since priming the synthesis of GAG is required but not enough for the antiproliferative activity of the xylosides, it is not possible to establish a direct strong correlation between the kinetic parameters of the recombinant B4GALT7 and the antiproliferative activity of the different xylopyranosides tested. On the other hand, preliminary results obtained in A549 cell line suggest that some xylopyranosides exhibit a promising antiproliferative activity.

Tesis doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de lectura: 17-07-2014, Screening of antibody (Ab) libraries by direct display on the surface of E. coli cells is hampered by the presence of the outer membrane (OM). In this work, we demonstrate that the native β-domains of EhaA autotransporter and Intimin, two proteins from enterohemorrhagic E. coli O157:H7 (EHEC) with opposite topologies in the OM, are effective systems for the display of immune libraries of single domain Abs (sdAbs) from camelids (nanobodies or VHH) on the surface of E. coli K-12 cells and for the selection of high affinity sdAbs using magnetic cell sorting (MACS). We analyzed the capacity of EhaA and Intimin β-domains to display individual sdAbs and sdAb libraries obtained after immunization of camelids with different proteins of biomedical interest, i.e. the extracellular domain of the translocated intimin receptor from EHEC (TirMEHEC), human fibrinogen (Fib) and A431 cells displaying human epidermal growth factor receptor (EGFR). We demonstrated that both systems displayed functional sdAbs on the surface of E. coli cells with little proteolysis and cellular toxicity, although E. coli cells displaying sdAbs with the β-domain of Intimin showed higher antigen-binding capacity. The sdAb libraries against TirMEHEC and Fib cloned in both E. coli display platforms were screened for antigen binding clones by MACS using purified biotinylated antigen. High affinity binders were selected by both display systems, although more efficiently with the Intimin β- domain. The specificity of the selected clones against their respective antigen was demonstrated by flow cytometry of E. coli cells, along with ELISA and surface plasmon resonance with purified sdAbs. In addition, we employed the E. coli cell display systems to provide an estimation of the affinity of the selected sdAb by flow cytometry analysis under equilibrium conditions. Further, we used the β-domain of Intimin to display a sdAb library against human EGFR and developed a method for the direct selection of this sdAb library on cells. Bacteria displaying the anti-EGFR sdAb immune library were subjected to consecutive rounds of selection on EGFRnegative cells (i.e. murine fibroblast cell line, 3T3 2.2) and EGFR-positive cells HER14 (i.e. 3T3 2.2 transfected cells expressing human EGFR) to enrich for EGFRspecific binding clones. EGFR-specific clones that bound HER14 cells and not 3T3 2.2 cells were identified and their specific binding to EGFR confirmed by flow cytometry analysis using biotinylated EGFR-Fc fusion. In addition, we used E. coli display to characterize the affinity and binding of these sdAbs to EGFR-Fc in the presence or absence of an excess of EGF, a natural ligand of EGFR. Our data demonstrates that E. coli display allows the selection of sdAbs against relevant tumor-associated antigens from libraries generated by cell immunization and performance of direct selection on tumor cells without the need for purified antigens

Tesis doctoral inédita. Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de lectura: 22-10-2010

Tesis doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Medicina, Dpto. de Bioquimica. Fecha de lectura: 16 de Noviembre de 2009.

Tesis doctoral inédita. Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular : 23-01-2009

Tesis doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de lectura: 15-12-2006