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With the discovery of optogenetics, using light becomes essential to study and control neural activity and connectivity. However, the complexity of the brain circuits demands advanced optical methods for detailed investigation. One of the most significant optical challenges is to address multiple targets with cellular resolution and high temporal precision in deep brain regions. During this thesis, I worked on three new optical systems to provide a possible answer to some of these technical challenges. First, we developed a new system to multiplex temporally focused light shapes (MTF-LS) for precise 3D photostimulation of neurons. Thanks to the flexibility of this new approach, different light-shaping methods can be applied: either computer-generated holography (CGH) or speckle-free generalized phase contrast. With these two approaches, the system was limited to multiplex only one shape at the time. To solve this issue we demonstrate an innovative amplitude/phase modulation technique, to multiplex different shapes in 3D. Due to the absorption and scattering, it is difficult to stimulate cells beyond ~ 600 µm of brain tissue with two-photon (2P) stimulation technique. Facing similar limitations in imaging, other laboratories used gradient index (GRIN) lenses implanted in the brain to access deep regions. Thus we develop a new in-depth photostimulation method, by coupling a GRIN lens with the MTF-LS previously demonstrated. This system represented the first microendoscope capable of generating tens of axially confined 2P excitation patterns matching target neuronal soma in a 3D volume for in-depth experiments. Third, to manipulate neuronal activity at sub-millisecond temporal scales and large cell populations, we built a new system using ultra-fast sequential light targeting (FLiT). We managed to control the spike delay among two cells with s temporal resolution. We also demonstrate a new stimulation protocol where the illumination time optimization allows to stimulate five times more cells than conventional static illumination for the same laser power., Avec la découverte de l'optogénétique, l’utilisation de la lumière est devenue essentielle pour étudier et contrôler l'activité et la connectivité neuronales. Cependant, la complexité des circuits cérébraux exige d’employer des méthodes optiques avancées pour toute investigation approfondie de son fonctionnement. C’est pourquoi, l'un des plus grands défis optiques est d'atteindre des cibles multiples avec une résolution cellulaire et une bonne précision temporelle dans les régions les plus profondes du cerveau. Au cours de cette thèse, j'ai travaillé sur trois nouveaux systèmes optiques afin d'apporter une réponse possible à certains de ces défis techniques. Premièrement, nous avons développé un nouveau système de génération de formes lumineuses focalisées dans le temps (MTF-LS) pour la photostimulation précise en 3D des neurones. Grâce à la flexibilité de cette nouvelle approche, différentes méthodes de modelage de la lumière ont put être utilisées: l'holographie générée par ordinateur (CGH) ou le contraste de phase généralisé. Avec ces deux approches, le système était limité à la multiplication en 3D d'une seule forme à la fois. Pour résoudre ce problème, nous avons proposé une technique innovante de modulation amplitude/phase, pour générer différentes formes en 3D. En raison de l'absorption et de la diffusion, il est difficile de stimuler des cellules au-delà de ~ 600 µm de tissu cérébral avec une méthode de stimulation à deux photons (2P). Face à des limitations similaires en matière d'imagerie, d'autres laboratoires ont utilisé des lentilles à gradient d'indice (GRIN) implantées dans le cerveau pour accéder à des régions profondes. Nous avons donc développé une nouvelle méthode de photostimulation en profondeur, en couplant une lentille GRIN avec le MTF-LS précédemment démontré. Ce système représente le premier microendoscope capable de générer des dizaines de sites d'excitation 2P, confinés axialement et correspondant aux dimensions du soma d’un neurone cible dans un volume 3D. Troisièmement, pour manipuler l'activité neuronale à des échelles temporelles inférieures à la milliseconde et/ou de grandes populations de cellules, nous avons construit un nouveau système utilisant le ciblage lumineux séquentiel ultra-rapide (FLiT). Nous sommes parvenus à contrôler le retard d’activation entre deux cellules avec une résolution temporelle de l'ordre de la microseconde. Nous avons également démontré un nouveau protocole de stimulation où l'optimisation du temps d'illumination permet de stimuler cinq fois plus de cellules que l'illumination statique conventionnelle pour la même puissance laser.

This thesis project consists in the development of new photoremovable protecting groups (PPGs) and their adaptations for different areas of neuroscience. The main aim involved the development of caged glutamate. Hence, two two-photon sensitive PPGs were synthesized and used to uncage glutamate on brain slices by Dr. Philippe Isope’s team. An additional collaboration with the team of Dr. Nicolas Vitale was then undertaken to design a caged nicotine. This project led to an elaboration of a PPG able to uncage nicotine efficiently upon green irradiation. Finally, a series of highly rigidified coumarine based PPGs were developed using a 5-exo-dig carbopallation followed by a Suzuki-Miyaura or Sonogashira cross-coupling reactions. This work of molecular engineering led to the synthesis of highly two-photon sensitive PPGs., Ce projet de thèse consiste à développer de nouveaux groupements protecteurs photolabiles (GPP) et de les adapter pour qu’ils puissent être utilisés en biologie, notamment, en neurosciences. Le projet principal de ce travail de thèse est de développer des précurseurs photolabiles du glutamate. Ainsi, deux GPPs sensibles à l’excitation bi-photonique ont été élaborés et utilisés pour libérer du glutamate sur tranches de cervelet par l’équipe du Dr. Philippe Isope. Une collaboration avec l’équipe du Dr. Nicolas Vitale a ensuite été entreprise dans le but de développer un précurseur photolabile de la nicotine. Cela a mené au développement d’un GPP permettant de libérer la nicotine efficacement après excitation à un photon dans le vert. Pour finir, une nouvelle série de coumarines au squelette rigidifié a été développée au laboratoire à l’aide de réactions domino initiées par une carbopalladation 5-exo-dig suivie d’un couplage de Suziki-Miyaura ou de Sonogashira. Ce travail d’ingénierie moléculaire par rigidification du squelette de ces coumarines a permis de développer des GPPs possédants d’excellentes sensibilités à l’excitation bi-photonique.

When scaled down up to nanometer size, semiconductors can exhibit quantum confinement effects for both electrons and photons. One interesting feature of nano-sized materials is the strong size dependence of their optical properties, that allows to master classical and non-classical light generation. This work concerns the development and the characterization of new sources for the gener- ation of classical and non-classical light states with isolated and coupled confined systems for photons and electrons. In particular: (i) a new type of semiconductor colloidal nanocrystals (NCs) is studied with the goal to obtain an efficient single photon generation at room temper- ature in the visible spectral range and (ii) NCs coupling with photonic crystals nanocavities has been obtained by using several methods; finally, (iii) in the last part of the manuscript the development of a two-photons excitation technique for microcavity polaritons is discussed with the final goal to obtain non-classical light generation. The first part of the manuscript is focused on the emission properties of a particular type of colloidal nanocrystals, called dot-in-rod (DR), in which a spherical cadmium selenide (CdSe) core is surrounded by a rod-like cadmium sulfide (CdS) shell. By virtue of their electronic properties, colloidal nanocrystals can emit single photons at room temperature. However the application of colloidal nanocrystals has been so far limited by two phenomena: the blinking of their photoluminescence and a non-polarized emission. The streaky point of dot-in-rods is that their emission properties are strongly dependent on their geometrical parameters. Here we show that by carefully choosing the diameter of the core, as well as the thickness and the length of the shell, the blinking behavior can be strongly reduced and a high degree of linear polarization of the emitted photons obtained. The second part of the thesis is devoted to the development of a silicon nitride photonic crystals cavity platform for applications in the visible spectral range. The weak coupling of these nanocavities with dot-in-rods has been achieved by using several deposition methods and we obtained a modification of the spontaneous emission by means of the Purcell effect. The possibility to reach the strong coupling regime by using this technology is also discussed from the theoretical point of view. The last part of the work studies a semiconductor system in which the strong coupling between quantum well excitons and a cavity mode gives rise to quasi-particles called polaritons. When polaritons experience a sufficiently strong three-dimensional confinement, they can exhibit a quantum blockade phenomenon. Indeed, in the case of ultra small cavity modal volume just one polariton at time can exist in the structure, while the injection of other po- laritons is forbidden by virtue of strong polariton-polariton repulsive interactions. With the purpose to reach this operation regime, an original excitation technique based on a resonant two-photon absorption (TPA) process has been developed. Moreover, TPA has been exploited to resonantly inject high polariton density in pillar microcavities, reaching an emission regime called two-photon polariton laser., Ce travail est consacré à l'étude de plusieurs types de Systèmes confinés pour les électrons et/ou les photons. En particulier : (i) un nouveau type de nanocristaux semi- conducteurs est étudié pour obtenir une source efficace de photons uniques à température ambiante dans le domaine spectral du visible ; (ii) leur couplage avec des cavités à cristaux photoniques en nitrure de silicium est obtenu par plusieurs techniques de déposition. (iii) Enfin, le développement d'une technique d'excitation à deux photons pour les polaritons dans les microcavité semiconductrices est décrit dans la dernière partie du travail de thèse. La première partie du manuscrit étudie les propriétés d'émission d'un type particulier de nanocristaux semiconducteurs, appelé dots-in-rod, dans lesquels un cœur de séléniure de cadmium (CdSe) est entouré par une coquille en sulfure de cadmium (CdS) de forme allongée. Depuis les année 2000, il est bien connu que les nanocristaux semiconducteurs sont des sources de photons uniques à température ambiante. Cependant, les applications des nanocristaux sont affectées entre autre par deux caractéristiques de leur photoluminescence: le scintillement et l'émission non polarisée. Nous avons montré qu'il est possible de modifier l'émission des dots-in-rod en agissant sur leurs paramètres géométriques, c'est-à-dire le diamètre du cœur ainsi que l'épaisseur et la longueur de la coquille, aboutissant à la suppression du scintillement et à un degré élevé de polarisation linéaire des photons émis. Dans la deuxième partie, la thèse démontre la réalisation des cavités à cristaux photoniques en nitrure de silicium (Si3N4) pour le domaine spectral du visible. Le couplage de ces cavités avec des dot-in-rods a été étudié en régime de couplage faible et nous avons obtenu une modification de l'émission spontanée par effet Purcell. La possibilité d'obtenir le régime de couplage fort dans ce système est aussi discutée du point de vue théorique. Dans la dernière partie du manuscrit nous avons étudié des systèmes semiconducteurs tels que les microcavités et le micropiliers dans lesquels le régime de couplage fort exciton-photon donne naissance aux polaritons. Dans le cas de polaritons confinés, les interactions répulsives entre polaritons peuvent porter à un régime appelé polariton quantum blockade, dans le quel un seul polariton peut être excité dans la structure, ce régime est très prometteur pour la réalisation de sources à photons uniques basées sur les polaritons en cavité. Dans ce travail, nous développons une technique original et flexible basée sur une excitation résonante à deux photons pour attendre le polariton quantum blockade. Enfin, un nouveau régime d'émission appelé two-photon polariton laser est étudié toujours à la technique d'excitation résonante à deux photons.

Jury: - Michel ROBERT-NICOUD : Président du jury Professeur - Institut Albert Bonniot (INSERM-Grenoble) - Claude-Albert BOCCARA : Rapporteur Directeur du laboratoire d'Optique Physique de l'ESPCI (Paris) - Robert PANSU : Rapporteur Directeur de recherche - laboratoire de Photophysique Moléculaire de l'ENS de Cachan - Alain BRUN : Directeur de thèse Professeur - laboratoire Charles Fabry de l'Institut d'Optique d'Orsay - Marie-Claire SCHANNE-KLEIN : Examinateur Chargée de recherche - laboratoire Optique et Biosciences de l'école Polytechnique de Palaiseau - Patrick GEORGES : Examinateur Directeur de recherche - laboratoire Charles Fabry de l'Institut d'Optique d'Orsay; This thesis presents the development of a fluorescence microscope based on the non linear process of two-photon absorption. This new type of fluorescence microscopy characterized by a intrinsic three-dimensional spatial resolution comparable to those of the confocal microscope, offers also many advantages for biological studies, in particular in terms of restriction of the photodamages. Combined with time resolved techniques, two-photon microscopy allows imaging with high space and time resolutions and opens up new opportunities for biological dynamics studies. In this context, two time resolved techniques for fluorescence analysis under two-photon excitation have been developed. The first time resolved technique, the fluorescence correlation microscopy, based on measurements in micro-volumes with weak molecular concentration, has been essentially applied to the study of translational diffusion processes. In particular, the technique has allowed the determination, at the single molecule level, of the diffusion coefficient of various fluorescent biological probes : FITC-dextran, GFP (Green Fluorescent Protein) and fluoresceine. Moreover, our two-photon fluorescence correlation technique has been originally applied to the study molecular diffusion processes inside bacterial biofilms A second time resolved technique, fluorescence lifetime imaging under two-photon excitation, have been developed. The fluorescence lifetime, or lifetime of the first singlet excited state is an important characteristic of the physico-chemical state and of the environment of a molecule. Thus, measurement of fluorescence lifetime can provide quantitative information about the system under study and can bring fundamental information on intracellular mechanisms. The first results obtained with this technique applied in the pharmacological domain to the study of molecule activity in vitro and in vivo are presented.; Ce mémoire présente la mise en place d'un système complet de microscopie de fluorescence basé sur le processus non linéaire d'absorption à deux photons. Cette technique récente de microscopie biphotonique est caractérisée par de nombreux avantages pour l'étude d'échantillons biologiques, notamment en terme de limitation des photodommages. Combinée à des méthodes d'analyse de la dynamique d'émission de fluorescence, elle permet l'étude à la fois spatiale et temporelle de l'émission de fluorescence. Dans ce contexte, nous avons développé deux techniques d'analyse résolue en temps de la fluorescence. Une première technique d'analyse dynamique, la microscopie de corrélation de fluorescence, basée sur des mesures en micro-volume et sur une faible concentration moléculaire, a essentiellement été appliquée à l'étude du processus de diffusion translationnelle. En particulier, la microscopie de corrélation de fluorescence a permis, avec la sensibilité de détection d'une molécule unique, la détermination des coefficients de diffusion de sondes souvent utilisées en biologie : le FITC-dextran, la GFP (Green Fluorescent Protein) et la fluorescéine. Les performances de cette technique pour les études en milieux biologiques ont par ailleurs été validées par une application novatrice et originale à l'étude des mécanismes de la diffusion moléculaire au sein de biofilms de bactéries. Une deuxième technique d'analyse dynamique, l'imagerie des durées de vie fluorescence sous excitation à deux photons a été développée. La durée de vie de fluorescence d'une molécule, ou durée de vie de l'état excité singulet, est un paramètre caractéristique de l'état physico-chimique et de l'environnement d'une sonde fluorescente. Elle renseigne donc sur de nombreuses propriétés moléculaires essentielles à la compréhension des mécanismes intracellulaires. De premières applications concluantes de cette technique sont présentées, notamment des études in vitro de la réactivité de molécules d'intérêt pharmacologique ainsi que de premières mesures réalisées in vivo.

Jury: - Michel ROBERT-NICOUD : Président du jury Professeur - Institut Albert Bonniot (INSERM-Grenoble) - Claude-Albert BOCCARA : Rapporteur Directeur du laboratoire d'Optique Physique de l'ESPCI (Paris) - Robert PANSU : Rapporteur Directeur de recherche - laboratoire de Photophysique Moléculaire de l'ENS de Cachan - Alain BRUN : Directeur de thèse Professeur - laboratoire Charles Fabry de l'Institut d'Optique d'Orsay - Marie-Claire SCHANNE-KLEIN : Examinateur Chargée de recherche - laboratoire Optique et Biosciences de l'école Polytechnique de Palaiseau - Patrick GEORGES : Examinateur Directeur de recherche - laboratoire Charles Fabry de l'Institut d'Optique d'Orsay; This thesis presents the development of a fluorescence microscope based on the non linear process of two-photon absorption. This new type of fluorescence microscopy characterized by a intrinsic three-dimensional spatial resolution comparable to those of the confocal microscope, offers also many advantages for biological studies, in particular in terms of restriction of the photodamages. Combined with time resolved techniques, two-photon microscopy allows imaging with high space and time resolutions and opens up new opportunities for biological dynamics studies. In this context, two time resolved techniques for fluorescence analysis under two-photon excitation have been developed. The first time resolved technique, the fluorescence correlation microscopy, based on measurements in micro-volumes with weak molecular concentration, has been essentially applied to the study of translational diffusion processes. In particular, the technique has allowed the determination, at the single molecule level, of the diffusion coefficient of various fluorescent biological probes : FITC-dextran, GFP (Green Fluorescent Protein) and fluoresceine. Moreover, our two-photon fluorescence correlation technique has been originally applied to the study molecular diffusion processes inside bacterial biofilms A second time resolved technique, fluorescence lifetime imaging under two-photon excitation, have been developed. The fluorescence lifetime, or lifetime of the first singlet excited state is an important characteristic of the physico-chemical state and of the environment of a molecule. Thus, measurement of fluorescence lifetime can provide quantitative information about the system under study and can bring fundamental information on intracellular mechanisms. The first results obtained with this technique applied in the pharmacological domain to the study of molecule activity in vitro and in vivo are presented.; Ce mémoire présente la mise en place d'un système complet de microscopie de fluorescence basé sur le processus non linéaire d'absorption à deux photons. Cette technique récente de microscopie biphotonique est caractérisée par de nombreux avantages pour l'étude d'échantillons biologiques, notamment en terme de limitation des photodommages. Combinée à des méthodes d'analyse de la dynamique d'émission de fluorescence, elle permet l'étude à la fois spatiale et temporelle de l'émission de fluorescence. Dans ce contexte, nous avons développé deux techniques d'analyse résolue en temps de la fluorescence. Une première technique d'analyse dynamique, la microscopie de corrélation de fluorescence, basée sur des mesures en micro-volume et sur une faible concentration moléculaire, a essentiellement été appliquée à l'étude du processus de diffusion translationnelle. En particulier, la microscopie de corrélation de fluorescence a permis, avec la sensibilité de détection d'une molécule unique, la détermination des coefficients de diffusion de sondes souvent utilisées en biologie : le FITC-dextran, la GFP (Green Fluorescent Protein) et la fluorescéine. Les performances de cette technique pour les études en milieux biologiques ont par ailleurs été validées par une application novatrice et originale à l'étude des mécanismes de la diffusion moléculaire au sein de biofilms de bactéries. Une deuxième technique d'analyse dynamique, l'imagerie des durées de vie fluorescence sous excitation à deux photons a été développée. La durée de vie de fluorescence d'une molécule, ou durée de vie de l'état excité singulet, est un paramètre caractéristique de l'état physico-chimique et de l'environnement d'une sonde fluorescente. Elle renseigne donc sur de nombreuses propriétés moléculaires essentielles à la compréhension des mécanismes intracellulaires. De premières applications concluantes de cette technique sont présentées, notamment des études in vitro de la réactivité de molécules d'intérêt pharmacologique ainsi que de premières mesures réalisées in vivo.