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Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2014. Casearia sylvestris é uma planta utilizada popularmente no tratamento de tumores. Quinonas tratam-se de compostos que apresentam significativo efeito antitumoral. Evidências indicam que o efeito antineoplásico de quinonas pode ser elevado pela associação destas com o ascorbato de sódio (ASC). Desta forma, este trabalho tem como objetivo avaliar os mecanismos envolvidos nos efeitos antiproliferativo e antitumoral mediados pelo extrato bruto (EB-ETOH) e frações de Casearia sylvestris, bem como pelas fenilaminonaftoquinonas 7 (Q7) e 9 (Q9) administradas isoladamente ou em associação ao ascorbato de sódio. A análise fitoquímica demonstrou a presença de casearina C na fração clorofórmica (f-CHCl3) e EB-ETOH de C. sylvestris. EB-ETOH e f-CHCl3, apresentaram importante citotoxicidade sobre células MCF-7. Quando administrados em doses subtóxicas (= CI20), EB-ETOH e f-CHCl3 exerceram atividade antiproliferativa sobre células MCF-7, sendo capazes de promover a parada do ciclo celular em G1, devido ao aumento da expressão de p53 e p16, bem como da redução da expressão de CDK2. Além disso, os extratos elevaram a fosforilação de ?H2Ax. EB-ETOH e f-CHCl3 apresentaram significativa atividade antitumoral in vivo em camundongos isogênicos Balb-C portadores do tumor sólido de Ehrlich, reduzindo a razão área da massa tumoral/área do osso em torno de 18 e 40%, respectivamente. Q7 e Q9 mostraram citotoxicidade seletiva sobre células T24, a qual foi potencializada pela associação destes compostos a ASC (CI50 Q7 = 27,1; CI50 Q9 = 44,3; CI50 Q7 + ASC = 14,5; CI50 Q9 + ASC= 16,9 µM). Fenilaminonaftoquinonas (10 µM) isoladas ou associadas à ASC não foram capazes de promover a ativação de caspases e a clivagem da PARP, sugerindo-se que o mecanismo de morte induzido pelas associações trata-se de necrose, visto que ambos tratamentos promoveram lise celular. Q7, Q9, Q7 + ASC e Q9 + ASC reduziram a proliferação de células T24 em torno de 29,7; 3,5; 36,7 e 88,8 %, respectivamente Além disso, fenilaminonaftoquinonas associadas ao ASC modificaram o número de células presentes na fase G2/M e elevaram a atividade da ß-galactosidase ácida, sugerindo que tais tratamentos são capazes de induzir senescência. Os efeitos citotóxico e antiproliferativo promovidos pela associação de fenilaminonaftoquinonas ao ASC envolve modificações na sinalização mediada por MAPKs. Os resultados obtidos permitem sugerir que tanto a associação de fenilaminonaftoquinonas ao ASC, quanto os extratos deC. sylvestris tratam-se de promissores coadjuvantes na terapêutica do câncer quando administrados juntamente a agentes citotóxicos. Abstract : The branches and leafs of Casearia sylvestris tree has medicinal properties comproved through ethnobotanical surveys reporting plant extracts has being used in traditional therapy as first approaches to several conditions, including cancer. Evidences indicate that quinones antineoplastic effect could be raised up through sodium ascorbate association (ASC). Thus, this study aims to evaluate some mechanisms related to in vitro antiproliferative and antitumor effects mediated by C. sylvestris ethanol crude extract (EB-EtOH) and fractions, as well mediated only by synthetic phenylaminonaphthoquinones or co-administered with ASC. EB-EtOH and its chloroformic fraction (f-CHCl3) had casearin C, a clerodane diterpene with chemopreventive activity. Consequently, both extracts showed significant cytotoxicity over MCF-7 cells. Furthermore, using subtoxic concentrations (= IC20), EB - EtOH and f-CHCl3 exerted antiproliferative activity on MCF - 7 cells, being able to promote cell cycle arrest in G1 due to increased expression of p53 and p16, as well as reducing CDK2 expression. Additionally, these extracts were still able to increase the ?H2Ax expression. EB-EtOH and f-CHCl3 had significant in vivo antitumor activity throught Ehrlich carcinoma-bearing Balb-c mice model causing reduction in the ratio tumor over bone area about 18 and 40 %, respectively. On the other hand, synthetic phenylaminonaphthoquinone 7 (Q7) and phenylaminonaphthoquinone 9 (Q9) showed selective cytotoxicity for T24 cells, which enhanced in the ASC presence (IC50 Q7 = 27.1; IC50 Q9 = 44.3; IC50 Q7 + ASC = 14.5; IC50 Q9 + ASC = 16.9 µM). Take into account that both phenylaminonaphthoquinones (10 µM) isolated or associated with ASC were not able to activate caspase 3 or PARP cleavage, ours results suggest that necrosis occurs instead apoptosis as cell death mechanism possible induced by the ASC association, since both treatments showed cytolytic effect. Q7, Q9, Q7 + ASC and Q9 + ASC reducing cell proliferation about 29.7; 3.5; 36.7 and 88.8%, respectively. Besides, phenylaminonaphthoquinones associated with ASC augment G2 / M phase cells and also increase acid ß-galactosidase activity, suggesting senescence induction capability. Moreover, cytotoxic and antiproliferative effects promoted by the ASC association involves changes in MAPK signaling pathways. These results suggest that C. sylvestris extracts and the association between phenylaminonaphthoquinones and ASC are promising adjuvants incancer therapy and could be administered together with conventional quimioterapic agents.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2010 O desenvolvimento de novas alternativas terapêuticas, como as terapias que utilizam as plantas medicinais, tem despertado grande interesse no tratamento do câncer, pois as terapias disponíveis não são capazes de regredir totalmente a evolução da patologia e/ou apresentam elevada toxicidade. A C. sylvestris, planta medicinal que possui vários usos populares no Brasil e outros paises americanos, tem sido indicada para o tratamento de tumores. Nesse contexto, o presente trabalho propôs avaliar as atividades citotóxica, antiproliferativa, pró-apoptótica, antiangiogênica e antitumoral do extrato bruto (EB-ETOH), e das frações metanólica (f-MeOH), acetato de etila (f-AcOEt) e clorofórmica (f-CHCl3) de Casearia sylvestris utilizando modelos experimentais in vitro e in vivo. Nos ensaios do MTT e incorporação de timidina triciada realizados respectivamente, para investigar a citotoxicidade e influência dos extratos sobre a proliferação celular, os resultados demonstraram que EB-ETOH, f-CHCl3 e f-AcOEt reduziram de maneira significativa a viabilidade e proliferação de células do carcinoma de Ehrlich, sendo a citotoxicidade promovida pelo tratamento com esses extratos, tempo e concentração dependente. Diante do efeito citotóxico promovido por EB-ETOH, f-CHCl3 e f-AcOEt sobre células do carcinoma de Ehrlich, avaliou-se o tipo de morte celular promovida pelos tratamentos. A coloração com brometo de etídeo/laranja de acridina (BE/LA) revelou que o provável tipo de morte celular induzida pelos tratamentos trata-se de apoptose, uma vez que a grande maioria das células, após terem entrado em contato com a referida solução corante, adquiriram uma coloração laranja-avermelhada, característica da ocorrência do fenômeno apoptótico. Entretanto, em relação à avaliação da atividade nucleásica, verificada através da realização do teste de dano ao DNA plasmidial, observou-se que os efeitos antiproliferativo e citotóxico induzidos por EB-ETOH, f-CHCl3 e f-AcOEt, não são mediados por uma interação e dano direto ao DNA. Além disso, a realização desse ensaio permitiu observar que os extratos têm a capacidade de proteger o DNA do ataque induzido por EROs, excluindo-se portanto, a possibilidade de estarem exercendo seus efeitos citotóxico e antiproliferativo através da indução de estresse oxidativo no núcleo. As avaliações morfológicas e bioquímicas realizadas nas amostras obtidas de camundongos portadores do tumor ascítico de Ehrlich mostraram que os animais tratados com EB-ETOH e f-CHCl3 apresentaram menor ganho de peso corporal (26 e 31%, respectivamente) e de circunferência abdominal (52 e 58%, respectivamente), menor volume de líquido ascítico (46 e 43%, respectivamente), aumento do percentual de longevidade (48 e 40%, respectivamente) e da proporção de células inviáveis/viáveis (70 e 78%, respectivamente), quando comparados ao grupo controle negativo. Com a realização do modelo in vivo do TAE, observou-se ainda que o efeito antitumoral promovido por esses extratos é dose-dependente, uma vez que se apresentou-maior, quanto mais elevada a concentração de extrato administrada ao animal. A realização do ensaio do CAM, permitiu verificar que tanto o EB-ETOH, como f-CHCl3 de C. sylvetris, exercem um significativo efeito antiangiogênico, de maneira dose-dependente, onde a administração de 3,25; 7,5 e 15 µg/disco de EB-ETOH e f-CHCl3 foram capazes de diminuir o percentual de vasos, em torno de 54,5; 61,4 e 71% e 42,1; 59,1 e 70,9%, respectivamente. Por fim, cabe ressaltar que a realização da biometria dos embriões possibilitou observar que o tratamento dos mesmos com extrato bruto e fração clorofórmica não se apresentou tóxico, uma vez que não alterou o desenvolvimento embrionário nem a morfogênese externa, avaliados pelo comprimento total do embrião, razão comprimento cefálico/comprimento truncal e razão comprimento cefálico/comprimento total. Dessa forma, conclui-se que EB-ETOH e f-CHCl3 de C. sylvestris apresentaram efeito citotóxico, antiproliferativo, pró apoptótico e antitumoral in vitro e in vivo, sobre as células do carcinoma de Ehrlich. Tal efeito antitumoral mediado por esses extratos, não envolvem sua intercalação ao DNA, e sugere-se que se deva, pelo menos em parte, à inibição da formação de vasos e a conseqüente supressão nutricional das células tumorais.

Orientador: Prof. Dr. Wesley Maurício de Souza Coorientadoras: Profa Dra. Karina Bettega Felipe, Profa Dra. Amanda Rabello Crisma Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas. Defesa : Curitiba, 28/02/2020 Inclui referências: p. 78-90 Área de concentração: Análises Clínicas Resumo: A Lafoensia pacari tem sido popularmente utilizada para o tratamento do câncer e de doenças inflamatórias. Estudos demonstram que o extrato metanólico da planta é capaz de induzir a apoptose em células de câncer colorretal (HRT-18), entretanto, os mecanismos envolvidos na mediação deste efeito, bem como a capacidade desta espécie vegetal em interferir na angiogênese e na metástase, ainda não foram elucidados. Desta forma, este trabalho tem por objetivo avaliar o efeito citotóxico, antiproliferativo e anti-metastático in vitro de extratos de L. pacari em células HRT-18, bem como verificar se tais efeitos estão associados à modulação da via do óxido nítrico (ON). O efeito citotóxico/antiproliferativo de 19 extratos da casca do caule de L. pacari produzidos a partir dos solventes água, metanol, etanol, acetona e combinações entre os mesmos, foi avaliado pela redução da resazurina em células HRT-18 e McCoy. De maneira geral, todos os extratos testados exerceram citotoxicidade significativa em células HRT-18, destacando-se o extrato E-14, que apresentou maior seletividade, sendo seu efeito confirmado pelo ensaio clonogênico e fragmentação do DNA. O ensaio de wound healing mostrou que E-14 foi capaz de inibir a migração de células HRT-18 na concentração de 16 ?g/mL em torno de 61%. Além disso, observou-se que E-14 reduziu em torno de 73% o potencial invasivo de células HRT-18 na concentração de 16 ?g/mL após 48 h de tratamento. Por meio da reação de Griess foi possível verificar que o tratamento com E-14 reduziu significativamente a produção de ON na linhagem tumoral. Adicionalmente, o ensaio de zimografia demonstrou que o E-14 foi capaz de bloquear a atividade das formas latentes de MMP-9 e reduziu significativamente (86%) a atividade de MMP-9 ativa. Os resultados sugerem que E-14 exerce efeito citotóxico e antimetastático significativo através da via de inibição do ON. Palavras chave: Lafoensia pacari, citotoxicidade, óxido nítrico, anti-metastático. Abstract: Lafoensia pacari has been popularly used for the treatment of various types of cancer and inflammatory diseases. Studies demonstrate that the methanolic extract of plant is capable of inducing in colorectal cancer cells (HRT-18), however, the mechanisms involved in mediating this effect, as well as the ability of this plant species to interfere in angiogenesis and metastasis, have not yet been elucidated.Thus, this work aims to evaluate the cytotoxic, antiproliferative and anti-metastatic effect in vitro of L.pacari extracts in HRT-18 cells, as well as to verify if these effects are associated with the modulation of the nitric oxide (NO) pathway. The cytotoxic/antiproliferative effect of 19 L. pacari stem bark extracts produced from the solvents water, methanol, ethanol, acetone and combinations between them was evaluated by the reduction of resazurin in HRT-18 and McCoy cells. In general, all the tested extracts exerted significant cytotoxicity in HRT-18 cells, especially the E-14 extract, which showed greater selectivity and its effect was confirmed by the clonogenic and DNA fragmentation assay. The wound healing assay showed that E-14 was able to inhibit the migration of HRT-18 cells at a concentration of 16 ug/mL around 61%. In addition, the transwell cell invasion assay demonstrated that E-14 was able to reduce the invasive ability of HRT-18 cells by 73% at a concentration of 16 ug/mL after 48 h of treatment. Through the Griess reaction it was possible to verify that the treatment with E-14 significantly reduced the production of NO in the tumor lineage. The zymography assay showed that E-14 was able to block the activity of latent forms of MMP-9 and significantly reduced (86%) the activity of active MMP-9. The results suggest that E-14 exerts a significant cytotoxic and anti-metastatic effect through the NO inhibition pathway. Key words: Lafoensia pacari, cytotoxicity, nitric oxide, anti-metastatic.

Orientador : Prof. Dr. Wesley Maurício de Souza Coorientadora : Profª Dra. Karina Bettega Felipe Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas. Defesa : Curitiba, 02/02/2018 Inclui referências : p. 91-111 Área de concentração : Análises clínicas Resumo : Quimioterápicos disponíveis para o tratamento do câncer apresentam pouca eficácia e baixa especificidade. Alcaloides indolicos isolados de plantas tratam-se de importantes fontes de medicamentos antitumorais. Dessa forma, esse trabalho teve por finalidade avaliar o potencial antitumoral da fração de alcaloides totais (FAT) obtida de suplemento elaborado a partir da casca da A. subincanum, em modelo experimental in vitro, tentando-se identificar possíveis alcaloides presentes na fração. A análise de por CLAE e espectrometria de massas evidenciou a presença da uleina e outros 7 alcalóides não identificados em FAT. Em relação as atividades biológicas, FAT teve efeito citotóxico e antiproliferativo em diversas linhagens tumorais (Hela, U937, HRT-18 e MCF7), sendo mais eficaz em células MCF7. Tal atividade foi seletiva, quando comparado o efeito exercido por FAT em células MCF7 e sobre a linhagem McCoy (fibroblastos murinos). FAT promoveu o aumento do número de células na fase G1 do ciclo celular, levando ao desencadeamento de apoptose. A fração também causou redução intracelular de EROs devido a uma ativação forte e persistente da CAT. Por fim, o tratamento com FAT culminou na supressão dos níveis de COX-2. Conclui-se que FAT apresenta importante efeito antitumoral devido a interferências no equilíbrio redox e na expressão de COX-2. No que se refere à investigação do efeito antitumoral de compostos e produtos naturais, é comum a realização de ensaios que avaliam o efeito citotóxico e antiproliferativo dos mesmos em linhagens celulares tumorais, destacando-se, o ensaio clonogênico. Há diversos problemas envolvidos nas análises dos resultados obtidos por meio deste ensaio. Assim, o segundo objetivo desse trabalho foi desenvolver e validar um software para determinação da área (total e individual) e do número de colônias. O software apresentou performance superior quando comparado ao método manual (padrão ouro de análise) e plugin, uma vez que foi capaz de analisar uma maior quantidade de parâmetros, além de ter otimizado o tempo de análise. Conclui-se que o software em desenvolvimento trata-se de uma ferramenta eficaz para determinação da área e do número de colônias. Palavras-chave: Antitumoral. Citotoxicidade. Uleina. Aspidosperma subincanum. Abstract : Chemotherapy drugs available for cancer treatment have low efficacy and low specificity. Indole alkaloids isolated from plants are important sources of antitumor drugs. Thus, the objective of this work was to evaluate the antitumor potential of the total alkaloid fraction (FAT) obtained from a supplement prepared from the A. subincanum bark, in an experimental model in vitro, in an attempt to identify possible alkaloids present in the fraction. Analysis by HPLC and mass spectrometry evidenced the presence of ulein and other 7 unidentified alkaloids in FAT. In relation to the biological activities, FAT had a cytotoxic and antiproliferative effect in several tumoral lines (Hela, U937, HRT-18 and MCF7), being more effective in MCF7 cells. Such activity was selective when compared to the effect exerted by FAT on MCF7 cells and on the McCoy line (murine fibroblasts). FAT promoted the increase in the number of cells in the G1 phase of the cell cycle, leading to the onset of apoptosis. The fraction also caused intracellular reduction of ROS because of a strong and persistent activation of CAT. Finally, treatment with FAT culminated in the suppression of COX-2 levels. It is concluded that FAT has an important antitumor effect due to interferences in redox balance and expression of COX-2. As regards the investigation of the antitumor effect of natural compounds and products, it is common to perform tests that evaluate the cytotoxic and antiproliferative effect of the same in tumor cell lines, especially the clonogenic test. There are several problems involved in the analysis of the results obtained by this assay. Thus, the second objective of this work was to develop and validate a software for determining the area (total and individual) and the number of colonies. The software presented superior performance when compared to the manual method (gold standard of analysis) and plugin, since it was able to analyze a greater amount of parameters, besides having optimized the analysis time. It is concluded that the software in development is an effective tool for determining the area and number of colonies. Key-words: Antitumor. Citotoxicity. Uleine. Aspidosperma subincanum.