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The human Ras superfamily of small GTPases controls essential cellular processes such as gene expression and cell proliferation. As their deregulation is widely associated with human cancer, small GTPases and their regulatory proteins have become increasingly attractive for the development of novel therapeutics. Classical methods to monitor GTPase activation include pulldown assays that limit the analysis of GTP-bound form of proteins from cell lysates. Alternatively, live-cell FRET biosensors may be used to study GTPase activation dynamics in response to stimuli, but these sensors often require further optimization for high-throughput applications. Here, we describe a cell-based approach that is suitable to monitor the modulation of small GTPase activity in a high-content analysis. The assay relies on a genetically encoded tripartite split-GFP (triSFP) system that we integrated in an optimized cellular model to monitor modulation of RhoA and RhoB GTPases. Our results indicate the robust response of the reporter, allowing the interrogation of inhibition and stimulation of Rho activity, and highlight potential applications of this method to discover novel modulators and regulators of small GTPases and related protein-binding domains., Summary: The development of a fluorescent reporter of GTPase activation based on tripartite split-GFP that enables the evaluation of GEF activity and the effect of modulators of GTPase activation in a high-content analysis.

Objectifs : Le mycophenolate mofetil (MMF) est une prodrogue de l’acide mycophenolique (AMP). Ce dernier est un immunosuppresseur dont le suivi therapeutique pharmacologique (STP) est devenu pratique courante apres des greffes renales, hepatiques et cardiaques. L’objectif de cette etude a ete de comparer deux methodes de dosage de l’AMP (Enzyme Multiplied Immunoassay Technique : EMIT vs la chromatographie liquide couplee a un detecteur UV : CL-UV) en fonction du traitement immunosuppresseur co-administre. Methode : Cent vingt-trois echantillons issus de 58 patients adultes transplantes renaux ont ete analyses selon les deux methodes. Dix-huit patients ont recu du MMF associe a la ciclosporine tandis que 40 ont recu du MMF associe au belatacept. Resultats : Independamment du traitement immunosuppresseur co-administre, les concentrations d’AMP ont ete sous-estimees par la methode EMIT par rapport a la methode CL-UV avec un biais de –0,829 mg/mL soit une sous-estimation de 8,86 %. Une sous-estimation des concentrations d’AMP a ete retrouvee dans le groupe traite par belatacept avec un biais de –1,06 % correspondant a une sous-estimation de 9,9 %, contrairement au groupe traite par ciclosporine. Conclusion : La methode EMIT n’est pas un outil suffisamment specifique pour le suivi therapeutique pharmacologique de l’acide mycophenolique dont le faible index therapeutique ne tolere pas cette limite analytique. On lui preferera une methode chromatographique (CL-UV ou mieux la chromatographie liquide couplee a la spectrometrie de masse CL-SM/SM).

Objectif : Notre objectif a ete d’evaluer l’Architect ® ci4100 TM (Abbott) et de le comparer au RXL Dimension ® (Siemens), en termes de facilite d’utilisation et de performances analytiques (justesse, fidelite, limites de detection et de quantification). Methodes : Des controles de qualite (CQ) ont ete testes sur l’Architect ci4100 TM (amikacine, digoxine, paracetamol, phenobarbital, vancomycine, ethanol, tacrolimus, benzodiazepines seriques). La justesse et la fidelite ont ete calculees pour chaque niveau de CQ, avec des criteres d’acceptabilite de 15 %. La comparaison entre les automates a porte sur des dosages quantitatifs (amikacine, digoxine, paracetamol, ethanol et tacrolimus). La facilite d’utilisation a porte sur les maintenances a realiser et la convivialite de l’automate. Resultats : Pour chaque molecule, la justesse et la fidelite des resultats ont ete en accord avec nos criteres de validation ( ® ci4100 TM en comparaison avec RXL Dimension ® pour l’amikacine et le tacrolimus (erreur systematique proportionnelle respectivement de 1,315 et 1,137) et une sous-estimation pour la digoxine (erreur systematique constante de –0,257 ng/mL). Avec l’Architect ® ci4100 TM , les calibrations ont ete plus faciles et plus rapides mais plus frequentes pour le phenobarbital, et les maintenances ont ete plus faciles mais plus longues. L’Architect ® ci4100 TM est plus convivial que le RXL Dimension ® . Conclusion : Notre evaluation a montre que l’Architect ® ci4100 TM repond aux exigences imposees par les referentiels utilises en biologie clinique. L’Architect ® ci4100 TM est facile a utiliser et rapide pour une utilisation en routine dans un laboratoire de pharmaco-toxicologie.

International audience; Monitoring protein-protein interactions in living cells is key to unraveling their roles in numerous cellular processes and various diseases. Previously described split-GFP based sensors suffer from poor folding and/ or self-assembly background fluorescence. Here, we have engineered a micro-tagging system to monitor protein-protein interactions in vivo and in vitro. The assay is based on tripartite association between two twenty amino-acids long GFP tags, GFP10 and GFP11, fused to interacting protein partners, and the complementary GFP1-9 detector. When proteins interact, GFP10 and GFP11 self-associate with GFP1-9 to reconstitute a functional GFP. Using coiled-coils and FRB/FKBP12 model systems we characterize the sensor in vitro and in Escherichia coli. We extend the studies to mammalian cells and examine the FK-506 inhibition of the rapamycin-induced association of FRB/FKBP12. The small size of these tags and their minimal effect on fusion protein behavior and solubility should enable new experiments for monitoring protein-protein association by fluorescence.