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Orientador: Jose Francisco Figueiredo Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas Resumo: Introdução: A qualidade da conservação obtida em um órgão e a duração do armazenamento seguro são dependentes do tipo de solução e tempo de conservação, estando sujeitas a intercorrências imprevisíveis. Em virtude disso, o parênquima renal e, particularmente, o túbulo contornado proximal (TCP), local onde ocorre necrose tubular aguda (NTA), são susceptíveis às mudanças na homeostase funcional do órgão, durante a conservação e durante a reperfusão pós-implante. O TCP reabsorve cerca de 70% de Na+ e H2O filtrados; sua membrana apical tem células especializadas com microvilosidades para aumentar a área de transporte unidirecional de solutos do lúmen para o sangue. O principal componente estrutural da bordadura em escova, filamentos de F-actina, interage com uma variedade de proteínas transmembranas, inclusive moléculas transportadoras de íons. Esta função é regulada por parâmetros fisiológicos e hormonais, sendo a Angiotensina II (AII) uma das principais envolvidas com o citoesqueleto de actina e proteínas associadas, mediada principalmente por seus receptores AT1. Métodos: Neste trabalho, túbulos isolados de fragmentos frescos e de fragmentos conservados por períodos de 1 e 24h nas soluções de Euro - Collins (ECO) e de Belzer (UW) foram tratados com AII, losartan e AII+losartan, para medida do volume de absorção de fluido (Jv=nl. min_1. mm-1 (microperfusão in vitro), e medida da intensidade (média) de pixel da fluorescência dos receptores AT1 e do citoesqueleto de actina (imunoistoquímica). Resultados: a) Demonstrou-se que AII (10-12M) estimula absorção fluida (Jv), que é diminuída com losartan (10-6M) em TCP frescos e também em TCP conservados em soluções de ECO 1h e UW 1-24h. Em túbulos conservados 24h em ECO, não houve absorção de fluidos. b) A média da intensidade de pixel de fluorescência dos receptores AT1 em túbulos frescos (sem conservação) apresentou discreta variação entre os grupos não estatisticamente significante. Em túbulos conservados 1h com ECO e UW, a média da intensidade de pixel de receptores AT1 estava aumentada no grupo sem drogas, quando comparados aos tratados com AII, losartan e AII+losartan. Entretanto, em túbulos conservados 24h, ambas as soluções, houve aumento na média de intensidade do pixel de receptores AT1, no grupo tratado com AII, quando comparados aos demais grupos. c) O citoesqueleto de actina em túbulos frescos (sem conservação) não mostrou variação estatisticamente significante na média de intensidade de pixel entre os grupos (AII, losartan ou AII+losartan). No entanto, verificamos uma maior coesão entre os filamentos de actina de túbulos tratados com AII. A distribuição dos filamentos de actina em túbulos conservados em ECO 1h e UW 1 e 24h, mostrou-se uniforme, sem diferenças entre os grupos. Entretanto, em túbulos conservados em ECO 24h (tratamentos AII, losartan, AII+losartan) foi verificada alteração do citoesqueleto de actina. Conclusão: Baseados nestes dados, verificamos que, na conservação do TCP realizada por tempo reduzido, as diferenças na composição das soluções escolhidas não acarretaram alterações estatisticamente significantes na capacidade de absorção de fluidos, na distribuição dos receptores AT1 e no citoesqueleto de actina. Porém, quando o tempo de conservação é estendido, a composição da solução utilizada no processo, interfere na qualidade da conservação, acarretando alterações no citoesqueleto de actina, determinando alterações que poderiam implicar em mudanças na função absortiva, sendo que a solução de UW mostrou o melhor desempenho nestas condições experimentais Abstract: Introduction: Depending on the preservation quality and duration, considering the solution composition and the preservation method, unexpected intercurrences may occur. In consequence, the renal parenchyma and particularly the proximal convoluted tubule (PCT), site where the acute tubular necrosis (NTA) occurs, are susceptible to changes in the organ functional homeostasis during preservation in the post implantation reperfusion period. The PCT reabsorbs approximately 70% of filtered Na+ and H2O, and its apical membrane has specialized cells with microvilli to increase the area of unidirectional solute transport from the lumen to the blood. The major structural component of brush border microvilli is the filamentous F-actin, which has been shown to interact with a variety of transmembrane proteins, including ion transport molecules. This function is regulated by physiological and hormonal parameters, such as angiotensin II (AII) interacting with actin cytoskeleton and associated proteins, mediated mainly through type I receptors (AT1R). After via different signaling pathways having been triggered, the varied functions are started, including fluid absorption (Jv), which is directly related to the actin cytoskeleton. Methods: Fresh (no preserved) and tubules preserved for 1h and 24hrs in Euro-Collins (EC) and Belzer (UW) solutions, treated with AII, losartan and AII+losartan, evaluated by "in vitro" microperfusion technique (fluid absorption (Jv=nl. min-1. mm-1), and by immunohistochemical technique (AT1 receptor measurement and actin cytoskeleton). Results: a) Our results showed that AII (10-12M) (physiological concentration) stimulates fluid absorption (Jv), which is reduced with losartan (10-6M) in fresh PCT, such as PCT preserved for 1h in EC and for 1-24hrs in UW solutions. There was no fluid absorption (Jv?0) in tubules preserved for 24hrs in EC solution. b) The mean fluorescence intensity of pixel of AT1 receptors in fresh tubules (no preserved) showed discreet changes while using drug treatments; however, these differences were not statistically significant. In tubules preserved for 1h in EC and UW, the mean fluorescence intensity of pixel of AT1 receptors increased in the group with no drug treatment, when compared with tubules treated with AII, losartan and AII+losartan. However, the mean pixel intensity of AT1 receptors in tubules preserved for 24hrs in both solutions increased in those treated with AII, when compared with other groups, control group, losartan and AII+losartan. c) When we examined actin cytoskeleton of fresh tubules (no preserved), comparing groups with no drug treatment and those treated with AII, losartan or AII+losartan, we verified that the variation in the mean pixel intensity of actin cytoskeleton, there was no difference statistically significant. However, we verified a greater cohesion in the actin filaments in tubules treated with AII. In tubules preserved in EC for 1h and UW for 1-24hrs there was a uniform distribution of actin filaments. However, it was verified disorganization in all groups (AII, losartan, AII+losartan) in tubules preserved for 24hrs in EC solution, showing that the organ preservation in this solution was not adjusted. Conclusion: Based on these data, we verified that when PCT preservation was carried out for a reduced time (1h), the differences in the composition of the chosen solutions were not significant; however, when the preservation time was extended, the composition of the solution used in the process affected the preservation quality and altered the actin cytoskeleton, determining alterations that could imply in changes in its absorptive functions. The UW solution showed better performance in these experimental conditions Doutorado Ciências Básicas Doutor em Clínica Médica

Orientadores: Antonio Carlos Boschiero, Everardo Magalhães Carneiro Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Introdução e objetivos: A ARHGAP21 é uma Rho-GAP que promove a ativação de um fator intrínseco da Rho-GTPase Cdc42 responsável pela hidrólise de GTP à GDP e inativação da atividade da proteína. ARHGAP21 se associa à PKC? em cardiomiócitos e à porção C-terminal da FAK em glioblastomas, onde inibe a ativação de Rho-GTPases, e, com isso, o rearranjo do citoesqueleto de actina. A Cdc42, FAK e PKC? estão envolvidas na secreção de insulina estimula por glicose, diferenciação e proliferação de ilhotas pancreáticas. O objetivo deste trabalho foi investigar em células beta pancreáticas: 1) a expressão e localização da ARHGAP21; 2) o efeito da glicose na expressão das proteínas PKC?, FAK e Cdc42 e sua associação à ARHGAP21 e; 3) a função da ARHGAP21 no controle da secreção de insulina estimulada por glicose. Materiais e Métodos: A expressão e localização da ARHGAP21 em células MIN6 foram avaliadas por imunoflorescência. Células MIN6 foram tratadas na presença de 5,6 ou 22 mM de glicose ou, na ausência ou presença de insulina (0,2 U/ml) por 3 dias. Após a extração protéica a expressão das proteínas ARHGAP21, PKC, FAK e Cdc42 foi avaliada por Western blot. Células MIN6 foram incubadas em solução contendo 22 mM de glicose e coletadas em diferentes tempos (0, 5, 15, e 30 min) para avaliação da interação ARHGAP21/FAK e ARHGAP21/PKC? por imunoprecipitação e, para análise do grau de fosforilação tirosina 397 e 925 da FAK e em treonina 410 da PKC?. A expressão dessas proteínas também foi avaliada em ilhotas pancreáticas de camundongos Swiss neonatos previamente tratados por dois dias com 1 nM de anti-sense anti-ARHGAP21 ou mismatch. Essas ilhotas foram incubadas com 2,8 ou 16,7 mM de glicose e a secreção de insulina avaliada. Resultados: A ARHGAP21 localiza-se no citoplasma, mais acentuadamente na região da membrana plasmática. Glicose reduziu a expressão da ARHGAP21 e PKC? e não alterou a expressão da FAK e Cdc42, enquanto a insulina não alterou a expressão de nenhuma das proteínas estudadas. A glicose também promoveu a dissociação ARHGAP21/FAK, levando ao aumento na fosforilação da FAK seguido de aumento na associação ARHGAP21/PKC? e redução na fosforilação da PKC? em Thr 410. Animais Knockdown para ARHGAP21 apresentaram menor expressão de PKC? e maior expressão de Cdc42, além de um aumento na secreção de insulina por ilhotas pancreáticas tanto em condição sub- (2,8 mM) quanto supra-estimulatória (16,7 mM) de glicose. Conclusão: ARHGAP21 modula Cdc42 e FAK, proteínas responsáveis pelo rearranjo do citoesqueleto de actina e extrusão do grânulo de insulina, reduzindo sua expressão e atividade, o que inibe a secreção de insulina. Além disso, observamos que a glicose modula as interações ARHGAP21/FAK e ARHGAP21/PKC? Abstract: Background/Aims: ARHGAP21 is a Rho-GAP that promotes activation of the Rho-GTPase Cdc42 intrinsic factor, which is responsible for the hydrolysis of GTP to GDP and those proteins inactivation. ARHGAP21 associates with PKC? in cardiomyocytes and to the C-terminal portion of FAK in glioblastoma, inhibiting Rho-GTPases and actin cytoskeleton rearrangement. Cdc42, FAK and PKC? promote glucose-stimulated insulin secretion, differentiation and proliferation in pancreatic islets. The aim this study was to assess in pancreatic beta cells: 1) ARHGAP21 expression and localization; 2) glucose effect in PKC?, FAK e Cdc42 expression and association to ARHGAP21; 3) The role of ARHGAP21 on glucose-stimulated insulin secretion. Materials and Methods: ARHGAP21 expression and localization in MIN6 cells were evaluated by immunofluorescence. MIN6 cells were treated with glucose (5.6 mM and 22 mM) or insulin (0.2 U/ml) for 3 days. After protein extraction, the ARHGAP21, PKC?, FAK e Cdc42 expressions were evaluated by Western blot. MIN6 cells were exposed for 0, 5, 15, e 30 min to 22 mM of glucose. ARHGAP21/FAK and ARHGAP21/PKC? interactions were evaluated for immunopreciption and phosphorylation of FAK in tyrosine 397 and 925 and phosphorylation of PKC? in threonine 410. The expression of these proteins also was evaluated in pancreatic islets of neonates Swiss mice previously treated for 2 days with 1 nM of ARHGAP21 antisense or mismatch oligonucleotides. These islets were incubated with 2.8 mM or 16.7 mM of glucose and insulin secretion was evaluated. Results: ARHGAP21 is localized in the cytoplasm, mainly the plasmatic membrane. Glucose reduced ARHGAP21 and PKC? expression but not altered FAK and Cdc42 expression, while insulin had no effect whatsoever on the expression of the studied proteins. Glucose also dissociated ARHGAP21/FAK, leading to increased FAK phosphorylation, which was followed by ARHGAP21/PKC? association and reduced Thr410 PKC? phosphorylation. ARHGAP21 Knockdown mice pancreatic islets had lower PKC? and higher Cdc42 expression, and also increased insulin secretion in both sub- (2.8 mM) and supra-stimulatory (16.7 mM) of glucose conditions. Conclusions: ARHGAP21 modulates Cdc42 and FAK, proteins responsible for rearrangement of actin cytoskeleton and extrusion of insulin vesicles, and reducing their expression leads to inhibited insulin secretion. Furthermore, we observed that glucose modulates ARHGAP21/FAK and ARHGAP21/ PKC? interactions Mestrado Fisiologia Mestre em Biologia Funcional e Molecular

El VV (virus vaccinia) es uno de los virus mas complejos, con un tamano superior a 300 nm y mas de 100 proteinas estructurales. Su montaje implica interacciones secuenciales y reordenamientos importantes de sus componentes estructurales. Se infectaron las celulas BSC40 y luego se seleccionaron mediante microscopia de fluorescencia de luz y posteriormente se formaron imagenes en el microscopio de rayos X en condiciones criogenicas. Se utilizaron series de inclinacion tomografica de imagenes de rayos X para producir reconstrucciones tridimensionales que muestran diferentes organelos celulares (nucleos, mitocondrias, RE), junto con otros dos tipos de particulas virales relacionadas con diferentes etapas de maduracion del virus vaccinia (IV) inmaduros y (MV) particulas maduras; los ensayos con witaferina mostraron enlaces con actina, que impide la polimerizacion y el alargamiento de los filamentos; causando viriones mal empaquetados o aberrantes, que inhibe la progresion de la infeccion viral. Los hallazgos demuestran que la cryo-tomografia de rayos X, es una poderosa herramienta para recolectar informacion estructural tridimensional a partir de celulas enteras congeladas, no fijadas y sin manchas con resolucion suficiente para detectar diferentes particulas de virus que exhiben distintos niveles de maduracion. filamentos de actina. Abstract VV (vaccinia virus) is one of the most complex viruses, with a size greater than 300 nm and more than 100 structural proteins. Its assembly involves sequential interactions and important rearrangements of its structural components. The BSC40 cells were infected and then selected by light fluorescence microscopy and subsequently imaged under the X-ray microscope under cryogenic conditions. Tomographic tilt series of X-ray images were used to produce three-dimensional reconstructions showing different cellular organelles (nuclei, mitochondria, RE), together with two other types of viral particles related to different stages of immature vaccinia (IV) maturation and (MV) mature particles; tests with witaferin showed links with actin, which prevents polymerization and elongation of the filaments; causing poorly packaged or aberrant virions, which inhibits the progression of the viral infection. The findings demonstrate that X-ray cryo-tomography is a powerful tool to collect three-dimensional structural information from frozen whole cells, unfixed and without spots with sufficient resolution to detect different virus particles that exhibit different levels of maturation. Keywords: Vaccinia virus, cryo-X-ray tomography, viral factory, actin filaments.

Orientador: Silvio Roberto Consonni Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Em células musculares, a transdução de sinais mecânicos da membrana sarcoplasmática ao núcleo e regulação da arquitetura nuclear são dependentes do complexo de ligação do nucleoesqueleto e citoesqueleto (LINC, do inglês linker of nucleoskeleton and cytoskeleton) ¿ composto pelas proteínas integrais das membranas interna e externa do envoltório nuclear ¿ que conecta e transmite as forças mecânicas do citoesqueleto ao núcleo através do envoltório. Os principais componentes do complexo LINC na membrana externa do envoltório nuclear são as proteínas nesprinas que se ligam ao citoesqueleto e ainda interagem com a porção C-terminal das proteínas domínio-SUN e Emerina na membrana interna do envoltório nuclear. Este conjunto de proteínas interage com as laminas A/C, que constituem a lâmina nuclear em contato com a cromatina. Assim, mutações nos genes que codificam as proteínas laminas A/C e Emerina resultam em doenças de espectro amplo, mas com fenótipos distintos, comumente referidas como laminopatias (ou envelopatias) nucleares, tais como: distrofia muscular de Emery-Dreifuss, distrofia muscular das cinturas e distrofia muscular congênita. A distrofia muscular de Emery-Dreifuss ligada ao X, causada por mutações no gene EMD que codifica a Emerina, clinicamente é caracterizada pelo enfraquecimento do músculo estriado esquelético progressivo, cardiomiopatia dilatada, arritmias cardíacas e contratura dos tendões. Assim, tendo em vista que a Emerina está envolvida em muitos processos celulares e intranucleares por meio de interações com vários parceiros moleculares, nosso estudo buscou compreender o papel da Emerina na biologia dos mioblastos C2C12. Para resolver essa questão, nós usamos o modelo de cultura celular in vitro e tecnologia de silenciamento gênico por shRNA para suprimir a expressão de Emerina e avaliar a morfologia das células C2C12 e expressão de genes relacionados ao citoesqueleto e fatores de transcrição. Nossa hipótese indica que a Emerina, quando ausente ou mutada poderia alterar o funcionamento, morfologia e composição dos mioblastos C2C12. A primeira parte deste estudo demostrou que o silenciamento gênico estabeleceu satisfatoriamente um modelo de estudo corroborado pelos resultados de imunofluorescência, microscopia eletrônica de transmissão, quantificação de área nuclear e taxa de proliferação entre os grupos shGFP (controle) e shEMD. A segunda parte deste estudo demonstrou variação na expressão de genes relacionados diretamente à interação com Emerina e ao citoesqueleto, o que corrobora a participação da Emerina na dinâmica celular de mecanotransdução. Em conclusão, nosso trabalho forneceu dados científicos de morfologia e expressão gênica que permitiram analisar o sucesso do silenciamento gênico e alterações fenotípicas dos mioblastos shEMD em estudo integrado entre alterações no núcleo celular e seus efeitos celulares e moleculares. Como perspectiva futura, por meio do uso deste modelo celular, tem-se a possibilidade de se compreender os efeitos da ausência de Emerina no ciclo celular de mioblastos e efeitos na sua diferenciação Abstract: In muscle cells, the transduction of mechanical signals from the sarcoplasmic reticulum membrane to the nucleus and regulation of nuclear architecture are dependent on the linker of nucleoskeleton and cytoskeleton (LINC) complex - composed of the integral proteins within the inner and the outer nuclear membranes ¿ that connects and transmits the mechanical forces of the cytoskeleton to the nucleus through the nuclear envelope. The main components of the LINC complex on the outer membrane of the nuclear envelope are the Nesprin proteins that bind to the cytoskeleton and still interact with the C-terminal portion of the SUN-domain and Emerin proteins on the inner membrane of the nucleus. This set interacts with lamin A/C, proteins that constitute the nuclear lamin in contact with the chromatin. Thus, mutations in the genes which encode the lamin A/C and Emerin proteins result in broad spectrum diseases, but with distinct phenotypes, commonly referred to as nuclear laminopathies (or envelopathies), such as: Emery-Dreifuss muscular dystrophy, limb-girdle muscular dystrophy and congenital muscular dystrophy. Emery¿Dreifuss muscular dystrophy linked to X, caused by mutations in the EMD gene that encodes Emerin, is clinically characterized by weakening of progressive skeletal striated muscle, dilated cardiomyopathy, cardiac arrhythmias, and tendon contracture. Thus, because Emerin is involved in many cellular and intranuclear processes through interactions with several molecular partners, our study sought to understand the role of Emerin in the biology of C2C12 myoblasts. To address this issue, we used the in vitro cell culture model and shRNA gene silencing technology to suppress emerin expression and to evaluate C2C12 cell morphology and expression of genes related to cytoskeleton and transcription factors. Our hypothesis indicates that Emerin, when it is absent or mutated, could alter the operation, morphology and composition of C2C12 myoblasts. The first part of this study demonstrated that gene silencing satisfactorily established a study model corroborated by the results of immunofluorescence, transmission electron microscopy, nuclear area quantification, and proliferation rate between the shGFP (control) and shEMD groups. The second part of this study demonstrated variation in the expression of genes directly related to the interaction with emerin and the cytoskeleton, which corroborates the participation of Emerin in the cellular dynamics of mechanotransduction. In conclusion, our work provided scientific data on morphology and gene expression that allowed us to analyze the success of gene silencing and phenotypic changes of shEMD myoblasts in an integrated study between alterations in the cell nucleus and its cellular and molecular effects. As a future perspective, through the use of this cellular model, one has the possibility to understand the effects of the absence of Emerin in the cell cycle of myoblasts and effects in its differentiation Mestrado Biologia Celular Mestra em Biologia Celular e Estrutural CAPES 001 CNPQ 169732/2017-7

RESUMEN El VV (virus vaccinia) es uno de los virus más complejos, con un tamaño superior a 300 nm y más de 100 proteínas estructurales. Su montaje implica interacciones secuenciales y reordenamientos importantes de sus componentes estructurales. Se infectaron las células BSC40 y luego se seleccionaron mediante microscopía de fluorescencia de luz y posteriormente se formaron imágenes en el microscopio de rayos X en condiciones criogénicas. Se utilizaron series de inclinación tomográfica de imágenes de rayos X para producir reconstrucciones tridimensionales que muestran diferentes organelos celulares (núcleos, mitocondrias, RE), junto con otros dos tipos de partículas virales relacionadas con diferentes etapas de maduración del virus vaccinia (IV) inmaduros y (MV) partículas maduras; los ensayos con witaferina mostraron enlaces con actina, que impide la polimerización y el alargamiento de los filamentos; causando viriones mal empaquetados o aberrantes, que inhibe la progresión de la infección viral. Los hallazgos demuestran que la cryo-tomografía de rayos X, es una poderosa herramienta para recolectar información estructural tridimensional a partir de células enteras congeladas, no fijadas y sin manchas con resolución suficiente para detectar diferentes partículas de virus que exhiben distintos niveles de maduración ABSTRACT VV (vaccinia virus) is one of the most complex viruses, with a size greater than 300 nm and more than 100 structural proteins. Its assembly involves sequential interactions and important rearrangements of its structural components. The BSC40 cells were infected and then selected by light fluorescence microscopy and subsequently imaged under the X-ray microscope under cryogenic conditions. Tomographic tilt series of X-ray images were used to produce three-dimensional reconstructions showing different cellular organelles (nuclei, mitochondria, RE), together with two other types of viral particles related to different stages of immature vaccinia (IV) maturation and (MV) mature particles; tests with witaferin showed links with actin, which prevents polymerization and elongation of the filaments; causing poorly packaged or aberrant virions, which inhibits the progression of the viral infection. The findings demonstrate that X-ray cryo-tomography is a powerful tool to collect three-dimensional structural information from frozen whole cells, unfixed and without spots with sufficient resolution to detect different virus particles that exhibit different levels of maturation