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Programa de Doctorando en Investigación Biomédica., [Introducción]: El Cáncer de Mama y Ovario Hereditario (CMOH) es una enfermedad con herencia autosómica dominante caracterizada por la aparición temprana del tumor. Actualmente, aunque se han asociado 26 genes a la aparición de la enfermedad, sólo dos de ellos están considerados como genes principales de cáncer de mama: BRCA1 y BRCA2. El rastreo de los genes BRCA en pacientes de alto riesgo ha dado lugar a la aparición de miles de variantes, muchas de ellas clasificadas como variantes de significado clínico desconocido (VUS). Éstas suelen ser variantes missense, sinónimas, deleciones o inserciones in-frame y variantes en regiones no codificantes como los intrones o las UTRs (Untranslated Region). En este contexto, los ensayos funcionales juegan un papel esencial para conocer el impacto de este tipo de variantes y su asociación con la enfermedad. El objetivo de esta tesis doctoral se centra en el estudio de la transcripción y el splicing de BRCA2. Se pretende estudiar los mecanismos reguladores de la expresión génica y evaluar las variantes que puedan alterar dichos procesos y estar asociadas a la susceptibilidad a CMOH., [Métodos]: Las variantes, recogidas de las bases de las principales bases de datos (BIC, UMD, ClinVar y Ensembl) y encontradas en pacientes del sistema de prevención de cáncer de Castilla y León (España), fueron analizadas in silico. Se seleccionaron aquellas variantes que potencialmente alteraban los mecanismos de transcripción o de splicing. El estudio de la transcripción se realizó a través de un vector reportero con el gen de luciferasa bajo el promotor de BRCA2. Los resultados fueron analizados mediante Dual-Luciferase Assays y RT-PCR semi-cuantitativa. Para estudiar el splicing, se construyeron dos minigenes (MGBR2_2-9 y MGBR2_14-20) basados en el vector pSAD (Patente P201231427,CSIC). Las variantes fueron introducidas mediante mutagénesis dirigida y ensayadas en células MCF-7. El estudio de regiones reguladoras se realizó a través de microdeleciones. Los factores implicados en el splicing se estudiaron mediante ensayos de interacción RNA-proteína (pull-down) y ensayos de pérdida de función (siRNA). Los transcritos generados fueron analizados mediante gel de agarosa, secuenciación SANGER y electroforesis capilar., [Resultados]: Las secuencias reguladoras de la transcripción se estudiaron a través de 13 microdeleciones a lo largo del promotor de BRCA2. Los resultados mostraron que seis disminuían significativamente la transcripción y tres la aumentaban. Una vez mapeado el promotor, se ensayaron 15 variantes que podrían alterar elementos reguladores, tres de ellas encontradas en pacientes del sistema de prevención de Cáncer de Castilla y León (rs3092989_A, rs206118_G y rs563971900_T). Diez variantes alteraron significativamente la expresión génica, de las cuales, tres provocaron la subexpresión del gen (rs551887850_G, rs570548398_T y rs55880202_T). Cabe destacar que ocho de las 10 variantes reguladoras mapeaban en el cluster 121 de hipersensibilidad a DNAsa, una región crítica para el inicio de la transcripción. Por otro lado, el estudio del splicing reveló que exones 3 a 8, 15, 17 y 18 de BRCA2 requieren de elementos reguladores de splicing (SREs) para su correcto reconocimiento. Además, los resultados indican que los factores SRSF3 y SRSF2 juegan un papel importante en el splicing de los exones 3 y 18, respectivamente. En total, se analizaron mediante minigenes 200 variantes repartidas a lo largo de los exones 2-9 y 14-18 de BRCA2. La mayoría de las variantes produjeron alteraciones en el splicing (104), entre ellas 49 eran exónicas (missense, sinónimas, nonsense y frameshift). Aproximadamente el 70% de las variantes espliceogénicas (73/104) provocaron graves alteraciones (>60% de transcritos aberrantes). En total, 74 variantes fueron clasificadas como patogénicas o probablemente patogénicas según los criterios propuestos por ACMG (American College of Medical Genetic and Genomics), 30 de las cuales se encontraban previamente catalogadas como VUS., [Conclusiones]: La transcripción y el splicing son mecanismos fundamentales en la expresión génica que pueden verse alterados debido a cambios en la secuencia de DNA. El promotor de BRCA2 es sensible a cambios de nucleótido y su rastreo debería incluirse en los estudios genéticos de pacientes de CMOH. Por otro lado, cualquier variación en la secuencia podría alterar el splicing. En este contexto, los estudios con minigenes proporcionan datos fiables para evaluar el impacto de las variantes cuando no se dispone de RNA de pacientes., Instituto de Salud Carlos III, Ministerio de Economía y Competitividad (proyecto ID PI13/01749; 2014-2016). Consejería de Educación de la Junta de Castilla y León (proyecto ID CSI90U14). Beca predoctoral de la Universidad de Valladolid cofinanciada por el Banco Santander (2015-2019), la beca EMBO Short-Fellowship (ASTF 517-2016), la beca ERASMUS+ y la ayuda para estancias brteves en el desarrollo de tesis doctorales de la Universidad de Valladolid 2018.

Trabajo presentado a la European Human Genetics (ESHG) Conference, celebrada en Milan (Italia) del 16 al 19 de junio de 2018., The clinical classification of BRCA2 variants of uncertain significance (VUS) poses a challenge in human genetics. Historically, variants have been catalogued from the protein outlook, however, upstream gene-expression mechanisms, such as splicing, could be impaired by changes in the DNA sequence. Disrupted splicing variants could alter the ORF provoking the BRCA2 truncation and be involved in cancer development. Here, we have evaluated the splicing effect of 83 BRCA2 exons 2-9 variants by functional assays using the minigene MGBR2_2-9. The MGBR2_2-9 was built based on the splicing vector pSAD (Patent-P201231427, CSIC). In silico selected BRCA2 variants, from BIC and UMD databases, were introduced into MGBR2_2-9 and assayed in MCF-7 cells. Transcripts were analyzed by capillary electrophoresis and sequenced. After the bioinformatic analysis of 302 BRCA2 variants, 83 were functionally tested. Results showed that 53 variants impaired splicing (26 intronic and 27 exonic). Among them, 36 provoked ¿2/3 of aberrant transcripts. According to the ACMG and ENIGMA criteria, our results support the re-classification of 12 variants from VUS to pathogenic (c.67+1G>T, c.67+3A>G, c.426-12del5, c.441A>G, c.451G>A, c.475+3A>T, c.516+4delAA, c.517-1G>A, c.517G>T, c.631+1G>A, c.632+3A>G and c.632-3G>C) and 3 from VUS to likely pathogenic (c.97G>A, c.100G>A, c.476-3C>A). The reproducibility of this technique was supported by previous studies based on minigenes or/and patient RNA. MGBR2_2-9 is a robust tool which provides RNA data for the clinical interpretation of splicing variants., Projects FIS PI13/01749 and PI17/00227 (ISCIII, Spanish Ministry of Economy and Competitivity), BIO/VA34/15 (Junta Castilla-León); EF-B is supported by a predoctoral fellowship (University of Valladolid/Banco Santander).

Póster presentado a la European Human Genetics Conference, celebrada en Copenague (Dinamarca) del 27 al 30 de mayo de 2017., Mutation screening of BRCA2 identifies a large fraction of variants of uncertain clinical significance (VUS). Our goal was to investigate the impact of reported variants of BRCA2 exons 17 and 18 on splicing to assess their role in hereditary breast cancer and to identify critical regulatory elements that may constitute hotspots for spliceogenic variants. A splicing reporter minigene with BRCA2 exons 14 to-20 (MGBR2_ex14-20) was constructed in the pSAD vector. Fifty-two candidate variants were selected with splicing prediction programs, introduced in MGBR2_ex14-20 by site-directed mutagenesis and assayed in MCF-7 cells. Functional mapping by microdeletions revealed essential sequences for exon recognition on the 3' end of exon 17 and the 5' end of exon 18. Thirty out of the 52 selected variants induced anomalous splicing in minigene assays with >16 different aberrant transcripts, where exon skipping was the most common event. According to the biological indicators of pathogenicity, 18 variants could be classified as disease-causing, accounting for 28.6% of all pathogenic variants of exons 17-18 at the BRCA Share database. Aberrant splicing is especially prevalent in BRCA2 exons 17 and 18 due to the presence of active ESEs, which are recognized by splicing factor as SC35 and Tra2ß that play an important role in exon recognition. Splicing functional assays with minigenes are a valuable strategy for the interpretation of VUS of any disease-gene., Projects FIS PI13/01749 (ISCIII,Spanish Ministry of Economy and Competitivity), BIO/VA34/15 (Junta Castilla-León); EF-B is supported by a predoctoral fellowship (University of Valladolid/Banco Santander) and by a Short-Fellowship (EMBO).

Resumen del trabajo presentado al I Congreso Interdisciplinar en Genética Humana, celebrado en Madrid del 25 al 28 de abril de 2017., [Objetivos]: El rastreo de mutaciones en BRCA2 ha identificado un gran número de variantes de significado clínico desconocido (VUS). Nuestro objetivo es investigar el impacto de este tipo de variantes en el splicing de los exones 17 y 18 de BRCA2, así como caracterizar elementos reguladores en los mismos que constituyan hotspots para variantes de splicing. [Material y Método]: Se construyó un minigen con los exones 14-20 de BRCA2 en el vector pSAD®. En él, se evaluaron 52 variantes seleccionadas a través de programas de predicción de splicing. Cada una de ellas, fue introducida en el minigen mediante mutagénesis dirigida y ensayada en células MCF7. El estudio de regulación se llevó a cabo mediante microdeleciones, ensayos de pulldown y siRNAs. [Resultados]: El minigen wild type produjo un transcrito estable de tamaño (1.802nt) y estructura (V1-[BRCA2_exons_14-20]-V2) esperada. El mapeo mediante microdeleciones reveló regiones esenciales en el extremo 3' del exón 17 (c.7944-7973) y en el 5' del exón 18 (c.7979-7988, c.7999-8013). Estas contienen secuencias de unión a proteínas SR, importantes en el reconocimiento de los exones. Por otro lado, 30/52 variantes, provocaron alteraciones en el splicing. Se encontraron más de 16 tipos de transcritos diferentes, siendo el skipping el evento más común. Encontramos alteraciones en un amplio número de elementos de splicing, incluidos los sitios canónicos (15), sitios alternativos de novo (3), tracto de polipirimidinas (3) y enhancer/silenciadores (9). Cabe destacar que 18 de las variantes estudiadas podrían ser reclasificadas como patogénicas, lo cual supone un 28.6% de las variantes patogénicas reportadas en los exones 17 y 18 de BRCA2. [Conclusiones]: Las mutaciones de splicing son especialmente prevalentes en los exones 17 y 18 debido a la presencia de ESEs activos. Los minigenes son una herramienta valiosa para discriminar entre variantes patogénicas y neutras, así como para estudiar los mecanismos reguladores del procesamiento del RNA mensajero.

Póster presentado al I Congreso Interdisciplinar en Genética Humana, celebrado en Madrid del 25 al 28 de abril de 2017., [Objetivos]: Los minigenes son herramientas biotecnológicas avanzadas que permiten el análisis de variantes de splicing sin necesidad de una muestra de ARN del paciente. El rastreo de genes de susceptibilidad genera una gran cantidad de variantes de significado clínico incierto que requieren una interpretación clínica. PALB2 es un gen supresor de tumores que participa en el mantenimiento de la integridad del genoma, estando implicado en la susceptibilidad hereditaria a cáncer de mama. Con el objetivo de analizar funcionalmente PALB2 desde la perspectiva del splicing, se construyó un minigen (MGPB2_5-7) dentro del proyecto europeo BRIDGES. [Material y Método]: El MGPB2_5-7 fue construido en el vector de splicing pMAD® mediante enzimas de restricción en dos pasos: exones 5-6 + exón 7. Éste se transfectó en células MCF7, se extrajo el RNA y se realizó RT-PCR específica del minigen. Los resultados fueron analizados mediante gel de agarosa, electroforesis capilar y secuenciación SANGER. [Resultados]: El minigen PB2_5-7, de 6705pb esta constituido por el vector pMAD9 (4500pb) +[ivs4(274pb)- ex5(830pb)-ivs5(364pb)-ex6(72pb)-ivs6(232pb)//ivs6(191pb)-ex7(162pb)-ivs7(114pb)]. MGPB2_5-6 dio lugar al transcrito canónico (1083nt) y 2 alternativos no caracterizados, mientras que MGPB2_5-7 indujo un transcrito estable (1245nt), estando por tanto preparado para el estudio de mutaciones de splicing. Por otro lado, a través del servicio externo del CSIC (http://www.ibgm.med.uva.es/servicios/servicio-de-splicing-minigenes/) construimos minigenes para el estudio funcional de mutaciones de splicing de los genes MLH1(Síndrome de Lynch, LorgenGP), SERPINA1(Déficit en α1-antitripsina, ISCIII), COL1A1 (Osteogénesis Imperfecta) y CHD7 (Discapacidad Intelectual Hospital Universitario Cruces). Todos ellos generaron el transcrito canónico, y se caracterizó el impacto de mutaciones de los sitios naturales de splicing. [Conclusión]: EL minigen PB2ex5-7 y las futuras ampliaciones de Este, nos permitiran realizar el análisis funcional de mutaciones de splicing, recogidas en la base de datos UMD como VUS. Los minigenes son una herramienta robusta que nos permite analizar funcionalmente el efecto en el procesamiento del ARNm que pueden causar ciertas mutaciones., This project has received funding from the European Union’s Horizon 2020 research and innovation programme under grant agreement No 634935. EAV lab was also supported by grant Fis: PI13/01749 from the Spanish Ministry of Economy and Competitivity, Plan Nacional de I+D+I 2013-2016, ISCIII, co-funded by FEDER from Regional Development European Funds (European Union), and grant CSI090U14 (ORDEN EDU/122/2014) from the Consejería de Educación (Junta de Castilla y León, Spain).

Resumen del trabajo presentado al I Congreso Interdisciplinar de Genética Humana, celebrado en Madrid los días 25 al 28 de abril de 2017., [Objetivos] Recientemente, gracias a las nuevas tecnologías de secuenciación masiva (Next Generation Sequencing, NGS), se ha realizado un gran progreso en la identificación de variantes genéticas responsables de patologías como la discapacidad intelectual (DI) asociada o no a malformaciones congénitas. Nuestro objetivo ha sido analizar funcionalmente la variante c.5665+1G>T en el gen CHD7, que predice un síndrome de CHARGE en un paciente fallecido e inicialmente diagnosticado de Síndrome de Treacher-Collins., [Material y Método] La variante fue identificada mediante NGS utilizando un panel de 565 genes relacionados con DI. Se realizaron análisis bioinformáticos de su posible efecto en el splicing con el programa Human Splicing Finder. Los exones y secuencias intrónicas flanqueantes fueron amplificados a partir de ADN del paciente y clonados en el vector de splicing pSAD®. Se transfectaron células HeLa con esta construcción y un minigen wildtype; se aisló el ARN a las 48h y se realizó RT-PCR con primers específicos., [Resultados] El análisis bioinformático de la variante c.5665+1G>T predijo la eliminación del sitio donador canónico del exón 28. El minigen wildtype produjo el transcrito canónico esperado, mientras que el constructo con c.5665+1G>T produjo un transcrito aberrante mayoritario que presentaba la inserción de 63 nucleótidos del intrón 28 por uso de un sitio donador alternativo 64 nt downstream. El efecto en la proteína sería la inserción de 8 nuevos aminoácidos (VKVPEKLV) y la aparición de un codón de terminación (TAG) prematuro 25 nucleótidos downstream dando lugar a una proteína truncada de 1896 aminoácidos (proteína normal 2997 aa)., [Conclusiones] La variante c.5665+1G>T tiene un impacto completo en el splicing del gen CHD7 cuyo resultado sería una proteína truncada, lo que confirma el Síndrome de CHARGE en este paciente. Estos análisis tienen una gran utilidad para confirmar la patogenicidad de las variantes halladas mediante NGS y para el Consejo enético a las familias.

Resumen del póster presentado a la European Human Genetics Conference, celebrada en Barcelona (España) del 21 al 24 de mayo de 2016., A large fraction of pathogenic BRCA2 variants impairs mRNA splicing in hereditary breast/ovarian cancer. Missense, synonymous or in frame-deletion/insertion variants are usually classified as variants of uncertain significance. The best method to identify splicing aberrations is based on the study of patient RNA, but that is often difficult to obtain. Minigene-based technology is an alternative approach to test candidate splicing variants without the need of patient samples. To study this process we constructed a large minigene in the pSAD plasmid with exons 14 to 20 (MGBR2_ex14-20) to keep the genomic context. Here, we focus on exons 17 y 18 because of the atypical GC donor in exon 17. The intronic GT dinucleotide is the most conserved element of the donor splice signal. However, in a small fraction of the donor sites (, Projects FIS PI13/01749 (ISCIII),BIO/VA34/15 (Junta Castilla-León); EF-B is supported by a predoctoral fellowship (University of Valladolid/Banco Santander).

Resumen del póster presentado al XL Congreso de la Sociedad Española de Genética, celebrado en Córdoba del 16 al 18 de septiembre de 2015., En cáncer de mama y ovario hereditario (CMOH) hay >20 genes implicados que son responsables de ~25-30% de esta enfermedad. Las mutaciones en la región promotora de un gen pueden tener unas consecuencias funcionales muy importantes en la expresión génica. La mayoría de las mutaciones reguladoras (>70%) de transcripción se concentran entre las posiciones -500 a +50 del sitio de inicio de la transcripción (TSS). Sin embargo, el rastreo de variantes en estas secuencias no forma parte del diagnóstico genético rutinario. En este trabajo nos propusimos secuenciar la región promotora de BRCA2 (772 pb) en pacientes CMOH de alto riesgo (≥3 CM ó CM+COv) con test BRCA negativo. Se clonó el promotor de BRCA2 en el vector reportero de luciferasa pGL4, en el que se introdujeron las variantes previamente detectadas mediante mutagénesis dirigida y se realizaron ensayos funcionales de luminiscencia en células MCF-7. Se secuenciaron 66 pacientes de alto riesgo en las que se identificaron los SNPs rs206118 y rs3092989, y una deleción de 591 pb (-466 a +125 del TSS) en una paciente que debe ser confirmada. El SNP rs3092989 junto con los anotados en Ensembl rs11571571, rs55710239 y rs370721506, eliminaban posibles sitios de unión de factores de transcripción. Todos ellos y la del591, fueron introducidos en pGL4-BRCA2 y se realizaron ensayos funcionales de luciferasa (Firefly/Renilla) junto con la construcción wt como control. La deleción prácticamente anulaba la expresión de luciferasa (6%), lo cual apoyaría su patogenicidad. Según nuestros datos, se trataría de la primera mutación patogénica de promotor identificada en genes de susceptibilidad a CMOH. Los alelos G de rs55710239 y C de rs11571571 redujeron la expresión del gen reportero un 48 y 59%, respectivamente, rs370721506 no la afectó, mientras que el alelo A de rs3092989 la incrementó un 197%. Los descensos en la expresión de los 2 SNPs son difíciles de clasificar, pero podrían sugerir a priori un incremento del riesgo asociado a los alelos G-rs55710239 y C-rs11571571, aunque esta hipótesis necesita ser confirmada mediante estudios caso-control que permitan un cálculo preciso del riesgo asociado. En conjunto, estos datos apoyan la necesidad de analizar otras etapas de la expresión génica (transcripción, splicing, etc) de genes implicados en enfermedades hereditarias para facilitar su clasificación clínica y el consejo genético y contribuir a la clarificación del espectro de predisposición genética a CMOH.

Póster presentado al XL Congreso de la Sociedad Española de Genética, celebrado en Córdoba del 16 al 18 de septiembre de 2015., El exón17 de BRCA2 presenta un sitio donador de splicing atípico (GC), que aparecen en un 1% de los intrones humanos (Kralovicova et al., 2011). Su reconocimiento debe estar mediado por reguladores en el exón e intrón 17 y/o el exón 18. De esta forma, las mutaciones que afecten a estas secuencias podrían alterar el proceso de splicing de BRCA2 y estar así asociadas a cáncer de mama y ovario hereditario (CMOH). En este estudio, construimos un minigen en plásmido reportero de splicing pSAD® con los exones de 14 a 20 de BRCA2 para el estudio del splicing de los exones 17 y 18 en su contexto genómico, así como para evaluar el impacto funcional de mutaciones sobre este proceso. Se analizaron in silico el exón e intrón 17 y el exón 18 de BRCA2, para mapear los putativos sitios crípticos y los motivos ESE y ESS. Se analizaron 66 mutaciones del exón 17 y 145 del exón 18 con NNSplice y HSF, recogidas en BIC y UMD. Se seleccionaron 31 mutaciones candidatas de splicing en el exón 18 y 14 en el exón 17. Se construyó un minigen híbrido 14-20 de BRCA2. Las variantes seleccionadas fueron generadas en el minigen mediante mutagénesis dirigida y ensayadas funcionalmente en células HeLa. El MGBR14-20 produjo un transcrito estable de tamaño (2046nt) y estructura (V1-BRCA2 exones 14 a 20-V2) esperados. Las predicciones bioinformáticas coinciden con los resultados del estudio de elementos reguladores de splicing mediante microdeleciones solapantes. Hasta la fecha, se han ensayado 24 mutaciones (10 del exón 17 y 14 del exón 18), de las cuales 15 (62.5%) alteran el splicing. Once (46%) inducen anomalías mayoritariamente con transcritos aberrantes con codones stop prematuros o deleciones in-frame de regiones esenciales de la proteína BRCA2, de modo que podían ser clasificadas como patogénicas. Las alteraciones más frecuentemente encontradas son: exón skipping, uso de sitios crípticos de splicing y uso de aceptores o donadores de novo. Cabe destacar que 7 de las 12 mutaciones missense estudiadas (58%) provocaron este tipo de alteraciones. El minigen MGBR2 14-20 es una herramienta robusta para el estudio de mutaciones en los exones 17 y 18 debido a su estabilidad y al mantenimiento del contexto genómico con un total de 7 exones. El estudio de mutaciones que puedan afectar al proceso de splicing resulta de vital importancia, pues variantes de significado clínico incierto provocan graves alteraciones en el transcrito de BRCA2, y podrían ser reclasificadas como patogénicas., EAV lab is supported by grant Fis: PI13/01749 from the Spanish Ministry of Economy and Competitivity, Plan Nacional de I+D+I 2013-2016, ISCIII, co-funded by FEDER from Regional Development European Funds (European Union), and grant CSI090U14 (ORDEN EDU/122/2014) from the Consejería de Educación (Junta de Castilla y León, Spain). EFB is supported by a predoctoral fellowship from the University of Valladolid (2015-2019).

Resumen del póster presentado al XXVIII Congreso Nacional de Genética Humana - AEGH, celebrado en Palma de Mallorca del 13 al 15 de mayo de 2015., [Objetivo]: El exón 17 de BRCA2 presenta un donador de splicing atípico (GC), su reconocimiento debe estar mediado por motivos reguladores en el intrón 17 y/o el exón 18. Las mutaciones que afecten a estas secuencias podrían alterar el proceso de splicing, y estar asociadas a cáncer de mama y ovario hereditario. Nuestro objetivo es la construcción de un minigen estable, que contenga los exones del 12-20 de BRCA2, para su utilización como herramienta de estudio de mutaciones de splicing en los exones 17 y 18. [Materiales y Métodos]: se analizaron in silico 66 mutaciones para el exón 17 y 145 mutaciones para el exón 18 con los programas NNSplice y HSF, recogidas en las bases de datos BIC y UMD. Las variantes seleccionadas fueron introducidas mediante mutagénesis dirigida en el minigen y transfectadas en células HeLa para observar el efecto de la mutación en el splicing. [Resultados]: hemos realizado la construcción de un minigen estable que incluye desde el exón 12 hasta el 20 de BRCA2 para estudiar mutaciones en los exones 17 y 18 en su contexto genómico. Se seleccionaron 22 mutaciones (10.4%) que fueron ensayadas funcionalmente en el minigen. Estudios previos de nuestro grupo sugieren que existen sitios críticos de regulación que son esenciales para el reconocimiento de los exones 17 y 18 (Acedo A. Tesis Doctoral). Según nuestros resultados, las mutaciones en estas regiones afectan al splicing provocando transcritos anómalos, grandes deleciones e inserciones y exón skipping. [Conclusiones]: Las variantes con impacto en el splicing provocan graves alteraciones en los transcritos generados. El estudio de mutaciones de splicing resulta de vital importancia para la clasificación de variantes con significado clínico desconocido, y los minigenes son una herramienta sencilla y robusta para el estudio de mutaciones que puedan estar afectando a este mecanismo., Proyectos PI13/01749 (ISCIII, Ministerio de Economía y Competitividad) y CSI090U14 (Consejería de Educación, Junta de Castilla y León), Beca Fundación Villalar 2014 (Castilla y León).

PALB2 loss-of-function variants confer high risk of developing breast cancer. Here we present a systematic functional analysis of PALB2 splice-site variants detected in approximately 113,000 women in the large-scale sequencing project Breast Cancer After Diagnostic Gene Sequencing (BRIDGES; https://bridges-research.eu/). Eighty-two PALB2 variants at the intron-exon boundaries were analyzed with MaxEntScan. Forty-two variants were selected for the subsequent splicing functional assays. For this purpose, three splicing reporter minigenes comprising exons 1-12 were constructed. The 42 potential spliceogenic variants were introduced into the minigenes by site-directed mutagenesis and assayed in MCF-7/MDA-MB-231 cells. Splicing anomalies were observed in 35 variants, 23 of which showed no traces or minimal amounts of the expected full-length transcripts of each minigene. More than 30 different variant-induced transcripts were characterized, 23 of which were predicted to truncate the PALB2 protein. The pathogenicity of all variants was interpreted according to an in-house adaptation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology (ACMG-AMP) variant classification scheme. Up to 23 variants were classified as pathogenic/likely pathogenic. Remarkably, three ±1,2 variants (c.49-2A>T, c.108+2T>C, and c.211+1G>A) were classified as variants of unknown significance, as they produced significant amounts of either in-frame transcripts of unknown impact on the PALB2 protein function or the minigene full-length transcripts. In conclusion, we have significantly contributed to the ongoing effort of identifying spliceogenic variants in the clinically relevant PALB2 cancer susceptibility gene. Moreover, we suggest some approaches to classify the findings in accordance with the ACMG-AMP rationale. © 2021 The Authors. The Journal of Pathology published by John Wiley & Sons, Ltd on behalf of The Pathological Society of Great Britain and Ireland.

PALB2 loss-of-function variants confer high risk of developing breast cancer. Here we present a systematic functional analysis of PALB2 splice-site variants detected in approximately 113,000 women in the large-scale sequencing project Breast Cancer After Diagnostic Gene Sequencing (BRIDGES; https://bridges-research.eu/). Eighty-two PALB2 variants at the intron-exon boundaries were analyzed with MaxEntScan. Forty-two variants were selected for the subsequent splicing functional assays. For this purpose, three splicing reporter minigenes comprising exons 1-12 were constructed. The 42 potential spliceogenic variants were introduced into the minigenes by site-directed mutagenesis and assayed in MCF-7/MDA-MB-231 cells. Splicing anomalies were observed in 35 variants, 23 of which showed no traces or minimal amounts of the expected full-length transcripts of each minigene. More than 30 different variant-induced transcripts were characterized, 23 of which were predicted to truncate the PALB2 protein. The pathogenicity of all variants was interpreted according to an in-house adaptation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology (ACMG-AMP) variant classification scheme. Up to 23 variants were classified as pathogenic/likely pathogenic. Remarkably, three ��1,2 variants (c.49-2A>T, c.108+2T>C, and c.211+1G>A) were classified as variants of unknown significance, as they produced significant amounts of either in-frame transcripts of unknown impact on the PALB2 protein function or the minigene full-length transcripts. In conclusion, we have significantly contributed to the ongoing effort of identifying spliceogenic variants in the clinically relevant PALB2 cancer susceptibility gene. Moreover, we suggest some approaches to classify the findings in accordance with the ACMG-AMP rationale. �� 2021 The Authors. The Journal of Pathology published by John Wiley & Sons Ltd on behalf of The Pathological Society of Great Britain and Ireland.