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Background. Our aim was to describe the steps in planning, implementing, and running a multicentre cohort study of maternal and perinatal health using a high-quality biobank comprised of maternal serum, plasma, and hair samples collected from five sites in Brazil.The Preterm SAMBA study, conducted by the Brazilian Network for Studies on Reproductive and Perinatal Health, was an innovative approach used to identify women at higher risk for preterm birth. It is also of great importance in the study of other maternal and perinatal complications in the context of Brazil, which is a middle-income country. Methods. We described phases of planning, implementing, and running the Preterm SAMBA study, a multicentre Brazilian cohort study of low-risk nulliparous pregnant women, to validate a set of metabolite biomarkers for preterm birth identified in an external cohort. Procedures and strategies used to plan, implement, and maintain this multicentre preterm birth study are described in detail. Barriers and experience cited in the current narrative are not usually discussed in the scientific literature or published study protocols. Results. Several barriers and strategies were identified in different phases of the Preterm SAMBA study at different levels of the study framework (steering committee; coordinating and local centres). Strategies implemented and resources used in the study are a legacy of the Brazilian Network, aimed at training collaborators in such complex settings. Conclusion. The Brazilian Network for Studies on Reproductive and Perinatal Health has gained some experience in conducting a multicentre cohort study using a resourceful biobank which may be helpful to other research groups and maternal/perinatal health networks that plan on employing a similar approach to a similar background.

Agradecimentos: This work was funded by Fundacao de Amparo a Pesquisa do Estado de Sao Paulo (FAPESP; Grants 2006/54878-3, 2007/55930-1, 2007/59442-1, 2008/53519-5, 2008/57805-2, 2010/02628-9) and Conselho Nacional de Pesquisa (CNPq: Grants 304366/2009-9, 475158/2010-5). We thank the access to equipment and assistance provided by the National Institute of Science and Technology on Photonics Applied to Cell Biology (INFABIC) at the State University of Campinas Abstract: Focal adhesion kinase (FAK) contributes to cellular homeostasis under stress conditions. Here we show that alpha B-crystallin interacts with and confers protection to FAK against calpain-mediated proteolysis in cardiomyocytes. A hydrophobic patch mapped between helices 1 and 4 of the FAK FAT domain was found to bind to the beta 4-beta 8 groove of alpha B-crystallin. Such an interaction requires FAK tyrosine 925 and is enhanced following its phosphorylation by Src, which occurs upon FAK stimulation. alpha B-crystallin silencing results in calpain-dependent FAK depletion and in the increased apoptosis of cardiomyocytes in response to mechanical stress. FAK overexpression protects cardiomyocytes depleted of alpha B-crystallin against the stretch-induced apoptosis. Consistently, load-induced apoptosis is blunted in the hearts from cardiac-specific FAK transgenic mice transiently depleted of alpha B-crystallin by RNA interference. These studies define a role for alpha B-crystallin in controlling FAK function and cardiomyocyte survival through the prevention of calpain-mediated degradation of FAK FUNDAÇÃO DE AMPARO À PESQUISA DO ESTADO DE SÃO PAULO - FAPESP Aberto

Agradecimentos: This work was funded by Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP; Grants 2006/54878-3, 2007/55930-1, 2007/59442-1, 2008/53519-5, 2008/57805-2, 2010/02628-9) and Conselho Nacional de Pesquisa (CNPq: Grants 304366/2009-9, 475158/2010-5, 573672/2008-3, 559698/2009-7) Abstract: Focal adhesion kinase (FAK) regulates cellular processes that affect several aspects of development and disease. The FAK N-terminal FERM (4.1 protein-ezrin-radixin-moesin homology) domain, a compact clover-leaf structure, binds partner proteins and mediates intramolecular regulatory interactions. Combined chemical cross-linking coupled to MS, small-angle X-ray scattering, computational docking and mutational analyses showed that the FAK FERM domain has a molecular cleft (similar to 998 angstrom(2)) that interacts with sarcomeric myosin, resulting in FAK inhibition. Accordingly, mutations in a unique short amino acid sequence of the FERM myosin cleft, FP-1, impaired the interaction with myosin and enhanced FAK activity in cardiomyocytes. An FP-1 decoy peptide selectively inhibited myosin interaction and increased FAK activity, promoting cardiomyocyte hypertrophy through activation of the AKT-mammalian target of rapamycin pathway. Our findings uncover an inhibitory interaction between the FAK FERM domain and sarcomeric myosin that presents potential opportunities to modulate the cardiac hypertrophic response through changes in FAK activity CONSELHO NACIONAL DE DESENVOLVIMENTO CIENTÍFICO E TECNOLÓGICO - CNPQ FUNDAÇÃO DE AMPARO À PESQUISA DO ESTADO DE SÃO PAULO - FAPESP Fechado

Orientador: Kleber Gomes Franchini Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas Resumo: O estímulo mecânico é um dos principais fatores responsáveis pelos ajustes funcionais e estruturais do miocárdio em resposta à sobrecarga de trabalho. O estímulo determina a ativação de uma rede complexa de vias de sinalização celulares que culminam com o crescimento hipertrófico de cada cardiomiócito. A quinase de adesão focal (FAK) tem sido indicada como principal proteína sinalizadora envolvida na resposta de cardiomiócitosao estímulomecânico.No entanto, os mecanismosde ativação da FAK pelo estímulomecânico aindanão são conhecidos. Na tentativa de entender melhor as vias de sinalização envolvidas no estabelecimento da hipertrofia cardíaca, utilizamos o sistema duplo-morido em levedura para procurar proteínas que se associam a FAK nesta situação. Para isso utilizamos uma construção de FAK contendo a porção C-Terminal e o domínio quinase (FAKNX) para procurar interações protéicas em uma biblioteca de cDNA de miocárdio de rato submetido às 6h de coarctação da aorta. Após o escrutíneo da biblioteca verificamos a existência de uma interação entre a FAK e sítios da região C-Terminal da cadeia pesada de miosina (MHC). A interação FAK/MHC foi confIrmada por ensaios de pulldown com a proteína híbrida GST-Miosina e extratos de miocárdios de rato. Imunotluorescência e microscopia confocal confIrmaram a colocalização da FAK e da MHC na região sarcomérica correspondente à banda A, em cardiomiócitos de ratos neonatos em cultura. Além disso, a demonstração da interação da FAK com MHC foi verifIcada em extratos de MHC purifIcada de corações de ratos neonatos em condições de força iônica elevada, indicando que a ligaçãoFAK-MHCé dependentede uma interação forte. Ensaios depulldown realizados com a porção FERM da FAK mostraram que esta região N-terminal é sufIciente para a interação FAK-MHC. Em experimentos de coimunoprecipitação com extratos de cultura de cardiomiócitos de ratos neonatos, verificamos que o estiramento acompanha-se de diminuição da associação FAKlMHC, efeito este paralelo à fosforilação da FAK no resíduo de tirosina 397. O bloqueio da fosforilação da FAK com PP2 ressaltou a importânciada fosforilação/ativaçãoda FAK na interação FAK/MHC uma vez que, o tratamento bloqueou a dissociação destas proteínas. Experimentos de imunofluorescência e microscopia confocal de miócitos tratados com PP2 confirmaram a colocalização da FAKlMHC mesmo após 60 minutos de estiramento. O ensaio de pulldown do GST-FERM com os extratos de cardiomiócitos estirados também apresentou diminuição na associação FAKlMHC sugerindo que o estiramento produz modificação estrutural e/ou funcionalnos sítios da MHCresponsáveispela interação com a FAK. A interação FAKlMHC apresentacaracterísticascompatíveiscom aquelas esperadas para um sistema transdutor biomecânico, sensível ao estiramento dos miócitos cardíacos Estes resultados são compatíveis com a idéia de que a transdução mecano-bioquímica, ao menos no que se relaciona à FAK é dependentedo estiramentode MHC em cardiomiócitos, podendo neste caso, a FAK ser considerada elemento sensor de estímulo mecânicos em cardiomiócitos Abstract: Mechanical stress is a major factor involved in the development of myocardial adaptive and maladaptive changes in heart diseases. Local mechanical forces activate signaling mechanisms in cardiac myocytes inducing the expression of specific genetic programs linked to myocardial structural and functional remodeling. Although mechanical forces might directly trigger signaling mechanisms in cardiac myocytes the mechanism by which they are sensed and convertedinto biochernicalsignals remains elusive. Focal adhesion kinase (FAK) has been implicated as a signaling molecule involved in the early response of cardiac myocytes to mechanical stress. The mechanism of FAK activation by mechanical stimuli is not c1ear.In this study we performed a yeast twohybrid screening in order to search for novel protein binding partners with FAK. We screened a N-Terminal FAK construction containing the FERM and kinase domain (bait) against a cDNA library constructed from a 6h pressure overloaded adult rat left ventricle. We found an interaction between FAK and C-terminal coiled-coil region of a-myosin heavy chain. We confrnned this interaction with pulldown assay with the hybrid protein GST-Myosin and myocardium rat extracts. Laser confocal rnicroscopy confrnned the colocalization of FAK and MHC in the sarcomericregion corresponding to the A band in cultured neonatal rat ventricular myocytes (NRVMs). We also demonstrated FAK and MHC interaction in purified myosin extracts of NRVMs in buffer with high salt concentration indicating that FAK-MHCis a strong interaction. Pulldown assay with GST-FERM showed that the N-Terminal domain is enough for FAK-MHC interaction. In coimmunoprecipitationassays with NRVMs we found out that cyclic stretch reduces FAK-MHC interaction and this effect is parallel to FAK phosphorylationin tyr397. Treatmentwith PP2 inhibitedFAKphosphorylation and blocked FAK-MHC dissociation showing the importance of FAK phosphorylation in FAK-MHC interaction. Laser confocal microscopy of NRMV treated with PP2 confirmed the colocalization of FAK-MHC afier 60 minutes of cyc1ic stretch. GST-FERM pulldown assay with NMRVs extracts presented reduction in FAK-MHC association suggesting that the cyc1ic stretch produces structural and/or functional modification in the C-terminal coiled-coil region of a-MHC responsible for FAK-MHCinteraction. We found out that FAKlMHC interaction presents distinct characteristics compatible with a biomechanical transducer system, responsive to cyc1ic stretch. Our results are compatible with the idea that the mechano-biochemical transduction involving FAK in cardiomyocytes depends on the stretch of MHC. In this case we could consider FAK as a sensor of mechanical stress in cardiomyocytes Doutorado Ciências Básicas Doutor em Clínica Médica

Orientador: Kleber Gomes Franchini Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas Resumo: As proteínas da família MEF2 são fatores de transcrição do tipo MADS-box que desempenham papéis importantes na regulação da miogênese e da morfogênse do miocárdio. Trabalhos desenvolvidos no nosso laboratório anteriormente, demonstraram que a rápida ativação de MEF2 por estímulo hipertrófico exerce um papel principal na ativação de c-jun, sugerindo sua importância na regulação da expressão de genes de resposta imediata por estímulo hipertrófico. o presente trabalho teve como objetivo estudar a expressão e regulação dos fatores MEF2 frente à sobrecarga mecânica. Foi demonstrado que os fatores MEF2 são ativados em resposta à sobrecarga mecânica em coração de rato. Essa ativação não ocorreu por um aumento na expressão de MEF2, mas provavelmente, por alguma modificação póstranscricional na proteína, aumentando assim a afinidade ao seu DNA consenso em ensaio de EMSA o método de duplo-híbrido em levedura foi utilizado para encontrar proteínas que interajam com MEF2 e atuem na sua regulação em resposta ao estímulo mecânico. Numa triagem de biblioteca de coração de rato previamente submetido à coarctação da aorta com uma "isca" de MEF2C, foram encontrados 4 c1ones de cDNA contendo a região C-terminal de miosina de cadeia pesada e 4 c1onescontendo a região Nterminal da proteína regulatória Ki-1I57. A interação entre MEF2C e miosina foi confirmada por imunoprecipitação em coração de rato e a interação entre MEF2C e Ki-1I57 foi confirmada por imunoprecipitação, ensaio de co-precipitação e análise microscópica de imunolocalização. A interação entre MEF2 e Ki-1I57 é dependente de estímulo mecânico no coração. Um ensaio de imunoprecipitação com anticorpo anti-MEF2 demonstrou uma associação basal entre essas duas proteínas no ventrículo esquerdo de ratos controle. No entanto, o estímulo mecânico causou uma redução significativa nesta associação. Ki-l/57 se apresentou co-Iocalizado com MEF2 no núcleo de miócitos de ratos controle. Porém, ao submeter ratos a coarctação da aorta, essa co-Iocalização não foi mais observada no núcleo dos miócitos. Ki-1I57 também exerce um efeito inibitório sobre a ligação de MEF2 a sua região consenso de DNA em ensaio de EMSA Esses resultados sugerem que a interação de Ki-l/57 com :MEF2é inibitória e que esteja envolvida com a regulação de MEF2 em resposta ao estímulo mecânico no coração Abstract: The MEF2 proteins family is composed of MADS box transcription factors that plays important roles in the regulation of myogenesis and morphogenesis of myocardium. Previous work developed in our laboratory showed that the early activation of MEF2 proteins by mechanical overload plays a main role in the actívation of c-jun, suggestíng its importance in the regulation of irnmediate early genes response to mechanical overload The present work objective was to study the expression and regulatíon of MEF2 factors in face of mechanical overload. 1t was demonstrated that the MEF2 factors are activated in response to mechanical overload in rat heart This activation did not occur by an increase in MEF2 expression, but probably by some kind of post-transcriptíonal modification in the protein, raising the affinity ofMEF2 to its DNA in EMSA experiments. The yeast two-hybrid system was used to find proteins that interact with MEF2 and act in its regulation in response to mechanical overload In a rat heart library screening witb MEF2C as bait, four cDNA c1ones encoding a C-terminal region of Myosin Heavy Chain were isolated, as well as four c1ones encoding the N-terminaI region of the regulatory protein Ki-l/57. Tbe interaction between MEF2C and myosin was confirmed by irnmunoprecipitation in rat beart and the interactíon between MEF2C and Ki-1I57 was confirmed by immunoprecipitation, pull down assay and immunlocalization by laser confocaI microscopic analysis. The interactíon of :MEF2with Ki-l/57 is dependent on mechanical overload in the beart. An immunoprecipitation assay using anti-MEF2 antibody sbowed a basal association between these two proteins in left ventric1eof control rats. However, the mecbanical overload caused a significant reduction in this association. Ki-l/57 co-Iocalizes with MEF2 in the nuc1eusof myocytes of control rats. On the other hand, after submitting the animais to transverse aortic constriction, this co-Iocalization in the nucleus was no longer observed. Ki-1I57 also exerts an inhibitory effect upon MEF2C's DNA binding activity. These results suggest that the interaction between MEF2 and Ki-l/57 is inhibitory and that it may be involved in the regulation ofMEF2 in response to mechanical stimulus in the heart Doutorado Medicina Experimental Doutor em Fisiopatologia Médica

Orientador: Eduardo Arantes Nogueira Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: o conceito de volume cardíaco total invariante foi confirmado em animais, com demonstrações experimentais. Entretanto, em humanos, não há infonnação sobre o volume do coração durante o ciclo cardíaco, embora já demonstrado que o ápex permanece praticamente imóvel durante a sístole. Com base nestes dados levantamos a hipótese de que, em humanos normais, o volume cardíaco também deve ser constante. O conceito do ápex cardíaco estacionário implica que o volume cardíaco total deve ser constante durante o ciclo cardíaco Para testar esta hipótese utilizamos a ecocardiografia bidimensional para avaliar o volume cardíaco total. Para isso, utilizamos como técnica de investigação o ecocardiograma bidimensional, avaliando as dimensões do coração como um todo durante o ciclo cardíaco. Estudamos 41 crianças e adolescentes, cuja idade variou entre 3 meses e 14 anos (média de 6,15), que foram encaminhadas ao Serviço de Ecocardiografia do Hospital das Clínicas da Universidade Estadual de Campinas para avaliação de sopro cardíaco, porém com estudo ecocardiográfico normaL Vinte crianças eram do sexo femininoe 21 do sexo masculino. No estudo ecográfico bidimensional avaliamos o perímetro, área e volume total do conteúdo intrapericárdico através da região subcostal, em sístole e diástole final. Os dados mostraram uma forte correlação entre sístole e diástole, com índices de 0,98 para o perímetro, e 0,99 para área e também para o volume. Nossas medidas mostraram uma leve tendência a um maior volume diastólico em relação ao sistólico, também observado em estudos com animais, sendo 3,55 B,O % para o perímetro, 4,18:t 2,8 % para a área e 6,6 :t 4,2% para o volume diastólico. Em conclusão, nosso estudo mostra que, também em humanos, a variação volumétrica do coração durante o ciclo cardíaco é mínima, podendo ser considerada quasi-invariante Abstract: Background : The concept of a stationary apex predicts tOOttotal heart volume should be constant during the cardiac cyc1e. Total heart volume invariance was already demonstrated in animaIsbut not in humans. The apex of heart in humans also appears to be stationary. We hypothesized tOOttotal cardiac volume should be invariant in humans. We evaluated the dimensions of the heart during the cardiac cyc1e with two-dimensional echocardiography of 41 nonnal children and adolescents, whose age ranged from Oto 14 years (average of6,15 years). Twentywere females and 21 males. Methods: We measured the perimeter, area and volume in systole and diastole imaging the heart in subcostal 4-chamber view. Results: Our data showed a strong correlation between the parameters in systole and diastole, with indices of correlation of 0.98 for the perimeters and 0.99 for areas and also 0.99 for volumes. Diastolic dimensions were systematica11ylarger by a small amount, 3,55 :t 3,0% ofthe diastolic perimeter, 4,18 :f:2,8% ofthe diastolic area and 6,6:f: 4,2% ofthe diastolic volume. ConcIusion: Our data show tOOt,in normal humans, the volumetric variation of the heart during cardiac cyc1eis also small, and total volume invariance is still tenable Mestrado Clínica Médica Mestre em Clínica Médica

Orientador: Gilberto de Nucci Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas Resumo: O sildenafil, inibidor específico de PDE5, é utilizado no tratamento da disfunção erétil. Na procura de um inibidor mais potente e seletivo de PDE5, testamos vinte novos análogos do sildenafil (6a-v), caracterizados pela presença de um grupo sulfonil ou de um substituinte n'n'etilendiamina na posição do grupo metil da piperazina. Os objetivos deste trabalho foram: 1) Avaliar a atividade inibitória da PDE5 de plaquetas humanas; 2) Avaliar o efeito relaxante dos análogos do sildenafil em corpo cavernoso de coelho; 3) Avaliar o efeito relaxante dos análogos do sildenafil em anéis de aorta de coelho. Foi utilizado sangue de voluntários sadios para a atividade inibitória da PDE5 e coelhos New Zealand machos (2-3 kg) procedentes do CEMIB-UNICAMP para os estudos funcionais. Os animais foram anestesiados com uretana, o corpo cavernoso e a artéria aorta foram rapidamente removidos. O tecido cavernoso e anéis de aorta foram montados em banho para órgão isolado contendo solução de Krebs (37oC, 95% O2 / 5% CO2). Os tecidos foram ligados a transdutores isométricos conectados a um sistema PowerLab® de aquisição de dados. Nossos resultados mostraram que a atividade inibitória da PDE5 induzida pelos análogos do sildenafil em plaquetas humanas foi de maneira dependente da concentração. Os compostos 6m, 6n e 6q mostraram valores elevados de IC50 para inibir a PDE5 plaquetária, enquanto que os compostos 6a, 6b, 6d, 6g e 6p produziram inibição inferior a 50%. A potência inibitória (IC50) dos compostos 6c, 6e, 6f, 6h, 6i, 6l e 6o foi similar ao sildenafil (IC50: 0,05 µM) com valores variando entre 0,05 e 0,15 µM. Os análogos que derivaram da molécula n'n'etilendiamina (6r, 6s, 6t e 6v) mostraram uma boa atividade inibitória com valores entre 0,20-0,51 µM. Interessantemente, o composto 6u mostrou uma potência de 0,04 µM, o qual representou o menor valor obtido dos análogos do sildenafil. Nos estudos funcionais, todos os análogos do sildenafil, à exceção do análogo 6m, relaxaram preparações de corpo cavernoso de coelho de maneira dependente da concentração. Particularmente, o análogo 6f mostrou o melhor perfil farmacológico no relaxamento, com potência similar ao sildenafil, e pode servir de base para o desenvolvimento de novos inibidores de PDE5 para o tratamento da disfunção erétil. Além disso, nossos resultados mostraram que os análogos do sildenafil produzem relaxamento dependente da concentração em anéis de aorta de coelho com endotélio íntegro ou removido. Somente o análogo 6b e 6m apresentaram valores de potência inferiores quando comparados ao sildenafil em tecidos com endotélio íntegro. A remoção do endotélio ou a adição do LNAME ou do ODQ (inibidor da NO sintase e da guanilil ciclase solúvel, respectivamente) em tecidos com endotélio íntegro, provocou deslocamento à direita para o sildenafil e seus análogos, à exceção do 6r e 6u que não apresentaram diminuição da potência decorrente da inibição do NO, seja pela remoção do endotélio, pela inibição da NO sintase ou pela inibição da guanilil ciclase solúvel. Nossos dados também mostram que o 6r e 6u, em combinação com o BAY 41-2272, aumentam a potência evocada por estes análogos tanto em anéis de aorta com endotélio íntegro ou removido. O relaxamento evocado pelo sildenafil, 6r e 6u não envolve a participação de canais de potássio e de cálcio, nem envolve a formação de prostanóides. As respostas relaxantes destes dois análogos não foram alteradas em tecidos desprovidos de endotélio, mostrando-se independentes da via NO/GMPc. Isto sugere que estes dois análogos podem ser de particular interesse em patologias decorrentes de disfunção endotelial. Abstract: Sildenafil, a cGMP-specific phosphodiesterase-5 (PDE5) inhibitor, is used for the treatment of erectile dysfunction. In the search for a potent and selective PDE5 inhibitor, new sildenafil analogues (6a-v), characterized by the presence on the sulphonyl group in the 5' position of novel N-4-substituted piperazines or ethylenediamine moiety, were synthesized. The aim of this work was 1) To evaluate the PDE5 inhibitory activity in human platelets; 2) To evaluate the relaxing effect of sildenafil analogues in rabbit corpus cavernosum; 3) To evaluate the relaxing effect of sildenafil analogues in rabbit isolated aorta. Blood from human volunteers were collected and used for PDE5 inhibitory activity and Male New Zealand rabbit (2-3 kg) for functional studies. The rabbits were anaesthetized with urethane and sacrificed. The cavernosal tissue and aortic rings were mounted in organ bath containing Krebs solution (37oC, 95% O2 / 5% CO2). Each tissue was connected to an isometric transducer which was connected to a data acquisition system Powerlab®. Our results showed that sildenafil and its analogues concentration-dependently inhibited PDE5 activity in human platelets. Compounds 6m, 6n and 6q showed higher values of IC50 to inhibit PDE5 of platelets, whereas compounds 6a, 6b, 6d, 6g and 6p did not reach 50% of inhibition. The inhibitory potency of PDE5 for 6c, 6e, 6f, 6h, 6i, 6l and 6o were similar with sildenafil (IC50: 0,05 µM) with values between 0,05-0,15 µM. Derived analogues from n'n' substitution showed great PDE5 inhibitory activity. Interesting, compound 6u exhibited greater IC50 value (0,04 µM). In functional studies, all sildenafil analogues with exception of 6m, relaxed concentration-dependently rabbit corpus cavernosum. Compound 6f exhibited great pEC50 value in corpus cavernosum and could be used as base for developing new PDE5 inhibitors. Moreover, our results showed that sildenafil analogues concentration-dependently relaxed both endothelium-intact and - denuded aortic rings with similar potency values of sildenafil. Compounds 6b and 6m showed lower values of potency when compared to sildenafil in endothelium intact. Endothelium denudation or addition of L-NAME or ODQ (NOS and sGC inhibitors, respectively) caused marked rightward shifts in the curve to sildenafil and its analogues, whereas the relaxation curves for 6r and 6u were not altered after endothelium removal or either by the NO synthase or sGC inhibition. Moreover, our data also suggest that compound 6r and 6u increased the potency values in combination with BAY 41-2272 in both intact and denuded endothelium. The relaxation evoked by sildenafil, 6r and 6u does not involve either calcium or potassium channels or prostanoids formation. The relaxing responses by these compounds were independent of NO/cGMP pathway, suggesting that these compounds may be used in several diseases involving endothelium dysfunction. Doutorado Doutor em Farmacologia

Orientador: Licio Augusto Velloso Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas Resumo: Diabetes melhtus tipo 2 é uma doença de etiologia multifatorial que resulta da confluência de pelo maios dois fenômenos distintos, resistência à ação e falência na produção de insulina. Evidências recentes tem sugerido que mecanismos comuns podem participar dos eventos que precipitam o desenvolvimento tanto da resistência à insulina quanto da falência da célula beta pancreática. A caracterização destes eventos pode abrir perspectivas para abordagens terapêuticas unificadas visando corrigir simultaneamente os dois mais importantes distúrbios que participam da gênese desta doença. A proteína co-ativador la do receptor ativado por prolíferador de peroxissoma, ou PGC-la, cumpre alguns requisitos que permitem sua inclusão numa lista de possíveis participantes nos mecanismos acima expostos. Para avaliar o papel desta proteína na produção e na ação periférica da insulina, utilizou-se um oligonucleotídeo antisense capaz de reduzir significativamente a expressão da PGC-la. Através deste método observou-se que a PGC- la responde a estímulos simpáticos que promovem a inibição da secreção de insulina. Tais estímulos induzem o aumento da expressão desta proteína que por sua vez leva a um aumento da expressão da proteína desacopladora-2 (UCP-2) em ilhotas pancreáticas. O desacoplamento da respiração mitocondrial deve favorecer a redução da produção de ATP decorrente do metabolismo da glicose e desta forma reduzir a secreção de insulina. Por outro lado, em um modelo animal de obesidade e diabetes induzido por dieta hiperüpídica observou-se um aumento da expressão da PGC-la em fígado e tecido adiposo. A inibição da expressão da PGC-la nestes animais promoveu restauração da homeostase da glicose, aumento da secreção de insulina, melhora na sinalização de insulina em tecidos periféricos e surpreendentemente, regressão da esteatose hepática induzida por dieta. Portanto, a proteína PGC-la surge como promissor alvo para abordagem terapêutica em diabetes mellitus e doenças afins Abstract: Type 2 diabetes mellitus is a multifactorial disease that results from the confluence of at least two distinct events, insulin resistance and failure of the pancreatic beta cell. Recent evidences suggest that common mechanisms may participate in the events that precipitate the development of both insulin resistance and beta cell disarrangement. The characterization of such events may offer new perspectives for a unified therapeutic approach for diabetes. The protein PGC-la fulfills some of the requirements to be included in a list of potential candidates for playing a role in the genesis of both the main mechanisms involved in the development of diabetes. To evaluate the role of this protein in the production and action of insulin we employed an antisense oligonucleotide to PGC-la, which is capable of significantly reducing the expression of this protein. Through this approach it was observed that PGC-la responds to sympathetic stimuli mat inhibit insulin secretion. Such stimuli induce the expression of PGC-la and subsequently of the uncoupling protein-2 (UCP-2). Once induced UCP-2 favors a reduction of ATP production from glucose metabolism and therefore reduces insulin secretion. In addition, the expression of PGC-la was increased in liver and adipose tissue of an animal model of diet-induced obesity and diabetes. The inhibition of PGC-la promoted an increase of insulin secretion, an increase of peripheral insulin action, an improvement of insulin signal transduction and, surprisingly the reversal of diet-induced hepatic steatosis. Thus, PGC-la appears as an attractive potential target for therapeutics in diabetes and related diseases Doutorado Ciências Básicas Doutor em Clínica Médica

Orientadores: Iscia Teresinha Lopes-Cendes, Ivan de Godoy Maia Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Doutorado Genética Animal e Evolução Doutor em Genética e Biologia Molecular

Orientador: Kleber Gomes Franchini Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas Resumo: O termo síndrome coronária aguda compreende a angina instável e o infarto do miocárdio, entidades clínicas freqüentes e potencialmente letais. Ambas as situações caracterizam-se por um desbalanço entre a oferta e a demanda de oxigênio no miocárdio, freqüentemente desencadeadas pela diminuição da perfusão resultante de estreitamento ou oclusão de artérias coronárias em conseqüência de aterosclerose. As elevadas taxas de morbidade e mortalidade destas condições são atribuídas, principalmente, à perda de massa miocárdica e instabilidades elétricas decorrentes não apenas da isquemia, mas também da reperfusão espontânea ou induzida de áreas do miocárdio isquêmico. Desta forma, é intensa a busca por estratégias e agentes farmacológicos que possam reduzir os danos miocárdicos provocados tanto pela isquemia como pela reperfusão. Evidências experimentais e algumas evidências clínicas indicam que a adenosina (Ado) administrada sistemicamente é capaz de proteger o miocárdio dos efeitos da isquemia/reperfusão. A proteção conferida pela Ado ocorre tanto aguda (1-6 horas) como tardiamente (1-3 dias) após a administração em dose única. Enquanto a proteção aguda depende da ativação de vias de sinalização que mobilizam efetores constitutivamente expressos nas células, a proteção tardia parece depender da alteração da expressão de genes envolvidos em múltiplas funções celulares. No entanto, algumas características da ação sistêmica da Ado, tais como a meia-vida curta e seus efeitos cardiovasculares (i.e. bradicardia e hipotensão), são barreiras importantes para seu uso clínico nas síndromes coronárias agudas. Uma das maneiras de evitar estes efeitos indesejáveis é utilizar agentes farmacológicos que aumentam a biodisponibilidade de Ado, como antagonistas de seus transportadores ou inibidores da adenosina quinase, uma enzima-chave no metabolismo de purinas que fosforila a adenosina em AMP através de hidrólise do ATP. Neste contexto, demonstramos anteriormente que compostos derivados de anilinoquinazolinas são inibidores de adenosina quinase e induzem a proteção miocárdica tanto aguda como tardia em modelo de coração isolado. Tendo em vista que a proteção tardia depende da expressão diferencial de genes, o presente estudo foi planejado para investigar as respostas transcricionais envolvidas na cardioproteção induzida tardiamente após a administração do composto quinazolínico líder inibidor de adenosina quinase, DMA. Para tanto, foram utilizados lâminas de oligonucleotídeos contendo as sequências referentes a todos os genes de camundongo (~35 mil genes). As sondas de RNA foram sintetizadas a partir de corações de camundongos tratados com dose única de DMA O termo síndrome coronária aguda compreende a angina instável e o infarto do miocárdio, entidades clínicas freqüentes e potencialmente letais. Ambas as situações caracterizam-se por um desbalanço entre a oferta e a demanda de oxigênio no miocárdio, freqüentemente desencadeadas pela diminuição da perfusão resultante de estreitamento ou oclusão de artérias coronárias em conseqüência de aterosclerose. As elevadas taxas de morbidade e mortalidade destas condições são atribuídas, principalmente, à perda de massa miocárdica e instabilidades elétricas decorrentes não apenas da isquemia, mas também da reperfusão espontânea ou induzida de áreas do miocárdio isquêmico. Desta forma, é intensa a busca por estratégias e agentes farmacológicos que possam reduzir os danos miocárdicos provocados tanto pela isquemia como pela reperfusão. Evidências experimentais e algumas evidências clínicas indicam que a adenosina (Ado) administrada sistemicamente é capaz de proteger o miocárdio dos efeitos da isquemia/reperfusão. A proteção conferida pela Ado ocorre tanto aguda (1-6 horas) como tardiamente (1-3 dias) após a administração em dose única. Enquanto a proteção aguda depende da ativação de vias de sinalização que mobilizam efetores constitutivamente expressos nas células, a proteção tardia parece depender da alteração da expressão de genes envolvidos em múltiplas funções celulares. No entanto, algumas características da ação sistêmica da Ado, tais como a meia-vida curta e seus efeitos cardiovasculares (i.e. bradicardia e hipotensão), são barreiras importantes para seu uso clínico nas síndromes coronárias agudas. Uma das maneiras de evitar estes efeitos indesejáveis é utilizar agentes farmacológicos que aumentam a biodisponibilidade de Ado, como antagonistas de seus transportadores ou inibidores da adenosina quinase, uma enzima-chave no metabolismo de purinas que fosforila a adenosina em AMP através de hidrólise do ATP. Neste contexto, demonstramos anteriormente que compostos derivados de anilinoquinazolinas são inibidores de adenosina quinase e induzem a proteção miocárdica tanto aguda como tardia em modelo de coração isolado. Tendo em vista que a proteção tardia depende da expressão diferencial de genes, o presente estudo foi planejado para investigar as respostas transcricionais envolvidas na cardioproteção induzida tardiamente após a administração do composto quinazolínico líder inibidor de adenosina quinase, DMA. Para tanto, foram utilizados lâminas de oligonucleotídeos contendo as sequências referentes a todos os genes de camundongo (~35 mil genes). As sondas de RNA foram sintetizadas a partir de corações de camundongos tratados com dose única de DMA Abstract: The term acute coronary syndrome includes unstable angina and myocardial infarction, which are frequent and potentially lethal clinical entities. Both situations are characterized by an imbalance between myocardial oxygen supply and demand, often triggered by the reduced perfusion caused by narrowing or occlusion of coronary arteries due to atherosclerosis. The high morbidity and mortality rates determined by these conditions are attributed mainly to loss of myocardial and electrical instabilities, arising not only from ischemia, but also from spontaneous or induced reperfusion of the ischemic regions. Thus, there is much interest in the development of strategies and pharmacological agents able to minimize the injuries caused not only by myocardial ischemia but also by reperfusion. Experimental and clinical data indicate that systemically administered adenosine (Ado) is able to protect the myocardium from ischemia/reperfusion injuries. The protection induced by Ado occurs in two phases, an acute (1-6 hours) and a late (1-3 days) phase after a single dose administration. While acute protection depends on activation of signaling pathways that mobilize end-effectors constitutively expressed in the cells, the late protection depends on the alterations of the expression of genes involved in multiple cellular functions. However, some characteristics of the systemic action of Ado, such as its short half-life and cardiovascular side effects (i.e. bradycardia and hypotension), are major barriers to its clinical use in acute coronary syndromes. One way to circumvent these undesirable effects is to use pharmacological agents that increase Ado bioavailability, as antagonists of its transporters or adenosine kinase (ADK) inhibitors. ADK is a key enzyme in the metabolism of purines that phosphorilates adenosine to AMP by ATP hydrolysis. In this context, we have previously demonstrated that derivatives of anilinoquinazolines are potent inhibitors of adenosine kinase and induce both acute and late phases of cardioprotection, as showed in isolated heart model. The present study was designed to investigate the transcriptional responses involved in late cardioprotection induced by administration of the anilinoquinazoline DMA. We used oligonucleotide microarrays containing representative sequences of all genes from mouse genome (~35 thousand genes). The RNA probes were synthesized from hearts of mice treated with DMA (30 mg/kg, single dose) ou vehicle (DMSO), 24 and 48 hours prior to tissue excision. We considered differentially expressed (fold change>[2.0], p

Orientadores: Otávio Rizzi Coelho, Maria Heloisa de Souza Lima Blotta Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: A aterosclerose é uma doença inflamatória e níveis séricos de marcadores inflamatórios como a interleucina 6 (IL-6), interleucina-18 (IL-18) e proteína C reativa (PCR) são utilizados para avaliação de pacientes em quadros de coronariopatia. No paciente com diabetes tipo 2 a aterosclerose está relacionada a um maior número de eventos como infarto e morte comparado aos pacientes sem diabetes. Com o objetivo de avaliar a resposta inflamatória nos pacientes com diabetes e eventos agudos de instabilidade coronária selecionamos primariamente dois grupos de pacientes. O primeiro grupo foi composto por pacientes ambulatoriais diabéticos com angina estável (D-SCC) e presença de coronariopatia ao estudo coronariográfico (n=36). O segundo grupo foi composto por pacientes diabéticos atendidos no Pronto Socorro com quadro de Síndrome Coronária Aguda (D-SCA) sem supradesnivelamento do ST (n=38). Como controle foram utilizados pacientes sem diabetes com SCA (n=22) e SCC (n=16). As concentrações séricas de PCR, IL-6 e IL-18 foram determinadas pelas técnicas de nefelometria (PCR) e ELISA (IL-6 e IL-18). Níveis mais elevados de IL-6 foram observados em pacientes com ou sem diabetes e SCA em relação ao grupo com SCC. Por outro lado, pacientes com diabetes e SCA apresentaram concentrações maiores de PCR em comparação aos outros grupos. Os níveis séricos de IL-18 não diferiram significativamente entre os pacientes estudados. Os resultados obtidos sugerem uma maior atividade inflamatória no paciente com quadro de instabilidade coronária. Essa atividade inflamatória, medida pela PCR, parece ser ainda mais intensa no paciente com diabetes Abstract: Atherosclerosis has an inflammatory component already detected and serum levels of inflammatory markers as interleukin- 6 (IL-6), interleukin-18 (IL-18) and C reactive protein (CRP) are detected for the evaluation of patients with coronary disease. In patients with type 2 diabetes atherosclerosis is related to a higher number of events as infarct and death as compared to patients without diabetes. Our study aimed to determine the inflammatory response in patients with diabetes and acute events of coronary instability. First we select two groups of patients: the first group (n=36) was composed of diabetic patients with steady angina (CCS) and presence of coronary disease at coronariography. The second (n=38) was composed of patients attended at the emergency unit with diagnostic of Acute Coronary Syndrome (ACS) without ST elevation (38). The control group was formed by patients with acute (ACS, n=22 ) or chronic (CCS, n=16) coronary syndrome without diabetes. High sensitivity CRP was evaluated by nephelometry and IL-6 and IL-18 by ELISA. Higher levels of serum IL-6 were detected in patients with ACS with diabetes or not as compared to SCC. On the other hand, patients with ACS exhibited the highest serum CRP among the other groups. IL-18 concentrations were similar among the groups. The results showed a more prominent inflammatory activity in patients with coronary instability. Concerning CRP the inflammatory process was further pronounced when diabetes mellitus was also present Mestrado Clínica Médica Mestre em Clínica Médica

Orientador: Wilson Nadruz Junior Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas Resumo: A subunidade p22phox é um componente essencial do complexo enzimático NADPH oxidase, o qual é considerado a principal fonte de produtos do stress oxidativo no sistema cardiovascular. O alelo -930G da p22phox tem sido associado com maior stress oxidativo mediado pela NADPH oxidase e hipertensão arterial. Nós recentemente demonstramos que a hipertrofia do ventrículo esquerdo é acompanhada de aumento na expressão miocárdica de p22phox em ratos submetidos à coarctação da aorta, sugerindo que esta proteína pode estar envolvida em lesões de órgão-alvo induzidas por hipertensão, mais especificamente na hipertrofia cardíaca. Foi pesquisada a prevalência deste polimorfismo em 160 indivíduos acompanhados no Ambulatório de Hipertensão Arterial Sistêmica da UNICAMP, e realizada a correlação desta variante com a massa e geometria ventricular esquerda, lesão renal e perfil metabólico destes pacientes. Não foram encontradas correlações significativas entre este polimorfismo e lesão renal ou estrutural em ventrículo esquerdo. Porém, nos indivíduos com genótipo GG foram encontrados níveis séricos de Triglicérides e de LDL colesterol significativamente mais baixos Abstract: The p22phox subunit is an essential component of the NAD(P)H oxidase enzymatic complex, which is considered the major source of oxidative stress products in the cardiovascular system. The -930G allele of p22-phox has been associated with higher promoter activity, increased NAD(P)H oxidase-mediated oxidative stress and hypertension. NADPH oxidases have been proved important in the pathogenesis of renal damage in models of hypertension. We recently reported that left ventricular hypertrophy is accompanied by increased myocardial p22-phox expression in aortic-banded rats, suggesting that this protein might be involved in hypertensive cardiac hypertrophy. Thus, the aim of the present report was to investigate the role of p22phox -930A/G polymorphism on cardiac hypertrophy, renal damage and metabolic profile in hypertensive patients. We research the -930A/G polimorfism prevalence in 160 hypertensive subjects from Ambulatory Hypertension Unit - UNICAMP. The follow-up was between 2005 and 2006. The variant -930A/G has not relationship with alterations in ventricular structure and with renal damage markers. However, in GG subjects was associated with lower seric levels of Triglycerides and LDL-cholesterol This finding suggest a association between this variant GG genotype with a best metabolic profile in hypertensives Mestrado Clínica Médica Mestre em Clínica Médica

Orientador: Kleber Gomes Franchini Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: A linhagem celular C2C12 é um modelo bem estabelecido para a diferenciação miogênica in vitro. Quando os mitógenos são retirados do meio de cultura (privação de soro fetal bovino), fatores de transcrição específicos são ativados, levando a indução de expressão de miogenina e outros fatores miogênicos. A expressão de miogenina marca o comprometimento dos mioblastos ao processo de diferenciação em músculo esquelético....Observação: O resumo, na integra, podera ser visualizado no texto completo da tese digital Abstract: The cellular lineage C2C12 is a well established model ofmyogenic differentiation in vitro. Upon mitogen withdrawal (bovine serum starvation), specific transcription fàctors are activated, leading to the induction of myogenin and other myogenic factors. Myogenin expression marks the commitment ofmyoblasts to the differentiation pathway... Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations Mestrado Mestre em Ciências Médicas

Orientador: Kleber Gomes Franchini Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: Sobrecargas hemodinâmicas induzem hipertrofia e remodeIamento das câmaras cardíacas inicialmente como mecanismo compensatório, evoluindo para insuficiência cardíaca quando as sobrecargas persistem. A resposta inicial à sobrecarga pressora inclui ativação rápida e coordenada de vias de sinalização intracelular que resultam na regulação de fatores nucleares, expressão gêniea e aumento na síntese protéica. A identidade dos vários componentes do mecanismo de sinalização e sua importância relativa para as mudanças fenotípicas dos miócitos cardíacos em resposta à sobrecarga pressora permanecem indefinidos. No presente estudo, utilizamos a técnica de mRNA differential display para avaliar a expressão gêniea ampla no ventrículo esquerdo de ratos submetidos a sobrecargas de pressão por constricção da crossa da aorta com duração de 2 e 4 horas. Inicialmente foram identificados 43 fragmentosde cDNA-candidatos que apresentaram aumento de expressão em ventrículos esquerdos sobrecarregados. Estes fragmentos foram então reamplificados, clonados, seqüenciados e identificados através de comparações com seqüências depositadas no GenBank. Foram identificados 5 seqüências homologas com genes já identificados. Um gene em especial, aquele que codifica a quinase TBKl, despertou nosso interesse por seu envolvimento potencial na regulação de vias que controlam a atividade do fator de transcrição NF-kB, conhecido por coordenar processos celulares fundamentais em resposta a estímulos de diversas naturezas. Assim, na avaliação subseqüente da TBKl, confirmamos o aumento de sua expressão no miocárdio através da técnica de RT-PCR com oligonucleotídeos específicos para o TBKl aplicada a RNA total obtido de ventrículos esquerdos submetidos a 2 e 4 horas de sobrecarga pressora e de ratos controle. Os resultados deste experimento confirmaram o aumento na expressão de TBKl no miocárdio em resposta à sobrecarga de pressão. Em seguida, avaliamos a expressão e localização da TBKl no ventrículo esquerdo através de técnicas de Westem Blot, fracionamento de componentes citoplasmáticos e citosólico através de ultracentrifugação diferencial e imunohistoquímica. Verificamos que a quinase TBKl se expressa tanto no miocárdio e em miócitos cardíacos como em células da camada média das artérias coronárias e que sua quantidade no miocárdio aumenta significativamente cerca de 2 horas até 24 horas após o início da sobrecarga pressora. Experimentos realizados com marcação do anticorpo anti-TBKl em extratos nucleares e citosólicos revelaram a presença de TBKl na fração nuclear dos miocárdios, com aumento significativo neste extrato após cerca de 30 minutos de hipertrofia e permanecendo elevada até 24 horas de sobrecarga pressora. Experimentos de co-imunoprecipitação indicaram que a TBKl se associa com o NF-kB e que esta associação aumenta no miocárdio de corações submetidos a sobrecarga pressora. Experimentos de quinase in vitro utilizando imunoprecipitados de TBKl e NF-kB indicaram que o imunocomplexo do anticorpo anti-TBKl induz a fosforilação do NF-kB e que este efeito está aumentado no miocárdio de corações sobrecarregados. Foram também realizados experimentos para avaliar a expressão, localização e atividade do fator de transcrição NF-kB. Experimentos com extratos nuclear e citosólico do miocárdio indicaram a translocação do NF-kB para o núcleo induzida pela sobrecarga pressora. Estes resultados foram corroborados pela detecção de marcação mais intensa de núcleos com o anticorpo anti-NF-kB nos miócitos cardíacos de corações sobrecarregados. Finalmente, experimentos realizados com extratos nucleares em ensaio de mobilidade eletroforética (EMSA) indicaram a ativação da ligação do NF-kB com o DNA de sondas contendo a região de consenso para este fator em miocárdio de corações submetidos a sobrecarga pressora. Nossos resultados indicaram 1) que a técnica de mRNA differential display permitiu a avaliação, apesar de restrita, de genes expressos diferencialmente durante sobrecarga pressora; 2) que a quinase TBKl é ativada e pode ter papel importante na ativação do fator de transcrição NF-kB nos períodos iniciais de resposta miocárdica à sobrecarga pressora; 3) o fator de transcrição NF-kB é ativado precocemente e permanece ativado até 24 horas no miocárdio de ratos submetidos a sobrecarga pressora, indicando uma função potencial deste fator nos processos responsáveis pela resposta das células miocárdicas à sobrecarga hemodinâmica Abstract: To examine genes that are early differentially expressed in response to pressure overload we performed differential display reverse transcriptase-polymerase chain reaction on samples of rat left ventricle (LV) subjected to 2 and 4 hours of transverse aortic constriction. Specifically, we identified increased expression of five genes out of 43 candidate-cDNA ftagments. One such a gene, TBKI raised our interest because of its potential role on the regulation of pathways that control the activity of the transcription factor NF-kB, known to coordinate fundamental cellular processes in response to stressful stimuli. RT-PCR analysis with TBKI-specific primers in LV samples confirmed the enhanced expression of transcripts of TBKI in overloaded myocardium. To verify the functional significance of such finding we first examined TBKI expression in LV by immunoblot and immunohistochemical analysis. TBKI protein levels increased at 2 and remained elevated up to 24 hs of pressure overload. The immunostaining analysis showed TBKI expressed predominantly in cardiac myocytes and in the media of coronary vessels. Co-immunoprecipitation experiments indicated a load-induced increase in the association of TBKI with p50NF-kB that was paralleled by enhanced anti-TBKI immunocomplex kinase activity toward p50NF-kB. Experiments with myocardial nuclear and cytosolic extracts indicated a load-induced p50NF-kB translocation from cytosolic to nuclear fraction and increases in DNA-binding activity demonstrated by electrophoretic mobility shift assay, concurrent with increased TBKI expression and p50NF-kB phosphorylation by anti- TBKI immunoprecipitates. These results suggest that TBKI is rapidly activated and might regulate NF-kB in overloaded myocardium with potential implications in load-induced cardiac hypertrophy and remodeling Mestrado Ciências Básicas Mestre em Clínica Médica

Orientador: Kleber Gomes Franchini Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Médicas Resumo: O presente estudo teve como objetivos a avaliação dos efeitos da colchicina (inibidor da polimerização da tubulina) sobre o crescimento hipertrófico e a função cardíaca basal e durante aumentos progressivos de resistência periférica com fenilefrina, em ratos submetidos à constrição da crossa da aorta. Os ratos submetidos à sobrecarga de pressão por constrição da crassa da aorta (CoAo) ou cirurgia fictícia (SO) foram divididos em grupos tratados com colchicina (T-0.4 mg/kg/dia i.p.) ou salina e avaliados após o 2'% 6o e 15° dias da cirurgia. Após pesagem dos corações, verificou-se aumento de 24 e 30% da razão massa do ventrículo esquerdo/massa do ventrículo direito nos ratos CoAo era relação aos ratos KG quando avaliados no 6° e 15° dias após a cirurgia.Já os ratos CoAo-T, nesses mesmos períodos, apresentaram aumentos de 15 e 15% em relação aos ratos SO-T. Da análise dessas diferenças estimamos que o tratamento com colchicina atenuou o crescimento hipertrófico, avaliado no 6° e 15° dias após a cirurgia, do ventrículo esquerdo em ratos coarctados em 38 e 50%. respectivamente. Resultados das análises planimétrica e morfométrica do ventrículo esquerdo mostraram que a CoAo provocou aumento da espessura da parede ventricular esquerda e aumento no diâmetro dos miócitos, enquanto o tratamento com colchicina atenuou significativamente estas alterações nos ratos CoAo-T. Não foram detectadas dilatações do ventrículo esquerdo nos grupos SO-T, CoAo-T e CoAo. Os ratos CoAo e CoAo-T apresentaram valores de pressão sistólica do ventrículo esquerdo (PSVE) semelhantes. Não houve diferença significativa entre os dois grupos de ratos nos valores do gradiente sistólico transcoarctaçâo (GS), indicando o mesmo grau de sobrecarga pressora nos dois grupos. Os ratos SO e SO-T apresentaram valores semelhantes de FSVE. A pressão diastólica do ventrículo esquerdo (PDVE) permaneceu em -7 mmHg em todos os grupos no 2° e 6° dia após a cirurgia. No 15° dia, ratos CoAo e CoAo-T apresentaram elevação da PDVE para 10 e 11 mmHg, respectivamente. Grupos diferentes de ratos foram preparados para avaliação do comportamento das pressões do ventrículo esquerdo durante infusões de doses crescentes de fenilefrina. Os ratos de todos os grupos apresentaram respostas semelhantes de aumentos de PSVE e PDVE não importando o nível das mesmas na situação basal, no 2°, 6° e 15° dias apôs a cirurgia. Estes resultados indicam que a ftinção ventricular tanto basal como durante sobrecargas agudas de pressão dos ratos SO-T, CoAo-T e CoAo estava preservada. Foram realizados experimentos com separação das frações de tubulina polimerizada e não-polimerizada e posterior separação e identificação da ß-tubulina através de Western Blot. Observamos que a CoAo produz aumento de cerca de 2.5 vezes na quantidade detectada de tubulina polimerizada e que o tratamento com colchicúia aboliu este aumento nos animais com constrição da aorta. Nossos resultados permitem a conclusão de que o tratamento com colchicina atenuou o crescimento hjpertrófico do miocárdio de ratos submetidos à sobrecarga pressora por constrição da crassa da aorta, sem, entretanto, causar disfunção cardíaca tanto basal como em situação de aumento progressivo de resistência periférica. De maneira geral, os resultados de nosso estudo permitem afirmar que a integridade funcional dos microtúbulos é um pré-requisito para o crescimento hipertrófico do miocárdio induzido por sobrecarga pressora. Por outro lado, a preservação da função na ausência de hipertrofia compensatória sugere que a ruptura da integridade dos microtúbulos favorece a ativação de mecanismo que melhora a eficiência contrátil do miocárdio e/ou impede sua deterioração funcional Abstract: To determine whether the inhibition of microtubule integrity in vivo by colchicine could attenuate the development of cardiac hypertrophy, we studied four groups of rats: 1. Transverse aorta constriction treated with colchicine - TAoC-T; 2. Transverse aorta constriction treated with saline - TaoC: 3. Sham operated rats treated with colchicine SO-T; 4, Sham operated rats treated with saline - SO. Six week old rats were daily administered colchicine (0.4 mg/Kg/day) or saline via intraperitoneal injection for variable period that ranged 2 to 15 days alter the surgery. TAoC and SO rais. showed similar body weight gain along the period that followed the surgery. Colchicine treatment retarded the body weight gain of both SO-T and TAoC-T rats. These animals lost weight from the beginning of colchicine treatment up to the 6th day after the surgery. After this period there was a partial recover of body weight gain in colchicine treated rats. LV and RV mass evaluated at 2th. 6 th and 15 th post-operative days paralleled the changes in body mass in SO and SO-T rats. Thus, the ratio between LV and RV mass and body mass remained stable in these rats over the period of this study. In addition, the ratio between LV and RV mass i, LVM/RVM) remained stable at --3.5 in these rats. Because, this index is not influenced by changes in body mass, it was preferred to estimate the effect of pressure overload in the LV mass gain in rats that underwent TAoC. In untreated rats. TAoC increased this index by 24% (to 4.2) and 30% (to 4.3) al 6 th and 15 th after the surgery, respectively, compared with SO rats. In contrast. TAoC-T rats showed no change in the LVM/RVM, (3.9) along the experimental period. As expected, TAoC induced a progressive increase in LV wall thickness (LVWT). Compared to the values of the 2nd post-operative day the LVWt of TAoC rats increased by 33% and 72%, at the 6"' and 15Ib day after the surgery, respectively. However, no significant change was observed m LVWTf SO, SO-T and TAoC-T rats. TAoC caused a progressive increase the ratio LVWT/LVD LVWT/LVd. characterizing a concentric hypertrophy. Otherwise. TAoC-T and SO-T rats showed patterns indicating concentric remodeling.Stereological analysis of myocardial section indicated that TAoC rats increased the diameter of single cardiac, myocytes progressively along the experimental period.The diameter of the cardiac myocytes in the remaining groups of rats did not change along the experimental period. Stable systolic gradients of 45 mmHg between the left ventricle and abdominal aorta were seen in both, TAoC and TAoC-T rats. Left ventricular peak systolic pressures (LVSP) were also comparable in these rats. Left ventricular end diastolic pressure (LVEDP) increased from ~7 mmHg at the 2nd and 6* day to 11 mmHg in T'AoC and TAoC-T rats. Increasing doses of phenylephrine increased LVSP and LVEDP in all groups of rats. Because the basal pressures and the responses to phenylphrine of TAoC and TAoC-T were higher than that of SO and SO-T rats, we analyzed the pressure responses to phenylephrine of the various groups by comparing the slopes of the regression line for the relationship between the maximal changes of LVSP and their respective LVEDP- No difference in this slope was observed among the various groups. Thus, these results indicated the preservation of cardiac pumping function in CO-T, TAoC and TAoC-T rats.Treatment with colchicine consistently reduced the polymerized fraction of tubulin in the myocardium of both sham-operated and aortic constricted rats, while TAoC-untreated rats showed a consistent increase in polymerized fraction, compared with sham-operated treated and untreated and TAoC-treated rats. Thus the inhibition of microtubule polymerization attenuated the development of cardiac hypertrophy in pressure overloaded rat heart, but did not affect the cardiac function Mestrado Ciências Básicas Mestre em Clínica Médica

Orientador: Kleber Gomes Franchini Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas Resumo: Estímulos mecânicos provocam ativação precoce da quinase de adesão focal (Fak) no miocárdio. Esta ativação é acompanh~da pelo recrutamento de vias de sin31i7~ção intracelulares envolvidas no crescimento hipertrófico, bem como de outras vias envolvidas na sobrevivência celular. Dados anteriores obtidos em nosso laboratório demonstraram que o estímulo mecânico ativa a Fak e desempenha papel critico na regulação da re-expressão de genes fetais, sugerindo a participação deste sin31i7~dorintracelular no estabelecimento da hipertrofia e remode1amentocardíacos. No presente estudo, investigamos: 1- a expressão, fosforilação e distnDuiçãoda Fak no resíduo de tirosina 397 e 2 -a expressão e fosforilação nos resíduos Ser/Thr da Erk1l2, ambos na área de infarto e no miocárdio remoto, durante o processo de remodelamento do ventrículo esquerdo, em modelo experimental de infarto do miocárdioem ratos. Dados obtidos no pr esente trabalho demonstraram que a ligadura da artéria coronária descendente anterior provocou infartos classificados como infartos de extensão moderada a grande. As análises morfométicas e das pressões do ventrículo esquerdo, obtidas 1, 3, 7, 15 e 45 dias após o infarto, demonstraram dilatação da câmara, acomp~mh~dade aumentos do comprimento e diâmetro dos cardiomiócitos e aumentos da pressão diastólica final, eventos característicos do remodelamento cardíaco após infarto do miocárdio. Estes dados confirmam dados da literatura que demonstram que em infartos de grandes extensões, a tensão na parede do ventrículo esquerdo dificilmente se normaliza, o que ocasiona dilatação, tanto pelo estiramento da área remota, quanto por expansão da área de infarto, seguida de deterioração funcional progressiva do ventrículo. Além disto, experimentos com as técnicas de westem blot e imunohistoquímicademonstraram que após o infarto do miocárdio ocorre ativação da Fak no miocárdio remoto, detectada com anticorpo específico para a Fak fosforilada no resíduo de tirosina 397, presente já no primeiro dia e mantida até 45 de evolução do infarto do miocárdio. Por outro lado, na área do infarto, houve desaparecimento da expressão da Fale,seguida de aumento progressivo de sua expressão e atividade, ao longo da evolução do processo de cicatrização. Importante observar, que o aumento da expressão e atividade da Fak na região do infarto foi acompanhada pela infiltração de células inflamatórias naquela região. Semelhante ao que foi observado com a Fak demonstramos a ativação e expressão da ErkI/2, tanto na área remota, quanto na área de infarto. Diante dos resultados obtidos nesta investigação e ainda com base nos estudos anteriores de nosso laboratório, podemos inferir que a atividade aumentada da Fak no miocárdio remoto possa contribuir para o estabelecimento do crescimento hipertrófico dos cardiomiócitos. No entanto, também é possível que a ativação excessiva e prolongada da Fale, tanto nos cardiomiócitos, quanto nas células intersticiais e inflamatórias ative mecanismos de sinalização que contnDuem para a deterioração funcional e estrutural do miocárdio, de tal forma, que a modulação de sua atividade no infarto do miocárdio pode trazer beneficiosterapêuticos Abstract: Mechanical stimuli initiate an acute activation of focal adhesion molecule (Fak) in the myocardium. This Fak activation initiates intracellular pathways that cnlmlnHtein the hypertrophy development. In addition, the activation of Fak can be accompanied by activation of other intracellular signa1ingpathways involved in the cellular growth. Data obtained in our laboratory demonstrated that mechanical stress activates Fak and it is crucial in the regulation of fetal genes re-expression, demonstrating the important role of Fak in the hypertrophy and cardiac remodeling. In the present study we investigated: 1 - Fak expression and phosphorylation at Tyr-397 residue in the infarcted area and in the remote myocardium; 2 - Erk 1/2 expression and activation at SerlThr residue in the infarcted area and in the remote myocardium. These events were observed during left ventricle (LV) myocardial remodeling afier myocardial infarction in rats. In this study the ligation of the left anterior descending artery induced infarcted area of the LV, classified as moderate to large extension. Morphometrical and hemodinamic ana1ysisevaluated 1, 3, 7, 15 e 45 afier myocardial infarction demonstrated that the LV diastolic final pressure and diameter was markedly elevated, and that cardiac myocytes became elongated and hypertrophied. These results were confirmed by data obtained in the literature that demonstrated that afier a large to moderate myocardial infarction the LV undergoes a series of morphologic changes characterized by progressive increase inLV mass and volume and decrease in global LV systolicperformance. In addition, using westem blot and immunohistochemica1techniques, we a1so demonstrated that Fak is phosphorylated at Tyr-397 in the remote myocardium in the first day up to 45 days afier LV infarction. On the other hand, the absence ofFak expression in the infarcted area by the 1st day afier the myocardial infarction was followed by a progressive increase of Fak expression and activation, paralleled to scaring processes and intlammatory cell migration at this site. Similarly, we observed Erk 1/2 expression and activation in the infarcted and remote area. Since Fak was constantly activated in the remote area demonstrated in the present study, and based on the results obtained in our laboratory that demonstrated the important role of the Fak in the myocardial remodeling afier pressure overload, we hypothesize that Fak could contribute to hypertrophic growth afier myocardial infarction. On the other hand, the increase in the Fak activation in the myocardium and/or intlammatory cells could be deleterious, and could contribute to the dysfunction ofthe heart. Thus, the Fak would be a new therapeutic target in the future Mestrado Farmacologia Mestre em Farmacologia

Orientadores : Mario Jose Abdalla Saad, Kleber Gomes Franchini Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas Resumo: A resistência à insulina, definida como uma resposta biológica subnormal a uma determinada concentração de insulina, é componente essencial da fisiopatologia ou etiopatogenia de importantes doenças como diabetes tipo 2, obesidade e hipertensão arterial. Em humanos e em modelos animais, a hiperinsulinemia produzida por "clamp" normoglicêmico por 3 a 5 dias é capaz de induzir resistência à insulina A insulina, ao se ligar à subunidade a de seu receptor heterotetramérico, dá inicio a uma série de ações imediatas e tardias, metabólicas e promotoras de crescimento. Tais eventos ocorrem através da estimulação da subunidade f3transmembrana do receptor, que se autofosforila e ativa a fosforilação de substratos endógenos intracelulares, conhecidos como substratos do receptor de insulina ou IRSs. Os principais substratos do receptor de insulina são o IRS-1 e IRS-2, que quando fosforilados em tirosina se ligam e ativam proteínas com porção SH2, como a PI 3-quinase. A ativação destas proteínas desencadeia a ativação de duas serina-quinases importantes que são a AKT e as ERKs (112), que são essenciais, respectivamente, para os efeitos metabólicos e de controle gênico do hormônio. Neste estudo investigamoso nível protéico e grau de fosforilação em tirosina do receptor de insulina, dos substratos 1 e 2 do receptor (IRS-1 e IRS-2), a associação deles com a enzima PI 3-quinase, o grau de fosforilação em serinaftreonina da AKT e a fosforilação das ERKs (112)em tecido hepático, muscular, cardíaco, adiposo, e em ilhotas de Langerhans isoladas de ratos submetidos ao clamp hiperinsulinêmico normoglicêmico por cinco dias (Ri5). A infusão de insulina por cinco dias induziu aumento dos níveis séricos de insulina de jejum e reduziu em cerca de 40% a utilização de glicose mediada pela insulina. No tecido hepático, a hiperinsulinemia crônica induziu, após estímulo agudo com insulina, redução do grau de fosforilação do receptor de insulina, do IRS-2, da associação deste substrato com a PI 3-quinase e da fosforilação da AKT. Não observamos diferença nos níveis protéicos do IR e de seus substatos (1 e 2), da fosforilação do IRS-1 e sua associação com a PI 3-quinase, e da fosforilação das ERKs (112), em ratos Ri5 comparado aos controles. Quando estudamos o tecido muscular, após estímulo agudo com insulina, observamos uma diminuição significativa no grau de fosforilação do receptor de insulina, do IRS-l, na associação deste substrato com a PI 3-quinase e na fosforilação da AKT em ratos Hi5, em relação aos controles. Entretanto, a hiperinsulinemia crônica não alterou os níveis protéicos do IR, IRS-I, IRS-2, a fosforilação do IRS-2, a associação IRS-2/PI 3-quinase e a fosforilação das ERKs. o tecido cardíaco de ratos Hi5 apresentou resultados similares ao músculo esquelético, com redução do nível protéico e fosforilação do IRS-I, da associação deste substrato com a PI 3-quinase e da fosforilação da AKT, após estímulo agudo com insulina. Não houve diferença no nível protéico e grau de fosforilação do receptor de insulina e do IRS-2, na associação IRS-2/PI 3-quinase, e na fosforilação das ERKs, entre os grupos controle e Ri5. A hiperinsulinemiacrônica por cinco dias não alterou o nível protéico e grau de fosforilação do receptor de insulina no tecido adiposo, comparado aos controles, mas induziu aumento do nível protéico, grau de fosforilação e associação com a PI 3-quinase dos substratos 1 e 2 do receptor de insulina. No estudo da AKT, observamos aumento da fosforilação no estado basal dos ratos do grupo Hi5. Também não foi observada alteração do grau de fosforilação das ERKs. As ilhotas de Langerhans isoladas de ratos Ri5 apresentaram, como no tecido adiposo, aumento do nível protéico, grau de fosforilação e associação com a PI 3-quinase dos IRS-l e -2, sem alterar o nível protéico e grau de fosforilação do receptor de insulina e das ERKs. Em resumo, os resultados do nosso estudo demonstraram que a infusão crônica de insulina por 5 dias induziu resistência a esse hormônio, com diminuição de transmissão do sinal de insulina em fígado, músculo e coração, e incremento dessas vias em tecido adiposo e ilhotas. No fígado, a menor fosforilação/ativação da AKT foi conseqüente à menor fosforilação do IRS-2, e em músculo esquelético e cardíaco à menor fosforilação do IRS-l. Em tecido adiposo e ilhotas, os dois substratos do receptor de insulina, IRS-l e IRS- 2 aumentaram seus níveis e grau de fosforilação. A hiperinsulinemia crônica por 5 dias modulou especificamente os efeitos metabólicos do hormônio, através da AKT, sendo que a via mitogênica, através das ERKs (112)não sofreu regulação em nenhum tecido estudado dos animaisRiS. A regulação tecido-específica das vias de transmissão do sinal de insulina em ratos que receberam infusão desse hormônio por 5 dias, contribui para explicar os mecanismos moleculares de resistência à insulina nestes animais, e sugere também modelos de regulação que podem estar presentes na instalação de obesidade, hiperinsulinemia e resistência à insulina Abstract: Insulin resistance, defined as subnormal response to a given concentration of insulin, is an important component in the pathophysiology of diseases with high prevalence in the population as obesity, diabetes mellitus type 2 and hypertension. The chronic euglycemic hyperinsulinemiafor as 3-5 days can induce insulinresistance. Insulin initiates its growth and metabolic promoting effects by binding to its receptor at the plasma membrane, which has tyrosine-kinase activity, and is able to autophosphorylates and phosphorylates cytoplasmatic proteins called insulin receptor substrates (IRSs). The main substrates ofinsulin receptor are IRS-l and IRS-2, which when phosphorylated in tyrosine bind and activate several proteins, including phosphatidylinositol (PI) 3-kinase. These initial steps lead to the activation of two serineltreonina kinases - AKT and the ERK family(1/2) ofMAPK. In this study we investigated the levels and phosphorylation of the insulin receptor, IRS-l and IRS-2, their association with PI 3-quinase, and the phosphorylation of AKT and ERKs (1/2) in liver, muscle, heart, adipose tissue and in isolated pancreatic islets ofrats with chronic euglycemichyperinsulinemia for 5 days (Ri5). The 5 days of euglycemic hyperinsulinemia increased the fasting plasma insulin concentration and decreased the whole-body insulin-mediated glucose disposal. Rowever, the insulin secretion in response to glucose in isolated islets was increased in hiperinsulinemicrats compared to controls. In liver of Ri5 rats there was a decrease of insulin-stimulated receptor autophosphorylation, without change in the insulin receptor protein levels. The chronic hyperinsulinemia did not change the protein leveI, the phosphorylation status of IRS-l and its association with PI 3-kinase, although there was a decrease in the phosphorylation of IRS-2, its association with PI 3-kinase and the phosphorylation of AKT in this tissue. The IRS-2 protein leveI and the phosphorylation of ERKs (1/2) were similar in Ri5 and control rats. Chronic insulin infusion for 5 days did not significantly change the levei of IR, IRS-l and IRS-2 protein in musc1e.Afier stimulation with insulin, phosphorylation of the insulin receptor, IRS-l, the association IRS-l/PI 3-kinase and the phosphorylation AKT were reduced in Ri5 rats compared to the controls. Rowever, there was no change in the insulin-stimulated IRS-2 phosphorylation, IRS-2/PI 3-kinase association and phosphorylation ofERKs (1/2). The protein leveI and the insulin-stimulated autophosphorylation of the insulin receptor were similar in the heart in both the Ri5 and control rats. Following stimulation with insulin, the chronic hyperinsulinemia induced a decrease in the IRS-l protein leveI, and as in muscle, also decreased the IRS-l phosphorylation, the IRS-l/PI 3-kinase association and phosphorylation of AKT, without changing the leveI, the phosphorylation of IRS-2, its association with PI 3-kinase, and the phosphorylation of ERKs (112), compared to the controls. In the adipose tissue, the chronic hyperinsulinemia did not change the protein leveI and the phosphorylation status of insulin receptor, before and afier stimulation with insulin. In contrast, there was an increase in the IRSs protein levels, phospholylation and association with PI 3-kinase before and afier stimulation with insulin, in the Ri5 rats compared to the controls. Basal AKT phosphorylation was higher in Ri5 rats compared to control group. There was no change in ERKs (112)phosphorylation in the adipose tissue of Ri5 rats compared to the controls. Similarly, no significant change occurred in the protein levei and phosphorylation of the insulin receptor in isolated islets ttom Ri5 rats when compared tothe controls. Rowever, the chronic hyperinsulinemia increased the protein levels, phospholylation and associations with PI 3-kinase of the IRS-l and 2, after stimulation with insulin, compared to the controls. The insulin-stimulated phosphorylation of ERK was similar in isolated islets in both the Ri5 and control rats. In summary, our results demonstrated that 5 days of euglycemic hyperinsulinemia induced insulin resistance, with a decrease in insulin signal transductional in tiver, muscle and heart, and an increase in these pathways in adipose tissue and isolated islets. In tiver, the reduced phosphorylation/ativation of AKT was consequence of reduced IRS-2 phosphorylation, and in muscle and heart due to reduced IRS-I phosphorylation. In adipose tissue and islets, the protein levels and phosphorylation status of the two insulin receptor substrates, IRS-I and IRS-2, were increased. The chronic hyperinsulinemia modulated specifically the metabotic pathway through AKT. However, the mitogenic pathway, through ERKs (112) did not undergo regulation in neither of tissues studied ITomanimalsHi5. The tissue-specific regulation of insulin signal transductional pathways in rats with chronic insulin infusion during 5 days, contribute to explain the molecular mechanisms of insulin resistance in these animals, and also suggest models of regulation which can be present in the early stages of obesity, hyperinsulinemiaand insulinresistance Doutorado Ciências Básicas Doutor em Clínica Médica

Orientador: Kleber Gomes Franchini Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas Resumo: Uma variedade de estímulos, como a sobrecarga hemodinâmica, pode levar a um aumento de tensão mecânica em cardiomiócitos, que normalmente é compensado pelo desenvolvimento de um fenótipo hipertrófico. A resposta inicial à sobrecarga é caracterizada por uma rápida e coordenada ativação de vias de sinalização intracelulares que regulam a expressão gênica e culminam com o crescimento hipertrófico de cada cardiomiócito. A importância relativa de cada elemento que participa das vias de sinalização e sua contribuição para as alterações adaptativas observadas nos miócitos cardíacos em resposta à sobrecarga pressora têm sido o foco de diversas pesquisas. No presente estudo, investigamos a ativação e localização subcelular da FAK em miócitos ventriculares de ratos neonatos (MVRN) submetidos a ciclos de estiramento, além da sua participação na ativação do gene do fator natriurético atrial (ANF). O estiramento pulsátil dos cardiomiócitos, de 5 a 20%, por períodos de 10 a 120 minutos, levou a um aumento da fosforilação da FAK no seu resíduo de tirosina 397, conforme detectado pelo anticorpo fosfoespecífico. Tal ativação foi paralela com uma alteração na localização da Fak em MVRN que, da região perinuclear em miócitos não estirados, passou a distribuir-se ao longo dos miofilamentos, como agregados protéicos, em células estiradas. Além disso, 4 horas de estiramento pulsátil aumentou a atividade do gene repórter da luciferase contendo o promotor do ANF. A interrupção da sinalização pelo complexo endógeno Fak/Src, seja pela expressão de um mutante negativo de Fak, onde a tirosina foi substituída por fenilalanina no resíduo 397, ou pelo tratamento com um inibidor farmacológico da c-Src, diminuiu severamente a ativação da Fak e sua redistribuição ao longo dos miofilamentos, mediados pelo estiramento, além de inibir a ativação do gene do ANF. No entanto, a expressão de um mutante selvagem de Fak potencializou a fosforilação dessa quinase, induzida por estiramento, sem alterar a expressão gênica do ANF, em comparação aos MVRN não transfectados...Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital Abstract: A variety of stimuli, such as hemodynamic overload, can lead to an increase in mechanical stress on cardiomyocytes that can be compensed by the development of a hypertrophyc phenotype. The hypertrophyc response is characterized by a rapid and coordinate activation of intracellular signaling pathways that regulate gene expression and results in a hypertrophyc growth of cardiac myocyte. The relative importance of each element that participate of signaling pathway and its contribution for the adaptative changes observed in cardiac myocyte in response to pressure overload, has been the focus of diverse researches. In the present study we investigated the Fak activation and subcellular localization in neonatal rat ventricular myocytes (NRVMs) submitted to pulsatile stretch, instead its participation in the atrial natriuretic factor (ANF) gene activation 5% to 20% (10-120 minute) pulsatile stretch of NRVMs lead to an increase of Fak phosphorylation at Tyr-397, as detected by phosphospecific antibody. This activation was accompanied by a change in Fak localization in NRVMs that, of the perinuclear regions in nonstretched cells change to aggregates regularly distributed along the myofilaments in stretched cells. Furthermore, a 4-hour cyclic stretch enhanced the activity of the ANF promoter-luciferase reporter gene. Disrupting endogenous FaklSrc signaling either by expression of a dominant-negative Fak mutant with phenylalanine substituted for Tyr-397 or by treatment with a c-Src pharmacological inhibitor markedly attenuated stretchinduced Fak activation and its redistribution at myofilaments and inhibited stretch-induced ANF gene activation...Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations Doutorado Ciências Básicas Doutor em Clínica Médica

Orientadores: Sara T. O. Saad, Carlos Lenz Cesar Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas Resumo: Lasers têm sido uma ferramenta cada vez mais utilizada na área da Biologia Celular e Medicina para medidas, diagnóstico e manipulação. Dentre essas utilizações destaca-se o trabalho pioneiro de A. Ashkin e colaboradores em 1986 que demonstraram o uso de uma técnica baseada na transferência de momentum dos fótons para capturar partículas dielétricas. Logo a seguir eles utilizaram essa técnica para capturar e manipular partículas biológicas com tamanhos variando de décimos a centenas de micra, demonstrando, desta forma, que este sistema funciona como uma "pinça óptica" para realizar manipulações intra e extracelulares sem causar prejuízo algum ao organismo vivo. Neste trabalho, a pinça óptica foi empregada para a análise do comportamento mecânico de hemácias normais, portadoras de hemoglobina 5 (homozigotos e heterozigotos) no estado normal e em crise falcêmica, esferocitose hereditária e anemia ferropriva. Foi ainda estudada a ação da hidroxiureia na reologia dos eritrócitos, da irradiação gama e da heterozigose para hemoglobina 5 em células estocadas em bolsas de doação de sangue. As análises foram feitas com um feixe de laser fortemente focado por uma objetiva de x100 de um microscópio, acoplado a um sistema de vídeo utilizado para gravar as imagens e posteriormente envia-Ias para análise em um computador. Pelo menos 20 células de cada participante foi pinçada pelo laser e arrastada contra plasma humano AS + com viscosidade conhecida em 6 velocidades constantes variando de 150 J.1m1s a 250J.1m1s (150, 170, 190, 210, 230, 250J.1m1s). A análise da deformação celular em razão da velocidade nos permitiu ter uma visão da elasticidade celular. A pinça óptica apresenta uma vantagem em relação as técnicas comumente utilizadas para aferir a deformabilidade celular, a análise das células é individual, levando em consideração a interação do citoplasma e da membrana. Os resultados sugerem que alterações na membrana da hernácia ou da hemoglobina causam um distúrbio no comportamento mecânico normal dos eritrócitos,. tomando-os mais rígidos, algumas vezes ultrapassando a capacidade de medida da metodologia. Com a pinça foi possível caracterizar a ação da HU no comportamento mecânico das células HbSS. A metodologia de pinça óptica pode ser muito útil para se verificar o efeito de outras drogas na deformabilidade de hemácias normais ou em pacientes com alterações da hemoglobina ou da membrana celular e também, estudar o efeito de diferentes conservantes para estocagem de hemácias Abstract: The deformability of erythrocytes is a critical determinant of blood flow in microcirculation. By capturing red blood cells with optical tweezers and dragging them through a viscous fluid we were able to measure their overall elasticity. Laser optical tweezers, based on photon momentum transfer, have been used successfully in a variety of biological applications. This technique is capable of measuring the whole red blood cell elasticity and viscosity. The optical trap was performed with a Nd:YAG laser strongly focused in a microscope connected to a CCD camera. A computer captured the images, where they were quantitatively and qualitatively analyzed. The elasticity measurement was obtained by dragging the RBC with the optical tweezers through the plasma fluid with a known viscosity. It should be pointed out that the laser does not exert any pressure or photo-damage on the cell. The analysis of the cell deformation vs velocity allowed us to obtain cell elasticity expressed in dyn/cm. The model we used to extract the values for the membrane elasticity and viscosity assumed that the cell is a parallelepiped with length lo, width W and negligible thickness which is located at distance Z1 trom the bottom of the Neubauer chamber and Z2 trom the cover slip. We assumed that the elastic response to an applied force is given by F=J.1(WILo)~L, where F is the force, J.1 is the elasticity and ~L is the cell length deformation. We assumed a drag force F given by F=TI(Wl.o(kq)V, where TI is the plasma viscosity, (1/Zeq)= (11Z1)+ (11Z2) and Vis the drag velocity. The equilibrium occurs when one force cancels the other. Therefore the elongation ~L as a function of drag velocity is given by ~L= (Tllo 1(J.1Zeq)] V, which can be used to extract a value for J.1 provided by the plasm viscosity TI, length lo and Zeq which are easily measured. We measured, and compared, the red blood cell deformability trom normal contrais (HbAA) , patients with: homozygous (HbSS) and heterozygous (HbAS) sickle hemoglobin, HbSS subjects on sickling crisis, hereditary spherocytosis and with iron deficiency anemia. We also studied ,the action of hydroxyurea on rheologic behavior of HbSS cells, the gamma irradiation and the heterozygosis for sickle hemoglobin on cells storage on blood donation bags. Our results showed that the red blood cell deformability was significantly lower in HbS subjects (HbSS and HbAS) , except for HbSSIHU cells, whose deformability was similar to the normal controls. Our data showed that the laser optical tweezers technique is able to detect differences in HbS red blood cells trom subjects taking hyd,roxyurea as well as to differentiate red blood cells trom normal controls and HbAS, indicating that this is a very sensitive method and can be applied for detection of drug-response in sickle cell disease. The sensitivity of the laser optical tweezers method showed that there is no significant change in elasticity over time up to 14 days of storage, regardless of whether the unit was irradiated or not. However, beyond 21 days of storage, irradiated units demonstrate decreased elasticity. RBCs elasticity trom AS units stored for 1, 14 and 21 days presented significantly lower elasticity when compared to HbAA cells stored for the same period. Mostly of RBcs trom HbAS units stored for 28 and 35 days, Hereditary spherocytosis cells and sickle crisis cells were very rigid or escaped trom the optical trapo So these cells did not stay in the trap when the velocities were increased. Hence, the accuracy of elasticity measurement was impaired. Doutorado Clínica Médica Doutor em Clínica Médica

Orientador: Kleber Gomes Franchini Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A via de sinalização da Calcineurina (Cn), uma fosfatase dependente de cálcio, desempenha papel chave no desenvolvimento, na hipertrofia e no remodelamento patológico do coração. A Calcineurina é negativamente regulada pelas Calsarcinas (CS), uma família de proteínas específicas do músculo estriado, que interagem diretamente com Cn. No entanto, os mecanismos moleculares de inibição de Cn por CS permanecem obscuros. Compreender a estrutura do complexo Cn:CS é fundamental para desvendar esse mecanismo de regulação. Neste trabalho foram combinados ensaios bioquímicos, crosslinking químico acoplado à Espectrometria de Massas (experimentos de MS / MS), análise mutacional e uma estratégia de modelagem computacional para a caracterização estrutural do complexo CnA:CS1 (isto é, constituído pela subunidade A de Cn e a isoforma 1 de CS, ambas murinas). O complexo recombinante foi submetido a crosslinking químico, tripsinizado e analisado por LC-MS/MS. Os dados obtidos foram utilizados em um docking in silico dos modelos de ambos os polipeptídeos, gerando várias poses para o complexo. As poses de menor energia de ligação foram agrupadas de acordo com semelhança estrutural e submetidas à simulação de dinâmica molecular. A superfície de interação identificada em CnA abrangeu as ?-hélices 1, 3 e loops vizinhos, enquanto a superfície correspondente de CS1 compreendeu os loops carboxiterminais das regiões Leu179-Phe185, Phe195-Ser199 e Thr250-Leu264. Notavelmente, a superfície de interação de CnA situa-se muito próxima à folha-? 14, o principal sítio de ligação do motivo PxIxIT do fator de transcrição NFAT, importante efetor da Calcineurina. Experimentos realizados com vários mutantes de CnA (FLAG- CnA) e CS1 (myc -CS1 ) foram utilizados para validar o modelo estrutural do complexo CnA:CS1. Os resíduos Lys40 (CnA) e Glu254 (CS1) foram identificados como críticos para a estabilidade do complexo. O modelo gerado neste estudo apoia a hipótese de que CS1 interage com um sítio alostérico para inibir a atividade de CnA Abstract: Signaling by the calcium-dependent phosphatase calcineurin (Cn) plays key roles in regulating cardiac development, hypertrophy, and pathological remodeling. Cn binds to and is negatively regulated by calsarcins (CS), a family of muscle-specific proteins. However, the molecular mechanisms involved in the inhibition of Cn by CS remain unclear. Understanding the architecture and structure of Cn-CS complex is critical to unravel the regulation of Cn by CS. Here we combined biochemical assays, chemical crosslinking coupled to mass spectrometry experiments (MS/MS), mutational analysis and a modeling strategy for structural characterization of CnA-CS1 assembly. The MS/MS data obtained from the cross-linked peptides of both proteins were used to guide an in silico docking of their polypeptide models. The protein complex models with the smallest estimated binding energy were clustered according to structural similarity and submitted to molecular dynamics simulation. The interacting surface of CnA was mapped in a pocket between the 1st and 3rd ?-helixes and surrounding loops, while the corresponding surface of CS1 was mapped to the carboxyterminal loops within the Leu179-Phe185, Phe195-Ser199 and Thr250-Leu264 regions. Notably, the region of CnA that interacts with CS1 was found to be located in close proximity, but not coincident, to the ?-sheet 14, the main binding site for the PVIVIT sequence of NFAT. Experiments performed with several CnA (FLAG-CnA) and CS1 (myc-CS1) mutants were used to validate the structural model of the CnA-CS1 assembly. The Lys40 (CnA) and Glu254 (CS1) residues were identified as critical for the complex stability. The model that emerges from this study supports the notion that CS1 interacts with an allosteric site to inhibit the activity of CnA Doutorado Bioquímica Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Nilson Ivo Tonin Zanchin Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: As células respondem constantemente a uma enorme variedade de estímulos, que são interpretados e integrados por meio de redes de sinalização, dando origem a uma resposta biológica. Defeitos nesses circuitos são a causa de diversas doenças, incluindo muitos, se não todos os tipos de câncer. As fosfatases, enzimas que removem grupamentos fosfato dos substratos de quinases, dependem principalmente de subunidades regulatórias para definir sua especificidade. As fosfatases do tipo 2A constituem a subfamília PPP, que é formada por PP2A, PP4 e PP6. PP2A é a principal fosfatase solúvel de fosfosserina e fosfotreonina em células animais e é encontrada predominantemente como uma holoenzima formada por uma subunidade catalítica (C), uma subunidade regulatória (B, B', B'' ou B''') e uma de ancoragem (PR65/A). Em levedura, as fosfatases 2A desempenham um importante papel na via da quinase TOR, o que ocorre por meio da proteína essencial Tap42. A proteína Tip41 foi identificada como um parceiro de interação de Tap42 e regulador da via da quinase TOR em levedura. A homóloga de Tap42 em mamíferos, chamada de a4, está envolvida na regulação de diversos processos celulares, como diferenciação, desenvolvimento, migração celular e apoptose, por meio de seu papel conservado de regulador de fosfatases 2A. A homóloga em mamíferos de Tip41, chamada TIPRL, é uma proteína ainda pouco caracterizada. Este trabalho teve como objetivo analisar a função das proteínas a4 e TIPRL humanas e esclarecer seu papel na regulação de fosfatases 2A. A caracterização estrutural de a4 e Tap42, usando dados de SAXS, dicroísmo circular e proteólise limitada, mostrou que essas proteínas apresentam um domínio N-terminal compacto formado por a-hélices e um domínio C-terminal desestruturado. Em uma triagem de interações com a proteína TIPRL humana, identificamos as fosfatases PP2Ac, PP4c e PP6c como seus parceiros de interação, assim como os fatores de transcrição MafB e TAF10. Ao contrário do esperado a partir do modelo de levedura, a4 e TIPRL não interagem diretamente, mas formam um complexo ternário com PP2Ac. Uma triagem de substratos de fosfatases 2A regulador por TIPRL identificou os fatores de splicing SF2/ASF e SF2p32. Nossos resultados sugerem um modelo estrutural para a regulação das fosfatases 2A por a4 e mostram que TIPRL é um novo regulador comum dessas fosfatases com funções na regulação da expressão gênica. Abstract: Cells respond constantly to a variety of stimuli, which are interpreted and integrated through signaling networks, giving rise to biological responses. Defects in this circuitry are a cause of many diseases, including cancer. Protein phosphatases are enzymes which remove phosphate groups from kinase substrates, relying mainly on regulatory subunits for their substrate specificity. Type 2A phosphatases belong to the PPP subfamily, which is formed by PP2A, PP4 and PP6. PP2A is the major soluble serine/threonine phosphatase in animal cells and is found predominantly as a heterotrimer composed of a catalytic (C), a regulatory (B, B', B'' or B''') and a scaffold (PR65/A) subunit. Type 2A phosphatases play a major role in the yeast TOR signaling pathway through their interaction with the essential protein Tap42. Tip41 was identified as a Tap42 interacting protein and regulator of the TOR pathway. a4, the mammalian orthologue of Tap42, regulates many cellular processes such as differentiation, development, cell migration and apoptosis as a conserved type 2A phosphatase regulator. TIPRL, the mammalian orthologue of Tip41, is still poorly characterized. The objective of the present work was to analyse the function of a4 and TIPRL and improve the understanding of their role as type 2A phosphatase regulators. The structural characterization of a4 using SAXS analyses, circular dichroism and limited proteolysis, showed that these proteins are formed by an a-helical N-terminal domain and an unfolded C-terminal domain. A screen for TIPRL interacting proteins identified PP2Ac, PP4c and PP6c and also the transcription factors MafB and TAF10. Unlike their yeast conterparts, a4 and TIPRL do not interact directly, but rather form a ternary complex with PP2A. A search for type 2A phosphatase substrates regulated by TIPRL identified the splicing factor SF2/ASF and its regulatory protein SF2p32. Our results suggest a structural model for the regulation of type 2A phosphatases by a4 and show that TIPRL is a novel common regulator of these phosphatases which functions in regulation of gene expression. Doutorado Genética Animal e Evolução Doutor em Genética e Biologia Molecular

Orientador: Kleber Gomes Franchini Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: Os fatores MEF2 (Myocyte Enhancer Factor 2) pertencem à família MADS Box (MCM1-Agamous-Deficiens-Serum response factor) e foram descritos pela primeira vez como fatores de transcrição que se ligam a sequencias de DNA ricas em A/T nos promotores de vários genes músculo específicos. Existem 4 genes da família MEF2 que foram identificados em vertebrados: MEF2A, B, C e D que são expressos de forma distinta durante a embriogênese e nos tecidos adultos. Estudos anteriores do nosso laboratório demonstraram que o fator de transcrição MEF2 é ativado por estiramento mecânico e influencia a expressão de genes relacionados à hipertrofia cardíaca. Utilizando a tecnologia de siRNA para MEF2C (siRNAMEF2C) demonstramos a atenuação da hipertrofia cardíaca induzida por coarctação da aorta nos animais que receberam o siRNAMEF2C. Por outro lado trabalhos demonstraram que animais transgênicos com a superexpressão de MEF2A ou de MEF2C e submetidos à sobrecarga de pressão por coarctação da aorta, não apresentam hipertrofia cardíaca compensatória. Nesses animais a superexpressão de MEF2A ou de MEF2C no coração está associada à deterioração cardíaca funcional e estrutural e o desenvolvimento de cardiomiopatia dilatada. Contudo, a caracterização fenotípica e os mecanismos moleculares envolvidos na superexpressão de MEF2C em miócitos cardíacos ainda são desconhecidos. Da mesma forma não é conhecido o papel do fator de transcrição MEF2C na resposta hipertrófica do miócito cardíaco após coarctação da aorta. No presente trabalho foi demonstrado que a superexpressão de MEF2C em miócitos cardíacos de ratos neonatos (NRMV), com o uso de partículas adenovirais, induziu a desdiferenciação celular e a ativação de mecanismos envolvidos na progressão do ciclo celular. Esses resultados foram obtidos por meio de experimentos de microarranjo de DNA, proteoma, PCR em tempo real e western blotting. A análise do fenótipo celular por microscopias de luz, confocal e eletrônica de transmissão demonstra que NRMV possuem aumento na binucleação e desorganização sarcomérica, alterações coerentes com o quadro de desdiferenciação celular e ativação da progressão do ciclo celular. Por meio da técnica de incorporação de iodeto de propídeo e citometria de fluxo confirmamos o aumento de células em ciclo celular. Para confirmar os achados nos cardiomiócitos neonatos passamos a investigar o efeito da superexpressão de MEF2C em cardiomiócitos de ratos adultos. Para isso padronizamos a técnica de isolamento destas células e tratamos com AdMEF2C. Sendo assim o tratamento com AdMEF2C em miócitos cardíacos de ratos adultos resultou em aumento da expressão de MEF2C após 48 horas de tratamento. O efeito observado foi semelhante ao encontrado em cardiomiócitos neonatos, sendo que os adultos apresentaram aumento da expressão de genes relacionados ao ciclo celular e diminuição dos genes estruturais. O nível ultraestrutural observado por microscopia eletrônica de transmissão no tempo de 48 horas de tratamento não observamos diferenças na estrutura sarcomérica das células tratadas com AdMEF2C. Por fim demonstramos que o silenciamento de MEF2C pela injeção de lentivírus no coração demonstrou ser capaz de impedir o desenvolvimento da hipertrofia cardíaca em camundongos coarctados por 15 dias. A hipertrofia do coração foi avaliada por meio da espessura da parede posterior do ventrículo esquerdo e gravimetria do ventrículo esquerdo e dos pulmões. O conjunto de dados demonstra que a superexpressão de MEF2C leva a alterações estruturais no miócito cardíaco compatíveis com quadro de deterioração e insuficiência cardíaca e que o silenciamento de MEF2C no coração impede o desenvolvimento da hipertrofia cardíaca decorrente da coarctação da aorta Abstract: The factors MEF2 (myocyte enhancer factor 2) belong to the family MADS box (MCM1-Agamous-deficiens-Serum response factor) and were first described as transcription factors that bind DNA sequences rich in A / T in the promoters of multiple muscle-specific genes. There are four MEF2 family genes that were identified in vertebrates MEF2A, B, C and D are expressed differently during embryogenesis and in adult tissues. Previous studies from our laboratory demonstrated that the transcription factor MEF2 is activated by mechanical stretch and influences the expression of genes related to cardiac hypertrophy. Using siRNA technology to MEF2C (siRNAMEF2C) demonstrated attenuation of cardiac hypertrophy induced by aortic coarctation in animals that received siRNAMEF2C. On the other hand studies have demonstrated that transgenic mice with overexpression of MEF2A or MEF2C and subjected to pressure overload by aortic coarctation show no compensatory cardiac hypertrophy. In these animals the overexpression of MEF2A or MEF2C in the heart is associated with structural and functional cardiac deterioration and development of dilated cardiomyopathy. However, the phenotypic and molecular mechanisms involved in the overexpression of MEF2C in cardiac myocytes are still unknown. Likewise, there is known the role of the transcription factor MEF2C in cardiac myocyte hypertrophic response after aortic coarctation. In the present study it was shown that overexpression of MEF2C in neonatal rat cardiac myocytes (NRMV) with the use of adenoviral particles, and cellular dedifferentiation induced activation mechanisms involved in cell cycle progression. These results were obtained by DNA microarray experiments, proteomics, real time PCR and western blotting. The analysis of cell phenotype by light microscopy, confocal and transmission electron shows that NRMV have increased binucleation and sarcomeric disorganization, changes consistent with the framework of cellular dedifferentiation and activation of cell cycle progression. By means of the propidium iodide incorporation technique and flow cytometry, confirmed increasing cells in the cell cycle. To confirm the findings in neonatal cardiomyocytes we investigate the effect of overexpression of MEF2C in cardiomyocytes of adult rats. For this standardized technique and isolation of these cells treated with AdMEF2C. Thus treatment with AdMEF2C in adult rat cardiac myocytes resulted in increased expression of MEF2C after 48 hours of treatment. The observed effect was similar to that found in cardiomyocytes neonates, adults who showed increased expression of genes related to cell cycle and decreased structural genes. The ultrastructural level observed by transmission electron microscopy in the time of 48 hours of treatment showed no difference in sarcomeric structure of cells treated with AdMEF2C. Finally we show that MEF2C silencing by lentivirus injection in the heart has been shown to prevent the development of cardiac hypertrophy in mice after 15 days of pressure overload. The heart hypertrophy was evaluated by the thickness of the posterior wall of the left ventricle and the left ventricle gravity and lungs. The data set shows that overexpression of MEF2C leads to structural changes in the cardiac myocyte compatible framework of deterioration and failure, and MEF2C silencing of the heart prevents the development of cardiac hypertrophy due to aortic coarctation Doutorado Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento Doutora em Ciências

Orientador : Kleber Gomes Franchini Tese (Doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: A compreensão de como a quinase de adesão focal (FAK) contribui para os processos de hipertrofia, insuficiência cardíaca e câncer são de grande interesse científico. Um dos nossos objetivos específicos é desenvolver inibidores desta tirosina quinase com vistas à sua aplicação terapêutica no tratamento de insuficiência cardíaca e câncer. Portanto, foi realizado planejamento racional e a síntese de inibidores farmacológicos para a FAK. Estudos computacionais de docking e farmacocinéticos permitiram selecionar 28 estruturas de quinazolina mais promissoras em relação à capacidade de inibir a FAK. Desta forma, economiza-se tempo e dinheiro para obter-se a síntese apenas de 6 das estruturas pré-selecionadas. Uma quinazolina denominada 4-BZLO foi sintetizada após o planejamento racional. Tal quinazolina foi capaz de inibir em 50% da atividade da FAK in vitro com aproximadamente 1nM. Os testes de pureza da síntese, absorção por via oral, melhor resultado em triagem em células que superexpressam a FAK e o melhor resultado para triagem em duas linhagens de célula leucêmicas e tumor sólido permitiram direcionar o 4- BZLO para ser o composto líder deste estudo. O composto 4-BZLO apresentou resultado promissor para experimentos com camundongos submetidos à coarctação da aorta, que induz hipertrofia cardíaca. Para avaliar se o tratamento preventivo seria eficiente para hipertrofia cardíaca, foi realizado experimento em animais tratados com 30mg/Kg/dia durante 30 dias. Após este período, foi realizada cirurgia de coarctação da aorta para induzir a hipertrofia cardíaca nos animais e os mesmos foram tratados por mais 30 dias. Parâmetros tais como: peso médio do ventrículo esquerdo sobre peso corpóreo de cada animal (LVW/BW), medida da espessura da parede do ventrículo esquerdo (LVWT) e parâmetros histológicos (diâmetro dos miócitos cardíacos) demonstrou que nos animais tratados houve regressão da hipertrofia comparada ao controle (animais sem tratamento). Outro estudo realizado no qual os animais foram tratados de maneira curativa, ou seja, o tratamento foi realizado somente após a coarctação da aorta demonstrou uma melhora no quadro de hipertrofia e função cardíaca. O modelo de fibrose cardíaca foi usado para avaliar se tratamento com 4-BZLO é capaz de reduzir a fibrose cardíaca nos animais. Os resultados obtidos demonstraram que os animais tratados com 4-BZLO por 30 dias apresentaram redução da acumulação de colágeno, que é um indicador de fibrose, em relação ao controle. Nosso laboratório desenvolveu camundongos transgênicos específicos para a FAK que desenvolve moderada hipertrofia cardíaca. Assim, tal modelo permitiu testar o tratamento com o 4-BZLO para hipertrofia cardíaca induzida pela FAK. Os animais transgênicos específicos para a FAK foram tratados com o composto líder e houve melhora dos parâmetros cardíacos. Os resultados obtidos permitiram concluir que a quinazolina denominada 4-BZLO é um bom candidato a fármaco como inibidor da FAK Abstract: Understanding how the focal adhesion kinase (FAK) contributes to the processes of hypertrophy, heart failure and cancer are of great scientific interest. One of our goals is to develop specific inhibitors of this tyrosine kinase with potential therapeutic application in the treatment of heart failure and cancer. In this view, we used rational design to select a group of possible FAK inhibitors. Computational studies such as docking and pharmacokinetic studies allowed us to select 28 structures most likely to inhibit FAK. In this way, we saved up time and money in devising the synthesis of 6 pre-selected structures. Accordingly, quinazoline 4-BZLO was prepared and was able to inhibit the in vitro activity of FAK by 50% at a concentration of approximately 1nM. Several factors contributed to 4-BZLO being chosen as the lead compound in this study: 1) the degree of purity achieved during synthesis; 2) good oral bioavailability; 3) the best inhibition values in cells over expressing FAK in screening, 4) the best result against two leukemic cell lines and one solid tumor target. 4-BZLO showed promising results in experiments with mice subjected to aortic coarctation, which develops cardiac hypertrophy. To assess whether 4- BZLO would be effective for the preventive treatment of cardiac hypertrophy, an experiment was conducted in animals treated with 30 mg/kg/day for 30 days. After this period, an aortic coarctation was performed surgically in order to induce cardiac hypertrophy in animals, and these were further treated for 30 days. Parameters such as left ventricular weight per body weight ratio (LVW/BW), measurement of the left ventricle wall thickness (LVWT), and histological parameters, such as the diameter of cardiac myocytes in treated animals showed that there was a regression of hypertrophy, compared to untreated animals (control). A similar study, where treatment with 4-BZLO was performed only after aortic coarctation showed an improvement regarding hypertrophy and cardiac function. A cardiac fibrosis model was used and the results obtained demonstrated that animals treated with 4-BZLO for 30 days showed a reduction of collagen accumulation, which is an indicator of fibrosis, equal to the control group. Our laboratory has developed transgenic mice specific for FAK, which develop moderate cardiac hypertrophy. Consequently, this model allows us to test 4-BZLO for the treatment of FAK induced cardiac hypertrophy. The transgenic animals were treated with 4-BZLO, leading to an improvement of the cardiac parameters. These results showed that synthetic quinazoline 4-BZLO is a good drug candidate for the inhibition of the FAK enzyme Doutorado Farmacologia Doutor em Farmacologia

Orientador: Kleber Gomes Franchini Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Medicas Resumo: Estudos do nosso laboratório demonstraram que a quinase de adesão focal (FAK) é ativada e contribui para a regulação dos mecanismos de sinalização que determinam as alterações fenotípicas de cardiomiócitos submetidos a estímulos mecânicos. Em estudo anterior demonstramos através da inibição farmacológica da Shp2, que a mesma contribui para a regulação do nível de fosforilação em resíduos de tirosina (atividade) da FAK e regulação da expressão de genes associados ao fenótipo hipertrófico em células em cultura. O presente estudo foi realizado para examinar o impacto da depleção da Shp2,induzida por silenciamento gênico, na atividade da FAK e nas alterações fenotípicas de Miócitos Ventriculares de Ratos Neonatos (MVRNs) em condições basais e de estímulo mecânico e os efeitos da introdução de mutações no gene da Shp2, que resultem em perda, ganho ou deleção da proteína, sobre a atividade da FAK e sobre as alterações fenotípicas nos corações de camundongos. A depleção dos níveis protéicos da Shp2 por siRNA específico induziu ao aumento da fosforilação da Tyr397, Src Tyr418, AKT Ser473, TSC2 Thr1462, e S6 quinase Thr389, à re-expressão do gene fetal marcador molecular de hipertrofia cardíaca (?-MHC) e à um fenótipo hipertrófico dos MVRNS não estirados. A inibição da atividade do complexo FAK/Src através do tratamento dos MVRNs com PP2 {4-amino-5-(4-chlorophenyl)-7-(t-butyl)pyrazolo[3,4-d]pyrimidine}aboliu o aumento na fosforilação da AKT, TSC2, e S6 quinase, bem como a hipertrofia dos MVRNs induzida pela depleção da Shp2. A inibição da mTOR (mammalian target of rapamycin) com rapamicina bloqueou o surgimentos da hipertrofia nos MNRNs tratados com siShp2. Os MVRNs tratados com PP2 ou com RNA de interferência, específico para a FAK, apresentaram-se deficientes na ativação e aumento da fosforilação da FAK, Src, ERK (extracellular signal-regulated kinase), AKT, TSC2, e S6 quiinase, e na indução de aumento da área celular em resposta ao estimulo mecânico de estiramento cíclico prolongado in vitro. A Hipertrofia em resposta ao estiramento prolongado também foi prevenida pelo tratamento dos MVRNs com rapamicina. Os resultados são consistentes em apontar que a perda ou diminuição da função da Shp2 (por depleção, mutação ou deleção gênica cardíaco-específica) induz ao aumento da ativação da FAK, AKT e via da mTOR/S6K , que são vias de sinalização sabidamente envolvidas nos processos hipertróficos do miocárdio. Interessantemente os animais portadores de mutação LS-Shp2 apresentaram redução de 50% da atividade fosfatase relacionada ao imunoprecipitado de Shp2 no miocárdio, recapitularam a desordem humana apresentando baixa estatura, dismorfia craniofacial, evidências morfológica, histopatológica, ecocardiográficas e molelculares de presença de cardiomiopatia hipertrófica. Notavelmente o tratamento desses animais com o inibidor específico da mTOR, rapamicina, foi capaz de reverter completamente o fenótipo hipertrófico dos animais LS-Shp2. Consistentemente, o ganho de função da Shp2 (no miocárdio), induzido por mutação NS (Noonan Syndrome), foi acompanhado de diminuição da atividade basal da FAK, bem como da AKT e de proteínas envolvidas na via da mTOR e de redução da área total e largura dos cardiomiócitos adultos quando comparados aos extraídos de animais selvagens. Em conjunto, os dados, aqui apresentados, indicam que a tirosino-fosfatase Shp2 contribui para regular o nível de fosforilação da FAK em cardiomiócitos e para a regulação da expressão de gêneses do programa hipertrófico e do tamanho celular através da modulação da atividade da FAK e mTOR. Sugere também, que a inibição prolongada de Shp2 pode, por si só, induzir ao aparecimento de hipertrofia cardíaca através da FAK pela modulação da via mTOR/S6K Abstract: Focal Adhesion Kinase (FAK) has been implicated in the sensing and transduction of mechanical forces, which drive changes in cardiac myocyte function and structure, in response to hemodynamic overload, into biochemical events in cardiac myocytes. This study was performed to examine whether Shp2 (Src homology region 2, phosphatase 2) controls Focal Adhesion Kinase (FAK) activity and its trophic actions in cardiomyocytes. Our study was performed in neonatal rat ventricular myocytes subjected to depletion of Shp2 by RNA interference and genetically modified mice carrying mutations that induce gain and loss of function and Shp2 cardiac-specific conditional gene deletion.Depletion of Shp2 by specific small interfering RNA increased the phosphorylation of FAK Tyr397, Src Tyr418, AKT Ser473, TSC2 Thr1462, and S6 kinase Thr389 and induced hypertrophic gene expression pattern (?- MHC) and phenotype of nonstretched NRVMs. Inhibition of FAK/Src activity by PP2 {4-amino-5-(4-chlorophenyl)-7- (t-butyl)pyrazolo[3,4-d]pyrimidine} abolished the phosphorylation of AKT, TSC2, and S6 kinase, as well as the hypertrophy of NRVMs induced by Shp2 depletion. Inhibition of mTOR (mammalian target of rapamycin) with rapamycin blunted the hypertrophy in NRVMs depleted of Shp2. NRVMs treated with PP2 or depleted of FAK by specific small interfering RNA were defective in FAK, Src, extracellular signal-regulated kinase, AKT, TSC2, and S6 kinase phosphorylation, as well as in the hypertrophic response to prolonged stretch. The stretch-induced hypertrophy of NRVMs was also prevented by rapamycin. Subsequently we tested the hypothesis that the introduction of mutations in the Shp2 gene, causing protein deletion or loss of protein function, would contribute to increase the levels of tyrosine phosphorylation of FAK resulting in a hypertrophic phenotype in mice hearts. Likewise, we investigated the possibility that the introduction of a mutation in the Shp2 gene, which leads to gain of function, would result in decrease phosphorylation of FAK. The results were consistent in pointing out that the loss of protein or impairment of the function of Shp2 (gene deletion, depletion or mutation) induces increased activation of FAK, AKT and a the mTOR/S6K pathways, which are signaling pathways known to be involved in controlling cardiac growth and hypertrophy. Ls-Shp2 mice recapitulated the human disorder, with short stature, craniofacial dysmorphia, and morphological, histological, echocardiographic and molecular evidence of hypertrophic cardiomyopathy (HCM). Heart and/or cardiomyocyte lysates from LS-Shp2 mice showed decreased Shp2 catalytic activity, consistent with previous reports that LS mutants have dominant negative effects. Remarkably, the cardiac hypertropic phenotype in LS-Shp2 mice were completely reversed by treatment with the mTOR inhibitor, rapamycin. Consistently, the gain of function of Shp2 (induced by mutation) was accompanied by decreased basal activity of FAK and AKT and proteins involved in the mTOR signaling pathway. These findings demonstrate that basal Shp2 tyrosine phosphatase activity controls the size of cardiomyocytes by downregulating a pathway that involves FAK/Src and mTOR signaling pathways. Our results also establish the tight regulation of FAK phosphorylation by Shp-2 as a potential counter-regulatory signaling in the control of the hyperthophic genetic program in cardiac myocytes Doutorado Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento Doutor em Fisiopatologia Médica

Orientador: Kleber Gomes Franchini Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas Resumo: O presente estudo tem como objetivo avaliar a influência da estimulação biventricular prolongada no pós-operatório de revascularização miocárdica em pacientes portadores de disfunção ventricular esquerda, FE = 40%, associada à duração do QRS menor ou igual a 130ms. Foram selecionados 21 pacientes dos quais 16 foram randomizados em dois grupos denominados: Grupo de estimulação biventricular (Grupo EBV) e Grupo Controle. Os dois grupos foram submetidos à monitorização contínua por um período de 12 horas com os seguintes parâmetros coletados: parâmetros hemodinâmicos sistêmicos (pressão arterial média, índice de resistência vascular sistêmica e temperatura), parâmetros hemodinâmicos cardíacos (débito cardíaco, índice cardíaco, índice do volume sistólico do ventrículo esquerdo e freqüência cardíaca) e parâmetros hemodinâmicos pulmonares (pressão em cunha de capilar pulmonar, pressão venosa central e índice de resistência vascular pulmonar). Para análise dos resultados foram empregados o teste t de Student, teste de Wilcoxon, teste exato de Fisher, teste de Wilks e MANOVA. A sincronização obtida através da estimulação biventricular sob captação atrial (sinusal) aumentou o índice cardíaco em conseqüência do aumento do volume sistólico. Observou-se também uma redução significativa da resistência vascular sistêmica em comparação com os pacientes não estimulados. Esses efeitos permaneceram nas 6 horas que se seguiram após a parada da estimulação no Grupo EBV. Não houve diferença estatisticamente significativa na pressão arterial média entre os grupos. O grupo estimulado apresentou uma menor pressão em cunha de capilar pulmonar do que o grupo controle durante o período da estimulação. Podemos concluir que a estimulação biventricular produziu nesses pacientes uma melhora do desempenho sistólico do ventrículo esquerdo por restaurar a coordenação da contratilidade cardíaca em conseqüência da sincronização independente da variável freqüência cardíaca e duração do QRS Abstract: The present study aims to evaluate the influence of lengthened biventricular stimulation on the post-surgical period of myocardical revascularization in patients that carry left ventricular dysfunction, FE = 40%, associated to QRS endurance equal to or less than 130 ms. From a selection of 21 patients, 16 of which were randomized in 2 groups named: Biventricular Stimulation Group (EBV Group) and Control Group. Both groups have been submitted to a 12-hour continuous monitoring period, with the following parameters being collected: systemic hemodynamic parameters (mean arterial pressure, systemic vascular resistance index and temperature), cardiac hemodynamic parameters (cardiac output, cardiac index, left ventricle stroke volume index and heart rate) and pulmonary hemodynamic parameters (pulmonary artery wedge pressure, central venous pressure and pulmonary vascular resistance index). For the analysis of the results we have applied the Student's t test, Wilcoxon rank-sum test, Fisher's exact test, Wilks' test and MANOVA. The synchronization obtained through biventricular stimulation under atrial sense increased the cardiac index, as a consequence of the increased systolic volume. A significant reduction of systemic vascular resistance has also been observed, in comparison to that of the non-stimulated patients. These effects have endured for the 6-hour period that succeeded the interruption of the stimulation in the EBV Group. There was no statistically significant difference in the average blood pressure between the groups. The stimulated group presented a lower pulmonary artery wedge pressure than that of the control group over the stimulation period. We can concluded the biventricular stimulation has produce an improvement on the systolic performance as the left ventricular do the restoration of the ventricular contractibility as a consequence of a synchronization that the not depend the frequency and the QRS lasting Doutorado Medicina Experimental Doutor em Fisiopatologia Médica

Orientador: Heitor Moreno Junior Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas Resumo: A Hipertensão arterial refratária (HAR) é definida, de acordo com o Seventh Joint National Committe (JNC VII), quando os níveis pressóricos permanecem acima de 140 mm Hg para pressão arterial sistólica e 90 mm Hg para pressão arterial diastólica, mesmo sob uso de três ou mais classes de anti-hipertensivos, incluindo um diurético em dose plena e os demais anti-hipertensivos em doses submáximas a despeito de boa adesão ao tratamento não-farmacológico e farmacológico. A fisiopatologia da hipertensão arterial, inclusive a refratária, é complexa, sendo modulada por diversos fatores interligados: sistema nervoso autônomo, músculo liso vascular (endotélio-óxido nítrico) e rins, além do sistema renina-angiotensina-aldosterona (SRAA), entre outros. Desta forma, a fisiopatologia da HA é assumida como poligênica e heterogênea, com contribuição importante do ambiente (multifatorial). Entre as muitas adaptações sofridas pelo organismo para suportar a sobrecarga crônica de pressão encontra-se a hipertrofia ventricular esquerda (HVE) e o remodelamento vascular. Os resultados do Framingham Heart Study demonstraram de forma inequívoca o valor prognóstico da detecção de hipertrofia ventricular esquerda na estratificação de risco para doença cardiovascular, morbidade e mortalidade. A avaliação da espessura íntima - média das paredes anterior e posterior da carótida, utilizando ultra-som de alta resolução, vem sendo usado na detecção precoce de remodelamento vascular e como marcador precoce de aterosclerose. A produção endotelial de NO é a maior contribuinte do relaxamento da musculatura lisa vascular. A inabilidade de liberação de NO ou disfunção endotelial, pode ser avaliada de forma não invasiva, quantificando-se a resposta da artéria braquial ao estímulo mecânico como a resposta à manobra de compressão/descompressão da artéria braquial ou após estímulo farmacológico de substâncias vasodilatadoras, como a nitroglicerina, cuja ação é direta sobre a musculatura lisa vascular. Uma abordagem genética permite investigar a participação dos polimorfismos de base única dos genes (SNP) que codificam os componentes do sistema renina-angiotensina-aldosterona, tais como, o polimorfismo I/D da enzima conversora da angiotensina e a variante M235T do angiotensinogênio e o polimorfismo Glu-Asp do gene para sintase endotelial do óxido nítrico em pacientes com hipertensão arterial refratária. Foram estudados, 220 indivíduos, dos quais 70 eram hipertensos refratários (HAR), 80 responsivos a tratamento farmacológico (HT) e 70 indivíduos controles (CT). Os objetivos do presente estudo foram: 1) caracterizar e analisar comparativamente perfil clínico, demográfico, antropométrico e bioquímico de pacientes com HAR, HT e CT; 2) avaliar a massa do ventrículo esquerdo (HVE), a espessura íntima - média (EIM) das carótidas e quantificar a reatividade vascular, visando identificar alterações morfológicas e funcionais cardiovasculares; 3) analisar marcadores genéticos (SNP) dos genes do AGT, da ECA e da eNOS, visando esclarecer mecanismos básicos de controle da PA, incluindo a identificação de predisposição individual à HAR; 4) avaliar a associação dos polimorfismos da AGT, ECA e eNOS, com as alterações morfológicas e funcionais cardiovasculares. Os principais resultados do presente estudo mostraram: a) semelhante prevalência de indivíduos não caucasianos e caucasianos, aumento do índice de massa corporal, elevação da concentração sérica de aldosterona, da atividade plasmática da renina e da excreção urinária de sódio em pacientes com HAR; b) presença de alterações morfológicas caracterizadas por HVE e aumento da EIM das carótidas (remodelamento cardiovascular) e alterações funcionais qualificadas como alteração da vasodilatação dependente (VMF) e não dependente do endotélio; c) elevada prevalência do genótipo T/T do polimorfismo M235T do gene para angiotensinogênio e do genótipo Glu-Glu para eNOS nos pacientes com HAR, ambos em correlação estatisticamente significante com alterações morfológicas e funcionais cardiovasculares. Os resultados deste trabalho permitem concluir que: HAR tem distribuição étnica equivalente e que apresentam fatores associados como: aumento do IMC e hiperatividade do sistema renina-angiotenisna-aldosterona; fenótipos intermediários caracterizados por remodelamento cardiovascular (HVE e aumento da EIM das carótidas) e alterações funcionais representadas pela disfunção vascular dependente e não-dependente do endotélio, estão envolvidas na expressão fenotípica de pacientes com HAR e HT. O genótipo T/T do polimorfismo do gene para AGT e o Glu-Glu da eNOS têm maior prevalência em pacientes com HAR, contudo somente o genótipo TT do polimorfismo para AGT apresenta correlação com alterações estruturais e funcionais cardiovasculares. Enquanto, os genótipos Glu-Glu e Glu-Asp se correlacionam somente com alterações funcionais Abstract: Refractory hypertension (HAR) is defined, according to the Seventh Joint National Committee (JNC VII), when the systolic arterial pressure remains above 140 mmHg and the diastolic arterial pressure above 90 mmHg even when taking three or more classes of anti-hypertensive agents including full-dose of a diuretic and the other agents at sub maximum doses with good compliance to both non-pharmacological and pharmacological treatments. The pathophysiology of arterial hypertension, including refractory hypertension, is complex; it is modulated by several interlinked factors including the autonomic nervous system, vascular smooth muscles (endothelium-nitric oxide) and kidneys, as well as the renin-angiotensin-aldosterone system (RAAS). Thus the pathophysiology of arterial hypertension is considered polygenic and heterogeneous with significant involvement of the environment (multifactorial). Among the many changes suffered by the organism to cope with the chronic pressure overload are left ventricular hypertrophy (LVH) and vascular remodeling. The results of the Framingham Heart Study unequivocally demonstrated the prognostic value of detecting left ventricular hypertrophy in the stratification of risk for cardiovascular disease, morbidity and mortality. Assessment of the intimae-media measurement of the anterior and posterior walls of the carotid artery utilizing high-resolution ultrasound is being used for the early detection of vascular remodeling and as an early marker of atherosclerosis. The endothelium production of NO is the greatest contributor to vascular smooth muscle relaxation. Inability to release NO or endothelial dysfunction can be non-evasively evaluated by measuring the brachial arterial response to mechanical stimuli such as the response to a compression/decompression maneuver or after pharmacological stimulus using vasodilator agents, including nitroglycerine which acts directly on the vascular smooth muscle. An approach using genetics allows the investigation of the participation of Single Nucleotide Polymorphisms (SNP) which code to components of the renin-angiotensin-aldosterone system which include the I/D polymorphism of the angiotensin-conversion enzyme gene (ACE), the M235T angiotensinogen gene polymorphism (AGT) and the Glu-Asp endothelial nitric oxide synthase gene polymorphism (eNOS) in patients with refractory hypertension. A total of 220 individuals were studied including 70 patients with refractory hypertension (HAR), 80 responsive to pharmacological treatment (HT) and 70 control subjects (CT). The objectives of this study were: 1) to characterize and comparatively analyze the clinical, demographic, anthropometric and biochemical profile of the HAR, HT and CT individuals; 2) to evaluate the left ventricle mass (LVH), the intimae-media thickness (IMT) of the carotid arteries and measure the vascular reactivity aiming at identifying morphological and cardiovascular functional alterations; 3) analyze the SNP genetic markers of the AGT, ACE and eNOS genes aiming at elucidating the basic control mechanisms of arterial pressure including identifying the individual predisposition to HAR; 4) to evaluate the association of the AGT, ECA and eNOS polymorphisms with the morphological and cardiovascular functional changes. The main results of the current study showed: a) similar prevalence in non-Caucasian and Caucasian individuals, increases in the body mass index, elevations in the serum aldosterone concentrations, the plasma renin activity and of the sodium urine excretion in patients with HAR; b) the presence of morphological changes characterized by LVH, an increase of the IMT of the carotid arteries (cardiovascular remodeling) and functional changes such as endothelial dependent and independent vasodilation; c) a higher prevalence of the TT genotype of the M235T ATG gene polymorphism and of the Glu-Glu genotype of the eNOS gene in patients with HAR. In conclusion HAR has an ethnically equivalent distribution and presents associated factors such as: an increase in the body mass index and hyperactivity of the RAAS; intermediary phenotypes characterized by cardiovascular remodeling (LVH and an increase of the IMT of the carotid arteries) and functional alterations represented by endothelial-dependant and independent vascular dysfunction, are involved in the phenotypic expression. The TT genotype of the AGT gene polymorphism and the Glu-Glu of eNOS gene have a higher prevalence in patients with HAR, however only the TT genotype of the AGT gene polymorphism is associated with both structural and functional cardiovascular alterations. The Glu-Glu and Glu-Asp genotypes have correlations with functional alterations alone Doutorado Doutor em Farmacologia

Orientador: Kleber Gomes Franchini Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas Resumo: Estudos epidemiológicos têm estabelecido uma relação contínua entre a massa do ventrículo esquerdo (VE) e o risco cardiovascular na população geral e na população hipertensa. O pior prognóstico de pacientes hipertensos com aumento na massa do VE tem sido, em parte, atribuído à disfunção do miocárdio, mas permanece desconhecido se os pacientes hipertensos sem hipertrofia do VE (HVE) definida pelos critérios habituais apresentam alterações na função do miocárdio. Os índices ecocardiográficos derivados das dimensões do VE e das velocidades do fluxo mitral aferidas através do Doppler têm provado ser geralmente não específicos e insensíveis para a detecção de alterações discretas da dinâmica ventricular. O Doppler Tecidual (DT) tem demonstrado ser um método eficiente e rápido para avaliar a função do miocárdio. Nos pacientes hipertensos com hipertrofia do VE tem sido descrita redução das velocidades sistólica e diastólica inicial. Entretanto não tem sido relatada investigação da função sistólica do miocárdio do VE através do DT em pacientes hipertensos sem ou com discreta elevação da massa do VE. O presente estudo avalia se, através da velocidade sistólica e diastólica aferidas pelo DT, é possível identificar alterações na contração e relaxamento do miocárdio de indivíduos hipertensos com ou sem hipertrofia ventricular definida pelos valores de corte habituais e com fração de ejeção preservada. Para tanto indivíduos normotensos e hipertensos com ou sem hipertrofia do ventrículo esquerdo (índice de massa do VE [IMVE] > 51g/m2.7) foram avaliados através da ecocardiografia convencional e do DT em 5 segmentos do anel mitral. Os subgrupos incluíram indivíduos normotensos não obesos (n=16; idade 51 ± 9 anos; 11 feminino; pressão arterial sistólica [PAS] 109 ± 11 mmHg; índice de massa corpórea [IMC] 24 ± 2,7 Kg/m2 ; IMVE 32 ± 5.5g/m2.7), hipertensos não obesos sem HVE (n=16; idade 54 ± 12 anos ; 12 femininos; PAS 166 ± 15 mmHg; IMC 25 ± 2,7 g/m2; IMVE 42 ± 5,5 g/m2.7) e hipertensos não obesos com HVE (n=22; idade 56 ± 10 anos; 10 feminino; PAS 181 ± 19 mmHg; IMC 26 ± 2,3 g/m2; IMVE 69 ± 16 g/m2.7). A fração de ejeção foi comparável entre os subgrupos, mas a fração de encurtamento da parede média foi reduzida nos pacientes hipertensos com hipertrofia do VE (¿26%). O tempo de relaxamento isovolumétrico foi aumentado nos pacientes hipertensos com hipertrofia do VE, enquanto a velocidade A do fluxo mitral encontrou-se aumentada em indivíduos hipertensos com e sem hipertrofia do VE. A velocidade sistólica (SM) e diastólica inicial (EM) aferida através do DT ao nível do anel mitral encontraram-se significativamente reduzidas nos indivíduos hipertensos com e sem HVE quando comparadas com as dos indivíduos normotensos. Evidenciou-se correlação positiva entre SM e EM (r=0,68; p

Orientador: Orientador : Kleber Gomes Franchini Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: Durante os primeiros dias do desenvolvimento pós-natal, os miócitos cardíacos perdem a capacidade de proliferação, sendo o crescimento adicional do coração decorrente de hipertrofia e não hiperplasia dos miócitos cardíacos. No entanto, em situações de estresse os miócitos cardíacos diferenciados podem apresentar desdiferenciação e reestabelecimento do ciclo celular. Os mecanismos envolvidos nesse fenômeno são ainda pouco compreendidos. No presente estudo, demonstramos que a ativação do fator de transcrição MEF2C (Myocyte Enhancer Factor 2-C) tem papel crítico no processo de desdiferenciação de miócitos cardíacos. Essa conclusão foi obtida por meio de experimentos de ganho de função pela superexpressão de MEF2C em miócitos ventriculares de ratos neonatos em cultura (MVRNs). Demonstramos que a superexpressão de MEF2C em MVRNs induziu a desdiferenciação e a ativação de mecanismos envolvidos na progressão do ciclo celular. Esses resultados foram obtidos por meio de experimentos de microarranjo de DNA, PCR em tempo real, western blotting e análise do fenótipo celular por microscopias de luz, confocal e eletrônica de transmissão. Esses fenômenos foram atenuados pela superexpressão da quinase de adesão focal (FAK), uma proteína que reconhecidamente exerce efeitos pró-hipertróficos em miócitos cardíacos adultos. Experimentos in vivo e in vitro demonstraram a interação direta entre o fator de transcrição MEF2C e a FAK. Estudos com base em ensaios de reação cruzada associada à espectrometria de massas, dinâmica molecular, espalhamento de raios-X a baixos ângulos e mutação sítio dirigida, demonstraram que as hélices 1 e 4 do domínio FAT da FAK interagem diretamente com a domínio de ligação ao DNA do dímero de MEF2C. Estudos de afinidade e de gel shift demonstraram que a porção FAT da FAK desloca a interação MEF2C/DNA in vitro. Ensaios de gene repórter demonstraram que a FAK, mediada pela região C-terminal, diminui a atividade transcricional de MEF2C em células C2C12. O conjunto de dados demonstra que a ativação do fator de transcrição MEF2C em MVRNs induz a desdiferenciação e ativação de mecanismos de progressão do ciclo celular e que a FAK impede esses efeitos através da interação inibitória no domínio de ligação de MEF2C ao DNA Abstract: During the first days of postnatal development, cardiac myocytes lose their ability to proliferate, and the further growth of the heart is due to hypertrophy and not hyperplasia of cardiac myocytes. However, in response to stress, cardiac myocytes may have dedifferentiation and re-establishment of the cell cycle. The mechanisms involved in this phenomenon are still poorly understood. In the present study, we demonstrated that activation of the transcription factor MEF2C (myocyte enhancer factor 2-C) plays a critical role in the process of dedifferentiation of cardiac myocytes. This conclusion was obtained by gain-of-function experiments through overexpressing MEF2C in neonatal rat ventricular myocytes in culture (NRVMs). We also showed that overexpression of MEF2C in NRVMs induced the dedifferentiation and activation of mechanisms involved on cell cycle progression. These results were obtained by DNA microarray experiments, real time PCR, western blotting and cell phenotype analysis by light microscopy, confocal and electronic transmission. These effects were attenuated by overexpression of focal adhesion kinase (FAK) protein known to exert pro-hypertrophic effects on adult cardiac myocytes. In vivo and in vitro experiments demonstrated the direct interaction between the transcription factor MEF2C and FAK. A model based on crosslinking technology coupled with mass spectrometry, small angle X-ray scattering and the site directed mutation analyses indicated that alpha-helices 1 and 4 of FAK FAT domain interacts directly with the DNA binding domain of MEF2C dimer. Affinity studies and gel shift assay demonstrated that the FAK FAT domain displaces the MEF2C/DNA interaction in vitro. Reporter gene assays demonstrated that FAK, mediated by the C-terminal region, decreases the transcriptional activity of MEF2C in C2C12 cells. The data set shows that the activation of the transcription factor MEF2C in MVRNs induces dedifferentiation and activation of cell cycle progression and that FAK prevents these effects by inhibitory interaction with DNA binding domain of MEF2C Doutorado Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento Doutor em Ciências

Orientador: Kleber Gomes Franchini Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas Resumo: A insuficiência cardíaca é um dos maiores problemas de saúde pública da atualidade. Esforços têm sido feitos para a obtenção do entendimento dos mecanismos que resultam no comprometimento funcional e estrutural do miocárdio, responsáveis, em última instância, pela síndrome clínica. Doenças das válvulas constituem importante contingente dentre as causas de disfunção miocárdica que resulta insuficiência cardíaca. Tipicamente, as doenças das válvulas resultam em sobrecargas mecânicas das câmaras ventriculares que têm papel central no estabelecimento e evolução das alterações estruturais que acompanham a deterioração funcional do miocárdio e, por conseguinte, a da função global das câmaras cardíacas. É fato bem estabelecido na prática clínica a estreita relação entre a presença e a intensidade de comprometimento da função das câmaras ventriculares e o prognóstico clínico ou cirúrgico dos pacientes. Portanto, o esclarecimento dos mecanismos moleculares e celulares que resultam em alterações estruturais irreversíveis, bem como o estabelecimento de indicadores clínico-laboratoriais de alterações precoces é área de grande interesse prático. No presente estudo foram avaliados pacientes portadores de insuficiência mitral com indicação clínica de tratamento cirúrgico, com o objetivo de avaliar alterações estruturais do miocárdio e sua relação com a função ventricular e a expressão e atividade da quinase de adesão focal, uma tirosino-quinase envolvida em mecanismos de sinalização de estímulos mecânicos. Pacientes com insuficiência mitral (21) foram avaliados clinica e ecocardiograficamente no período pré-operatório e em seguimento de um ano após a cirurgia. Foram realizadas biópsias intra-operatórias do ventrículo esquerdo para análise histo-morfométrica e bioquímica da expressão e atividade da quinase de adesão focal e quantificação da área ocupada pelo interstício miocárdico. A maioria dos pacientes apresentava sintomas importantes de insuficiência cardíaca (classe funcional III-IV) no pré-operatório de cirurgia para correção da insuficiência mitral. A média da fração de ejeção e a do diâmetro sistólico final do ventrículo esquerdo encontravam-se dentro da faixa de normalidade. Havia sinais de remodelamento excêntrico do ventrículo esquerdo e aumento dos níveis médios de pressão sistólica da artéria pulmonar. Esses pacientes foram acompanhados por 12 meses após a cirurgia valvar mitral, com avaliações clínicas e ecocardiográficas a cada três meses. Foram verificadas reduções significativas no número e intensidade dos sintomas no período de seguimento pós-operatório. Houve também alteração das características ecocardiográficas indicativas de redução da intensidade do remodelamento no período de seguimento pós-operatório. Foi detectada correlação negativa entre a pressão da artéria pulmonar e o diâmetro diastólico final do ventrículo esquerdo no período pré-operatório. Constatou-se redução significativa da pressão da artéria pulmonar no seguimento pós-operatório. A análise histo-morfométrica das amostras de biópsias subendocárdicas dos pacientes com insuficiência mitral revelou intensa degeneração do miocárdio, com sinais de degeneração e fibrose intersticial. Houve correlação negativa entre a intensidade da fibrose e a fração de ejeção do ventrículo esquerdo no pré-operatório. Detectou-se aumento na expressão da quinase de adesão focal (FAK) em amostras de biópsias de ventrículo esquerdo de pacientes com insuficiência mitral, em comparação com a expressão no miocárdio de pacientes com estenose mitral (grupo de seis pacientes submetidos a biópsia intra-operatória). Além de aumento na expressão, também verificamos aumento na fosforilação em tirosina da FAK com anticorpo fosfo-específico para a tirosina 397, indicativo de aumento da atividade da enzima. Na análise quantitativa de amostras preparadas através de imuno-histoquímica com os anticorpos anti-FAK e anti-vimentina (marcador de fibroblasto) verificamos aumento da marcação com anticorpo anti-FAK nas células intersticiais e também nos cardiomiócitos de amostras de pacientes com insuficiência mitral. Os novos achados do presente estudo são: 1) correlação negativa entre o nível da pressão da artéria pulmonar e do diâmetro do ventrículo esquerdo; 2) correlação entre a intensidade da fibrose e a disfunção ventricular esquerda e 3) aumento da atividade da quinase de adesão focal, correlacionado à intensidade da fibrose intersticial em pacientes com insuficiência mitral com indicação cirúrgica. Estes achados permitem-nos concluir que a elevação precoce da pressão na artéria pulmonar pode constituir-se em marcador clínico de valor para indicação precoce de cirurgia em portadores de insuficiência mitral na ausência de intenso remodelamento excêntrico do ventrículo esquerdo. Por outro lado, a correlação estreita entre a área do interstício subendocárdico e a disfunção ventricular sugere que a avaliação da intensidade da fibrose no ato operatório pode ser um bom marcador de prognóstico. Finalmente, o aumento da atividade da FAK, principalmente no interstício, sugere que esta enzima e suas vias de sinalização intracelular podem contribuir para a gênese da fibrose intersticial. Este resultado aponta para a possibilidade de que modalidades terapêuticas específicas para FAK possam ter papel no tratamento pós-operatório de pacientes com insuficiência mitral e cardíaca Abstract: Heart failure is one of the biggest problems faced by public health. Efforts have been made in order to achieve full understanding of the mechanisms that result in the myocardium structural and functional deterioration, which is responsible for advanced symptoms. Valvular diseases are important causes of myocardium dysfunction, which result in heart failure. Typically, valvular diseases result in mechanic overload of the ventricular chambers, which play a central role in the setting up and evolution of the structural alterations that follow myocardium functional deterioration and, consequently, the global dysfunction of the cardiac chambers. The close relation between the ventricular dysfunction and the clinical or surgical prognosis of the patient is well documented in clinical practice. Therefore, the understanding of the cellular and molecular mechanisms that result in the irreversible structural alterations, as well as the setting up of clinical-laboratorial indicators of early alterations is an area of great practical interest. In the present study patients presenting mitral valve disease with clinic indication for surgical treatment, aiming at evaluating structural alterations of the myocardium and their relations to the ventricular function, and the expression and activity of focal adhesion kinase, a tyrosine-kinase involved in mechanisms of mechanic stimulus signalization. Patients suffering from mitral regurgitation (21) were evaluated by clinical exams and echocardiography in the pre-operative period and underwent clinical and echocardiograph exams for a period of one year after surgery. Intra-operative biopsies of the left ventricle were performed in order to carry out histomorphometric and biochemical analyses of the expression and activity of focal adhesion kinase and quantification of the area occupied by the myocardium interstice. The majority of the patients presented advanced symptoms of heart failure (CF III-IV) in the pre-operative for the for mitral failure correction. The average ejection fraction and the left ventricle end systolic volume were found within normality range. There were signs of eccentric remodeling of the left ventricle and increase in the mean levels of systolic pressure of the pulmonary artery. There was a follow up of these patients during three months after mitral valve surgery with clinical and echocardiograph assessments every three months. Significant reductions of symptoms in number and intensity in the post-operative outcome were verified. There was negative correlation between the pressure of the pulmonary artery and the left ventricle final diastolic diameter the pre-operative period. There was significant decrease in the pressure of the pulmonary artery in the post-operative period. The histomorphometric analysis of subendocardial biopsy samples originated from patients with mitral disease showed intense myocardium degeneration, with signs of degeneration and interstitial scar tissue. There was negative correlation between the intensity of the scar tissue and the ejection fraction of the left ventricle in pre-operative. There was increase in the expression of focal adhesion kinase (FAK) in samples of left ventricle biopsies coming from patients with mitral regurgitation in comparison to myocardium expression of patients presenting mitral stenosis (group of six patients submitted to intra-operative biopsy). Besides the increase in expression, there was also increase in tyrosine phosphorylation from FAK with phosphor-specific antibody for tyrosine 397, which indicates increase in the enzymatic activity. The quantitative analysis of samples through imunohistochemistry with anti-FAK antibodies and anti-vimentine (fibroblast marker) showed increase in the marking of interstitial cells with anti-FAK antibody and also in the samples of cardiomyocytes from patients with mitral regurgitation. The new findings of this study are: 1) negative correlation between the level of the pulmonary artery and the left ventricle diameter; 2) correlation between the scar tissue intensity and the left ventricle dysfunction and 3) increase of the focal adhesion kinase (FAK) activity correlated to the interstitial scar tissue intensity in patients with mitral regurgitation having surgical indication. These findings lead to the conclusion that the early increase of pressure in the pulmonary artery may be a valuable clinical marker to indicate precocious surgery in carriers of mitral disease when there is lack of intense eccentric remodeling of the left ventricle. On the other hand, the close correlation between the subendocardial interstitial area and the ventricular dysfunction suggest that the assessment of the scar tissue intensity during the open heart surgery act may be a good prognostic marker. Finally, the increase in the FAK activity, mainly interstitial, suggests that this enzyme and its intracellular signalizing pathway may contribute to interstitial scar tissue genesis. This result points at the possibility that specific therapeutics conditions for FAK can play a role in the post-operative treatment of patients presenting mitral disease and heart failure Doutorado Medicina Experimental Doutor em Fisiopatologia Médica