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Bovine alphaherpesvirus 5 causes meningoencephalitis in cattle, belongs to the Herpesviridae family, and can be divided into subtypes a, b, and c. Limited information is available about subtype c. Here, we report the complete genome sequences of two strains, P160/96, and ISO97/45, isolated from cattle in southeast Brazil.

The 2021 re-emergence of yellow fever in non-human primates in the state of Rio Grande do Sul (RS), southernmost Brazil, resulted in the death of many howler monkeys (genus Alouatta) and led the state to declare a Public Health Emergency of State Importance, despite no human cases reported. In this study, near-complete genomes of yellow fever virus (YFV) recovered from the outbreak were sequenced and examined aiming at a better understanding of the phylogenetic relationships and the spatio-temporal dynamics of the virus distribution. Our results suggest that the most likely sequence of events involved the reintroduction of YFV from the state of São Paulo to RS through the states of Paraná and Santa Catarina, by the end of 2020. These findings reinforce the role of genomic surveillance in determining the pathways of distribution of the virus and in providing references for the implementation of preventive measures for populations in high risk areas.

Os poliomavírus humanos JC e BK (JCPyV e BKPyV) são virus ubíquos, espécie-específicos, pertencentes à família Polyomaviridae. Estes vírus são conhecidos por serem excretados pela urina humana, sendo considerados potenciais indicadores de contaminação por águas residuais urbanas. Buscando acessar a distribuição de JCPyV e BKPyV em amostras de águas coletadas de uma estação de tratamento de esgoto e de um arroio canalizado de Porto Alegre, Brasil, duas técnicas de nested-PCR foram otimizadas e aplicadas às amostras coletadas. Os amplificados obtidos foram submetidos ao sequenciamento e suas sequências analisadas com base em sequências de poliomavírus humanos previamente depositadas no GenBank. Doze de 30 amostras de água (40%) foram positivas para JCPyV, enquanto 6 amostras (20%) foram positivas para BKPyV. Os resultados do sequenciamento confirmaram a presença dos subtipos 1 e 3 de JCPyV, enquanto apenas os BKPyV Ia e Ib foram encontrados. Este estudo demonstra pela primeira vez a presença de poliomavírus humanos em águas superficiais e em amostras coletadas em uma estação de tratamento de esgoto na região sul do Brasil. The human polyomaviruses JC and BK (JCPyV and BKPyV) are ubiquitous, species-specific viruses that belong to the family Polyomaviridae. These viruses are known to be excreted in human urine, and they are potential indicators of human wastewater contamination. In order to assess the distribution of both JCPyV and BKPyV in urban water samples collected from a sewage treatment plant (STP) and from a canalized water stream of Porto Alegre, Brazil, two nested-PCR assays were optimized and applied to the samples collected. The amplicons obtained were submitted to sequencing, and the sequences were analyzed with sequences of human polyomaviruses previously deposited in GenBank. Twelve out of 30 water samples (40%) were JCPyV positive, whereas six samples (20%) were BKPyV positive. The sequencing results confirmed the presence of JCPyV subtypes 1 and 3, whereas only BKPyV Ia and Ib were found. This study shows for the first time the presence of human polyomaviruses in surface water and in samples collected in a sewage treatment plant in southern Brazil.

Submitted by Tâmara Marinho (tamarama@stj.jus.br) on 2016-06-29T18:35:00Z No. of bitstreams: 2 mediacao_conflitos_oriundos_franco.pdf: 623345 bytes, checksum: db69ce140a44853fe970f5d52a848788 (MD5) license.txt: 1239 bytes, checksum: c9b4c351324448672315a00808efb725 (MD5) Approved for entry into archive by Roberta Marins (rmarins@stj.jus.br) on 2016-07-06T19:51:14Z (GMT) No. of bitstreams: 2 mediacao_conflitos_oriundos_franco.pdf: 623345 bytes, checksum: db69ce140a44853fe970f5d52a848788 (MD5) license.txt: 1239 bytes, checksum: c9b4c351324448672315a00808efb725 (MD5) Made available in DSpace on 2016-07-06T19:51:14Z (GMT). No. of bitstreams: 2 mediacao_conflitos_oriundos_franco.pdf: 623345 bytes, checksum: db69ce140a44853fe970f5d52a848788 (MD5) license.txt: 1239 bytes, checksum: c9b4c351324448672315a00808efb725 (MD5) Previous issue date: 2016

Here we report the presence and expression levels of the vanC1 and vanC2/3 genes in vancomycin-susceptible strains of Enterococcus faecalis. The vanC1 and vanC2/3 genes were located in the plasmid DNA and on the chromosome, respectively. Specific mRNA of the vanC1 gene was detected in one of these strains. Additionally, analysis of the vanC gene sequences showed that these genes are related to the vanC genes of Enterococcus gallinarum and Enterococcus casseliflavus. The presence of vanC genes is useful for the identification of E. gallinarum and E. casseliflavus. Moreover, this is the first report of vanC mRNA in E. faecalis.

Background: Rabies has long been recognized as the major cause of encephalitis in cattle in Latin American countries. It has been estimated that nearly 50.000 cattle heads per year are lost due to encephalitis in that subcontinent, with a signifi cant economic impact on cattle productive chains. In Brazil only, 2.500 to 3.000 cattle heads are estimated to be lost every year due to rabies. However, it is believed that rabies incidence in cattle is much larger, since usually only a few samples from affected animals in disease outbreaks are submitted to diagnostic laboratories. Rabies encephalitis is promptly and accurately diagnosed; however, particularly when rabies is excluded as causa mortis, the agent responsible for neurological disease of infectious origin often remains undetermined. Two bovine herpesviruses (BoHVs), bovine herpesvirus type 1 (BoHV-1) and bovine herpesvirus type 5 (BoHV-5) are major pathogens of cattle which are widely disseminated in Brazil. As usual in herpesvirus’ biology, these tend to infect a large number of hosts and establish lifelong latent infections which may occasionally be reactivated. Both viruses, particularly BoHV-5, are often recovered from cases of neurological disease in cattle. The participation of BoHVs in the differential diagnosis of rabies must be evaluated. Besides, there might be associations between the occurrence of rabies and BoHV infections that deserve investigation. The aim of this study was to investigate whether bovine herpesvirus 1 and 5 would play a signifi cant role in cases of neurological disease where rabies was the presumptive clinical diagnosis. In addition, associations between the occurrence of rabies and BoHV infections were searched for. The approach adopted for conducting such investigations was based on the search for viral nucleic acids as well as classical virus isolation on tissues of cattle submitted to rabies diagnosis over a two-year Materials, Methods & Results: Brain tissue samples of 101 cattle originally submitted to rabies diagnosis were collected over a two year period (2009-2010) from various municipalities within the state of Rio Grande do Sul, Brazil. Thirty nine of these samples had the diagnosis of rabies confi rmed by standard laboratory diagnostic methods. Aliquots of tissues were submitted to DNA extraction and examined in search for genomes of bovine herpesviruses (BoHV) types 1 (BoHV-1) and 5 (BoHV-5) by as well as for infectious virus. Bovine herpesvirus genomes were detected in 78/101 (77.2%) samples, in which BoHV-1 genomes were detected in 26/78 (25.7%), BoHV-5 genomes in 22/78 (21.8%) and mixed BoHV infections (BoHV-1 and BoHV-5 genomes) were detected in 30/101 (29.7%) samples. In the 39 samples with confi rmed rabies diagnosis, BoHV-1 DNA was detected in 9/39 (23%), BoHV-5 DNA in 6/39 (15.4%) and mixed infections with both BoHV types in 16/39 (41%) samples. However, no infectious herpesvirus was recovered from any of the specimens examined. Discussion: The high prevalence of BoHV1 and BoHV-5 infections was evidenced in the sampled population, but the absence of infectious BoHVs indicate that these were not associated to the occurrence of the cases of encephalitis where rabies was the primary suspicion. In addition, no association was detected between occurrence of rabies and detection of BoHVs, since the frequency of detection of herpesvirus genomes did not signifi cantly differ between rabies-positive and rabies-negative samples. The detection of BoHV DNA in scattered areas of the brain with no infectious virus suggests that latency may take place in different regions of the brain.

Durante a realização de experimentos envolvendo inoculações experimentais com herpesvírus bovino tipo 5 (BoHV-5), um grupo de bovinos foi acidentalmente também inoculado com vírus da diarréia viral bovina (BVDV). Os dados obtidos nesta co-infecção foram então comparados a aqueles observados em animais inoculados exclusivamente com BoHV-5. No grupo infectado com BoHV-5 somente, dois dos seis animais inoculados mostraram sinais clínicos de moderados a graves. No grupo co-infectado com BoHV- 5 e BVDV, três dos quatro animais desenvolveram doença grave, e dois deles morreram. BoHV-5 foi isolado em títulos maiores e por um período de tempo mais longo no grupo co-infectado. Os resultados sugerem que o BVDV pode exacerbar os sinais clínicos induzidos pelo BoHV-5 e, ainda, aumentou os níveis de excreção deste último. During a series of experiments attempting to reproduce clinically apparent bovine herpesvirus type 5 (BoHV-5) infections, a group of calves was inadvertently infected with bovine viral diarrhoea virus (BVDV). Another group of calves was infected with BoHV-5 only. This paper reports the outcome of such infections. Two out of six calves solely infected with BoHV-5 displayed moderate to severe clinical signs. Three out of four calves of the group co-infected with BoHV-5 and BVDV developed severe clinical signs, two of them died. BoHV-5 virus was isolated to higher titres and for a longer period from the group of calves infected with both viruses. These results suggest that BVDV may enhance clinical signs induced by BoHV-5 and may also play a role in extending the period of BoHV-5 shedding.

O presente estudo teve como objetivo examinar a capacidade de duas amostras de herpesvírus bovino tipo 1 (BHV-1) de diferentes subtipos (amostra EVI 123/96: BHV-1.1; amostra SV265/98: BHV-1.2a) de induzir doença respiratória em bovinos. Estas duas amostras são representativas de subtipos de BHV- 1 prevalentes no Brasil. Os subtipos das amostras foram confirmados por análises com anticorpos monoclonais e com enzimas de restrição. As amostras foram inoculadas por via intranasal em sete bezerros de três meses de idade (quatro com BHV-1.1, três com BHV-1.2a), soronegativos para BHV-1, sendo outros três animais mantidos como controles não infectados. Nos dois grupos de animais inoculados, os sinais clínicos observados foram consistentes com o quadro de rinotraqueíte infecciosa bovina (IBR), incluindo febre, apatia, anorexia, descargas mucopurulentas nasais e oculares, conjuntivite, erosões e hiperemia na mucosa nasal, dispnéia, tosse, estridor traqueal e aumento dos linfonodos retrofarín-geos, submandibulares e cervicais. Não foram observadas diferenças significativas entre os escores clínicos atribuídos aos animais nos dois grupos. Igualmente, foram similares as quantidades de vírus re-isoladas dos animais infectados, à exceção de uma diferença significativa na disseminação de vírus pelas secreções nasais, a qual foi maior nos animais infectados com BHV-1.1 nos dias 1 a 3 pós-inoculação. Após reativação induzida por corticosteróides, foi observado recrudescimento dos sinais clínicos, os quais foram também similares em ambos os grupos. Em conclusão, as amostras de BHV-1 dos subtipos 1 e 2a não apresentaram diferenças significativas em sua patogenicidade sobre o trato respiratório nos animais inoculados, tanto após a infecção primária como após a reativação. The study aimed to examine the capacity of two bovine herpesvirus type 1 (BHV-1) isolates of different subtypes (EVI 123/96, BHV-1.1; SV265/98, BHV-1.2a) to induce respiratory disease in calves. These two isolates are representative of the BHV-1 subtypes prevalent in Brazil. Viral subtypes were confirmed by monoclonal antibody analysis and by restriction enzyme digestion of viral genomes. The viruses were inoculated intranasally into seven 3 months old calves (four with BHV-1.1, three with BHV-1.2a). Three other calves of identical age and condition were kept as uninfected controls. In both groups of infected calves, the clinical signs observed were consistent with typical infectious bovine rhinothracheitis (IBR), including pyrexia, apathy, anorexia, nasal and ocular mucopurulent discharges, erosions on the nasal mucosa, conjunctivitis, lachrymation, redness of nasal mucosa, dyspnoea, coughing, tracheal stridor and enlargement of retropharingeal, submandibular and cervical lymphnodes. No significant differences were observed between the clinical scores attributed to both groups. Virus shedding in nasal and ocular secretions were also similar, apart from a significant difference in nasal virus shedding on day 1 to 3 post-inoculation, which was higher for BHV-1.1 than for BHV- 1.2a. Following corticosteroid induced reactivation of the latent infection, recrudescence of clinical signs was also observed, with no significant differences on both groups. It was concluded that both subtypes BHV-1.1 and BHV-1.2a were able to induce clinically undistinguishable respiratory disease in calves, either subsequent to a primary infection or following reactivation.

É descrito o isolamento do vírus Parainfluenza bovino tipo 3 (bPI-3) a partir de secreções nasais coletadas de um bovino com infecção respiratória. A identificação do agente foi realizada através de isolamento em cultivo celular e confirmada por testes de hemaglutinação, inibição da hemaglutinação, hemadsorção e imunofluorescência direta. Este é o primeiro registro do isolamento do vírus no Rio Grande do Sul. The isolation of bovine parainfluenza virus type 3 (bPI-3) from a case of mild respiratory disease in a calf is described. Identification was carried out by virus isolation in cell cultures and confirmed by hemagglutination, hemagglutination inhibition, hemadsorbtion and direct imunofluorescence. This is the first report on the isolation of bPI-3 in Rio Grande do Sul, Brazil.

O perfil antigênico de 45 herpesvírus (44 de bovinos, sendo seis amostras de referência de BHV-1 e 15 prováveis BHV-1; três amostras de referência de BHV-5 e 20 prováveis BHV-5) e uma amostra de herpesvírus bubalino (BuHV) foi examinado com um painel de anticorpos monoclonais (Acms) produzidos contra antígenos de herpesvírus bovinos. Para os exames, foi utilizada a prova de imunoperoxidase (IPX) sobre cultivos de células infectadas, tendo os Acms como anticorpos primários. A determinação dos padrões de reatividade das amostras de vírus frente aos Acms permitiu a diferenciação entre os tipos 1 e 5. Todas as amostras isoladas de casos de encefalite apresentaram perfil de BHV-5. Quatro amostras de BHV-5 isoladas de áreas geograficamente distintas apresentaram perfís de reatividade diferenciados em relação às demais amostras do tipo 5. Duas amostras de vírus com perfil antigênico de BHV-5 foram isoladas de sêmen de animais infectados. Estes resultados comprovam a utilidade da caracterização antigênica com este painel de Acms na tipagem de amostras de BHV-1 e BHV-5. The antigenic profile of 45 herpesviruses (44 viruses from cattle, including six reference BHV-1 strains and 15 putative BHV-1; three reference BHV-5 strains and 20 putative BHV-5) and one buffalo isolate (BuHV) were examined with a panel of monoclonal antibodies (Mabs) prepared against bovine herpesvirus antigens. Tests were performed by immunoperoxidase (IPX) on infected cell cultures, with the Mabs as primary antibodies. Immunostaining allowed the differentiation between types 1 and 5 viruses. All isolates from cases of encephalitis displayed BHV-5 profiles. Four BHV-5 isolates obtained from geographically distinct areas displayed different and highly variable IPX patterns of reactivity. Two viruses with BHV-5 antigenic profile were isolated from semen of asymptomatic bulls. The results showed that the antigenic characterization with the Mab panel employed here is useful for typing BHV- 1 and BHV-5 isolates.

Os retrovírus são patógenos mundialmente distribuídos com grande importância na medicina veterinária e humana. Em felinos domésticos existem dois retrovírus que causam doenças: o vírus de leucemia felina (FeLV) e o vírus da imunodeficiência felina (FIV). Tanto o FIV quanto o FeLV estão associado a síndromes imunossupressoras, apresentação de doenças oportunistas e desenvolvimento de tumores. O FeLV é uma das principais causas de doença e morte em gatos, sendo assim mais patogênico do que o FIV. Muitos aspectos importantes da patogênese do FeLV ainda não foram elucidados, mas sabe-se que o curso da doença desenvolvida varia entre indivíduos. Esta variação é determinada por fatores tanto virais quanto do próprio hospedeiro. Sobre o vírus, informações sobre variantes específicas são muitas vezes suficientes para prever o resultado da doença. Além disso, no caso dos retrovírus, a proteína do envelope é um fator chave que define o subtipo ou subgrupo viral. A glicoproteína do envelope possui duas subunidades: superfície (SU) e transmembrana (TM). A glicoproteína de superfície determina o tropismo celular e é estruturalmente conformada por regiões conservadas e variáveis que são importantes na interação vírus-células. Para estabelecer uma infecção eficiente, os retrovírus precisam neutralizar a atividade de diversas proteínas celulares, conhecidas como fatores de restrição, através de proteínas virais que interferem ou suprimem a dita atividade. Além disso, os fatores de restrição determinam em parte o repertório de hospedeiros e assim limitam a transmissão entre espécies. Os fatores de restrição são menos eficientes contra os vírus do hospedeiro natural. A tese apresenta dois estudos que visam contribuir para a compreensão do FeLV. O primeiro trabalho é um estudo in sílico de bioinformática e filogenética do gene de superfície do envelope (SU) onde propõe-se um método altamente suportado para a classificação genética do FeLV. O segundo trabalho é um trabalho in vitro sobre o efeito do fator de restrição SERINC5 humano e felino (huSER5 e feSER5) sobre a infecciosidade do vírus da imunodeficiência humana – 1 (HIV-1), FIV e FeLV. Além disso, foi avaliada a capacidade de contra atacar o efeito inibitório das SER5s pelas proteínas virais Nef do HIV-1, glycoGag e Env do FeLV-A e do FeLV-B. Retroviruses are globally distributed pathogens with great importance in veterinary and human medicine. In domestic cats there are two retroviruses that cause disease: feline leukemia virus (FeLV) and feline immunodeficiency virus (FIV). Both FIV and FeLV are associated with immunosuppressive syndromes, opportunistic diseases and tumors development. FeLV is a major cause of disease and death in cats and thus is more pathogenic than FIV. Many important aspects of the pathogenesis of FeLV remain to be unveiled, but it is known that the course of the disease varies between individuals. This variation is determined by both viral and host factors. Viral aspects, such as information on specific variants is often sufficient to predict the outcome of the disease. Furthermore, in retroviruses the envelope protein is a key factor defining the viral subtype or subgroup. The envelope glycoprotein possesses two subunits: surface (SU) and transmembrane (TM). The surface glycoprotein determines cell tropism and is structurally conformed by conserved and variable regions that are important in the virus-cell interaction. To establish an efficient infection, retroviruses need to neutralize the activity of several cellular proteins known as restriction factors. Viral proteins are capable of interfere with or suppress these host mechanisms. In addition, restriction factors partly determine the host repertoire and thus limit transmission between species. However, restriction factors are less efficient against natural host viruses. This thesis presents two studies that aim at contributing to the understanding of FeLV. The first work is a bioinformatics and phylogenetic study in silico of the envelope surface gene (SU). This paper proposes a highly supported method for genetic classification of FeLV. The second work is an in vitro study on the effect of the restriction factors human and the feline SERINC5 (huSER5 and feSER5) on the human immunodeficiency virus-1 (HIV-1), FIV and FeLV infectivity. In addition, the ability to counteract the inhibitory effect of SER5s by the viral proteins Nef from HIV-1, glycoGag and Env from FeLV-A and FeLV-B was studied.

Os quirópteros constituem um importante grupo de reservatórios de vírus de importância em saúde pública. As razões para isso são várias, tais como a ampla diversidade, extensa distribuição, longevidade, adaptação a ecossistemas alterados, grande diversidade trófica, diversidade de habitats, capacidade de voar longas distancias, e a alta interação entre espécies tanto da mesma ordem como entre outras espécies de mamíferos, incluindo os humanos. Centenas de vírus tem sido associados a morcegos, entre os quais se encontram os influenzavírus e os coronavírus. Este tipo de associação vírus-hospedeiro de longa data pode ter se originado através de processos de co-evolução. Sendo assim, a detecção precoce e caracterização destes vírus em seus hospedeiros naturais poderia ajudar a entender melhor fenômenos spillover em humanos como o que aconteceu recentemente com o SARS-CoV-2. Este estudo teve como objetivo detectar por métodos moleculares a presença de alfa influenzavírus (IAV) e coronavírus (Orthocoronavirinae) em morcegos não hematófagos coletados no estado de São Paulo, Brasil. Assim, amostras de pulmão e intestino delgado de 111 morcegos oriundos de 23 municípios do estado de São Paulo foram obtidas e identificadas em 12 espécies diferentes pela amplificação e sequenciamento de 710 pb do gene mitocondrial COI. As amostras foram processadas buscando a amplificação por RT-PCR de um fragmento de 245 pb do gene da proteína da Matriz (M) dos IAV; e amplificação por RT-nPCR de um fragmento de 602 e 440 pb do gene que codifica a RNA polimerase dependente de RNA (RpRd) dos coronavírus. O limite de detecção de cada PCR também foi determinado. Não foi observada amplificação em nenhuma das amostras testadas para coronavírus e IAV. O limite inferior de detecção das reações foi determinado em 4,59 cópias genômicas/μL para a RT-PCR de IAV, e 3,53x103 copias genômicas/μL para a RT-nPCR de coronavírus. Embora tenha se demostrado que os morcegos albergam um grande número de patógenos, os resultados do presente estudo apoiam a teoria de que a circulação de vírus em morcegos na natureza muitas vezes é baixa, e de que a nossa compreensão da complexa dinâmica infecciosa destes vírus em condições selvagens ainda é limitada. Bats constitute an important group of virus reservoirs of public health importance. The reasons for this are several, such as wide diversity, extensive distribution, longevity, adaptation to altered ecosystems, great trophic diversity, habitat diversity, ability to fly long distances, and the high interaction between species both of the same order and among others mammal species, including humans. Hundreds of viruses have been associated with bats, including influenza viruses and coronaviruses. This type of long-standing virus-host association may have originated through co-evolution processes. Thus, early detection and characterization of these viruses in their natural hosts could help to better understand spillover phenomena in humans, such as what happened recently with SARS-CoV-2. This study aimed to detect by molecular methods the presence of alpha influenza virus (IAV) and coronavirus (Orthocoronavirinae) in non-hematophagous bats collected in the state of São Paulo, Brazil. Thus, samples of lung and small intestine from 111 bats from 23 cities in the state of São Paulo were obtained and identified in 12 different species by amplification and sequencing of 710 bp of the mitochondrial COI gene. Samples were processed seeking amplification by RT-PCR of a 245 bp fragment of the IAV Matrix (M) protein gene; and amplification by RT-nPCR of a 602 and 440 bp fragment of the gene encoding the RNA-dependent RNA polymerase (RpRd) of the coronaviruses. The detection limit of each PCR was also determined. Amplification was not observed in any of the samples tested for coronavirus and IAV. The lower limit of detection of reactions was determined as 4.59 genomic copies/μL for IAV RT-PCR, and 3.53x103 genomic copies/μL for coronavirus RT-nPCR. Although bats have been shown to harbor a large number of pathogens, the results of the present study support the theory that virus circulation in bats in the wild is often low, and that our understanding of the complex infectious dynamics of these viruses in wild conditions is still limited.

A espécie Sapajus nigritus, compreende primatas não-humanos bem distribuídos na América do Sul. Eles são onívoros e vivem em grupos de até 40 indivíduos. As superfícies mucosas são um portal perfeito de entrada para vírus e bactérias do ambiente para acessar novos hospedeiros. A cavidade oral é um portal de entrada para vários microrganismos, incluindo vírus, e compreende a gengiva, língua, paladar, a superfície dos dentes e saliva. A descoberta periódica de novos vírus sugere que subestimamos o número total e a diversidade destes na natureza. Por outro lado, a crescente melhoria da detecção de vírus contribui para a descoberta de um mundo microscópico ainda inexplorado. Bacteriófagos (ou fagos) são o grupo mais abundante de vírus. Eles desempenham um papel dinâmico no ecossistema à medida que se replicam em hospedeiros bacterianos que habitam todos os tipos de ambientes, incluindo superfícies corporais de diferentes espécies de animais. Este estudo tem como objetivo apresentar a composição dos vírus em suabes orais, sangue e urina de macacos-capuchinhos selvagens (Sapajus nigritus) coletados de 12 animais em dois pontos de coleta distintos. As amostras foram coletadas seguindo as orientações do Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis (Ibama), armazenadas no gelo e transportadas para o laboratório. Posteriormente, foram processadas em três pools distintas (cotonete, sangue e urina), e a extração de ácidos nucleicos foi realizada utilizando-se Trizol®, de acordo com as instruções do fabricante. Após a extração, os ácidos nucleicos foram aleatoriamente amplificados e submetidos à plataforma Illumina para sequenciamento da próxima geração. Os resultados revelaram a presença de bacteriófagos pertencentes às famílias Siphoviridae, Myoviridae e Podovirida e 11 famílias virais eucarióticas: Herpesviridae, Parvoviridae, Papillomaviridae, Polyomaviridae, Caulimoviridae, Iridoviridae, Astroviridae, Poxviridae e Baculoviridae, além de dois genomas virais completos de Anelloviridae e Genomoviridae. Este estudo contribui para o acesso às sequências virais de macacos capuchinhos, melhorando nosso conhecimento restrito sobre comunidades microbianas em primatas não humanos. Sapajus nigritus, is a specie of non-human primates which are widespread in South America. They are omnivores and live in troops of up to 40 individuals. Mucosal surfaces are a perfect portal of entry for viruses and bacteria from the environment to access new hosts. The oral cavity is a portal of entry for several microorganisms including viruses, and it contains the gingiva, tongue, palate, the surface of teeth and saliva. The periodic discovery of new viruses suggests that we underestimate the total number and diversity of viruses existing in nature. On the other hand, the growing improvement of virus detection contribute to the discovery of a microbiology world yet unexplored. Bacteriophages (or phages) are the most abundant group of viruses. They play a dynamic role in the ecosystem as they replicate in bacterial hosts which inhabit all types of environments, including body surfaces of different species of animals. This study aims unveiling the viruses composition in oral swabs, blood and urine of wild capuchin monkeys (Sapajus nigritus) collected from 12 animals in two distinct collection points. Samples were collected following the Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis (IBAMA) guidelines, stored on ice and transported to the lab. Samples were processed in three distinct pools (swab, blood and urine), and the extraction of nucleic acids was performed using Trizol®, according to the manufacturer´s instructions. Following extraction, nucleic acids were randomly amplified and submitted to Illumina plataform for next generation sequencing. The results revealed the presence of bacteriophages belonging to the families Siphoviridae, Myoviridae, and Podovirida and 11 eukaryotic viral families: Herpesviridae, Parvoviridae, Papillomaviridae, Polyomaviridae, Caulimoviridae, Iridoviridae, Astroviridae, Poxviridae and Baculoviridae, in addition to two complete viral genomes of Anelloviridae and Genomoviridae. This study contributes to access the viral sequences from capuchin monkeys, lead to improve our restrict knowledge regarding microbial communities in non-human primates.

A influenza é uma doença respiratória viral aguda que afeta várias espécies de aves e mamíferos, incluindo o homem. A doença em suínos é causada pelo vírus influenza A (IAV), tendo um impacto econômico significativo nos rebanhos suínos afetados, além de representar uma ameaça à população humana devido ao seu potencial pandêmico e zoonótico. Muito embora os subtipos virais globalmente prevalentes em suínos sejam o H1N1, H1N2 e H3N2, estes são geneticamente e antigenicamente distintos, de acordo com a região geográfica de origem. Estudos recentes realizados com isolados do IAV de suínos confirmaram que as linhagens virais detectadas no Brasil são restritas ao território brasileiro, não sendo encontrados vírus semelhantes em suínos de outros países. Desta forma, um teste de diagnóstico rápido, que seja capaz de detectar e diferenciar o subtipo do IAV em suínos é importante para o monitoramento e controle da infecção em rebanhos suínos. Além disto, no Brasil não existem testes rápidos disponíveis comercialmente, como RT-qPCR para subtipar o IAV em amostras clínicas de suínos. Assim, este estudo teve como objetivo desenvolver e validar dois ensaios de RT-qPCR multiplex (um para a hemaglutinina viral – H1pdm, H1hu, H3; e outro para a neuraminidase viral – N1pdm, N1hu, N2) para a detecção e diferenciação dos subtipos H1N1, H1N2 e H3N2 do IAV circulantes em suínos no Brasil. A especificidade analítica da técnica foi de 100%, na correta identificação do subtipo e linhagem viral em 85 IAVs previamente caracterizados por sequenciamento genômico. O ensaio apresentou 100% de especificidade diagnóstica em 50 amostras negativas para o IAV e positivas para outros patógenos de suínos. O limite de detecção da RT-qPCR variou entre 5,09x103 e 5,09x101 cópias de RNA viral/μL, conforme o gene avaliado. Posteriormente, 73 amostras clínicas de suínos positivas para o IAV por RT-PCR (gene da matriz) foram testadas. A RT-qPCR multiplex identificou o subtipo e a linhagem viral em 74% das amostras clínicas analisadas, sendo que o subtipo H3N2 de origem humana (46,3%) foi o mais detectado, seguido pelo H1N1 de origen pandêmica (33,3%), H1N2 de origem humana (11,1%) e HxN1pdm (3,7%). Além disto, coinfecções (3,7%) e vírus que sofreram rearranjo gênico (1,9%) foram detectados. Portanto, o ensaio de RT-qPCR multiplex desenvolvido e validado neste estudo mostrou-se um método rápido, muito sensível e específico para a identificação dos subtipos e linhagens do IAV em amostras de suínos. A técnica descrita é economicamente viável quando comparada a outros métodos, como o sequenciamento genômico, e uma vez implementada em laboratórios de diagnóstico, poderá fornecer informações sobre a prevalência dos subtipos virais em suínos, contribuindo para o monitoramento e vigilância da influenza em rebanhos suínos. Influenza is an acute viral respiratory disease that affects several species of birds and mammals, including humans. The disease in pigs is caused by influenza A virus (IAV), which may has a significant economic impact on the affected swine herds, posing a threat to the human population due to its pandemic and zoonotic potential. Although the prevalent virus subtypes in swine herds worldwide are H1N1, H1N2 and H3N2, these are genetically and antigenically distinct, according to the geographic region of origin. Recent studies with IAV isolates from swine confirmed that the viral lineages detected in Brazil are restricted to the Brazilian territory, and no similar viruses were found in swine from other countries. In this way, a rapid diagnostic test, able to detect and differentiate the IAV subtype in pigs is important for the monitoring and control of the infection in swine herds. In addition, in Brazil there are no rapid tests commercially available, such as RT-qPCR, to subtype IAV in swine clinical samples. This study aimed to develop and validate two multiplex RT-qPCR assays (one for viral hemagglutinin – H1pdm, H1hu, H3; and another for viral neuraminidase – N1pdm, N1hu, N2) for the detection and differentiation H1N1, H1N2 and H3N2 IAV subtypes circulating in swine in Brazil. The analytical specificity of the technique was 100%, identifying the correct viral subtype and lineage in 85 IAVs previously characterized by genomic sequencing. The assay presented 100% of diagnostic specificity in 50 negative samples for IAV and positive for other swine pathogens. The limit of detection of the RT-qPCR ranged from 5.09x103 to 5.09x101 copies of viral RNA/μL, according to the gene evaluated. Afterwards, 73 swine clinical samples positive for IAV by RT-PCR (matrix gene) were tested. The multiplex RT-qPCR identified the viral subtype and lineage in 74% of the clinical samples analyzed, which the human-origin H3N2 (46.3%) subtype was the most detected, followed by the pandemic-origin H1N1 (33.3%), human-origin H1N2 (11.1%) and HxN1pdm (3.7%). In addition, co-infections (3.7%) and reassortant viruses (1.9%) were detected. Therefore, the multiplex RT-qPCR assay developed and validated in this study showed to be a rapid, very sensitive and specific method for IAV subtyping and lineages identification in swine samples. The technique described is cost-effective when compared to other methods, such as genomic sequencing, and once implemented in diagnostic laboratories, may provide information on the prevalence of viral subtypes in pigs, contributing to the monitoring and surveillance of influenza in swine herds.

Os morcegos são reconhecidamente reservatórios de diversos vírus com potencial zoonótico, como o vírus da raiva e ebola. A grande diversidade ecológica, acrescida de alguns fatores fisiológicos, característicos desses animais, faz deles excelentes mecanismos de manutenção e dispersão de vírus na natureza. O crescente contato entre humanos e morcegos é uma preocupação para a saúde pública, aumentando o foco para a vigilância viral nesses animais. No Brasil, poucos estudos buscaram acessar a diversidade viral em morcegos, dificultando o trabalho de vigilância, uma vez que não são conhecidos os vírus circulantes nesses animais. Assim, o presente estudo visa acessar a diversidade viral em amostras de morcegos através do sequenciamento de alto desempenho. Foram utilizadas amostras de swab anal, swab oral e pulmão, de diferentes espécies e localidades. Após as análises dos resultados, foram identificados fragmentos de Adenovirus, Papillomavirus e Parvovírus, bem como dois genomas completos de duas novas espécies de Anellovirus e uma nova espécie de Circovírus. As análises filgenéticas demonstraram que um dos fragmentos de Adenovirus possui similaridade com o adenovírus humano tipo C, associado a doenças respiratórias. Os resultados encontrados contribuem para aumentar o conhecimento da diversidade viral, bem como reforça a importância de uma vigilância não apenas para raiva, demonstrando a possibilidade da presença de outros vírus com potencial zoonótico. Bats are recognized as reservoirs of several viruses with zoonotic potential, such as rabies virus and ebola. The large ecological diversity, added to fisiological characteristics, typical from bats, makes them excellent mechanisms of maintenance and dispersion of viruses in nature. The increasing contact between humans and bats is a concern for public health, reinforcing the importance for viral surveillance in these animals. In Brazil, few studies have sought to access viral diversity in bats, making surveillance difficult, since the circulating viruses in these animals are still unknown. Thus, the present study aims to access viral diversity in bat samples through high throughput sequencing. Samples of different origins, species and regions were used. Following the analysis of the results, fragments of Adenovirus, Papillomavirus and Parvovirus were identified, as well as two complete genomes of two new species, one Anellovirus and one species of Circovirus. The phylogenetic analyzes demonstrated that one of the fragments of Adenovirus has similarity with the human adenovirus type C, associated to respiratory diseases. The results described here contribute to the knowledge of viral diversity, as well as reinforce the importance of surveillance not only for rabies, as long as they demonstrate the presence of other viruses with zoonotic potential in Brazilian bats.

Morcegos são reservatórios naturais de uma grande variedade de vírus de interesse a saúde pública, incluindo vírus zoonóticos que podem causar patologias graves aos humanos. Dados epidemiológicos demonstram que o morcego é a espécie animal responsável pela maioria dos casos de raiva humana no Brasil nas últimas duas décadas. A mudança no perfil epidemiológico desta doença, que anteriormente era predominantemente transmitida por cães, gerou um aumento nas amostras de morcegos enviadas aos órgãos públicos para a vigilância do vírus rábico. No presente estudo, amostras obtidas de morcegos urbanos da espécie Tadarida brasiliensis monitorados no âmbito do Programa de Controle e Profilaxia da Raiva do Estado do Rio Grande do Sul foram analisadas por abordagem de metagenômica, com objetivo de identificar outros vírus, que representassem risco à saúde pública ou não, colaborando para a melhor compreensão da diversidade viral destes animais. Foram encontradas sequências relacionadas a 04 famílias virais que infectam uma ampla variedade de hospedeiros: Anelloviridae, Circoviridae, Papillomaviridae e Poxviridae. Estes achados auxiliam no melhor conhecimento sobre os vírus carreados por morcegos desta região e demonstram que o uso da metagenômica como instrumento de vigilância amplia a gama de vírus de interesse que podem ser monitorados nestas amostras. Bats are natural reservoirs for a wide variety of viruses of public health concern, including zoonotic viruses that can cause severe diseases in humans. Epidemiological data revealed that bats are the animal species responsible for most cases of human rabies in Brazil in the last two decades. This change in the rabies epidemiological profile, which was previously predominantly transmitted by dogs, generated an increase in the number of bats samples sent to public organs for surveillance of rabies virus. In the present study, samples obtained from urban bats from the species Brazilian free-tailed bat, monitored under the Rio Grande do Sul State Rabies Control and Prophylaxis Program were analyzed by a metagenomic approach with the objective of identifying other viruses, that pose as a risk to public health or not, providing a better understanding of bats viral diversity locally and in the general way. Sequences related to 04 viral families that infect a wide variety of hosts have been found: Anelloviridae, Circoviridae, Papillomaviridae e Poxviridae. These findings improves the knowledege about the viruses carried by these animals and demonstrate that the use of metagenomics as a surveillance tool expand the range of viruses of public health concern investigated in these samples.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES Infectious diseases caused by herpes simplex virus types 1 and 2 (HSV-1 and HSV-2) are among the pathologies that most affect the population. The search for new therapeutic alternatives for its treatment becomes relevant due to the growth of cases resistant to Aciclovir, a reference in the treatment of herpetic infections. Thus, this thesis investigated the effect of diphenyl diselenide (PhSe)2, an organic molecule of selenium, for the treatment of infections caused by herpes simplex virus 1 (HSV-1) and 2 (HSV-2) in vitro and in vivo. In the protocol 1 related to articles 1 and 2, the cell viability test (MTT) was initially performed to check the toxicity of the compound (1-100 μM) and later its effect on the virus was verified by the plaque reduction assay, both tests performed on VERO cell culture. After, the experiments were carried out in vivo. The protocol consisted of treatment with (PhSe)2 (5 mg/kg/day, intragastric, i.g.) 5 days before and 5 days after infection; mice were infected at day 6. The extravaginal lesion score was evaluated from days 6 to 10. At the end of treatments, the animals were killed and ex vivo analyses of the genital, renal, hepatic and plasma tissues were performed. Other parameters were also investigated such as viral load, histological analysis, oxidative stress, inflammation, immune response, antioxidant and anti-inflammatory enzyme activities, renal and hepatic toxicity parameters. In the protocol 2 related to the manuscript 1, the antiviral effect of (PhSe)2 against HSV-1 infection was investigated at different times post-infection (4 and 24 hours) in glial culture cells. The viral load was quantified through plaque reduction assay, inhibition of viral DNA synthesis and inhibition of genes involved in the replicative cycle (ICP27, ICP0, ICP8 and viral DNA polymerase). The activation of the immune system (NF-κB and TNF-α) in HSV-1 infected cells was also investigated. The results of articles 1 and 2 demonstrated an antiviral effect of (PhSe)2 in vitro and in vivo as well as the reduction of oxidative stress, inflammation and restoration of antioxidant capacity, such as the content of non-protein thiols and the activity of antioxidant enzymes. Furthermore, the compound protected against toxic effects generated by infection at the renal and hepatic levels. The results obtained in manuscript 1 were also positive because the antiviral effect of (PhSe)2 against HSV-1 infection in glial cells was confirmed as well as the reduction of viral DNA synthesis and regulation of the replicative cycle genes. The compound reduced the expression of most viral genes studied at different time points after infection. (PhSe)2 showed an immunomodulatory effect by reducing the expression of the cytokine TNF-α. From these data, (PhSe)2 can be considered an important therapeutic alternative to treat HSV-1 and HSV-2 infections. Doenças infecciosas ocasionadas pelo herpes simplex vírus do tipo 1 e 2 (HSV-1 e HSV-2) estão entre as patologias que mais acometem a população. A busca por novas alternativas terapêuticas para o seu tratamento torna-se relevante devido ao crescimento de casos resistentes ao Aciclovir, referência no tratamento de infecções herpéticas. Desta forma, esta tese investigou o efeito do disseleneto de difenila (PhSe)2, uma molécula orgânica de selênio, no tratamento de infecções geradas pelo herpes simplex vírus humano 1 (HSV-1) e 2 (HSV-2) in vitro e in vivo. No protocolo 1 referente aos artigos 1 e 2, foi realizado incialmente o teste de viabilidade celular (MTT) para verificar se há toxicidade do composto (1-100μM) e posteriormente verificou-se o seu efeito sobre o HSV-2 através do ensaio de redução de placa viral, ambos os testes realizados em cultura de células VERO. Após, foram realizados os experimentos in vivo. O protocolo consistiu de 5 dias de pré-tratamento com (PhSe)2 (5 mg/kg, via intragástrica, i.g.), infecção intravaginal no dia 6 e pós-tratamento com o composto por mais 5 dias. Ao final dos tratamentos, os animais foram mortos e análises ex vivo dos tecidos genital, renal, hepático e plasma foram realizadas. A evolução da lesão extravaginal foi analisada a cada dia pós-infecção. Outros parâmetros também foram investigados como carga viral, análise histológica, estresse oxidativo, inflamação, resposta imune, atividades de enzimas antioxidantes e anti-inflamatórias, parâmetros de toxicidade renal e hepática. No protocolo 2 referente ao manuscrito 1, as análises do efeito antiviral do (PhSe)2 contra a infecção por HSV-1 foram realizadas em dois tempos diferentes após a infecção (4 e 24 horas) em culturas de células gliais. Foi quantificada a carga viral através dos ensaios de redução de placa, inibição da síntese de DNA viral e inibição de genes envolvidos no ciclo replicativo (ICP27, ICP0, ICP8 e DNA polimerase viral). Também foi investigada a ativação do sistema imunológico (NF-κB e TNF-α) nas células infectadas por HSV-1. Os resultados referentes aos artigos 1 e 2 demonstraram um efeito antiviral do (PhSe)2 in vitro e in vivo bem como a redução do estresse oxidativo, inflamação, restauração da capacidade antioxidante como o conteúdo de tióis não-proteicos e da atividade de enzimas antioxidantes. Ainda, o composto protegeu contra efeitos tóxicos gerados pela infecção a nível renal e hepático. Os achados obtidos no manuscrito 1 também foram positivos, uma vez que foi confirmado o efeito antiviral do (PhSe)2 contra a infecção por HSV-1 nas células gliais bem como a redução da síntese de DNA viral e regulação dos genes do ciclo replicativo. O composto reduziu a expressão da maioria dos genes virais estudados nos diferentes tempos de análise após a infecção. E de certa forma apresentou efeito imunomodulador através da redução da expressão da citocina TNF-α. A partir dos dados obtidos pode-se considerar o (PhSe)2 uma importante alternativa terapêutica frente as infecções causadas pelo HSV-1 e HSV-2.

O vírus da imunodeficiência felina (FIV), membro da família Retroviridae, é um vírus mundialmente distribuído em gatos domésticos. Até o momento foram descritos sete subtipos de FIV em várias regiões do mundo. No Brasil, os estudos revelam a presença unicamente do subtipo B do FIV (FIV-B). Entretanto, o baixo número de sequências genômicas disponíveis nos bancos de dados dificulta a realização de estudos filogenéticos. Com a finalidade de compreender melhor alguns aspectos da epidemiologia molecular de FIV, trinta e uma amostras de gatos positivos para FIV, coletadas entre 2012 e 2016 no município de Porto Alegre-RS, foram submetidas à amplificação e sequenciamento da região C5-V4 do gene env, importante na subtipificação viral. Todas as sequências obtidas pertencem ao FIV-B. No entanto, 4 sequências (13 %) apresentaram um grupamento diferente das demais, confirmando a ocorrência de eventos de recombinação. Além disso, observou-se a existência de cinco clados altamente suportados nas sequências brasileiras, sugerindo cinco eventos independentes de introdução do vírus no Brasil. Por fim, os resultados obtidos sugerem que a epidemia de FIV-B se remonta a 1942 e, no Brasil, as cinco entradas do vírus aconteceram entre 1981-1991. Além disso, foi feita uma análise visando compreender a relação entre a frequência de mutações nos genes env e vif do FIV e gene A3Z3 do hospedeiro, um importante fator de restrição que induz hipermutações no vírus. Foram identificados 5 dos 7 haplótipos no gene A3Z3 descritos previamente e se encontrou um baixo ou indetectável nível de hipermutações nos genes virais analisados. Feline immunodeficiency virus (FIV), a member of the Retroviridae family, is a widespread virus in domestic cats. To date, seven FIV subtypes have been described in different regions of the world. In Brazil, the studies show only the presence of FIV subtype B (FIV-B). However, the low number of available genomic sequences in the databases is a challenge for phylogenetic studies. In order to better understand some aspects of the molecular epidemiology of FIV, thirty-one samples of FIV positive cats collected between 2012 and 2016 in Porto Alegre-RS, were submitted to amplification and sequencing of the C5-V4 region of the env gene, used to viral subtyping. All sequences obtained belong to FIV-B. However, 4 sequences (13%) presented a different grouping pattern when compared to other sequences, confirming the occurrence of recombination events. In addition, we observed the existence of five clades highly supported in the Brazilian sequences, suggesting five independent events of introduction of the virus in Brazil. Finally, the results obtained suggest that the FIV-B epidemic dates back to 1942 and, in Brazil, the five entries of the virus occurred from 1981 to 1991. In addition, an analysis was developed to understand the relationship between the frequency of mutations in the env and vif genes of the virus and A3Z3 host gene, an important restriction factor that induces hypermutations in the virus. Five of the 7 haplotypes in the A3Z3 gene described previously were identified and a low or undetectable level of hypermutations was found in the analyzed viral genes.

Marseilleviridae é uma família de vírus gigantes cujos membros infectam amebas de vida livre. Esses vírus têm sido encontrados em amostras ambientais de água, larvas de inseto, torres de resfriamento e mais recentemente em amostras humanas. Eles possuem capsídeo icosaédrico medindo entre 190-250 nm e genoma de DNA dupla fita circular ou linear. Sua replicação ocorre no citoplasma amebiano onde observam-se fábricas virais. Este trabalho tem como objetivo investigar a presença de vírus gigantes em mexilhões-dourados (Limnoperna fortunei) que habitam o Lago Guaíba, Porto Alegre, Brasil. Quarenta indivíduos foram coletados e agrupados em pools de 5 amostras (água interna e corpo, totalizando dezesseis pools). Os pools foram homogeneizados em tampão fosfato, centrifugados e o sobrenadante filtrado em membrana de 0,45μM. Foram cultivadas amebas da espécie Acanthamoeba polyphaga em meio PYG em microplacas de 24 poços, inoculadas com os sobrenadantes, incubadas a 30ºC e examinadas diariamente em busca de efeito citopático (ECP) até 72 horas após a inoculação. Quando CPE era evidente, os sobrenadantes foram coletados e ultracentrifugados através de um gradiente de sacarose de 25%. Um dos dezesseis pools induzindo CPE claro foi submetido à extração de DNA e sequenciamento do genoma viral completo um sequenciador de nova geração (Illumina MiSeq). O genoma do vírus chamado Golden mussel marseillevirus consiste de uma única molécula de DNA de 360610 pb, com um teor de G+C de 43,1%. A análise da sequência de nucleotídeos traduzida revelou a presença de proteínas virais que apresentam homologia com proteínas de outros membros da família Marseilleviridae, como Lausanevirus e vírus Insectomime, porém grande parte do seu genoma não apresenta identidade com proteínas depositadas no banco de dados. A análise filogenética do gene D6/D11 Helicase sugere que este vírus faça parte de uma nova linhagem de marseillevirus. Este é o primeiro estudo que demonstra o isolamento de um vírus gigante a partir de tecidos de mexilhão-dourado e infere que estes vírus estão distribuídos amplamente no meio ambiente. Marseilleviridae is a family of giant viruses whose members infect free living amoebae. These viruses have been found in environmental samples of water, insect larvae, cooling towers and, more recently, in human samples. They have icosahedral capsids measuring between 190-250 nm and their genome is double-stranded circular or linear DNA. Replication occurs in the host cell cytoplasm, inside the viral factories. This study aims to investigate the presence of giant viruses in tissues of golden mussels (Limnoperna fortunei) that inhabit the Guaiba Lake, Porto Alegre, Brazil. Forty specimens were pooled in groups of 5 specimens (internal water and body, totalizing sixteen pools). The pools were homogenized with phosphate buffer, centrifuged and the supernatant was filtered in 0,45μM. Monolayers of Acanthamoeba polyphaga were cultivated with PYG medium in 24-well microplates, inoculated with the pooled samples, incubated at 30 ºC and examined daily in search for cytopathic effect (CPE) up to 72 hours after inoculation. When CPE was evident, the supernatants were collected, clarified and ultra centrifuged through a 25% sucrose cushion. One out of the sixteen CPE positive pools was submitted to DNA extraction and complete sequencing of the viral genome in a NGS apparatus (Illumina MiSeq). The genome of the virus named Golden mussel marseillevirus consists of a single DNA molecule of 360,610 bp, with a G+C content of 43.1%. The analysis of the translated nucleotide sequence reveals the presence of proteins which are homologs to proteins predicted in other members of the family Marseilleviridae like, e.g. Lausannevirus and Isectomime virus. However, part of the viral genome has no identity with the nucleotide sequences available at the database. The phylogenetic analysis of the D6/D11 Helicase gene suggests that this virus is part of a new lineage of marseillevirus. This is the first study where the isolation of a giant virus from golden mussel tissues is achieved, suggesting that these viruses are widely distributed in the environment.

A costa do Rio Grande do Sul recebe sazonalmente uma variedade de espécies marinhas que incluem aves, tartarugas e mamíferos. Entre elas, os lobos-marinhos são observados freqüentemente nas praias do litoral, principalmente durante os meses de inverno. Embora muitos destes animais procurem as praias para descansar, muitos deles chegam debilitados ou mortos. Estabelecer quais são os prováveis agentes microbiológicos que possam causar doenças nestes animais e seu potencial para transmissão de zoonoses é uma tarefa difícil pelos dados disponíveis. O objetivo deste estudo foi de aplicar uma análise metagenômica para caracterizar o viroma fecal de lobos-marinhos encontrados mortos ao longo da costa sul-rio-grandense. Duas espécies foram examinadas: o lobo-marinho-sul-americano (Arctocephalus australis) e o lobo-marinho-subantártico (Arctocephalus tropicalis). Dez amostras de fezes de A. australis (n=5) e A. tropicalis (n=5) foram coletadas dos intestinos de lobos-marinhos mortos e as partículas virais foram purificadas, extraídas e uma PCR randômica foi realizada. Os produtos amplificados foram seqüenciados por duas plataformas de seqüenciamento, Ion Torrent e Illumina, e os contigs foram submetidos ao BLASTx. Ambos os viromas foram predominados por bacterófagos, no entanto, vírus entéricos de eucariotos e potenciais novos vírus também foram encontrados. Seqüências de anelovírus, parvovírus e picornavírus foram identificadas nas duas espécies de lobos-marinhos. Seqüências de picobirnavírus e semelhantes a hepevírus foram identificadas em A. australis, enquanto sapovírus, rotavírus e sakobuvírus foram encontrados em A. tropicalis. Estes resultados contribuem para um maior entendimento dos vírus que circulam entre as populações de lobos-marinhos. The Rio Grande do Sul coast, the southernmost state in Brazil, seasonally hosts numerous marine species, including birds, turtles and mammals. Among the marine mammals, the Subantarctic and South American fur seals are observed near and on-shore frequently, particularly during winter months. Although some reach the coast to rest, several are found dead or debilitated along the shore. Establishing microbial etiological agents of diseases and the potential for fur seals to serve as reservoirs of zoonotic diseases remains limited due to available data. The aim of this study was to apply a metagenomic approach to characterize the fecal virome of fur seals found dead along the Rio Grande do Sul coast. Two species were analyzed: the South American fur seal (Arctocephalus australis) and the Subantarctic fur seal (Arctocephalus tropicalis). Ten fecal samples from A. australis (n=5) and A. tropicalis (n=5) were collected from the intestines of dead fur seals and viral particles were purified, extracted and a random PCR was performed. The amplified products were sequenced through Ion Torrent and Illumina NGS platforms and assembled reads were subjected to BLASTx searches. Both viromes were dominated by bacteriophages, however, enteric and potentially novel eukaryotic viruses were also found. Sequences of anellovirus, parvovirus and picornavirus were identified in both fur seal species. Sequences of picobirnavirus and a hepevirus-like were identified in A. australis; while sapovirus, rotavirus and sakubovirus were found in A. tropicalis. These findings contribute to a better understanding of the viruses that occur in fur seal populations.

Os morcegos (Ordem Chiroptera) estão entre as espécies de mamíferos mais diversificadas e distribuídas no mundo. É reconhecido o papel fundamental que eles exercem na natureza. Por outro lado, são conhecidos como importantes reservatórios de agentes de doenças infecciosas, dentre os quais vírus, até pouco tempo desconhecidos, que nas últimas décadas se tornaram emergentes em humanos e outras espécies. Dentre os vírus RNA emergentes, destacam-se o SARS-CoV, MERS-CoV, vírus Hendra e Nipah e o último a causar importante surto na África, vírus Ebola.Mais de 100 espécies de vírus já foram detectadas em morcegos em todo o mundo, tanto vírus RNA, quanto vírus DNA, embora importância desses últimos como agentes de zoonoses ainda não tenha sido confirmada. Estudos no Brasil com relação à detecção de vírus em morcegos são praticamente inexistentes, e são focados apenas na vigilância e epidemiologia do vírus rábico. Portanto, este trabalho objetivou a detecção de vírus, tanto RNA, quanto DNA, em amostras de morcegos no estado do Rio Grande do Sul, através de técnicas moleculares e sequenciamento dos fragmentos obtidos. Identificamos a presença de vírus da família Coronaviridae, Circoviridae e Adenoviridae em amostras de fezes e tecidos de morcegos insetívoros e hematófagos. A detecção de novas espécies de vírus da família Circoviridae confirma a diversidade viral que estes vírus podem apresentar. Os resultados obtidos por investigação não podem afirmar se tais vírus apresentam potencial zoonótico, mas por serem dados inéditos no país, reforçam a importância da vigilância e de estudos adicionais para melhor compreender o papel que diferentes espécies de morcegos tem como reservatórios de vírus que possam ter impacto na saúde animal e humana. Bats (Order Chiroptera) are among the most diverse and worldwide distributed mammal species. It is recognized the important role they play in nature, but, on the other hand, they are known as important reservoirs of infectious diseases, including viruses, until then unknown, that have become emerging in recent decades. Among RNA viruses of great importance are the SARS-CoV, MERS-CoV, Hendra and Nipah viruses and the one responsible to cause major outbreaks in Africa recently, the Ebola virus. More than 100 species of virus have been detected in bats in the world, both RNA and DNA viruses DNA, although the latter still hasn't confirmed its importance on zoonosis or the impact it would cause to the host itself.Studies in Brazil are practically nonexistent, because they are focused only on surveillance and epidemiology of rabies virus. Therefore, this work aimed to virus detection, both RNA and DNA in samples from bats in the State of Rio Grande do Sul, through molecular techniques and sequencing of the fragments obtained.We identify the presence of viruses of the family Coronaviridae, Circoviridae and Adenoviridae in stool samples and tissues. In addition, the discovery of new species of viruses of the family Circoviridae confirms viral diversity that these bats can carry. The results obtained in this investigation cannot confirm if such viruses have zoonotic potential, but as they are the first data published in the country, it underscores the importance of vigilance and additional studies to better understand the role that different species of bats have as reservoirs of viruses that may have an impact on animal and human health.

O herpesvírus bovino tipo 4 (BoHV-4) é um herpesvírus membro da subfamília Gammaherpesvirinae, gênero Rhadinovirus que tem sido detectado em bovinos sadios e com diferentes sinais clínicos em todos os continentes. Sugere-se que este vírus está relacionado com diversas doenças do trato reprodutivo de bovinos. Dessa forma, faz-se necessária a pesquisa desse vírus em amostras biológicas com potencial utilização em biotécnicas de reprodução de bovinos, com o objetivo de reduzir sua transmissão e possíveis prejuízos econômicos advindos de sua infecção. Cento e dezenove amostras de líquido folicular de fêmeas abatidas em frigorífico e 164 amostras de sêmen de centros de inseminação artificial foram submetidas a uma reação de nested PCR para detecção do genoma do BoHV-4. Foi detectado o DNA de BoHV-4 em 2 amostras (1,68%) de liquido folicular e em 14 amostras (8,54%) de sêmen. Sete produtos foram submetidos ao sequenciamento, que revelou a semelhança dessas amostras com amostras europeias. É o primeiro relato de detecção do DNA de BoHV-4 em amostras de líquido folicular de bovinos, o que pode sugerir uma nova via de transmissão desse agente. Dessa forma, as alíquotas de sêmen destinadas à inseminação artificial e os ovários destinados a produção de embriões in vitro necessitam de um controle maior para evitar a disseminação do BoHV-4 entre os rebanhos bovinos e possíveis prejuízos econômicos associados ao vírus. Bovine herpesvirus type 4 (BoHV-4), a member of the Gammaherpesvirinae subfamily, genus Rhadinovirus has been detected in healthy as well as diseased cattle in all continents. It is suggested that this virus is associated to several disorders of the reproductive tract of bovines, and the virus or its genome has been found in clinical and biological samples like fetuses, semen and cells of the granulosa. Given the lack of evidences on the circulation of BoHV-4 in bovines of Brazil, specifically from samples from the reproductive tract, this study aimed the detection of BoHV-4 DNA from semen and follicular fluids of bovines. One hundred and nineteen follicular fluid samples obtained from a slaughterhouse and 164 semen samples obtained in artificial insemination centers were subjected to a nested PCR for the detection of BoHV-4 DNA. BoHV-4 DNA was detected in 2 samples (1.68%) from follicular fluid and 14 (8.54%) of semen samples. Seven products were subjected to sequencing, which confirmed the identity of the PCR products and revealed the similarity of these viruses with European virus isolates. It is the first report on the detection of BoHV-4 DNA in bovine follicular fluid samples and semen in Brazil, which may suggest that the virus may be disseminating in Brazilian cattle through reproductive practices. In addition, the results found here point to the a requirement for the testing of such samples, in search for BoHV-4 DNA, in order to prevent the spread of BoHV-4 between the cattle herds and the potential economic losses associated.

O vírus da imunodeficiência felina (FIV) e o vírus da leucemia felina (FeLV), pertencem à família Retroviridae, são amplamente distribuídos e induzem um efeito imunossupressor significativo em gatos domésticos (Felis catus) infectados. Proteínas que apresentam atividade contra os retrovírus são conservadas entre mamíferos e são denominadas de fatores de restrição. As citidinas deaminases da família de genes APOBEC3 são a classe mais estudada de fatores de restrição e o gene APOBEC3H (A3H) codifica duas proteínas (APOBEC3H e APOBEC3CH). Essas proteínas de felinos são os principais responsáveis pela restrição de FIV e FeLV, o que ocorre por meio de hipermutações geradas nos provírus durante a transcrição reversa. Alterações na sequência desse gene podem alterar a estabilidade e a localização celular de proteínas APOBEC3H em mamíferos. Considerando a importância do gene A3H em gatos, a investigação de sua variabilidade é relevante. Cinquenta amostras de DNA de gatos FIV e/ou FeLV positivos e cinquenta e nove amostras de gatos negativos para ambos os vírus foram usadas para amplificar duas regiões diferentes do gene, com posterior seqüunciamento e análise comparativa das sequencias. A primeira região investigada demonstrou-se conservada entre todas as amostras. Na segunda, foi possível identificar seis pontos de variação de nucleotídeos únicos, e um deles, o A65S (A65I) foi significativamente correlacionado com a suscetibilidade à infecção por FIV e/ou FeLV. Por outro lado, a análise de haplótipos mostrou que a combinação "GGGGCC " foi significativamente correlacionada com a ausência de infecção retroviral, talvez indicando um efeito protetor. Considerando que um polimorfismo na posição 65 já foi encontrado no Tigre da Indochina e dada a correlação encontrada nesta pesquisa, mais estudos sobre o efeito desses polimorfismos na atividade de fatores de restrição codificados pelo gene A3H devem ser realizados. Da mesma forma, investigações a respeito dos efeitos da combinação "GGGGCC" devem ser realizadas de modo à corroborar um possível efeito protetor sugerido no presente trabalho. The Feline Immunodeficiency Virus (FIV) and the Feline Leukemia Virus (FeLV) belong to the Retroviridae family, are widely distributed and induce a significant immunosuppressive effect in infected domestic cats (Felis catus). Proteins with activity against retroviruses are conserved between mammals and determined as restriction factors. Cytidine deaminases of the APOBEC3 gene family are the most studied class of restriction factors and the APOBEC3H gene encodes two proteins (APOBEC3H and APOBEC3CH) that are the most responsible for this restriction among cats, through hypermutations in provirus DNA during reverse transcription. Changes on the gene sequence can alter the stability and cellular localization of homologous proteins to APOBEC3H in mammals. Considering the importance of APOBEC3H gene in cats, the investigation of its variability is relevant. Fifty DNA samples of cats FIV and/or FeLV positives and fifty-nine of negative cats to both viruses were used as template to amplify two different regions of the gene, with subsequent sequencing and analysis. The first investigated region was conserved among all samples. On the second one it was possible to identify six single nucleotide variation points, and of them, the A65S (A65I) was significantly correlated with the susceptibility to FIV and/or FeLV infection. On the other hand, the haplotype analysis showed that the combination “GGGGCC” was significantly correlated with the lack of retroviral infection, maybe indicating a protective effect. Whereas a polymorphism at position 65 have been found in Indochinese Tiger and given the correlation found in this research, more studies about the effect on the activity of restriction factors encoded by the A3H gene should be performed. Similarly, research about the effects of the combination “GGGGCC” should be carried so that we can confirm a possible protective effect shown in this work.

A VP3, ou Apoptina, é uma das proteínas codificadas pelo vírus da anemia infecciosa das galinhas (CAV). Esta proteína é capaz de induzir apoptose em células humanas tumorais; entretanto, o mesmo não ocorre em células normais. Assim, esta proteína apresenta-se como uma promissora candidata como agente antineoplásico. O girovírus aviário 2 (AGV2), descrito em 2011, é relacionado ao CAV e codifica proteínas homólogas às expressas por este vírus, incluindo a VP3. A comparação da sequência de aminoácidos da VP3 do AGV2 com a da Apoptina do CAV revela uma identidade de 32,2% e o compartilhamento de domínios importantes para a atividade pró-apoptótica tumor-especifica. Nesse trabalho objetivamos investigar o potencial de três variantes da VP3 do AGV2 em induzir seletivamente a morte de células humanas tumorais. Os genes das VP3 foram expressos através de um sistema de expressão adenoviral. Após a transdução dos adenovírus recombinantes expressando as VP3 do AGV2 nas células humanas tumorais A549 e normais MRC-5, a localização subcelular dessas proteínas foi analisada por imunofluorescência e suas implicações sobre a viabilidade celular foram determinadas pelo ensaio de MTT. Nossos resultados evidenciam que os adenovírus expressando as variantes da VP3 do AGV2 possuem a habilidade de inibir preferencialmente a proliferação de células tumorais. Demonstramos também que as VP3 do AGV2 acumulam-se no núcleo das células tumorais, enquanto que na maior parte das células normais essas proteínas ficam restritas ao citoplasma. No entanto, inesperadamente detectamos, em menor proporção, a expressão de VP3 do AGV2 também no núcleo das células normais. Ainda, analisando as sequências de aminoácidos das variantes da VP3 do AGV2, pudemos conjecturar que a presença de um sinal de exportação nuclear com menor eficiência do que o existente na Apoptina do CAV pode estar correlacionado com a localização nuclear dessas proteínas nas células normais e com a inibição da proliferação celular verificada nessas células. Este é o primeiro trabalho demonstrando o potencial da proteína VP3 codificada pelo AGV2 em induzir preferencialmente a morte de células humanas tumorais. VP3, also known as Apoptin, is one of the proteins encoded by the chicken anemia virus (CAV). This protein is able to induce apoptosis in tumor cells; however, the same does not occur in normal cells. Thus, this protein appears as a promising candidate for anticancer therapy. The recently discovered avian gyrovirus 2 (AGV2) is related to CAV and encodes CAV-homologous proteins, including VP3. The comparison of the AGV2-VP3 amino acid sequence with CAV-Apoptin shows an identity of 32.2% and the presence of functional domains that seem to be important for its tumor-specific pro-apoptotic activity. In this work, we aim to investigate the potential of three AGV2-VP3 protein variants as inducers of apoptosis in human tumor cells. VP3 genes were expressed through an adenoviral expression system. After transduction of the recombinant adenoviruses expressing the AGV2-VP3 variants in human tumor A549 cells and normal MRC-5 cells, subcellular localization of these proteins was analyzed by immunofluorescence and their effects on cell viability was determined by MTT assay. Our results show that the adenoviruses expressing AGV2-VP3 have the ability to inhibit preferentially the proliferation of tumor cells. We also demonstrate that AGV2-VP3 variants accumulate in the nucleus of tumor cells, whereas in most normal MRC-5 cells these proteins are restricted to cytoplasm. However, we unexpectedly detected the expression of AGV2-VP3 proteins, in a lesser extent, in the nucleus of normal cells. Furthermore, analyzing the amino acid sequences of AGV2-VP3 variants we could speculate that the presence of a nuclear export signal (NES) with a lower efficiency than CAV-Apoptin NES may be correlated to the nuclear localization of these proteins in normal cells and to the cell proliferation inhibition observed in these cells. This is the first study validating the potential of AGV2-VP3 protein to preferably induce death of human tumor cells.