Search

Glioblastoma Multiforme (GBM), yüksek invaziflik ve düşük hayatta kalma ile karakterize IV. derece diffüz gliomadır. Son yıllarda, GBM patogenezinin anlaşılmasında önemli gelişmeler olmasına rağmen, GBM hastalarının ortalama sağ kalım süresi 12-15 ay arasında değişmektedir veGBM tedavisinde yeni ve daha etkili tedavi stratejilerinin geliştirilmesine ihtiyaç duyulmaktadır. Bu tez çalışmasında, radyofrekans (RF)-alan kaynaklı hipertermi maruziyet sisteminin üretimi veüretilen bu cihazla farklı fonksiyonel özellikler kazandırılan nanopartiküllerin RF-alan hipertermi ileetkinliğinin arttırılması ve in vitro koşullarda GBM hücrelerinde (T98G) araştırılması amaçlanmıştır. Bu amaçla, öncelikle, 13,56 MHz frekansta RF-alan hipertermi maruziyet sisteminin tasarımı veüretimi gerçekleştirilmiştir. Daha sonra, alternatif manyetik alan (AMF) ile etkileşerek hedef bölgede ısı oluşumu sağlayacak süperparamanyetik demir oksit nanopartiküller (SPDON'lar) sentezlenmiş ve karakterize edilmiştir. Elde edilen SPDON’lar, PLGA-b-PEG di-blok ko-polimeri ile kaplanarak, poli(laktik-ko-glikolik asit) (PLGA) polimerinin biyobozunur/biyouyumluluk, poli(etilen glikol)'ün (PEG) ise makrofajlarca tanınmama özellikleri ile fonksiyonlandırılmış ve manyetik özellikli PLGA (PLGA+SPDON) nanopartiküller (NP'ler) üretilmiştir. Ardından, PLGA+SPDON NP'leretemozolomid (TMZ) enkapsülasyonu çalışmaları yapılmış, ancak TMZ'nin % enkapsülasyon verimi(%EE, %4) düşük çıktığından, T98G hücrelerinde etkin toksik doz derişimine ulaşılamamıştır. Bu nedenle, etken madde değiştirilerek GBM tedavisi için potansiyel bir ajan olan kurkumin (CUR)çalışılmış ve CUR yüklü manyetik PLGA NP'ler sentezlenerek, bu NP'lere, yüzeylerine fibronektinyapışma sekansı olan glisin-arjinin-glisin-aspartik asit-serin (GRGDS) peptit konjugasyonu ilehücresel alım/hedeflendirme fonksiyonu kazandırılmıştır. Ayrıca, üretilen ve farklı biyo-aktif özellikkazandırılan tüm nanopartiküllerin karakterizasyon işlemleri gerçekleştirilmiştir. Bu aşamadansonra, hücre kültürü deneyleri yapılmıştır ve peptit bağlı CUR yüklü manyetik PLGA NP'ler 6 kat daha az CUR içermesine rağmen CUR yüklü manyetik PLGA NP'ler ile T98G hücreleri üzerinde 24, 48 ve 72. saatlerde MTT analizlerinde benzer toksik etkiler görülmüştür ve 72. saatte bu etkiler canlı/ölü hücre boyama ve Anneksin V/PI analizleri ile desteklenmiştir. Bu durum, GRGDS ilefonksiyonelleştirilmiş PLGA NP'lerin hücresel alım/hedeflendirme başarısıyla açıklanabilir. Ayrıca,RF-hipertermi uygulanan NP'ler, T98G hücrelerinin % canlılık değerlerini RF-hipertermi uygulanmayan PLGA+SPDON, PLGA+SPDON+CUR ve PLGA+SPDON+CUR+GRGDS NP'leregöre istatistiksel olarak anlamlı derecede azaltmıştır. Sonuç olarak, peptit bağlı kurkumin yüklümanyetik PLGA NP'lerin RF-hipertermi ile birlikte glioblastoma tedavisinde etkili bir anti-tümörsistemi olarak kullanılabileceği in vitro deneylerle gösterilmiştir.Anahtar Kelimeler : Hipertermi maruziyet sistemi, radyofrekans, manyetik nanopartikül, HUVEC, T98G, glioblastoma, RGD, kurkumin, TMZ, PLGA, PEG Glioblastoma Multiforme (GBM) is characterized by high invasiveness and low survival IV. degreediffuse glioma. In recent years, despite significant improvements in understanding the pathogenesis of GBM, the average overall survival of GBM patients varies between 12-15 months, so new andmore effective treatment strategies need to be developed in GBM treatment. In this thesis, it is aimed to produce hyperthermia exposure system originated from the radiofrequency (RF)-field and to increase the effectiveness of nanoparticles with different functional properties with this device toinvestigate in GBM cells (T98G) in vitro conditions. For this purpose, firstly, the design andproduction of RF-field hyperthermia exposure system at 13,56 MHz frequency was realized.Subsequently, superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPIONs) were synthesized and characterized, which would interact with the alternating magnetic field (AMF) to generate heat in the target area. The obtained SPIONs were coated with PLGA-b-PEG di-block co-polymer which functionalized due to both biodegradability/biocompatibility of poly (lactic-co-glycolic acid)(PLGA) polymer and the non-recognition properties of poly (ethylene glycol) (PEG) bymacrophages, and then magnetic PLGA (PLGA+SPDON) nanoparticles (NPs) were produced. Afterwards, temozolomide (TMZ) encapsulation studies were performed on PLGA+SPDON NPs, but effective toxic dose concentration could not be achieved in T98G cells since TMZ's % encapsulation efficiency (EE%, 4%) was low. Therefore, curcumin (CUR), a potential agent for GBM treatment, was studied by changing the active ingredient, and CUR-loaded magnetic-PLGA NPs were synthesized, and these NPs were provided with cellular uptake/targeting function by their glycine-arginine-glycine-aspartic acid-serine (GRGDS) peptide conjugation on their surface. In addition, characterization processes of all nanoparticles produced and brought into different bioactiveproperties were carried out. After this, cell culture experiments were conducted and although thepeptide-bound CUR-loaded magnetic-PLGA NPs contained 6 times less CUR than CUR-loaded magnetic-PLGA NPs, they showed similar toxic effects on T98G cells at 24, 48 and 72 hours in MTTanalysis, and at 72 hours, these effects were supported by live/dead staining and Anneksin V/PI analysis. This can be explained by the cellular uptake/targeting success of PLGA NPs functionalizedwith GRGDS. In addition, NPs applied RF-hyperthermia statistically significant reductions in PLGA+SPDON, PLGA+SPDON+CUR and PLGA+SPDON+CUR+GRGDS NPs were observed inthe % cell viability of T98G cells compared to NPs without RF-hyperthermia. In conclusion, in vitroexperiments have been shown that peptide-bound CUR-loaded magnetic-PLGA NPs can be used as an effective anti-tumor system in the treatment of glioblastoma with RF-hyperthermia.Key Words : Hyperthermia exposure system, radiofrequency, magnetic nanoparticle,HUVEC, T98G, glioblastoma, RGD, curcumin, TMZ, PLGA, PEG

Radyofrekans (RF) ve Mikrodalga (MW) radyasyona kısa süreli ya da uzun süreli maruziyetler; toplum ve çevre sağlığı üzerindeki olumlu/olumsuz sağlık ve biyolojik etkileri ya da oluşturabilecekleri riskler açısından henüz netlik kazanamamış, tartışmaya açık konular arasında yer alsa dahi Dünya Sağlık Örgütü (WHO), Uluslararası Kanser Araştırma Ajansı (IARC) tarafından 2011 yılında RF alanları insanlarda kanser oluşturması mümkün olan Grup 2B sınıfına dahil etmiştir. Kanser gelişim süresinde; tümör baskılayıcı fonksiyon, DNA onarımı ve apoptoz kritik önem taşımaktadır. Kanser hücreleri bu süreçte programlanmış hücre ölümüne karşı direnç geliştirmektedir. Bu nedenle, radyo frekans alanların kanserin oluşumu ya da tedavi edici etkisinin araştırılması söz konusu olduğunda; öncelik, Elektromanyetik (EM) alanların apoptoz mekanizması üzerindeki olası etkilerini araştırmak yaklaşımlardan biri olmalıdır. Çalışmada, insan kolorektal adenokarsinoma hücre hattı olan HT-29 hücreleri kullanıldı. HT-29 hücreleri, farklı frekanslarda [1800 MHz; 2100 MHz; 2600 MHz] ve farklı uygulama sürelerinde (3 saat sürekli, 6 saat kesikli [3saat RF Alan Maruziyet sistemi açık /1saat RF Alan Maruziyet sistemi kapalı/3saat RF Alan Maruziyet sistemi açık], 6 saat sürekli) RF Alanlara maruz bırakılarak, programlı hücre ölümü yolağı ve sağkalım mekanizmalarında aktif rol oynayan 4 Kaspazın [Başlatıcı Kaspaz (Kaspaz-8; Kaspaz-9), Uyarıcı Kaspaz (Kaspaz-3) ve Yangı Kaspaz (Kaspaz-12)] gen ifadelenme düzeyleri kantitatif real time PCR yöntemi ile SYBR Green I boyası kullanılarak analiz edilmiştir. Kaspaz-bağımlı apoptoz süreci değerlendirildiğinde; 2100 MHz RF radyasyonun uygulanan 3 saat sürekli ve 6 saat kesikli maruziyet sürelerinde Başlatıcı Kaspazlar olan Kaspaz-8 ve Kaspaz-9' un gen ifadelenme düzeyinde anlamlı seviyede artış olduğu tespit edilmiştir. Kaspaz-3' ün gen ifadelenme düzeyinin ise sadece 6 saat kesikli maruziyet süresinde anlamlı bir artış gösterdiği tespit edilmiştir. Bu doğrultuda; 2100 MHz RF radyasyonun hem ölüm reseptör yolağı Başlatıcı Kaspazı olan Kaspaz-8' i, hem de iç mitokondriyal yolağı Başlatıcı Kaspazı olan Kaspaz-9' u aktive edebileceği, Başlatıcı Kaspazların 3 saat maruziyet sonrasında Uyarıcı Kaspaz olan Kaspaz-3' ü aktive edebileceği yönünde bir görüş belirtilebilmektedir. Ancak; Kaspaz-12' nin gen ifadelenme düzeyinde kendi negatif kontrol ve sham gruplarına göre bir değişim olmaması, Kaspaz-9 ve Kaspaz-3 aktivasyonunun Endoplazmik Retikulum Stresine bağlı gelişen bir apoptoz olmadığını göstermektedir. Apoptoz birçok patolojik ve fizyolojik olayda etkin rol almaktadır. Bu nedenle apoptotik sürece müdahale ederek yeniden düzenlenmesi, önemli tedavi yöntemlerini gündeme getirebilmektedir. Bu tez çalışması, Gazi Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri (BAP) Birimi tarafından desteklenen 01/2013-17 proje kodlu Doktora Tez projesinden temin edilen Hücre Hattı ve Hücre Hattına ait Besiyeri; 01/2013-17 proje kodlu Doktora Tez projesi ile eş zamanlı çalışılması planlanan 01/2015-10 proje kodlu Bağımsız Araştırma projesinden temin edilen Kaspaz gen ekspresyon kitleri, Hücre Hattına ait Besiyeri ve laboratuvar sarf malzemeleri kullanılarak tamamlanmıştır. Although effects of exposure to radiofrequency (RF) and microwave (MW) radiation for short and long periods of time on environmental health and community health have not been clarified yet; World Health Organisation (WHO) and International Agency for Research on Cancer (IARC) included exposure to RF fields in Group 2B, which can cause cancer in 2011. Tumor suppressing function, DNA repair and apoptosis have critical importance in the developmental period of cancer. In this process, cancer cells develop resistance to programed cell death. Therefore, when it comes to researching the cancer causing or curing effects of radio frequency fields, an approach to be adopted should be to first study the probable effects of EM fields on apoptosis mechanism. This study uses HT-29 cells- which is a human colorectal adenocarcinoma cell line. HT-29 cells were analysed in differing frequencies [1800 MHz; 2100 MHz; 2600 MHz] and by exposing the respondents to RF fields in differing lengths of application (3 hours continuously, 6 hours discontinuously [RF field exposition system is on for 3 hours/ it is off for 1 hour/ it is on for 3 hours], 6 hours continuously) and by analysing the expression of caspases (caspase-8; caspase-9, caspase-3 and caspase-12) which play active roles in cell death path and in survival mechanisms through real time PCR method. It was found gene expression level of initiator caspases (caspases-8 and caspases-9) significantly increased when 2100 MHz RF radiation was applied for 3 hours continuously and 6 hours intermittently. Caspase-3 gene expression levels were, however, found to increase significantly only during 6 hour intermittent exposure. Accordingly, it can be said that 2100 MHz RF radiation can activate both caspase-8 - death receptor path starter- and caspase-9 internal mitochondrial path starter caspase,- and that the starter caspases can activate caspase-3 after 3 hours of exposure. Yet, the fact that there was no change in gene expression levels of caspase-12 according to its own negative control and sham groups indicated that caspase-9 and caspase-3 activation was not developing apoptosis due to endoplasmic reticulum stress. Apoptosis plays active roles in many pathological and physiological actions. Therefore, interfering in the apoptotic process and re-arranging it can bring new methods of treatment into discussion. This thesis was completed by using Cell Line and Cell Line Medium obtained from the project for doctoral thesis supported by Gazi University Unit of Scientific Research Projects and carrying the project code of 01/2013-17 and from Caspase Gene Expression Kids, Cell Line Medium and Laboratory Consumables- an independent research project with the project code of 01/2015-10 and which was planned to be conducted synchronally with doctoral thesis project carrying the project number 01/2013-17.

Dunya cap.nda artan kanser oranlar. ve cep telefonu, baz istasyonu gibi insan eliyle uretilen RF alan kaynaklar.n.n art.s. aras.nda iliski olup olmad... bilim dunyas. kadar halk taraf.ndan da merak edilen konular aras.ndad.r. Bu cal.smada, 15 dakikal.k aral.klarla, kesikli sekilde uygulanan GSM-EDGE (Global Mobil .letisim Evrimi icin Genisletilmis Veri Aktar.m Oranlar.) modulasyonlu 900 MHz ve 1800 MHz frekansl. RF (Radyo Frekans) alanlar.n (10 V/m, uzak alan) 1 saat, 2 saat, 3 saat ve 4 saat suresinde HepG2 (Hepatoselluler Karsinom) hucrelerinin canl.l...na etkisi arast.r.ld.. Hep G2 hucre canl.l..., tetrazolum tuzu WST-1 fin mitokondriyal dehidrogenaz enzim aktivitesi sonucunda formazana donusmesi ilkesine dayanan spektrofotometrik test ile saptand.. Hucre hasar. gostergesi olan LDH ve glukoz seviyesi hucre supernatantlar.nda kalorimetrik analiz kiti kullan.larak saptand.. Morfolojik incelemeler mavi floresan 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) nukleik asit boyas. ile 400 kat buyutulen floresan mikroskop alt.nda incelendi. Hucre canl.l.k testleri sonucunda, 1800 MHz RF alan.n 1 saat sureyle 15 dakikal.k aral.klarla uygulanmas.n.n hucre canl.l...nda art.sa neden oldu.u goruldu (p

Radyofrekans (RF) ve Mikrodalga (MW) radyasyona kısa süreli ya da uzun süreli maruziyetler; toplum ve çevre sağlığı üzerindeki olumlu/olumsuz sağlık ve biyolojik etkileri ya da oluşturabilecekleri riskler açısından henüz netlik kazanamamış, tartışmaya açık konular arasında yer alsa dahi Dünya Sağlık Örgütü (WHO), Uluslararası Kanser Araştırma Ajansı (IARC) tarafından 2011 yılında RF alanları insanlarda kanser oluşturması mümkün olan Grup 2B sınıfına dahil etmiştir. Kanser gelişim süresinde; tümör baskılayıcı fonksiyon, DNA onarımı ve apoptoz kritik önem taşımaktadır. Kanser hücreleri bu süreçte programlanmış hücre ölümüne karşı direnç geliştirmektedir. Bu nedenle, radyo frekans alanların kanserin oluşumu ya da tedavi edici etkisinin araştırılması söz konusu olduğunda; öncelik, Elektromanyetik (EM) alanların apoptoz mekanizması üzerindeki olası etkilerini araştırmak yaklaşımlardan biri olmalıdır. Çalışmada, insan kolorektal adenokarsinoma hücre hattı olan HT-29 hücreleri kullanıldı. HT-29 hücreleri, farklı frekanslarda [1800 MHz; 2100 MHz; 2600 MHz] ve farklı uygulama sürelerinde (3 saat sürekli, 6 saat kesikli [3saat RF Alan Maruziyet sistemi açık /1saat RF Alan Maruziyet sistemi kapalı/3saat RF Alan Maruziyet sistemi açık], 6 saat sürekli) RF Alanlara maruz bırakılarak, programlı hücre ölümü yolağı ve sağkalım mekanizmalarında aktif rol oynayan 4 Kaspazın [Başlatıcı Kaspaz (Kaspaz-8; Kaspaz-9), Uyarıcı Kaspaz (Kaspaz-3) ve Yangı Kaspaz (Kaspaz-12)] gen ifadelenme düzeyleri kantitatif real time PCR yöntemi ile SYBR Green I boyası kullanılarak analiz edilmiştir. Kaspaz-bağımlı apoptoz süreci değerlendirildiğinde; 2100 MHz RF radyasyonun uygulanan 3 saat sürekli ve 6 saat kesikli maruziyet sürelerinde Başlatıcı Kaspazlar olan Kaspaz-8 ve Kaspaz-9' un gen ifadelenme düzeyinde anlamlı seviyede artış olduğu tespit edilmiştir. Kaspaz-3' ün gen ifadelenme düzeyinin ise sadece 6 saat kesikli maruziyet süresinde anlamlı bir artış gösterdiği tespit edilmiştir. Bu doğrultuda; 2100 MHz RF radyasyonun hem ölüm reseptör yolağı Başlatıcı Kaspazı olan Kaspaz-8' i, hem de iç mitokondriyal yolağı Başlatıcı Kaspazı olan Kaspaz-9' u aktive edebileceği, Başlatıcı Kaspazların 3 saat maruziyet sonrasında Uyarıcı Kaspaz olan Kaspaz-3' ü aktive edebileceği yönünde bir görüş belirtilebilmektedir. Ancak; Kaspaz-12' nin gen ifadelenme düzeyinde kendi negatif kontrol ve sham gruplarına göre bir değişim olmaması, Kaspaz-9 ve Kaspaz-3 aktivasyonunun Endoplazmik Retikulum Stresine bağlı gelişen bir apoptoz olmadığını göstermektedir. Apoptoz birçok patolojik ve fizyolojik olayda etkin rol almaktadır. Bu nedenle apoptotik sürece müdahale ederek yeniden düzenlenmesi, önemli tedavi yöntemlerini gündeme getirebilmektedir. Bu tez çalışması, Gazi Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri (BAP) Birimi tarafından desteklenen 01/2013-17 proje kodlu Doktora Tez projesinden temin edilen Hücre Hattı ve Hücre Hattına ait Besiyeri; 01/2013-17 proje kodlu Doktora Tez projesi ile eş zamanlı çalışılması planlanan 01/2015-10 proje kodlu Bağımsız Araştırma projesinden temin edilen Kaspaz gen ekspresyon kitleri, Hücre Hattına ait Besiyeri ve laboratuvar sarf malzemeleri kullanılarak tamamlanmıştır. Although effects of exposure to radiofrequency (RF) and microwave (MW) radiation for short and long periods of time on environmental health and community health have not been clarified yet; World Health Organisation (WHO) and International Agency for Research on Cancer (IARC) included exposure to RF fields in Group 2B, which can cause cancer in 2011. Tumor suppressing function, DNA repair and apoptosis have critical importance in the developmental period of cancer. In this process, cancer cells develop resistance to programed cell death. Therefore, when it comes to researching the cancer causing or curing effects of radio frequency fields, an approach to be adopted should be to first study the probable effects of EM fields on apoptosis mechanism. This study uses HT-29 cells- which is a human colorectal adenocarcinoma cell line. HT-29 cells were analysed in differing frequencies [1800 MHz; 2100 MHz; 2600 MHz] and by exposing the respondents to RF fields in differing lengths of application (3 hours continuously, 6 hours discontinuously [RF field exposition system is on for 3 hours/ it is off for 1 hour/ it is on for 3 hours], 6 hours continuously) and by analysing the expression of caspases (caspase-8; caspase-9, caspase-3 and caspase-12) which play active roles in cell death path and in survival mechanisms through real time PCR method. It was found gene expression level of initiator caspases (caspases-8 and caspases-9) significantly increased when 2100 MHz RF radiation was applied for 3 hours continuously and 6 hours intermittently. Caspase-3 gene expression levels were, however, found to increase significantly only during 6 hour intermittent exposure. Accordingly, it can be said that 2100 MHz RF radiation can activate both caspase-8 - death receptor path starter- and caspase-9 – internal mitochondrial path starter caspase,- and that the starter caspases can activate caspase-3 after 3 hours of exposure. Yet, the fact that there was no change in gene expression levels of caspase-12 according to its own negative control and sham groups indicated that caspase-9 and caspase-3 activation was not developing apoptosis due to endoplasmic reticulum stress. Apoptosis plays active roles in many pathological and physiological actions. Therefore, interfering in the apoptotic process and re-arranging it can bring new methods of treatment into discussion. This thesis was completed by using Cell Line and Cell Line Medium obtained from the project for doctoral thesis supported by Gazi University Unit of Scientific Research Projects and carrying the project code of 01/2013-17 and from Caspase Gene Expression Kids, Cell Line Medium and Laboratory Consumables- an independent research project with the project code of 01/2015-10 and which was planned to be conducted synchronally with doctoral thesis project carrying the project number 01/2013-17. 132

Dünya çapında artan kanser oranları ve cep telefonu, baz istasyonu gibi insan eliyle üretilen RF alan kaynaklarının artışı arasında ilişki olup olmadığı bilim dünyası kadar halk tarafından da merak edilen konular arasındadır. Bu çalışmada, 15 dakikalık aralıklarla, kesikli şekilde uygulanan GSM-EDGE (Global Mobil İletişim Evrimi için Genişletilmiş Veri Aktarım Oranları) modülasyonlu 900 MHz ve 1800 MHz frekanslı RF (Radyo Frekans) alanların (10 V/m, uzak alan) 1 saat, 2 saat, 3 saat ve 4 saat süresinde HepG2 (Hepatosellüler Karsinom) hücrelerinin canlılığına etkisi araştırıldı. Hep G2 hücre canlılığı, tetrazolum tuzu WST-1'in mitokondriyal dehidrogenaz enzim aktivitesi sonucunda formazana dönüşmesi ilkesine dayanan spektrofotometrik test ile saptandı. Hücre hasarı göstergesi olan LDH ve glukoz seviyesi hücre süpernatantlarında kalorimetrik analiz kiti kullanılarak saptandı. Morfolojik incelemeler mavi floresan 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) nükleik asit boyası ile 400 kat büyütülen floresan mikroskop altında incelendi. Hücre canlılık testleri sonucunda, 1800 MHz RF alanın 1 saat süreyle 15 dakikalık aralıklarla uygulanmasının hücre canlılığında artışa neden olduğu görüldü (p