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While most national constitutions today enumerate national emergency procedures, Japan remains an exception. However, the recent onset of major natural disasters and crises, including the 2011 Great East Japan Earthquake and the 2020 COVID-19 pandemic, has prompted calls to amend the Constitution of Japan (COJ) to explicitly specify emergency protocols. Both government and opposition parties have argued that the COJ currently prevents the government from taking necessary actions to facilitate disaster response in a timely way, including enforced lockdowns, stay-at-home orders, and vaccine mandates. Existing surveys suggest that there is strong public support for emergency provisions in constitutions. However, these studies rarely ask about the concrete details of such provisions. These include (1) the conditions under which emergencies can be declared; (2) sunset clauses and oversight procedures; (3) what enhanced powers are given to central versus local governments. Our survey experiment examines how voters trade off these components, with the goal of understanding whether voters have a comprehensive "ideal type" of national emergency procedures. Specifically, we randomize the order in which voters make decisions on these three components to assess the effects of different "veils of ignorance" regarding who should have what levels of power.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Il devient de plus en plus clair que pour traiter efficacement les tumeurs solides, nous devons également nous intéresser au microenvironnement tumoral. Physiologiquement, les zones intratumorales peuvent présenter une disponibilité anormale en nutriments, un pH altéré ou encore des niveaux d’oxygène bas (hypoxie). Il est connu que l’adaptation hypoxique engendre des cellules tumorales qui sont plus difficiles à traiter indépendamment de l’approche thérapeutique. De plus, l’adaptation hypoxique est nécessaire pour la progression tumorale puisque cette dernière favorise des processus tels que: la survie cellulaire, la motilité, l’angiogenèse, le métabolisme du glucose, l’immunomodulation ainsi que la résistance aux médicaments. Ces phénotypes passent par la régulation des ARN messager (ARNm) et des micro ARN (miARN). Pour ces raisons, des efforts importants ont été déployés pour comprendre l’adaptation hypoxique et les interventions thérapeutiques potentielles pouvant la contrer. À l’heure actuelle, il y a un manque de cohérence et de variété dans les protocoles de traitement hypoxique in vitro qui ne tient pas compte des aspects importants de l’hypoxie in vivo, comme la réduction de la disponibilité en éléments nutritifs, la durée de l’exposition hypoxique ainsi que le degré d’hypoxie. Pour mieux simuler le microenvironnement hypoxique in vivo, nous avons développé de nouveaux protocoles hypoxiques in vitro qui visent à simuler ces aspects. Tout d’abord, en utilisant une lignée cellulaire B16-HIF1a-eGFP, nous avons optimisé le stress métabolique à court terme en conjonction avec l’hypoxie pour augmenter la stabilisation de l’HIF1a. Pour déterminer comment le programme HIF1 adapte les cellules à ces différentes conditions, nous avons analysé les données de séquencage d’ARN qui démontrent que le stress métabolique induit un programme transcriptionnel HIF1 plus robuste et diversifié dans les cellules hypoxiques, et que ce dernier est représentatif du stress hypoxique in vivo. Nous avons également identifié de nouveaux miARN induits par l’hypoxie et démontré que notre protocole d’incubation régule davantage les miRNA associés au pronostic négatif du patient. Nous avons aussi étudié l’adaptation hypoxique à long terme et extrême in vitro. Nous avons observé que l’incubation hypoxique à long terme induit une transition épithéliale à mésenchymateuse (TME), indépendante de l’expression différentielle des facteurs de transcription du TME canonique. Ce changement se produit à des niveaux spécifiques d’oxygène, et nécessite une pré-incubation à des niveaux hypoxiques plus faible. Avec ce protocole, nous avons découvert une nouvelle isoforme de WT1 (tWT1), un moteur potentiel du TME. tWT1 commence la transcription dans l’intron 5 du gène WT1, une région avec plusieurs séquences d’ADN contenant des éléments de réponse à l’hypoxie. La protéine tWT1 a une fonctionnalité limitée : elle est localisée au niveau du noyau, et conserve la liaison de l’ADN aux régions précédemment connues. Nous avons aussi identifié l’expression de tWT1 dans les échantillons de patients atteints de leucémie ainsi qu’une isoforme tWT1 potentiellement plus fonctionnelle grâce à des analyses par kmer. Pour cibler ces phénotypes identifiés dans nos expériences d’adaptation hypoxiques, nous avons développé une nouvelle catégorie d’ARN intérférent (ARNi) thérapeutique : le microARN synthétique (synmiR). Les synmiR sont des molécules de RNAi avec des multiples cibles. En utilisant des expériences in vivo, nous avons établi de nouveaux principes de RNAi qui élargissent considérablement l’espace de conception pour les synmiR. Nous avons mis au point deux algorithmes de conception de synmiR distincts et avons testé leur efficacité dans le contrôle de l’activité transcriptionnelle du génome du VIH in vivo. En conclusion, nous avons montré que l’inclusion de facteurs physiologiques supplémentaires associés à l’hypoxie in vitro entraîne un engagement plus robuste de l’adaptation de l’hypoxie. À ce jour, aucun de nos protocoles d’hypoxie n’a été reproduit dans la littérature. Nous contribuons aux connaissances dans le domaine en décrivant les nouveaux ARNm/miARN induits par l’hypoxie, ainsi que la méthode d’induction fiable de l’EMT par l’hypoxie seulement. Nous faisons également état de l’existence de nouveaux isoformes de WT1 et de leurs liens avec le cancer et l’hypoxie. La connaissance de ces isoformes est importante pour l’avenir de la recherche sur WT1, car elle pourrait faire la lumière sur des résultats auparavant inexplicables. Notre travail dans les synmiR ouvre une nouvelle voie d’investigation pour le traitement de certaines maladies, et fournit un mécanisme d’action testable pour les miRNA endogènes. Une fois suffisamment développés, les synmiR offrent une occasion thérapeutique unique d’exploiter leur multi-ciblage pour avoir un impact spectaculaire sur une seule voie, ou affecter plusieurs voies par le ciblage simultané de gènes clés., It is becoming increasingly clear that in order to effectively treat solid tumours, we must also address the tumour microenvironment. Physiologically, intratumoral areas may have abnormal nutrient availability, pH, or lower oxygen levels (hypoxia). It is known that hypoxic adaptation results in tumour cells which are harder to treat regardless of therapeutic approach, and hypoxic adaptation is necessary for disease progression due to the induction of tumour promoting phenotypes such as, but not limited to: cell survival, motility, angiogenesis, glucose metabolism, immunomodulation, and drug resistance. This is accomplished through the regulation of both mRNAs and miRNAs. For these reasons, significant effort has been applied to understanding hypoxic adaptation and potential therapeutic interventions. Currently, there is a lack of consistency and protocol variety in in vitro hypoxic treatments that leaves out important aspects of in vivo hypoxia, such as reduced nutrient availability, length of hypoxic exposure, and degree of hypoxia. To better simulate the in vivo hypoxic microenvironment, we have developed new in vitro hypoxic protocols which aim to simulate these aspects. First, using a B16-HIF1α-eGFP hypoxia reporter cell line, we optimized short-term metabolic stress in conjunction with hypoxia to enhance HIF1α stabilization. To ascertain how the HIF1 program adapts the cells to these different conditions, deep transcriptome profiling were performed and demonstrated metabolic stress induces a more robust and diversified HIF1 transcriptional program in cells under hypoxia, which was more representative of in vivo hypoxic stress. We identified novel hypoxia-induced miRNAs as well, and demonstrated our incubation protocol regulated more miRNAs associated with negative patient prognosis. We also investigated long-term and extreme hypoxic adaptation in vitro. Long term hypoxic incubation induced a epithelial to mesenchymal transition (EMT), independent of canonical EMT factor differential expression. This switch occurred at specific oxygen levels, and required pre-incubation at milder hypoxic levels, highlighting the relevance of simulating in vivo hypoxia development in vitro. Through this protocol, we discovered a novel isoform of WT1 (tWT1), a potential driver of our EMT. tWT1 begins transcription within intron 5 of the WT1 gene, a region with several Hypoxia Response Elements DNA sequences. tWT1 retains limited functionality: it is able to localize to the nucleus, and retains DNA binding to previously known gene promoter regions. We also identified the expression of tWT1 in leukemic patient samples as well as a potentially more functional tWT1 isoform through kmer-based analyses. To target these multiple phenotypes identified in our hypoxia adaptation experiments, we worked towards developing a new category of RNA-interference (RNAi) therapeutic, the synthetic microRNA (synmiR). SynmiRs are single-sequence, multi-targeted RNAi molecules. Using in vivo knock-down experiments, we established new RNAi principles which dramatically expand the design space for synmiRs. We developed two philosophically distinct synmiR design algorithms, and validated their efficacy in controlling HIV genome transcriptional activity in vivo. In conclusion, we have shown the inclusion of additional physiological factors associated with hypoxia in vitro results in a more robust engagement of hypoxia adaptation. To date, neither of our hypoxia protocols have been replicated in the literature. We contribute to the literature by describing novel hypoxia induced mRNAs/miRNAs, as well as methods for reliably inducing EMT through hypoxia alone. We also discovered the existence of novel WT1 isoforms and their links to cancer and hypoxia. Knowledge of these isoforms is important for WT1 research moving forward, as it may shed light on previously unexplainable results. Our work in synmiRs opens a new therapeutic avenue for multiple disease states, and provides a testable mechanism of action for endogenous miRNAs. Once sufficiently developed, synmiRs offer a unique therapeutic opportunity to harness their multi-targeting to dramatically impact a single pathway, or affect multiple pathways through simultaneous targeting of key genes.

La reconnaissance du peptide lié au complexe majeur d’histocompatibilité (pCMH) par les cellules T CD8+ et leur récepteur spécifique (TCR) est une étape cruciale dans l’établissement d’une réponse immunitaire protectrice adéquate et de longue durée. L’engagement du TCR engendre une cascade d’évènements de signalisation qui contrôle la prolifération, la différenciation et les fonctions effectrices des lymphocytes T CD8+ (LT8). Différentes études suggèrent un rôle crucial du zinc dans la biologie des LT8, particulièrement l’observation d’un influx de zinc suivant l’engagement du TCR. De plus, la multitude de transporteurs contrôlant homéostasie du zinc au sein des LT8, couplé aux multiples rôles de cet ion dans les processus cellulaires nous a amené à concentrer notre recherche sur le rôle du zinc dans les cellules T CD8+, qui à ce jour n’est que peu décrit. ZIP13, un des 14 transporteurs contrôlant l’homéostasie du zinc chez les LT8 murins, régule l’activation, la prolifération et la différenciation de ces cellules. En effet, une diminution de l’expression de ZIP13 (ZIP13-KD) en utilisant un petit ARN en épingle à cheveux (shRNA) entraîne une activation précoce exacerbée des LT8 se traduisant par une plus grande prolifération. Ceci a été démontré in vitro dans des lignées d’hybridomes CD8+, mais également chez les LT8 primaires murins (OT-I). De plus, cette hyperactivation est suivie par une perte substantielle des cellules, démontrant un rôle pour ZIP13 de régulateur positif de la survie des cellules T CD8+. L’étude d’une modulation de l’expression de ZIP13 chez les cellules primaires OT-I in vivo dans un modèle d’infection aiguë à Listeria monocytogenes souligne des rôles additionnels de ce gène dans la différenciation des populations effectrices des LT8. Les LT8 ZIP13-KD montrent un biais de différenciation vers la population de cellules effectrices précoces (EEC) au détriment des autres populations effectrices, ainsi qu’une diminution de Ly6C dans les organes lymphoïdes secondaires (SLO). Au site de l’infection, les cellules ZIP13-KD sont enrichies en précurseur de cellules T CD8+ résidentes mémoires (pré-Trm). ZIP13 joue également un rôle dans la formation de la mémoire immunologique puisque les cellules ZIP13-KD ne forment pas de cellules T CD8+ centrales mémoires (Tcm) dans les ganglions lymphatiques. Ces observations sont, corrélées avec une diminution drastique du marqueur de surface CD62L. Ceci se traduit par des cellules OT-I ZIP13-KD formant une mémoire immunologique uniquement composée LT8 effecteurs mémoires (Tem) et de LT8 résidents mémoires (Trm). Finalement, des analyses transcriptomiques des OT-I ZIP13-KD au stade effecteur de la réponse à une infection à Lm-OVA identifient des signatures de gènes associées aux LT8 épuisés et aux cellules Tc17. Nos résultats soulignent l’importance d’une régulation stricte et précise de l’homéostasie du zinc dans les cellules T CD8+ par des transporteurs spécifiques pour une réponse immunitaire adéquate. ZIP13 est le premier transporteur étudié dans le contexte d’une infection aiguë et identifié comme crucial pour la différenciation des populations effectrices ainsi que la formation de la mémoire immunitaire, ajoutant de l’importance à la régulation du zinc dans la biologie des LT8. Une connaissance précise de l’homéostasie spatiotemporelle du zinc dans les LT8 identifierait de nouveaux mécanismes de régulation de ces cellules qui pourrait mener potentiellement au développement de nouveaux outils pour des immunothérapies à base de cellules T génétiquement modifiées., CD8+ T cell activation via the recognition of peptide-loaded major histocompatibility complex (pMHC) by the T cell receptor (TCR) is crucial for the establishment of a long lasting and protective immune response. TCR triggering induces a cascade of signaling events controlling T cell effector function and differentiation. The multitude of genes controlling zinc homeostasis in T cells, and the observation of an influx of zinc following TCR activation point towards a link between the regulation of zinc homeostasis and CD8+ T cell biology. This growing body of evidence led us to focus our research on zinc homeostasis in T cells, which remains poorly understood. With this study, we have shown that ZIP13, one of the many transporters controlling zinc homeostasis, significantly regulates T cell activation and differentiation following activation. Knockdown (KD) of ZIP13 by shRNA led to a substantial increase in early activation, both in murine CD8+ T cell lines and primary mouse OT-I cells in vitro. Subsequently, this increase in T cell activation is followed by a massive loss of these cells days after activation, highlighting an addition role for ZIP13 in T cell survival. Study of ZIP13 in primary CD8+ T cells in an in vivo acute infection model of Listeria monocytogenes highlights new roles of ZIP13 in the control of effector T cell differentiation. ZIP13-KD in CD8+ T cells alter the normal effector cell differentiation pattern; favoring the early effector cells (EEC) subset and induces a decrease in the surface marker Ly6C in secondary lymphoid organs. At the site of infection, ZIP13-KD CD8+ T cells are enriched in resident memory T cells precursor (pre-Trm). ZIP13 has also an impact on memory T cell formation, since ZIP13-KD cells are lacking the central memory population (Tcm), through the drastic decrease of the surface marker CD62L. This results in ZIP13-KD cells at the memory stage that are mostly composed of effector memory (Tem) and resident memory (Trm) cells. Finally, transcriptomic analyses of WT CD8+ T cells and ZIP13-KD CD8+ T cells at the effector stage demonstrates ZIP13’s role in driving an exhausted T cell and Tc17 cell gene expression signature. Taken together, our results point to the importance of a strict and fine-tuned regulation of zinc homeostasis in T cells through specific zinc transporters for an effective immune response. ZIP13 is the first zinc transporter reported as essential for T cell differentiation and memory formation, adding weight to the importance of zinc regulation in CD8+ immune responses. Having a clear picture of zinc homeostasis in CD8+ T cells would reveal new mechanisms regulating the activity of these cells that could potentially lead to the development of new tools for T cell-based immunotherapy.

Les lymphocytes T orchestrent la réponse immunitaire adaptative afin de nous protéger contre les pathogènes. Les lymphocytes T sont dotés d’un récepteur de surface, le récepteur de cellules T (TCR), qui transmet le signal de stimulation vers l’intérieur de la cellule afin d’amorcer la cascade d’activation des cellules T. Le TCR est un complexe multimérique composé des dimères TCRαβ, CDεγ, CD3εδ et CD3ζζ. Les chaînes TCRαβ reconnaissent les antigènes pathogéniques tandis que les chaînes CD3 initient la cascade de signalisation des cellules T par la phosphorylation de leurs chaînes cytoplasmiques. Il est toujours incompris comment le signal d’activation du TCR est transmis des chaînes TCRαβ jusqu’aux domaines cytoplasmiques des chaînes CD3. Chez les lymphocytes T au repos, les chaînes CD3ε et CD3ζ sont associées au feuillet interne de la membrane plasmique (MP). Le domaine cytoplasmique de CD3ε et CD3ζ est riche en acides aminés basiques, ce qui permet leur association électrostatique avec les phospholipides acides de la MP. La phosphatidylsérine (PS) est le phospholipide acide le plus abondant de la MP. La PS est redistribuée exclusivement à la face cytoplasmique de la MP. Lors de l’activation des lymphocytes T, les chaînes CD3ε et CD3ζ des TCRs doivent se détacher de la PS pour leur phosphorylation. La dissociation membranaire d’un grand nombre de chaînes CD3 est essentielle à l’amplification de l’activation des lymphocytes T. Un mécanisme de dissociation des chaînes CD3ε et CD3ζ des TCRs proposé dans la littérature est par l’élévation intracellulaire de calcium. Un influx robuste de calcium est généré suivant la stimulation des cellules T. En plus d’être essentiel à l’activation efficace des cellules T, il a été proposé que le calcium neutralise les phospholipides acides de la MP afin de dissocier les chaînes CD3. Le calcium est également un co-facteur dans l’activité de plusieurs enzymes, comme la scramblase lipidique TMEM16F. TMEM16F redistribue la PS à la MP suivant l’élévation du calcium intracellulaire, ce qui résulte en la réduction de la PS au feuillet interne. Nous avons donc émis l’hypothèse que le calcium régule la dissociation des chaînes CD3 par l’activation de TMEM16F. Notre étude démontre que la redistribution calcium-dépendante de la PS par TMEM16F est essentielle à la dissociation membranaire de CD3ε dans la lignée de cellules T Jurkat. La réduction de l’expression de TMEM16F par ARN interférant (shTMEM16F) empêche la dissociation massive des chaînes CD3ε suivant la stimulation des cellules T. De plus, les cellules shTMEM16F démontrent une diminution de la phosphorylation des molécules de signalisation des cellules T. En contraste, l’expression d’une forme constitutivement active de TMEM16F augmente la redistribution de PS à la MP, la dissociation membranaire des chaînes CD3ε et la phosphorylation des molécules de signalisation. Notre étude démontre que la redistribution de la PS par la scramblase calcium-dépendante TMEM16F régule la dissociation membranaire des chaînes CD3 du TCR afin d’amplifier l’activation des cellules T. Enfin, nous avons confirmé les défauts d’activation dans des cellules T murines primaires exprimant shTMEM16F lors d’une réponse immunitaire. En conclusion, notre étude démontre le rôle de la régulation de la PS dans l’activation des cellules T. Nous avons démontré que nous pouvons modifier le niveau d’activation des cellules T en modulant la PS à la MP. Nos résultats ont ainsi plusieurs implications pour la conception et l’amélioration des immunothérapies basées sur les cellules T., T lymphocytes protect us against pathogens by orchestrating the adaptive immune response. T lymphocytes possess a specific surface receptor, the T cell receptor (TCR), which conveys the stimulation signal towards the cytoplasm for the initiation of the T cell activation cascade. The TCR is a multimeric complex composed of the TCRαβ, CDεγ, CD3εδ and CD3ζζ dimers. The TCRαβ chains recognize the pathogenic antigens while the CD3 chains initiate the T cells signaling cascade through the phosphorylation of their cytoplasmic tails. It is not yet understood how the TCR activating signal is transmitted through the membrane from the TCRαβ chains towards the cytoplasmic tails of the CD3 chains. In resting T cells, the CD3ε and CD3ζ chains are associated to the inner leaflet of the plasma membrane (PM). The cytoplasmic tails of CD3ε and CD3ζ are rich in basic amino acids, which allow electrostatic association with acidic phospholipids at the PM. Phosphatidylserine (PS) is the most abundant acidic phospholipid and is exclusively distributed towards the cytoplasmic PM leaflet. During T cell activation, the CD3ε and CD3ζ cytoplasmic tails have to dissociate from PS for their phosphorylation. The membrane dissociation of a large number of CD3 chains is essential for the amplification of T cell activation. A mechanism of CD3ε and CD3ζ chain dissociation that has been proposed in the literature is through intracellular calcium elevation. A robust calcium influx is generated following T cell stimulation. In addition to its essential role in regulating T cell activation, it has been proposed that calcium ions neutralize the PM acidic phospholipids for CD3 chain dissociation. Calcium is also an essential cofactor for the activity of many enzymes, such as the phospholipid scramblase TMEM16F. TMEM16F redistributes PS at the PM following intracellular calcium mobilization, resulting in a reduction of inner leaflet PS. We propose that calcium regulates CD3 chain dissociation through TMEM16F activity. Our study demonstrates that calcium-dependent PS redistribution by TMEM16F is required for CD3ε membrane dissociation in the Jurkat T cell line. Reduction of TMEM16F expression by shRNA targeting (shTMEM16F) prevents massive CD3ε chain dissociation following 8 T cell stimulation. The shTMEM16F cells show a reduction in the phosphorylation of TCR-proximal signaling molecules. In contrast, expression of a constitutively active mutant of TMEM16F increases PS redistribution, CD3ε chain dissociation and phosphorylation of TCR-proximal signaling molecules. Our study demonstrates that PS redistribution by the calcium-dependent TMEM16F scramblase regulates CD3 chain dissociation for the amplification of T cell activation. In addition, we have confirmed T cell activation defects in shTMEM16F murine primary T cells during an immune response. In conclusion, our study demonstrates the role of PS regulation by TMEM16F in T cell activation. We showed that we could modify the level of T cell activation by modulating the concentration of PS at the inner leaflet of the PM. Our results thus have important implications for the development and improvement of immune receptor-based cancer immunotherapies.