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Previous studies have evaluated the effects of different reproductive procedures on discomfort markers in sheep and cattle. Such studies may help stimulate the adoption of techniques that are more beneficial for animal welfare. However, markers that are commonly used to evaluate discomfort are highly influenced by external factors. To overcome this, several systemic markers can be evaluated to more precisely identify stress, pain, and inflammation. Such markers include cortisol, acute phase proteins, bradykinin, and substance P. We aimed to review the potential markers of stress, pain, and inflammation, and discuss how and when they are regulated after different stimuli related to reproductive procedures in cattle and sheep. Furthermore, we aimed to review how reproductive procedures with different degrees of invasiveness cause stress and provide information that may help develop strategies to limit animal discomfort. RESUMO: Estudos anteriores avaliaram o efeito de diferentes procedimentos reprodutivos sobre marcadores de desconforto em bovinos e ovinos. Tais estudos podem estimular a adoção de técnicas que preservem o bem-estar animal. Entretanto, os marcadores comumente utilizados apresentam alta influência de fatores externos. Para contornar isso, a avaliação conjunta de diferentes parâmetros sistêmicos pode ser utilizada para determinar com maior precisão a presença de estresse, dor ou inflamação, como cortisol, proteínas de fase aguda, a bradicinina e a substância P. O objetivo desta revisão é relacionar potenciais marcadores de inflamação e estresse, discutindo como e quando são regulados frente aos estímulos em bovinos e ovinos. Ainda, pretende-se revisar de que forma procedimentos reprodutivos com diferentes graus de invasividade acarretam em desconforto, fornecendo informações para a elaboração de estratégias que possibilitem minimizá-lo.

Pregnancy diagnosis is an important tool for farm management. Ultrasonography is the main technique used for pregnancy diagnosis in ewes. As an alternative, radioimmunoassay (RIA) allows accurate and early detection of pregnancy-associated glycoproteins (PAGs) in sheep blood. However, radioactive-based techniques, as RIA, have been increasingly inadvisable due to environmental risk. Homology between ovine and bovine PAGs is high, and ELISA kits used for PAGs detection in cattle are safer than RIA. Thus, this study aimed to evaluate the feasibility of PAGs detection for pregnancy diagnosis in sheep serum samples using an ELISA kit produced for cattle. The sensitivity and specificity of the ELISA kit were 93.5% and 98.9%, respectively, whereas positive and negative predictive values were 99.0% and 93.1%, respectively, in comparison to ultrasonography diagnostic (control). PAGs reached consistently detectable concentrations in ovine serum around 33 days after mating. Accuracy of the ELISA test was 96.1% from 33 days of pregnancy until lambing. After parturition, PAGs were still detectable seven days post-lambing. However, from 21 days post-parturition, PAGs from the previous pregnancy were no longer detected in serum samples. In conclusion, the bovine ELISA kit can accurately detect pregnancy in sheep 33 days following mating, while PAGs levels from the previous gestation are no longer detected from 21 days post-partum. The evaluated ELISA test is a reliable tool for pregnancy diagnosis in sheep at random stages and as a complementary exam at early gestation. RESUMO: O diagnóstico de gestação é uma ferramenta importante no manejo da propriedade. A ultrassonografia é a principal técnica utilizada no diagnóstico de prenhez em ovelhas. Como alternativa, o radiomunoensaio (RIA) permite acurácia e a detecção precoce de proteínas associadas à prenhez (PAGs) no sangue. No entanto, as técnicas radioativas, como o RIA, têm sido cada vez mais desaconselháveis, devido ao risco ambiental. A homologia entre PAGs de ovinos e bovinos é alta, e os kits de ELISA utilizados para a detecção de PAGs em bovinos são mais seguros do que RIA. Portanto, este estudo teve como objetivo avaliar a viabilidade de detecção de PAGs no soro ovino para diagnóstico de gestação em soro ovino, utilizando um kit de ELISA produzido para bovinos. A sensibilidade e a especificidade do kit de ELISA foram de 93,5% e 98,9%, respectivamente, enquanto que os valores preditivos positivo e negativo foram de 99,0% e 93,1%, respectivamente, em comparação com a ultrassonografia (utilizada como referência). As PAGs atingiram concentrações consistentemente detectáveis no soro ovino em torno de 33 dias após o acasalamento. A acurácia do teste de ELISA foi de 96,1% a partir de 33 dias de gestação até o parto. As PAGs ainda eram detectáveis sete dias pós-parto. No entanto, a partir de 21 dias após o parto, as PAGs da prenhez anterior já não eram detectadas no soro. Em conclusão, o kit de ELISA bovino pode detectar a prenhez com precisão em ovelhas a partir de 33 dias após o acasalamento, e os níveis de PAGs da gestação anterior não são detectados a partir de 21 dias pós-parto. O teste de ELISA avaliado é uma ferramenta confiável para o diagnóstico de gestação em ovelhas em estágios aleatórios e como exame complementar no início da gestação.

The objective of this study was to evaluate the efficiency of progestagen intravaginal devices (IVDs) in preventing parturition in sows by determining the effect of delaying parturition on the alive/total born piglets ratio. Evaluations of IVDs containing 0.5, 1.0 or 1.5g progesterone (P4) showed they were not effective in delaying parturition at any dosage tested. In a second experiment, seventy-five sows at day 112 of pregnancy were equally distributed (n=15 per group) in the following treatments: prostaglandin (PGF2α; 250µg sodium cloprostenol; control group) or PGF2α and simultaneous insertion of an IVD containing medroxyprogesterone acetate (MPA) for 48h. Control sows initiated labor 27.7±1.6h after PGF2α injection. The mean time (±SEM) between PGF2α administration and parturition was 72.1±8.8h, 72.7±3.8h, 82.7±7.1h and 81.8±3.5h for MPA 100, 200, 400 and 800mg, respectively, differing from control group (P0.05). These findings confirm that IVDs impregnated with MPA can effectively prevent parturition in sows without affecting the alive/total born piglets ratio and therefore represent an alternative to avoid weekend farrowing in swine herds. O objetivo do presente estudo foi avaliar a eficiência de dispositivos intravaginais (DIVs) contendo progestágeno na prevenção do parto e determinar o efeito do atraso do parto sobre a proporção de leitões vivos/nascidos totais. DIVs contendo 0,5, 1,0 ou 1,5g de progesterona (P4) não foram eficientes na prevenção do parto em nenhuma das doses. No experimento 2, setenta e cinco porcas aos 112 dias de gestação foram equilibradamente distribuídas (n=15 por grupo) nos seguintes tratamentos: prostaglandina (PGF2α; 250µg cloprostenol sódico; grupo controle) ou PGF2α e simultânea inserção de DIV contendo acetato de medroxiprogesterona (MAP) por 48h. Fêmeas do grupo controle iniciaram o parto 27,7±1,6h após injeção de PGF2α. O tempo médio entre a administração de PGF2α e início do parto foi 72,1±8,8h, 72,7±3,8h, 82,7±7,1h e 81,8±3,5h para os grupos MAP 100, 200, 400 e 800mg, respectivamente, diferindo do grupo controle (P0,05). Esses resultados confirmam que DIVs contendo MAP podem efetivamente inibir o início do parto em porcas sem afetar a proporção de leitões nascidos vivos e, portanto, representam uma alternativa para evitar partos aos finais de semana.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico The role of local factors in follicular selection in mammals is not fully understood. The aim of the present study was to identify local factors, receptors and intracellular signaling pathways involved in bovine dominant follicle selection and subordinate follicles atresia. In the first study, the pattern of mRNA expression and function of FGF10 and its receptor FGFR2b was evaluated during bovine follicle deviation. FGF10 and FGFR2b were significantly more expressed in theca and granulosa cells retrieved from subordinate follicles, respectively. Intrafollicular FGF10 treatment in the larger follicle dose-dependently inhibited follicle growth and significantly reduced estradiol secretion. In granulosa cells, FGF10 treatment decreased CYP19A1 and cyclin D2 mRNA expression whereas FGFR2b tended to be more expressed after treatment. In theca cells, a significant increase in FGF10 expression was observed in FGF10-treated follicles. In a second study, BMPRs, BMP15 and GDF9 expression was evaluated in cows ovariectomized when the size of the largest and second largest follicle did not have a significant difference (D2), had slight difference (D3) or marked difference (D4). At day 2 of follicular wave, it was observed a significant increase in BMPR1A expression whereas BMPR-2 and - 1B tended to be more expressed in future subordinate follicles. At day 3, when dominant and subordinate follicles are reliably identified, BMPR-2 and 1B were more expressed in subordinate follicles. At day 4, BMPR1B (mRNA and protein) was significantly more expressed in granulosa cells from atretic follicles. The increased BMPR1B expression during atresia was confirmed in granulosa cells from follicles induced to atresia with FGF10 or estradiol receptor antagonist treatment. Similar levels of BMP15 and GDF9 proteins were observed in follicular fluid from dominant and subordinate follicles. In a third study, we aimed to identify intracellular signaling pathways differentially activated in granulosa cells during deviation. Phosphorylated MAPK was more abundant in the future dominant follicle, but did not differ between follicles at the expected moment and after follicular deviation. Subordinate follicles phosphorylated STAT3 levels tended to increase at day 3 and were significantly greater at day 4 in comparison to dominant follicles. In conclusion, present results suggest that decreased FGF10 and FGFR2b expression allows dominant follicle growth and differentiation whereas increased FGF10 signaling in the subordinate follicle induces atresia. The patterns of BMPR- 2, -1B and -1A indicate that these receptors play roles during follicle deviation. Phosphorylated MAPK abundance is an early marker of follicle dominance, but is not differentially regulated during and after deviation. The functional status of STAT3 suggests that this pathway is involved in granulosa cell death. O controle local da seleção folicular em mamíferos ainda é pouco compreendido. O objetivo do presente estudo foi identificar fatores locais, receptores e rotas de sinalização envolvidas na seleção do folículo dominante e atresia dos subordinados em bovinos. Em um primeiro estudo, avaliou-se a regulação e função do FGF10 e do seu receptor FGFR2b durante a divergência folicular. A expressão de FGF10 e FGFR2b foi significativamente maior nas células da teca e granulosa, respectivamente, provenientes dos folículos subordinados. A injeção intrafolicular de FGF10 inibiu o crescimento folicular de maneira dose dependente e reduziu significativamente a síntese de estradiol. Nas células da granulosa, a injeção de FGF10 diminuiu a expressão de RNAm de CYP19A1 e ciclina D2, enquanto que uma tendência de aumento da expressão do receptor FGFR2b foi observada. Nas células da teca, um aumento significativo na expressão de FGF10 foi observado nos folículos tratados com FGF10. Em um segundo estudo, o padrão de expressão dos receptores de BMPs e das proteínas BMP15 e GDF9 foram avaliados em vacas ovariectomizadas em diferenes dias em relação ao inicio da onda folicular, comparando os dois maiores folículos antes (dia 2), durante (dia 3) ou após a divergência folícular (dia 4). No dia 2 da onda folicular, foi observada maior expressão do receptor BMPR-1A e tendências a maior expressão dos receptores BMPR-2 e -1B nos futuros folículos subordinados. No dia 3, quando os folículos dominantes e subordinados são identificados, a expressão de BMPR-1B e -2 foi maior nos folículos subordinados. No dia 4, o receptor BMPR1B (RNAm e proteína) foi significativamente mais expresso nas células da granulosa de folículos atrésicos. O aumento da expressão do BMPR1B durante a atresia folicular foi confirmado nas células da granulosa de folículos induzidos à atresia através do tratamento com FGF10 ou inibidor dos receptores de estradiol. A abundância de BMP15 e GDF9 no fluído folicular não diferiu entre folículos dominantes e subordinados. Em um terceiro estudo, buscou-se identificar rotas de sinalização diferentemente ativas nas células da granulosa durante a divergência. Os níveis de MAPK fosforilada foram significativamente superiores nos futuros folículos dominantes (dia 2), mas não diferiram entre os dois maiores folículos durante ou após a divergência. Folículos subordinados apresentaram maiores níveis de STAT3 fosforilada em relação aos seus respectivos dominantes em todos os pares de folículos coletados, sendo observado um aumento significativo em folículos atrésicos coletados no dia 4. Em conclusão, os resultados sugerem que a expressão reduzida de FGF10 e do receptor FGFR2b possibilitam o crescimento e diferenciação do folículo dominante, enquanto que o aumento da sinalização do FGF10 no folículo subordinado está associado com a atresia. O perfil de expressão dos receptores BMPR-2, -1B e -1A indica que os mesmos apresentam funções na regulação da divergência folicular em bovinos. A fosforilação da MAPK é um marcador inicial de dominância folicular, mas não é diferentemente regulada durante e após a divergência, enquanto que o padrão de ativação da STAT3 sugere que essa via está envolvida na morte das células da granulosa.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico The aim of this study was to evaluate the effect of fibroblast growth factor 10 (FGF10) on bovine oocyte meiotic resumption in an in vitro oocyte and follicular cells co-culture system. At first, an oil-free culture system able to maintain a stable osmolality of the medium without the negative interference of the oil was established. The maintenance of osmotic equilibrium confirms that fourwell plate with water in the central hole can be a feasible alternative to replace oil for scientific experimentation and embryo culture. The embryo development rate in the alternative system (near 30% blastocyst) was similar to that obtained in the conventional system (33% blastocyst). Afterwards, the role of FGF10 on bovine oocyte meiotic resumption was evaluated in a co-culture of oocytes and follicular cells in the presence of angiotensin II (10-11M AngII). All tested concentrations of FGF10 inhibited the resumption of meiosis induced by AngII (P ≤ 0.05). The highest germinal vesicle breakdown (GVBD) rate was observed when FGF10 was absent (45.3%). At concentrations of 10, 100, and 1000ng mL-1 FGF10, the rates of GVBD were 30.2, 29.6 and 27%, respectively. In a second experiment, oocytes were co-cultured with follicular hemisections to test if FGF10 (100ng mL-1) acts directly on COCs or through follicular cells to inhibit AngII (10-11M)-induced meiotic resumption. The AngII-induced GVBD (62.6%) was inhibited when FGF10 was added to in vitro co-culture system (37.8%; P ≤ 0.05). However, FGF10 did not affect meiotic resumption of COCs cultured without AngII in the presence or absence of follicular cells. The third experiment tested if FGF10 inhibits progesterone-induced meiotic resumption. The addition of FGF10 did not affect the meiotic resumption rate induced by progesterone (41.1% and 41.7% GVBD with and without FGF10, respectively; P ≥ 0.05). However, indomethacin (10μM) blocked (20.1% GVBD; P ≤ 0.05) progesterone positive effect suggesting that this steroid, like AngII, acts through cyclooxygenases pathway to induce meiotic resumption. Results show that FGF10 interacts with follicular cells to inhibit AngII but not progesterone-induced meiotic resumption of bovine oocytes. O presente trabalho teve por objetivo averiguar o papel do fator de crescimento fibroblástico 10 (FGF10) no reinício da meiose de oócitos bovinos, utilizando um modelo in vitro de co-cultivo de oócitos e células foliculares. Em um primeiro estudo, foi estabelecido um sistema de cultivo capaz de manter a osmolalidade dos meios constante na ausência de óleo. A adição de água entre os poços de placas de cultivo foi eficiente na prevenção da evaporação dos meios sendo uma alternativa na experimentação científica e produção in vitro de embriões. Com este sistema, se obteve uma taxa média de 30% de desenvolvimento embrionário, resultado similar ao obtido no sistema convencional (33% blastocistos). Após o estabelecimento do sistema, avaliou-se a participação do FGF10 no reinício da meiose de oócitos bovinos e sua interação com a maturação nuclear induzida por angiotensina II (AngII; 10-11M) e progesterona (100ng mL-1). Todas as concentrações de FGF10 testadas foram eficientes na inibição do reinício da meiose induzido por AngII (P ≤ 0,05). As maiores taxas de rompimento de vesícula germinativa (RVG) foram observadas na ausência de FGF10 (45,3%). Nas concentrações de 10, 100, e 1000ng mL-1 de FGF10, as taxas de RVG foram 30,2, 29,6 e 27%, respectivamente. Após o estabelecimento da dose ideal, foi verificado que a adição de FGF10 (100ng mL-1) ao cultivo de complexos cumulus-oócitos acarretou em diminuição na taxa de reinício da meiose somente na presença de células foliculares e AngII (37,8% e 62,6% de RVG com e sem FGF10, respectivamente; P ≤ 0,05). A partir dos resultados dos experimentos anteriores, o terceiro experimento foi delineado para testar se o FGF10 é capaz de inibir o reinício da divisão meiótica induzido por progesterona. A adição de FGF10 não afetou a taxa de reinício da meiose induzida pela progesterona (41,1% e 41,7% de RVG com e sem FGF10, respectivamente; P ≥ 0,05). Entretanto, a adição de indometacina (10μM) bloqueou (20,1% de RVG; P ≤ 0,05) o efeito positivo da progesterona. Este bloqueio demonstra que a progesterona, assim como já foi demonstrado para AngII, utiliza a via das ciclooxigenases para induzir o reinício da meiose e este evento parece não ser regulado pelo FGF10. Os resultados demonstram que o FGF10 interage com as células foliculares para inibir o reinício da meiose estimulado pela AngII mas não pela progesterona.