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International audience; Abstract The initial greening of angiosperm occurs upon light-activation of photoreceptors that trigger photomorphogenesis followed with the development of chloroplasts. In these semi-autonomous organelles, the construction of the photosynthetic apparatus depends on the coordination of nuclear and plastid gene expression. Here we show that PAP8, as an essential subunit of the plastid-encoded RNA polymerase, is under the control of a regulatory element recognized by the photomorphogenic factor HY5. PAP8 is localized and active in both plastids and the nucleus and particularly essential for the formation of late photobodies. In the albino pap8 mutant, phytochrome-mediated signalling is altered, PIFs are maintained, HY5 is not stabilized, and GLK1 expression is impaired. PAP8 translocates into plastids losing its pre-sequence, interacts with the PEP, and using an unknown route or a retrograde transport, reaches the nucleus where it has the ability to interact with pTAC12/HMR/PAP5. Since PAP8 is required for the phytochrome-B-mediated signalling cascade and the reshaping of the PEP, it may coordinate nuclear gene expression with the PEP-driven chloroplastic gene expression during chloroplast biogenesis.

The Rice Yellow Mottle sobemovirus (RYMV) belongs to the most damaging pathogens devastating rice fields in Africa. P1, a key protein for RYMV, was reported as a potent RNAi suppressor counteracting RNA silencing in plant reporter systems. Here we describe the complete 3D structure and dynamics of P1. Its N-terminal region contains ZnF1, a structural CCCC-type zinc finger strongly affine to zinc and a prominent short helix, rendering this region poorly amenable to structural changes. P1 C-terminal region contains ZnF2, an atypical HCHC-type ZnF that does not belong to any existing class of Zn finger proteins. ZnF2 appeared much less affine to zinc and more sensitive to oxidizing environments than ZnF1, and may serve as a sensor of plant redox status. The structure helped us to identify key residues essential for RYMV infectivity and spread in rice tissues through their participation in P1 oligomerization and folding. Altogether, our results provide the first complete structure of an antiviral silencing suppressor encoded by a virus infecting rice and highlight P1 structural and dynamical properties that may serve RYMV functions to infect and invade its host plant.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2019. Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES). Nos últimos anos diferentes estudos relataram o uso da tecnologia do RNA interferente para o controle de insetos-praga, por meio da produção de plantas geneticamente modificadas. Apesar do impacto, esta estratégia possui algumas limitações para sua aplicação, incluindo a degradação de moléculas de dsRNA no meio ambiente, como no intestino do inseto, bem como sua baixa internalização pelas células do epitélio intestinal do inseto. A presença de nucleases intestinais foi reportada em diferentes insetos de importância na agricultura, incluindo Schistocerca gregaria, Bombyx mori e Bemisia tabaci. Estudos anteriores relataram que para o bicudo-do-algodoeiro, Anthonomus grandis (Coleoptera: Curculionidae), a administração oral de dsRNA, por meio de dieta artificial, não é muito eficiente, não se sabendo o motivo, mas especulando-se a presença de nucleases intestinais. No presente estudo foram identificadas três nucleases no transcritoma do bicudo-do-algodoeiro, as quais foram validadas por análises in silico e silenciadas via RNAi por microinjeção, a fim de de avaliar o motivo da baixa eficiência do dsRNA no silencimento gênico, quando administrado via oral. Uma vez silenciadas as nucleases, a degradação do dsRNA pelo suco gástrico do bicudo-do-algodoeiro foi reduzida, o que contribui para o aumento do silenciamento gênico do gene-alvo. Demonstrada a presença de nucleases no intestino do bicudo-do-algodoeiro, este estudo abordou duas alternativas envolvendo a proteção da molécula de dsRNA e sua melhor internalização pelas células intestinais do bicudo-do-algodoeiro. Na primeira alternativa foram utilizadas nanopartículas de quitosana e dsRNA a fim de protegê-lo da degradação de nucleases intestinais de A. grandis. A tecnologia de nanoparticulas de quitosana vem sendo utilizada em estudos realizados com células animais na área farmacológica, bem como no controle de insetos-praga, como Aedes aegypti. Essa metodologia não só fez com que o dsRNA não fosse degradado pelas nucleases presentes no intestino do bicudo-do-algodoeiro, como contribuiu para significativa melhoria no silenciamento gênico do gene-alvo, quando comparado ao dsRNA livre. As nanopartículasde dsRNA também se mostraram altamente estáveis, quando aplicadas na superfície de plantas de algodão, demostrando potencial de serem utilizadas à campo, na forma de pulverização. A outra alternativa utilizada foi a proteína PTD-DRBD, que possui um domínio que facilita a fagocitose (PTD) e um domínio de ligação específico a dsRNA (DRBD). Essa proteína de fusão foi anteriormente caracterizada e vem sendo utilizada para entrega de ácidos nucléicos como droga em estudos da área farmacêutica. Em resumo, essa metodologia se mostrou bastante eficaz na proteção do dsRNA contra degradação de nucleases intestinais do bicudo-do-algodoeiro, além de ter causado melhor silenciamento gênico do gene-alvo, quando comparado ao dsRNA livre. Além disso, o complexo PTD-DRBD mediou a internalização celular do dsRNA pelas células do intestino do inseto. Ao contrário das nanopartículas de quitosana, essa metodologia pode ser utilizada para a produção de plantas transgênicas. O trabalho aqui apresentado contribui para os estudos envolvendo a eficiência do silenciamento gênico no bicudo-do-algodoeiro, inseto-praga de difícil controle via administração oral de RNAi. Os dados demostram a presença de nucleases no instestino do inseto, que podem ser, em parte, responsáveis pela degradação do dsRNA ingerido. O estudo também apresenta duas alternativas para contornar a degradação do dsRNA no intestino do bicudo-do6 algodoeiro: (1) nanopartículas de quitosana e dsRNA, que podem ser utilizadas na forma de pulverização, e (2) ribonucleoproteínas PTD-DRBD:dsRNA, que podem ser utilizadas, via planta transgênica. Ambas alternativas demostraram eficiência na proteção do dsRNA e são altamente promissoras para aplicações biotecnológicas contra o bicudo-do-algodoeiro e outros insetos-praga. In the last years, different studies reported the use of RNAi on the control of different crop insect pests through genetic modified plants. Despite the positive impact, this strategy has some limitations, including the dsRNA degradation in the environment, such as the insects gut, as well as its poor internalization by the insects gut cells. The presence of gut nucleases has been reported in different insects that are important for the economy, including Schistocerca gregaria, Bombyx mori and Bemisia tabaci. It was reported that the oral administration of dsRNA in artificial diet is not efficient for the cotton boll weevil, Anthonomus grandis (Coleoptera: Curculionidae). The reason is not well stablished, but it can be the presence of gut nucleases. In this study three nucleases were identified in the cotton boll weevil transcriptome, which were validated by in silico analysis and by RNAi through microinjection. Once the nucleases were silenced, the dsRNA degradation by the insects gut juice decreased and the gene silencing of the target gene when the dsRNA was orally delivered increased. Therefore, it was demonstrated the reason of the RNAi poor efficiency when orally delivered to cotton boll weevil. Once it was demonstrated the presence of gut nucleases in the cotton boll weevil, this study presented two approaches to protect the dsRNA molecule of gut nuclease degradation. The first approach is chitosan nanoparticles which were used in order to protect the dsRNA from degradation. This technology is already being studied to deliver nucleic acids to animal cells in the pharmaceutical field, as well as to control insect pests, such as Aedes aegypti. This methodology hampered the dsRNA degradation by cotton boll weevil gut nucleases, which increased the gene silencing of the target gene when orally delivered. The chitosan:dsRNA nanoparticles showed to be very stable when applied on the surface of cotton leaves which demonstrates the capacity application on fields through pulverization. The other approach is the fusion protein PTD-DRBD. This protein has a cell penetrating peptide domain (PTD) and a dsRNA binding domain (DRBD) and was characterized and studied as a nucleic acid delivery method in the pharmaceutical field. This methodology also showed efficiency in protecting the dsRNA from cotton boll weevil gut nuclease degradation, consequently increasing the gene silencing of the target gene when orally delivered. Besides, PTD-DRBD was able to mediate the dsRNA cell internalization by cotton boll weevil gut epithelial cells. Unlike chitosan nanoparticles, this approach can be used in the production of transgenic plants. This study is about the reason why the cotton boll weevil is a difficult insect to control via RNAi oral delivery. This difficulty is due to the presence of gut nucleases that are able to degrade the ingested dsRNA. This study also shows two alternatives to hamper the dsRNA degradation in the gut of the cotton boll weevil: chitosan:dsRNA nanoparticles, which can be pulverized, and PTD-DRBD:dsRNA ribonucleoproteins, which can be produced in transgenic plants. Both alternatives showed efficiency in dsRNA protection and are very promising to biotechnological applications against cotton boll weevil and other crop insect pests.