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International audience; Lactococcus cremoris and Lactococcus lactis are among the most extensively exploited species of lactic acid bacteria in dairy fermentations. The cell wall of lactococci, like other Gram-positive bacteria, possesses a thick peptidoglycan layer, which may incorporate cell wall polysaccharides (CWPS), wall teichoic acids (WTA), and/or lipoteichoic acids (LTA).In this study, we report the isolation, purification and structural analysis of the carbohydrate moieties of glycolipids (GL) and LTA of the L. cremoris model strain 3107. Chemical structures of these compounds were studied by chemical methods, NMR spectroscopy and positive and negative mode ESI MS. We found that the LTA of strain 3107 is composed of short chains of 1,3-polyglycerol phosphate (PGP), attached to O-6 of the non-reducing glucose of the kojibiose-Gro backbone of the glycolipid anchor. Extraction of cells with cold TCA afforded the detection of 1,3-glycerol phosphate chains randomly substituted at O-2 of glycerol by D-Ala. Unlike the LTA of L. lactis strains studied to date, the PGP backbone of the LTA of L. cremoris 3107 did not carry any glycosyl substitution. The deacylated glycolipid fraction contained the free kojibiose-Gro oligosaccharide, identical to the backbone of the GL anchor of LTA, and its shorter fragment α-Glc-1-Gro. These OS may have originated from the GL precursors of LTA biosynthesis.

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National audience; En dix ans, les recherches sur les particules plastiques, nano- (NP) et microplastiques (MP), et leurs contaminants associés se sont largement développées. L’amélioration des connaissances de ces familles de contaminant s’étant accrue, les pratiques analytiques ont dû évoluer et être adaptées. La garantie de la qualité des résultats générés ne peut être obtenue que par la mise en commun des expertises, ainsi que la mise en place d’infrastructures et l’utilisation d’appareillages complémentaires.Dans le cadre du CPER Marco, différents laboratoires (Anses, LOG et ULCO) ont mis en place la plateforme 3PAC de façon à partager leurs équipements analytiques, méthodes, expertises et connaissances.En terme d’infrastructure, de nombreuses possibilités existent. Tout d’abord des systèmes d’aquarium avec un environnement contrôlé sont disponibles pour réaliser des études d’exposition. Une pièce « microplastique » permet de réaliser des manipulations (digestion, filtration) sous atmosphère maîtrisée et ainsi limiter les risques de contamination. La caractérisation des particules (taille, forme) peut être réalisée à l’aide de divers équipements : loupes binoculaires ou directement par microscopie via l’utilisation des capteurs optiques du µ-Raman ou du µ-FT-IR. Enfin, l’identification des particules ou des contaminants associés est rendue possible par l’utilisation de techniques complémentaires soit spectroscopiques (µ-Raman, µ-FT-IR), soit spectrométriques (Py-GC/MS et Py-GC/Orbitrap). L’acquisition de nouveaux équipements, complémentaires, est programmée de façon à venir enrichir les possibilités analytiques (microscopie confocale, technologie light scattering).Dès aujourd’hui, l’expertise des différents partenaires permet de couvrir un large champ de recherches allant des études en laboratoire, aux prélèvements sur le terrain. A titre d’exemple, des travaux récents ont porté sur l’étude de sédiments et organismes prélevés in situ, la réalisation d’études d’encagement d’organismes marins, ou encore l’exposition de bivalves en conditions contrôlées.Désormais, l’ambition de la plateforme 3PAC est de répondre aux appels à projets nationaux et internationaux portant sur l’étude des particules plastiques et de leurs conséquences. Ces projets seront menés au sein d’un écosystème analytique idoine, regroupant expertises, technologies et infrastructures.

National audience; La recherche concernant les nano- (NP) et microplastiques (MP) s’est largement développée ces dernières années avec une meilleure connaissance de la façon dont les expérimentations doivent être conduites. Ainsi, il est désormais clair que ce sujet nécessite un investissement important en terme d’expertise, d’infrastructure, ou d’appareillage, de manière à garantir la production de résultats de qualité.Dans le cadre d’un contrat plan Etat/Région (CPER Marco), différents laboratoires du Boulonnais (Anses, LOG et ULCO) ont mis en place une plateforme (3PAC) de façon à partager leurs équipements analytiques, méthodes, expertises et connaissances.Parmi les infrastructures à disposition à l’heure actuelle sont retrouvés : des systèmes d’aquarium avec un environnement contrôlé pour réaliser des études d’exposition, une pièce « microplastique » permettant de réaliser des manipulations (digestion, filtration) sous atmosphère maîtrisée et ainsi limiter les risques de contamination. La caractérisation des particules (taille, forme) est ensuite réalisée à l’aide de divers équipements : une loupe binoculaire ou directement via l’utilisation du µ-Raman. Enfin l’identification des particules est rendue possible par l’utilisation de techniques spectroscopiques (µ-Raman) ou spectrométriques (Py-GC/MS et Py-GC/Orbitrap). L’acquisition de nouveaux équipements, complémentaires, est d’ores et déjà programmée de façon à venir enrichir les possibilités analytiques (microscopie confocale, µ-FT-IR, light scattering).Dès aujourd’hui, l’expertise des différents partenaires permet de couvrir un large champ de recherches allant des études en laboratoire, aux prélèvements sur le terrain. A titre d’exemple, des travaux récents ont porté sur l’étude de sédiments et organismes prélevés in situ, la réalisation d’études d’encagement d’organismes marins, ou encore l’exposition de bivalves en conditions contrôlées.L’ambition de la plateforme 3PAC est de répondre aux appels à projet nationaux et internationaux portant sur l’étude des particules plastiques et de leurs conséquences, en proposant un écosystème analytique idoine, regroupant expertises, technologies et infrastructures.

International audience; In the recent years, research on microplastics (MP) and nanoplastics (NP) has largely developed with better insights on the way analyses have to be conducted. It is now clear that research in this topic necessitates huge investment in terms of expertise, infrastructure and materials in order to insure the best quality for results.In the framework of a French regional project, CPER Marco, different laboratories from Universities, CNRS and Anses decided to create a common platform (3PAC) in order to share knowledge, expertise, working methodologies and analysis devices. This platform presently gather different equipment: monitored laboratory aquaria for controlled exposition studies, a laminar flow cabinet to avoid contaminations, stereomicroscopes to characterize particles and a µRaman, a Py-GC/MS and a Py-GC/HRMS for the identification of polymers. In the future, acquisitions of new analytical equipment are planned including light scattering technology for NP characterization and µFT-IR for polymer identification. By now, expertise of the different partners allows to cover a large field of applications from both laboratory and field studies. Recently investigations have been carried out on sediment, organisms from the environment and their microbiote, but also caging of marine organisms, exposition of bivalves in controlled conditions. The ambition of 3PAC is to answer national and transnational call for projects, making available an ecosystem gathering expertise, technologies and infrastructures.

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Monitoring of early stages of freshness decay is a major issue for the fishery industry to guarantee the best quality for this highly perishable food matrix. Numerous techniques have been developed, but most of them have the disadvantage of being reliable only either in the last stages of fish freshness or for the analysis of whole fish. This study describes the development of a qPCR method targeting the torA gene harboured by fish spoilage microorganisms. torA encodes an enzyme that leads to the production of trimethylamine responsible for the characteristic spoiled-fish odour.A degenerate primer pair was designed. It amplified torA gene of both Vibrio and Photobacterium with good efficiencies on 7-log DNA dilutions. The primer pair was used during a shelf-life monitoring study achieved on modified atmosphere packed, chilled, whiting (Merlangius merlangus) fillets. The qPCR approach allows the detection of an increase of torA copies throughout the storage of fillets in correlation with the evolution of both total volatile basic nitrogen (-0.86) and trimethylamine concentrations (-0.81), known as spoilage markers.This study described a very promising, sensitive, reliable, time-effective, technique in the field of freshness characterisation of processed fish.

International audience; BACKGROUND: Fish is a highly perishable food, so it is important to be able to estimate its freshness to ensure optimum quality for consumers. The present study describes the development of an SPME‐GC‐MS technique capable of quantifying both trimethylamine (TMA) and dimethylamine (DMA), components of what has been defined as partial volatile basic nitrogen (PVB‐N). This method was used, together with other reference methods, to monitor the storage of cod fillets (Gadus morhua) conserved under melting ice.RESULTS: Careful optimisation enabled definition of the best parameters for extracting and separating targeted amines and an internal standard. The study of cod spoilage by sensory analysis and TVB‐N assay led to the conclusion that the shelf‐life of cod fillet was between 6 and 7 days. Throughout the study, TMA and DMA were specifically quantified by SPME‐GC‐MS; the first was found to be highly correlated with the values returned by steam distillation assays. Neither TMA‐N nor DMA‐N were able to successfully characterise the decrease in early freshness, unlike dimethylamine/trimethylamine ratio (DTR), whose evolution is closely related to the results of sensory analysis until the stage where fillets need to be rejected.CONCLUSION: DTR was proposed as a reliable indicator for the early decrease of freshness until fish rejection.

International audience; Introduction:Tracking the early decline of freshness is an important concern for the fishery industry to insure the best quality for foodstuffs highly liable to spoil. A lot of techniques have been developed like sensory, chemical and more slightly microbial analysis. Unfortunately, most of them have drawbacks of being subjective, or having the disadvantage of being either reliable once the freshness is lost or for the analysis of whole fish. The study presents the development of a qPCR method targeting a gene harboured by specific spoilage organisms (SSOs) of fish: torA. This gene encodes an enzyme responsible of the production of trimethylamine whose odour is characteristic of the spoiled fish.Material and methods:The study aimed to develop a degenerate primer pair able to amplify torA gene in a wide range of SSOs. For that, numerous software and algorithms were used for a maximal reliability of the in silico design process. A first selection of pairs where tested in vitro to further characterization. Finally a primer pair was conserved for efficiency and selectivity tests. The selected primer pair was tested for analysing MAP-chilled whiting along a 15 days storage study. Methods such as total volatile basic nitrogen (TVB-N) and trimethylamine (TMA) analysis or total viable count (TVC) analysis were performed simultaneously to evaluate fish overall quality.Results and discussion:A degenerate primer pair was selected after six steps of in silico design and selection. It amplified torA gene of both Vibrio and Photobacterium with good efficiencies, ranging from 91.6 to 93 % regarding species, on 7-log DNA dilutions. The best conditions of annealing temperature and primer concentration were found to be 62°C and 1 µM. As regards with selectivity, the degenerate primer pair allows to selectively amplify torA gene of Vibrio and Photobacterium compared with other tested species. TVC study led to inconclusive results, probably because ISO standard used was not suitable for these kinds of food and storage. However, throughout the storage of fillets, the qPCR approach allows detecting an increase of torA copies. Additionally, good correlation between qPCR results and the evolution of known spoilage markers were established, such as -0.86 (TVB-N) and -0.81 (TMA). Conclusion:This study, thanks to careful steps of primers characterization, allowed designing a primer pair able to amplify torA gene of both Vibrio and Photobacterium. A very promising, sensitive and time-effective qPCR technique is thus proposed to characterize the freshness of processed whiting.

National audience; La fraîcheur est un paramètre clé pour l’évaluation de la qualité du poisson. Cette matrice étant extrêmement périssable, l’utilisation d’outils objectifs est nécessaire. Par le passé de nombreuses méthodes incluant les analyses sensorielles, chimiques, microbiologiques et physiques ont été développées pour suivre l’évolution de paramètres olfactifs visuels et tex-turaux tout au long du processus d’altération.L’altération du poisson est un processus complexe combinant des dégradations autolytiques et exogènes. Un exemple connu concernant l’altération de la chair des Gadidés est la dégra-dation de l’oxyde de triméthylamine (OTMA) selon deux voies cataboliques: la première fait intervenir l’OTMA réductase synthétisée par la flore spécifique d’altération et la seconde est le résultat de l’activité d’une enzyme endogène du poisson l’OTMA déméthylase. Ces réac-tions conduisent respectivement à la production de triméthylamine (TMA) et la diméthyla-mine (DMA).Jusqu’à présent la TMA et la DMA sont mesurées en routine de façon non-spécifique avec d’autres amines volatiles grâce l’analyse des amines basiques volatiles totales (ABVT) ; la TMA pouvant néanmoins être analysée plus spécifiquement avec l’ajout de formaldéhyde lors du processus analytique de l’ABVT. Le concept d’azote basique volatil partiel a été déve-loppé pour quantifier spécifiquement la DMA et la TMA à l’aide d’une SPME-GC-MS.La méthode développée a fait l’objet d’une phase d’optimisation puis de sélection d’un étalon interne avant de s’intéresser à la plage de quantification. Suite à ce développement un suivi d’altération a été réalisé sur des filets de cabillaud stockés sous glace fondante. Aux diffé-rents jours de conservation, trois filets ont été analysés à l’aide de différentes techniques : analyse sensorielle réalisée avec la méthode du Quality Index Method (QIM), analyses chi-miques par les méthodes d’ABVT et ABVP. Les concentrations en TMA mesurées par la méthode d’ABVT et celle d’ABVP sont très bien corrélées (r=0,98). Au regard des résultats de l’ABVT et de ceux du QIM, il apparait que la limite d’acceptation/rejet des filets est située au voisinage du 7ème jour de conservation. La production de TMA en cours d’altération a pu être modélisée, néanmoins son utilisation seule n’apparait pas comme un bon indicateur du déclin de la fraîcheur lors des premiers jours d’altération. Afin de surmonter cette limite, l’utilisation d’un nouvel indicateur issu des résultats de l’ABVP, le ratio DMA sur TMA (DTR), a montré des résultats encourageants avec une anti-corrélation significative (r = - 0,87 ; p-value < 0.001) lors de la phase précoce de déclin de la fraîcheur du poisson.

International audience; Freshness is a key parameter in the evaluation of the fish quality. As this matrix is highly perishable, objective tools for the freshness estimation are required. By the past, numerous methods including sensorial, chemical, microbiological and physical analysis were developed to follow evolution of odour, sight or texture throughout the spoiling process.Spoiling of fish is a complex process combining autolysis and exogenous degradations. One of the most famous examples is the degradation of trimethylamine-N-oxide (TMAO) in Gadidae by both TMAO reductases of specific spoiling organisms and TMAO demethylase, an endogenic enzyme. These reactions lead respectively to the production of trimethylamine (TMA) and dimethylamine (DMA). To date, TMA and DMA are routinely non-specifically measured among other volatile amines thanks to total volatile basic nitrogen (TVB-N) analysis; TMA can be nonetheless measured more specifically by TVB-N when formaldehyde is added. The concept of partial volatile base nitrogen (PVB-N) was implemented using SPME-GC/MS to quantify both TMA and DMA. Further, this technique allows specifically detecting and measuring TMA and DMA.Extraction (temperature, time, sample preparation) and separation (temperature, column phase, split type) parameters were optimized to obtain best chromatographic profiles. Both fresh and spoiled fish were analyzed by TVB-N and PVB-N techniques. First results show consistent conclusions. Moreover, comparison of TVB-N and PVB-N leads to the conclusion that the current TMA measurement, with addition of formaldehyde, is overestimating TMA content in the flesh of fish.

International audience; Freshness is a key parameter of fish quality assessment. This matrix is highly perishable thus, objective tools for freshness estimation are required. Fish spoilage results from both autolytic activities and exogenous actions of specific spoilage organisms (SSO). The flesh of marine fish is characterized by the presence of Trimethylamine N-oxide (TMAO) involved in the osmoregulation process. TMAO can be used by bacteria from the genus Vibrio, Photobacterium, Shewanella as final electron acceptor and its reduction, thanks to TMAO reductase encoded by torA, leads to the production of TMA responsible of the specific fishy odor of spoiled fish.An in silico approach using biofinformatics tools combining R software, NRDB, NRPS primer (Laboratoire ProBioGEM) and AmplifX was set up to design and select primers. Forty torA sequences of Vibrio, nine of Shewanella and nine of Photobacterium were used to select a set of twelve primers. After a first in vitro screening of primers (absence of important primer dimers, ability to amplify a unique PCR product), a pair of primers amplifying a 400 bp fragment was selected to further analysis. The pair was tested on bacterial DNA of S.putrefaciens, P.phosphoreum, P.damselae, V.vulnificus, V.alginolyticus and two strains isolated from a spoiled whiting, identified as Burkholderia cepacia and member of S.putrefaciens group. Then, primer concentrations and annealing temperature were optimized for the selected pair with DNA from Photobacterium and Vibrio strains.Results on bacterial DNA are encouraging for Vibrio and Photobacterium species with a good efficiency (> 90%) and an acceptable range of quantification (µg.mL-1 to pg.mL-1). Selected primers showed a poor specificity on S.putrefaciens and whiting isolated strains but a 400 bp fragment is nevertheless observed. Secondly, total DNA extract from a few fresh and spoiled fish samples have been analyzed thanks to the selected pair of primers.

National audience; La fraîcheur est un paramètre déterminant de la qualité sanitaire du poisson. S’agissant d’une matrice très altérable, l’évaluation objective de sa fraîcheur est essentielle pour les opérateurs de la filière mais également pour les services d’inspection. Il convient donc de disposer d’outils performants pour déterminer précisément le niveau d’altération. L’objectif est de proposer des méthodes qui permettent de déterminer la qualité des poissons de manière plus fiable et objective [1] dès les premiers stades d’altération.La matrice de poisson est étudiée par une double approche. La première consiste en une analyse des composés volatils par SPME-GC-MS, la seconde s’attache à la détection d’un gène, torA, par qPCR.Sur les poissons crus, la flore spécifique d’altération produit certains composés volatils dont la triméthylamine [2, 3], molécule dont l’odeur est caractéristique du poisson altéré [1], issue de la réduction de l’OTMA par des enzymes bactériennes comme TorA [4,5] ou d’aldolisation par des enzymes endogènes [6]. Une méthode de SPME-GC-MS est développée afin de détecter la TMA dans des échantillons de poisson. Une méthode de qPCR est développée parallèlement pour quantifier la flore du poisson synthétisant l’OTMA réductase.Une méthode SPME-GC-MS permet l’étude de l’ensemble des composés volatils émis par le poisson au cours de sa conservation [7]. Combinée à l’utilisation de statistiques multivariées cette méthode permet d’identifier des composés volatils, souvent odorants, marqueurs de la fraîcheur ou de l’altération. La méthode est transposable à l’étude d’autres processus industriels (conservation d’anchois salés ou marinés, cuisson de poissons, fumaison).Des suivis d’altération de poissons crus seront réalisés afin de pouvoir appliquer les méthodes développées. L’étude s’attache donc à étudier une cause et une conséquence de l’altération du poisson afin de déterminer la qualité/fraîcheur du poisson.Après présentation de la problématique et des méthodes utilisées, les principaux résultats seront exposés et discutés.