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Orientadora: Dorly de Freitas Buchi Co-orientador: Waldemiro Gremski Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciencias Biológicas, Programa de Pós-Graduaçao em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 2008 Inclui bibliografia e anexos Área de concentraçao: Biologia Celular e Molecular O microambiente da medula óssea é composto de fatores de crescimento, células estromais, matriz extracelular e células progenitoras, que se diferenciam em células sanguíneas. Estudos prévios demonstraram que o medicamento imunomodulador homeopático complexo Canova (IH) aumentou o número de leucócitos. Nesse trabalho relatamos o efeito do tratamento sobre as células mononucleares, tanto in vitro quanto in vivo. Quatro grupos foram realizados: a) tratado com o medicamento IH; b) tratado com IH e M-CSF; c) apenas com M-CSF como controle positivo; d) e sem nenhum tratamento. Os fêmures de camundongos suíços foram dissecados, limpos e as células da medula óssea foram lavadas. Foram então plaqueadas, tratadas ou não, incubadas em diferentes tempos e processadas para microscopia de luz e eletrônica de transmissão. A imunofenotipagem e as citocinas foram analisadas por citometria de fluxo. O medicamento aumentou o número de nichos e de células com núcleo em anel (precursoras). Microscopia de luz e eletrônica de transmissão mostraram diferentes estágios de maturação com células residentes e ativadas. Com o tratamento houve um acentuado aumento no volume celular, número de mitocôndrias, do retículo endoplasmático granular e do complexo de Golgi. Todas as técnicas de microscopia mostraram que a linhagem monocítica (CD11b+) e as células estromais (aderentes) foram ativadas com o tratamento. O medicamento aumentou os "clusters" (nichos celulares) sobre as células aderentes, sugerindo áreas de proliferação. As análises exvivo mostraram que o número de núcleos em anel, nichos celulares e macrófagos ativados aumentaram nas culturas tratadas. O tratamento permitiu a sobrevivência e diferenciação dessas células, provavelmente produzindo citocinas e fatores de diferenciação. Esses resultados podem ser de fundamental importância para tratamentos clínicos em medicina regenerativa e terapias celulares. The bone marrow microenvironment is composed of growth factors, stromal cells, extracellular matrix and progenitor cells which differentiate into mature blood cells. Previous studies demonstrated that an immunomodulator complex homeopathic drug called Canova (IH) induced up-regulation in leukocytes count. We now report the effect of the "in vitro" and "in vivo" IH treatment on the mononuclear cells lineage of the bone marrow. Four groups were performed: a) treated with the IH drug; b) with IH plus MCSF; c) with M-CSF only, as positive control; d) and without any treatment. Swiss mice femurs were dissected, cleaned and the cells of the marrow were flushed. The cells were plated, treated or not, incubated for different periods and processed for light and transmission electron microscopy analysis. Immunophenotyping and cytokines were analyzed by flow cytometer. An increase in the numbers of the cell niches and ringshaped nuclei cells (progenitors) was observed in treated group. Light and transmission electron microscopy showed the stages of monocyte maturation, with resting and activated cells. A marked increase in cell volume was observed under treatment as well as, an increase in the number of mitochondria, expansion of the RER and an enlargment were observed in Golgi apparatus. All microscopy techniques showed that a monocytic lineage (CD11b+) and stromal cells (adherent cells) were activated by treatment. IH also increased cell clusters over adherent cells, suggesting the presence of proliferation areas. The ex vivo analysis showed that the number of ring nuclei, niches cells, as well as activated macrophages increased in culture. The treatment allowed the survival and differentiation of these cells, probably inducing cytokines and growth factors production. These results may be of fundamental interest in clinical treatments, regenerative medicine and cellular therapies.

Orientador: Silvio Sanches Veiga Co-orientador: Waldemiro Gremski Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 05/11/2008 Inclui bibliografia e anexos Área de concentração: Biologia Celular e Molecular As aranhas marrons estão distribuídas mundialmente e os acidentes relacionados são considerados um problema de saúde pública, especialmente na América do Sul, os quais são denominados como Loxoscelismo. Após os acidentes, as vítimas apresentam lesões cutâneas necróticas ao redor da picada e, em menor freqüência, sinais sistêmicos tais como insuficiência renal, coagulação intravascular disseminada e hemólise. Neste presente trabalho, nós estudamos o mecanismo molecular pelo qual uma toxina recombinante purificada e obtida da glândula do veneno, a qual é caracterizada bioquimicamente como uma fosfolipase-D, induz hemólise. O tratamento de eritrócitos provenientes de sangue humano com a toxina induziu experimentalmente hemólise direta de modo concentração- e tempo-dependentes. Os eritrócitos expostos à toxina fosfolipase-D recombinante apresentaram alterações morfológicas no tamanho e na forma das células de modo tempo-dependente. Além disso, a hemólise não foi dependente do grupo ABO e sistema Rh, uma vez que os eritrócitos humanos de diferentes grupos sanguíneos tratados com a toxina recombinante sofreram hemólise de uma maneira semelhante. A lise direta dos eritrócitos induzida pela fosfolipase-D recombinante depende da espécie do animal testado, já que eritrócitos obtidos a partir de humanos, de coelhos e de carneiros sofreram hemólise em uma porcentagem muito superior do que a observada com eritrócitos de cavalo. Em ensaios de microscopia confocal e imunofluorescência indireta, bem como na citometria de fluxo, seja utilizando anticorpos contra a fosfolipase-D, ou uma proteína fusão recombinante GFP-fosfolipase-D mostraram a ligação direta da toxina à membrana dos eritrócitos humanos. Além disso, eritrócitos incubados com a toxina recombinante reagiram com anexina-V e tiveram alteração do seu perfil de distribuição dos microdomínios lipídicos, corroborando com uma mudança no conteúdo de fosfolipídios da membrana tratada, que passou a expor na superfície celular um fosfolipídio carregado negativamente, a fosfatidilserina, mostrando também uma reorganização dos componentes da membrana lipídica. Adicionalmente, três quelantes de íons divalentes (EGTA, EDTA e 1,10-fenantrolina) inibiram significativamente a hemólise induzida pela fosfolipase-D (a qual contém magnésio, no domínio catalítico), em comparação ao PMSF, um inibidor de serino-protease, que não teve efeito sobre hemólise, sugerindo que a catálise está envolvida na hemólise. Finalmente, usando uma fosfolipase-D recombinante com mutação sítio-dirigida no domínio catalítico, na qual foi substituída a histidina da posição 12 por uma alanina, a hemólise e as alterações morfológicas dos eritrócitos foram completamente inibidas. No entanto, a toxina mutada não perdeu a capacidade de ligar-se à superfície dos eritrócitos, o que reforça a idéia do envolvimento da atividade catalítica da enzima no efeito hemolítico e nas alterações celulares, mas não apenas vinculada à ligação da toxina na superfície celular. Desse modo, os resultados aqui descritos fornecem evidências de que a fosfolipase-D do veneno de L. intermedia desencadeia a hemólise direta sobre de eritrócitos humanos de maneira dependente da atividade catalítica. Brown spiders have world-wide distribution and accidents that are considered health problem especially in South America are named loxoscelism. Victims followed accidents present necrotic cutaneous lesions surrounding the bites and in a less intensity systemic signs such as renal failure, disseminated intravascular coagulation, and hemolysis. Here, we studied the molecular way by which a purified recombinant toxin from the venom gland, biochemically characterized as phospholipase-D, causes hemolysis. Toxin treatment of human blood erythrocytes experimentally induced direct hemolysis in a dose-dependent concentration manner and in a time-dependent way. Erythrocytes exposed to the recombinant phospholipase-D toxin showed morphological changes in size and shape of cells in a timedependent manner. Also, hemolysis was not dependent of ABO group and Rhesus systems, since human erythrocytes from all blood group treated by recombinant toxin suffered hemolysis in a similar manner. The direct lysis of erythrocytes evoked by recombinant phospholipase-D depends on animal species tested, since erythrocytes from human, rabbit and sheep suffered hemolysis in higher percentage than horse erythrocytes. Confocal microscopy and immunofluorescence assay using antibodies against phospholipase-D, as well as cell cytometry and confocal microscopy using a recombinant fusion GFP-phospholipase-D protein supported the direct binding of toxin to membrane of human erythrocytes. Moreover, erythrocytes treated by recombinant toxin reacted with annexin-V and had their lipid rafts profile altered, supporting for a changing in the phospholipid membrane contend of treated cells exposing negatively charged phosphatidylserine at the cell surface, and for a reorganization of membrane lipid components. Additionally, three divalent ion chelators (EGTA, EDTA and 1,10-phenanthroline), significantly inhibited hemolysis evoked by phospholipase-D (that has magnesium at the catalytic domain), as compared to PMSF a serine-protease inhibitor that had no effect upon hemolysis, suggesting catalysis as involved upon hemolysis. Finally, by using a site directed mutated recombinant phospholipase-D at the catalytic domain, substituting histidine at position 12 by alanine, the hemolysis and morphologic changes of erythrocytes were completely inhibited, but not the toxin binding on the erythrocytes surface, supporting that the catalytic activity of enzyme is involved on hemolysis and cellular alterations but not on the toxin cell binding. Thus, results described herein provide evidence that phospholipase-D from L. intermedia venom stimulates direct hemolysis upon human blood cells in a catalytic-dependent way.

Orientador : Silvio Sanches Veiga Co-orientador : Waldemiro Gremski Dissertaçao (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciencias Biológicas, Programa de Pós-Graduaçao em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 2008 Inclui bibliografia e anexos Área de concentraçao : Biologia celular e molecular Acidentes provocados pela picada de aranhas marrons (Gênero Loxosceles) estão relacionados com manifestações clínicas, incluindo dermonecrose com espalhamento gravitacional e envolvimento sistêmico que pode incluir insuficiência renal, trombocitopenia e hemólise. No presente trabalho, usando camundongos expostos a um tipo selvagem de fosfolipase – D recombinante (toxina dermonecrótica) e uma isoforma dessa toxina mutada no sítio catalítico, fomos capazes de mostrar que o mecanismo pelo qual o veneno provoca danos renais é dependente da atividade catalítica da enzima. Análises por microscopia óptica de biópsia renal de camundongos tratados com a toxina selvagem dermonecrótica recombinante "LiRecDT1" mostraram alterações morfológicas incluindo edema glomerular, eritrócitos e colapso do Espaço de Bowman, deposição de material protéico dentro do lúmen tubular e edema tubular, mas ausência de nefrotoxicidade para camundongos tratados com a isoforma da toxina mutada. Análises ultraestruturais por microscopia eletrônica de transmissão confirmam a citotoxicidade da toxina selvagem apontando distúrbios na estrutura glomerular em podócitos e no endotélio fenestrado. Alterações nos túbulos incluem deposição de material amorfo, edema do lúmen e um grande acúmulo de corpos multivesiculares bem como de estruturas elétron-densas no interior das células epiteliais. Adicionalmente, análises bioquímicas da urina e do sangue mostraram que a toxina selvagem induziu alterações na função renal como, hematúria e azotemia com elevação de uréia no sangue. Além disso, animais tratados com a fosfolipase – D selvagem tiveram proteinúria evidente, já a toxina mutada causou apenas atividade residual. Diferenças biológicas entre as toxinas recombinantes foram corroboradas através de ensaios de letalidade, que mostraram oligúria e mortalidade dos animais tratados com a toxina selvagem, porém ausência nos animais expostos à toxina mutada. Imunofluorescência com anticorpos que reconhecem a toxina fosfolipase–D foi analisada por microscopia confocal revelando deposição, tanto da toxina do tipo selvagem quanto a mutada, ao longo das estruturas tubulares renais. Por imunoblot utilizando soro hiperimune que reconhece a fosfolipase - D do veneno sobre urina de ratos tratados com as toxinas, nós detectamos sinal positivo na região de 30kDa de animais tratados com toxina do tipo selvagem, mas nenhuma reação positiva na urina de camundongos expostos à toxina mutada. Do mesmo modo, a toxina do tipo selvagem causou alterações morfológicas em células MDCK (epiteliais tubulares), incluindo aparecimento de vacúolos citoplasmáticos, defeito na adesão célula-célula e com o substrato de cultura. Também, tratamento com a toxina selvagem inibiu a viabilidade das células MDCK avaliadas pelo ensaio de captação do corante vital vermelho neutro, enquanto a isoforma mutada não apresentou nenhuma atividade. Assim, com base nos dados atuais, temos definida pela primeira vez na literatura um mecanismo molecular para a nefrotoxicidade causada pelo veneno de Loxosceles intermedia dependente da atividade catalítica da toxina fosfolipase – D. Accidents evoked by the bites of brown spiders (Loxosceles genus) are related to clinical manifestations including skin necrosis with gravitational spreading and systemic involvement that may include renal failure, hemolysis and thrombocytopenia. In the present report, by using mice exposed to recombinant wild-type phospholipase-D (dermonecrotic toxin) and a mutated toxin isoform at the catalytic domain, we were able to show that the mechanism by which the venom induces renal damage is dependent on the catalytic activity of the enzyme. Light microscopy analysis of renal biopsies from recombinant wild-type phospholipasetreated mice showed morphologic alterations including glomerular edema, erythrocytes and collapse of Bowman’s space, deposition of proteinaceus material within the tubular lumen and tubular edema, but absence of nephrotoxicity for mutated toxin-treated animals. Ultrastructural analysis through transmission electron microscopy confirmed wild-type toxin cytotoxicity pointing disorders of glomerular filter structure at foot processes and fenestrated endothelium membrane. Tubule alterations include deposits of amorphous material and edema of tubular lumina and increase in epithelial cytoplasmic multivesicular bodies and electron dense structures. Additionally, biochemical analyses of urine and blood showed that wild-type toxin induced changes in renal function causing hematuria and azotemia with elevation of blood urea. Moreover, wild-type phospholipase-D treatment induced proteinuria, whereas mutated toxin caused only residual activity. Biological differences for recombinant toxins were corroborated through mice lethality experiments, which showed oliguria and animal mortality after wild-type treatments, but an absence of lethality following mutated toxin exposure. Immunofluorescence with antibodies to phospholipase-D toxin and confocal microscopy analysis showed deposition of both wild-type and mutated toxins along the renal tubular structures. Immunoblotting with a hyperimmune antiserum against venom phospholipase on urine from toxins-treated mice, we detected a positive signal at region of 30kDa to animals treated with wild-type toxin, but no reaction on urine of mice exposed to mutated toxin. Similarly, wild-type toxin treatment caused morphological alterations of MDCK cells including appearance of cytoplasmic vacuoles, evoked impaired spreading cells detached from each other and from the culture substratum. Wild-type phospholipase toxin treatment of MDCK cells changed their viability evaluated by Neutral-Red Uptake, while mutated isoform had no activity. Thus, on the basis of the present data, we have defined for the first time at literature a molecular mechanism for Loxosceles venom nephrotoxicity dependent on the catalytic activity of phospholipase-D toxin.

Orientador: Silvio Sanches Veiga Co-orientador: Waldemiro Gremski Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciencias Biológicas, Programa de Pós-Graduaçao em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 2006 Inclui bibliografia e anexos O loxoscelismo, que é o termo usado para determinar o envenenamento por picada de aranha marrom (gênero Loxosceles), tem como característica marcante o aparecimento de lesão dermonecrótica com espalhamento gravitacional e placa marmórea. Dentro os vários componentes que formam o veneno da aranha marrom, uma das moléculas mais estudadas é a esfingomielinase D, responsável pela dermonecrose. Por isso esta enzima em particular tem sido alvo de estudos de biologia molecular com o objetivo de clonagem e expressão. Nosso grupo de pesquisa produziu uma biblioteca de cDNA a partir de glândulas produtoras de veneno de L. intermedia e rastreando vários clones descobriu uma família de esfingomielinases denominadas LiRecDT (Toxina Dermonecrótica Recombinante de Loxosceles intermedia). Neste trabalho foram produzidos anticorpos policlonais em coelho e camundongo com a inoculação da isoforma L1RecDT1 e veneno total. Estes anticorpos foram utilizados para mostrar a reatividade cruzada entre os anticorpos que foram gerados para a LiRecDT1 ou veneno e as outras 4 isoformas clonadas e expressas (LiRecDT2, LiRecDT3, L1RecDT4 e LiRecDT5) e relacionou a reatividade com outros parâmetros como atividade esfingomielinásica, capacidade dermonecrótica e características histológicas da lesão como infiltrado infamatório. A reatividade com os anticorpos foi maior com a LiRecDTI, seguida pela LiRecDT2 e a LiRecDT3 teve a menor reatividade. Estes dados seguiram a mesma proporção para os parâmetros de dermonecrose e atividade esfingomielinásica e infiltrado infamatório. As LiRecDT4 e LiRecDT5 foram também testadas resultando uma reatividade intermediária, onde a LiRecDT4 teve atividade esfingomielinásica e dermonecrótica maior que a LiRecDT5, porém menor que a LiRecDT1 e muito próxima da LiRecDT2. Este trabalho também buscou a clonagem de uma sexta isoforma de proteína dermonecrótica, a LiRecDT6. Esta enzima foi rastreada da mesma biblioteca, contudo se apresentava de forma incompleta faltando uma parte da fração 5'. Para se obter o cDNA completo se realizou uma técnica de 5' RACE usando-se mRNA obtido de extrato de glândula produtora de veneno de L. intermedia. Com o auxílio desta técnica foi possível se obter o cDNA completo e comprovando-se a existência de uma sexta isoforma de esfingomielinase D no veneno de L. intermedia, reforçando dados publicados pelo grupo e da literatura sobre a existência de uma família de proteínas dermonecróticas intra-espécie. Loxoscelism (the condition produced by the bite of brown spiders) has been reported worldwide, but especially in warmer regions. Clinical manifestations include skin necrosis with gravitational spreading while systemic loxoscelism may include renal failure, hemo!ysis and thrombocytopenia. The venom contains several toxins, of which the best biochemicaNy and biologically studied is the dermonecrotic toxin, a sphyngomyelinase. Purified toxin induces cutaneous and systemic loxoscelism, especially necrotic lesions, hematotogical disturbances and renal faNure. Herein, we describe cloning, heterologous expression and purification of two novel isoforms of the dermonecrotic toxin: L,RecDT4 and LiRecDT5. The recombinant proteins stably expressed in Escherichia coli cells were purifled from culture supernatants in a single step using Ni2-chelating chromatography producing soluble proteins of 34kDa (LiRecDT4) and 37kDa (LiRecDT5). Both proteins were recognized by whole venom serum antibodies and by a specific antibody to dermonecrotic toxin. Also, recombinant isoforms with lipase activity induced experimental skin lesions and caused a massive inflammatory response in rabbit skin dermis. Nevertheless, recombinant toxins displayed differential activities of platelet aggregation, increase in vascular permeability as well as not caused death in mice. These characteristics in combination with funttional studies iliustrates that a family of dermonecrotic toxins exists, and includes two novel members that are useful for future structural and functíonal studies. They will also be useful in biotechnological ends, for example, as inflammatory and platetet aggregating studies and antigens for serum therapy source.

Orientador : Prof. Dr. Waldemiro Gremski Co-orientador : Prof. Dr. Carlos Ricardo Soccol Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Tecnologia, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Defesa: Curitiba, 20/12/2006 Inclui referências : f. 87-95 Área de concentração: Saúde animal e humana Resumo: No infarto do miocárdio e na doença de Chagas existem alguns mecanismos fisiopatológicos em comum: perda de cardiomiócitos devido à isquemia, à redução da contratilidade e à disfunção cardíaca. A terapia celular vem propondo o tratamento para a falência cardíaca usando vários tipos celulares. Objetivos: Desenvolver e avaliar o método de co-cultivo de mioblastos esqueléticos e célulastronco mesenquimais para a terapia celular no infarto do miocárdio (IM) e na doença de Chagas (DC). Materiais e métodos: IM- 39 ratos completaram o estudo após um mês, 17 ratos receberam a terapia com o produto celular do co-cultivo e 22 ratos, receberam apenas meio na cicatriz. Na DC- 15 ratos completaram o estudo após um mês, 07 ratos receberam o produto celular de co-cultivos autólogos e 08 receberam apenas o meio. Todos os animais realizaram ecocardiograma antes e após um mês de terapia. Os parâmetros analisados foram: fração de ejeção ventricular esquerda (FEVE); volume sistólico e diastólico finais. A análise estatística pela ANOVA. O cocultivo de mioblastos esqueléticos e células-tronco mesenquimais mantido por um período de 14 dias (DMEN, 15% SFB, 1% Antibiótico, IGF-I e dexametasona). Análises histológicas, de rotinas, foram realizadas. Resultados: Entre as provas funcionais verificou-se no grupo IM FEVE, nos animais, que receberam células do co-cultivo de 23,52 8,67 a 31,45 8, 87 (p=0,006) e no grupo 26,68 6,92 a 22,32 6, 94 (p=0,004) e no grupo DC FEVE, nos animais que receberam células do cocultivo de 31,10 5,78 a 53,37 5, 84 (p

Orientador : Silvio Sanches Veiga Co-orientador : Waldemiro Gremski Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciencias Biológicas, Programa de Pós-Graduaçao em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 2005 Inclui bibliografia Esta tese está baseada na publicação de três artigos científicos os quais versam sobre a ação do veneno da aranha marrom (Loxosceles intermedia) sobre células da medula óssea e sangue periférico, utilizando como modelo animal coelhos. Ação do veneno da aranha marrom sobre o tecido renal, utilizando camundongos como modelo animal, tendo como enfoque a participação de células da medula óssea e do sangue periférico na nefrotoxicidade e uma revisão sobre loxoscelismo em um período compreendido entre 1993 e 2003. O objetivo do primeiro artigo publicado foi mostrar alterações celulares que ocorrem na medula óssea e sangue periférico de coelhos após a exposição aguda ao veneno da L. intermedia. Doses de 40 µg de proteínas do veneno (que corresponde a quantidade média de veneno inoculada pela aranha) foram injetadas na derme de 5 coelhos usando como controle outros 5 coelhos, tendo sido injetado nestes PBS, que também foi utilizado como solvente do veneno. Amostras de medula óssea e sangue periférico foram obtidas antes do envenenamento e 4, 8, 12, 24 e 48 horas e 5, 10, 15, 20 e 30 dias após o envenenamento. Na medula óssea observou-se a celularidade, células vermelhas nucleadas, megacariócitos e neutrófilos. No sangue periférico foi realizado o hemograma. O objetivo do trabalho foi verificar se o veneno tem um efeito direto sobre as células da medula óssea e sangue periférico, se as alterações são secundárias às necessidades teciduais e se há uma correlação entre a histopatologia e os achados hematológicos após a exposição ao veneno. A série vermelha não foi afetada pelo veneno, somente os eritroblastos apresentaram um decréscimo. A depleção medular de megacariócitos teve uma boa correlação com a trombocitopenia periférica, a qual correlacionou-se com os achados histopatológicos, obtidos a partir de biópsias da pele de coelhos. A queda da celularidade e dos neutrófilos medulares correlacionou-se significativamente com as alterações neutrofílicas periféricas. A trombocitopenia e a neutropenia em sangue periférico são devidas a depleção medular pela migração plaquetária e neutrofílica ao sítio inflamatório. Se o veneno tem um efeito direto sobre a medula óssea este foi transitório. No segundo trabalho publicado foi injetado intraperitonealmente 100 µl de veneno da L. intermedia diluído em PBS, equivalente a 1 mg de proteína/kg de peso, em 50 camundongos (grupo tratado). O grupo controle foi representado por 50 camundongos que receberam somente PBS. O camundongo foi utilizado como modelo animal pelo fato de não desenvolver lesão dermonecrótica, portanto qualquer lesão renal não pode ser atribuída a uma conseqüência secundária da lesão dermonecrótica. O objetivo do trabalho foi mostrar que o veneno induz diretamente o dano renal. Análises de biópsias renais ao microscópio óptico mostraram hialinização dos túbulos proximais e distais, eritrócitos nos espaços de Bowman’s, colapso glomerular, bolhas e vacúolos em células epiteliais celulares, edema intersticial e deposição de material eosinofílico no lúmen dos túbulos. O veneno causou aumento da concentração plasmática de uréia e não houve decréscimo da fração C3 do complemento. Não causou hemólise evidente "in vivo" porque não houve alteração da contagem de eritrócitos, da concentração de hemoglobina e determinação do hematócrito entre o grupo controle e o tratado. Também não foi evidenciada hemoglobinúria ou hematúria. Os dados experimentais apresentados evidenciam uma ação nefrotóxica direta do veneno da L. intermedia. O terceiro artigo publicado trouxe uma revisão sobre o loxoscelismo, nos últimos dez anos, enfocando a biologia e a epidemiologia da aranha marrom, os achados histopatológicos e alterações celulares após a exposição ao veneno. Mostra as toxinas identificadas e caracterizadas no veneno total, o mecanismo de desenvolvimento do quadro dermonecrótico e sistêmico causados pelo acidente com a aranha marrom, a imunogenicidade, as características clínicas, o diagnóstico e a terapia utilizada no tratamento do loxoscelismo. Por fim os produtos de biotecnologia já descritos e as proteínas clonadas até então This tesis is based in three papers. The purpose of the first work was to find out the cellular changes occuring in bone marrow and peripheral blood after acute exposure to the venom of Loxosceles intermedia. Doses of 40 ìg of venom were injected intradermally into five rabbits, and five rabbits receiving only phosphate-buffered saline (PBS) were used as controls. Bone marrow and peripheral blood samples were obtained before the envenomation and 4, 8, 12, 24 and 48 h, and 5, 10, 15, 20 and 30 days after envenomation. In bone marrow samples we assessed cellularity, nucleated red cells, megakaryocytes and neutophils, and in peripheral blood we assessed red cells (red cell concentration, hemoglobin and hematocrit), leukocytes, neutrophils and platelets. Our objective was to find out if the venom has a direct effect on bone marrow and peripheral blood or if changes in both of them are secondary to the needs of tissues, and if there is a good correlation between histopathological and hematological findings. We found that the red cell parameters were not affected by the venom, except for nucleated red cells which decreased after venom exposure. The depression of megacaryocyte numbers and thrombocytopenia showed a strong correlation with the histopathological changes observed in skin biopsies obtained from the rabbits. The changes in cellularity and neutrophils of bone marrow were strongly correlated with those in peripheral blood and skin. The thrombocytopenia and neutropenia in peripheral blood are due to marrow depression, which may be a consequence of an extensive migration of platelets and neutrophils to the necrotic lesion or the marrow depression may be a transitory effect of evenoming by L. intermedia. In the second work mice were exposed to L. intermedia venom with the aimed to show whether the venom directly induces renal damage. Mice were used as animal model because they did not develop dermonecrotic lesion. The experimental groups were composed of 50 mice as control and 50 mice that received the venom. Light microscopic analysis of renal biopsy specimens showed alterations including hyalinization of proximal and distal tubules, erytrocytes in Bowman’s space, glomerular collapse, tubule epithelial cell blebs and vacuoles, interstitial edema, and deposition of eosinophilic material in the tubule lumen. We also found that the venom caused azotemia with elevation of blood urea levels but did not decrease C3 complement concentration or cause hemolysis in vivo, because neither red blood cell count, hemoglobin, or hematocrit values showed significant differences between the venom-treated and control groups. No hemoglobinuria or the presence of red blood cells in urine was observed. The data provide experimental evidence that L. intermedia venom is directly involved in nephrotoxicity. The last work, a review, had the purpose to describe some insights into loxoscelism obtained over the last ten years. The biology and epidemiology of the brown spider, the histopathology of envenomation and the immunogenicity of Loxosceles venom are reviewed, as well as the clinical features, diagnosis and therapy of brown spider bites. The identification and characterization of some toxins and the mechanism of induction of local and systemic lesions caused by brown spider venom are also discussed. Finally, the biotechnological application of some venom toxins are covered.

Orientadora : Dorly de Freitas Buchi Co-orientador : Waldemiro Gremski Dissertaçao (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciencias Biológicas, Programa de Pós-Graduaçao em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 2005 Inclui bibliografia Resumo: Homeopatia é um sistema terapêutico usado por milhões de pessoas há 200 anos. Macrófagos estão envolvidos em muitos diferentes processos, cujas principais funções são fornecer uma linha de defesa contra microrganismos invasores e células tumorais. Uma vez que medicamentos homeopáticos visam a ativação das próprias defesas do organismo para eliminar a doença, estudos baseados em cultivos obtidos de macrófagos podem ser úteis para esclarecer algumas questões. Com esse objetivo, nós estudamos os efeitos do tratamento in vitro de sete medicamentos homeopáticos, amplamente usados, em diversas diluições sobre os macrófagos obtidos de camundongos. Macrófagos foram obtidos de camundongos suíços e as culturas foram tratadas com 20% de cada solução sucussionada. Aconitum napellus (Acon), Arsenicum album (Ars), Belladonna (Bell), Bryonia alba (Bry), Lachesis muta (Lach), Mercurius solubilis (Merc sol) and Thuya occidentalis (Thuj) foram testados em diversas diluições (CH e DH) com três grupos controles: tratadas com o medicamento Canova, com etanol a 1% e sem tratamento algum. As células foram fixadas, coradas e observadas em microscopia de luz. Citocinas Th1/Th2 foram mensuradas no sobrenadante da cultura através do citômetro de fluxo. A produção de NO foi detectada no sobrenadante da cultura através de reação com o reagente de Griess. 50ng/ml LPS and 26U/ml IFN-gama foram usados como controle positivo. Após essas duas análise nós fizemos uma sobreposição dos dados e foi possível distinguir dois grupos de medicamentos baseados em respostas imunes Th1 e Th2. O primeiro grupo, Th 30CH; La 12, 200; CH, Ar 6CH; Me 6, 12CH; Be 6, 30 e 200CH, mostrou aumento na liberação de IFN-gama. E o segundo grupo, Ac 30CH; Me 200CH, aumentou a liberação de IL-4. As outras citocinas testadas, TNFa, IL-2 e IL- 5, não foram alteradas com a metodologia estudada. Todos os medicamentos acima testados induziram a produção de NO. IFN-gama possui um importante papel na promoção de respostas Th1 participando na defesa do hospedeiro contra infecções virais e agentes patológicos juntamente com NO. IL-4 leva a imunidade humoral via resposta Th2 e está envolvida na proliferação e diferenciação de células B, além de Ter um importante papel na inflamação e hematopoiese. Nosso estudo mostrou que vários medicamentos preparados homeopaticamente, mesmo aqueles que ultrapassam o número de Avogadro, atuam sobre macrófagos peritoneais de camundongos, quando tratados in vitro, ativando-os morfologicamente, estimulando a produção de citocinas Th1/Th2 e de óxido nítrico Abstract: Homeopathy is a 200-year-old therapeutic system, which has been used by millions of people. In spite of the fact that homeopathic practitioners often paint a convincing picture of homeopathy clinical effectiveness, research evidences explaining how it actually works are lacking. Macrophages are involved in many different processes but their main function is to provide a defense line against microbial invasion and tumor cells. Once homeopathic medications are aimed at activation of the body’s own defense mechanisms to fight an existing disease, assays based in macrophages culture may be useful to enlighten some questions. We now carry on an investigation to evaluate the effects of in vitro administration of seven widely used homeopathic compounds in several dilutions on mice macrophages. Well-structured methodological studies may be useful to understand how homeopathy treatment works. Macrophages were obtained from Swiss mice and the cultures were treated in vitro with 20% of sucussioned solutions of Aconitum napellus (Acon), Arsenicum album (Ars), Belladonna (Bell), Bryonia alba (Bry), Lachesis muta (Lach), Mercurius solubilis (Merc sol) and Thuya occidentalis (Thuj) were tested in several CH dilutions with three control groups: treated with Canova medication, with 1% ethanol and withouth treatment. The cells were fixed, stained and observed under light microscopy. Mouse Th1/Th2 cytokine CBA kit for flow cytometry was used to determine cytokines in the culture supernatant. NO generation was estimated in cellfree supernatant, which was mixed with an equal volume of Griess reagent. 50ng/ml LPS and 26U/ml IFN-gama were used as positive control. It was possible to distinguish two groups of medication based Th1 and Th2-type response: the first group, Thuj 30CH; Lach 12, 200; CH, Ars 6CH; Merc sol 6, 12CH, Bell 6, 30 and 200CH, presented an increase in IFN-g production and the second one, Acon 30CH; Merc sol 200CH, increased IL-4 production. The others supernatant cytokines, TNF-g, IL-2 and IL-5, were not altered when this methodology was applied. All tested medication induced NO production. IFN-gama plays a role in promotion Th1 cell responses. It is an important cytokine in the host defense against infection by viral and microbial pathogens together with NO. IL-4 leads to Th2-type humoral immunity and it is involved in the proliferation and differentiation of B cells and IL-4 has an important role in inflamation and hematopoiesis. All together these data indicate that even the most diluted medication used, CH200, show a biological response, as observed on macrophages metabolism, activated morphologically, cytokine and oxide nitric production.

Orientador : Silvio Sanches Veiga Co-orientador : Waldemiro Gremski Dissertaçao (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular Molecular. Defesa: Curitiba, 14/09/2004 Inclui bibliografia Resumo: Estudando o extrato de cerdas da lagarta Lonomia obliqua, detectamos uma atividade lítica sobre moléculas de ácido hialurônico. O extrato de cerdas também foi capaz de degradar condroitim sulfato purificado, porém, incapaz de hidrolisar moléculas de heparam sulfato e dermatam sulfato. Além disso, por meio de ensaios de cinética de degradação de ácido hialurônico, observamos que esta atividade lítica é causada por uma enzima do tipo hidrolase e não do tipo liase. Baseando-se no método colorimétrico descrito por Reissig et al (1955), concluímos que esta hidrolase atua como uma enzima do tipo ß- endohexosaminidase originando resíduos terminais de açúcares Nacetilglucosamina após a lise do ácido hialurônico, ao invés de agir como uma enzima do tipo ß-endoglucuronidase que, por sua vez, gera resíduos de ácido glucurônico. Análises do extrato de cerdas por zimografia resultaram na identificação de moléculas com atividade lítica sobre o ácido hialurônico com mobilidade eletroforética difusa de 49kDa e 53kDa. Uma avaliação da atividade destas moléculas em função do pH mostrou que estas enzimas não apresentam atividade aparente em pH abaixo de 5,0 e acima de 8,0 e indica que a faixa de pH ótimo para a atividade enzimática está entre 6,0 e 7,0. Por fim, através de reação de fluorescência e análise em microscopia confocal, pudemos comprovar a ação de clivagem do extrato de cerdas sobre o ácido hialurônico organizado na matriz extracelular de derme de coelho. Estes dados nos fornecem evidências experimentais sobre a presença de hialuronidases no extrato de cerdas de L. obliqua, que possivelmente, podem estar envolvidos com os efeitos nocivos desencadeados no envenenamento. Inúmeros constituintes moleculares diferentes têm sido estudados a partir dos produtos de secreção da lagarta L. obliqua e entre eles se destacam as serinoproteases com atividade pró-coagulante e/ou fibrinogenolítica. Com base nestes dados, consideramos a hipótese de identificar e caracterizar um inibidor de serinoprotease na hemolinfa da lagarta com possível função de proteção contra suas próprias toxinas, ou mesmo, com função tóxica durante os acidentes. Experimentos utilizando fibronectina como substrato protéico para diferentes proteases (tripsina, elastase, quimiotripsina, proteinase K, papaína, pepsina e colagenase V) foram realizados na presença de hemolinfa. O perfil de degradação da fibronectina foi avaliado por ensaios de Western Blotting utilizando anticorpos que reconhecem fibronectina. A atividade proteolítica da tripsina, elastase, quimiotripsina e proteinase K foi inibida pela hemolinfa da lagarta. Esta atividade inibitória detectada foi avaliada sob diferentes temperaturas de incubação, mostrando que o inibidor de protease presente na hemolinfa é funcional a 4, 20, e 37°C. Além disso, experimentos adicionais mostraram que esta atividade inibitória da hemolinfa também ocorre quando tripsina é incubada com diferentes substratos protéicos (fibrinogênio, laminina e vitronectina). Com o intuito de purificar a molécula do inibidor de protease, alíquotas de hemolinfa bruta de L. obliqua foram submetidas a ensaios de cromatografia de gel filtração utilizando resina Sephadex G-100 seguidos de ensaios de cromatografia de afinidade utilizando resina tripsinaagarose. As frações eluídas das cromatografias foram monitoradas para a presença de proteínas por absorbância em 280nm e submetidas à incubação com fibronectina e tripsina para detecção da atividade inibitória observada por SDS-PAGE 7,5%. Para fortalecer este resultado foi realizado um zimograma reverso, utilizando gelatina como substrato, em que as frações com atividade inibitória foram avaliadas. Sob estas condições, identificamos um inibidor de serinoprotease na hemolinfa da lagarta L. obliqua com mobilidade eletroforética na região de 21kDa. Com o objetivo de avaliar o grau de reversibilidade da inibição da atividade proteolítica pela ação do inibidor de protease, alíquotas de tripsina pré-incubada com as frações enriquecidas da cromatografia foram submetidas a experimentos de zimograma com gelatina impregnada. Com isso pudemos observar que a interação inibidor-protease é resistente ao SDS e à eletroforese gerando alteração na mobilidade da tripsina mas não inativando irreversivelmente a sua atividade. Especulando sobre uma futura aplicação biotecnológica deste inibidor, realizamos um experimento, para avaliarmos a possível inibição da ação da molécula de trombina quando na presença de fibrinogênio em solução, em que trombina foi pré-incubada com as frações enriquecidas da cromatografia de gel filtração e depois adicionada à uma solução de fibrinogênio. Pudemos observar que, respeitando uma característica importante dos inibidores de protease que possuem aplicações no campo terapêutico, o inibidor de serinoprotease da hemolinfa da lagarta L. obliqua não foi capaz de inibir a atividade da trombina, uma importante enzima da cascata de coagulação Abstract: By studying Lonomia obliqua (caterpillar) bristles extract we were able to detect a lytic activity on purified hyaluronic acid. Also, the bristle extract hydrolyses purified chondroitin sulphate, but was unable to degrade either heparan sulphate or dermatan sulphate. Moreover, through purified hyaluronic acid-degrading kinetic assays, we observed that this lytic activity was caused by a hydrolase instead a lyase enzyme. In addition, by using the colorimetric reaction of Reissig (1955), we detected this hyaluronic acid hydrolase action as a ß-endohexosaminidase enzyme originating terminal N-acetylglucosamine residues instead a â-endoglucuronidase that might originate glucuronic acid residues. Zymogram analysis of the bristle extract detected 49kDa and 53kDa molecules with hyaluronic acid lytic activity. An examination of these hyaluronic acid degrading activities as function of pH showed that these hydrolases had no apparent activities at pH below 5.0 and higher than 8.0 and displayed their optimal activities at pH ranging from 6.0 to 7.0. Finally, through a fluorescence reaction to hyaluronic acid and confocal microscopy, we further comproved this cleaving action upon hyaluronic acid organised on the extracellular matrix of the rabbit dermis. The data provide experimental evidence of the presence of hyaluronidases in the L. obliqua bristle extract, probably involved on the harmful effects of the venom. Several different molecular constituents have been described in L. obliqua secretion products and among them serineproteases with procoagulant and fibrinogenolytic activity were identified in its bristles. Based on these results, we have considered the hypothesis of identifying a serineprotease inhibitor in caterpillar haemolymph with possible self defense function against their own toxins or even deleterious activities during accidents. Experiments using fibronectin as a protein substrate for different proteases such as trypsin, elastase, chymotrypsin, proteinase K, papain, pepsin and collagenase V were performed in the presence and absence of haemolymph. Fibronectin degradation profile was evaluated by Western Blotting assays using antibodies that recognize fibronectin. The proteolytic activities of trypsin, elastase, chymotrypsin and proteinase K were inhibited by incubation with L. obliqua haemolymph. This inhibitory activity was also evaluated at different temperatures showing that the inhibitor is functional at 4, 20, and 37°C. In addition, experiments showed that this inhibitory activity also occurs when trypsin was incubated with different substrates such as fibrinogen, laminin and vitronectin molecules. With the goal of purify the inhibitor molecule, haemolymph was submitted to a Sephadex G-100 gel filtration chromatography followed by an affinity chromatography using trypsin-agarose. Eluted fractions were monitored for the presence of proteins by absorbance at 280nm and were submitted to incubation with fibronectin and trypsin for detection of inhibitory activity that was observed by SDS-PAGE 7,5%. To ensure this result, a reverse zymography of the fractions with activity was performed using gelatin as substrate. Under these conditions, we were able to identify a trypsin inhibitor with a diffuse eletrophoretic mobility apparently at 21kDa region in L. obliqua haemolymph. Next, we studied the mechanism by which haemolymph serine protease inhibitor inactivates proteases. Trypsin was incubated with Sephadex G-100 enriched fractions and then electrophoresed by using a SDS-PAGE (experimental procedure that is able to separate protease from protease inhibitor in case of reversible inhibition), followed by a gelatin-zymogram. This assay suggest that protease inhibitor interaction with trypsin was resitent to SDS and electrophoretic separation conditions, altered trypsin mobility but did not inactivate its proteolytic activities in a unreversible manner. Then, speculating about the biotechnological applications of this protease inhibitor, we evaluated the ability of this molecule inhibit the thrombin activity upon fibrinogen. Aliquots of thrombin were pre-incubated with Sephadex G-100 enriched fractions and, then, incubated with fibrinogen solution. This result showed that the haemolymph serine protease inhibitor is unable to block fibrinogen-thrombin dependent clotting in vitro, as well as waited for all protease inhibitors use.

Orientador: Waldemiro Gremski Co-orientador: Silvio Sanches Veiga Dissertação( mestrado ) - Universidade Federal do Parana, Setor de Ciencias Biologicas Resumo: O presente trabalho teve como objetivo, estudar, a morfologia das glândulas produtoras de veneno da aranha L intermedia, bem como esclarecer questões relacionadas ao perfil e funções dos oligossacarídeos conjugados às glicoproteínas deste veneno. A aranha marrom, do gênero Loxosceles, tornou-se de grande importância médica, devido aos acidentes de envenenamento (loxoscelismo) que vem ocorrendo em diferentes partes do mundo. As atividades biológicas do veneno da aranha marrom normalmente incluem lesões dermonecróticas no local da picada, acompanhadas por efeitos hemolíticos e hemorrágicos e também pelo quadro clínico de insuficiência renal aguda (IRA). Pelo uso de microscopia óptica, microscopia eletrônica de transmissão e de varredura, demonstrou-se que a organização das glândulas produtoras de veneno de Loxosceles intermedia seguem a arquitetura geral das glândulas de veneno de outras aranhas. A microscopia eletrônica de varredura mostrou que as glândulas de veneno são estruturas pares, situadas no cefalotórax e que descarregam seus produtos de secreção diretamente em um par de tubos ligados a cada quelícera. Usando-se microscopia óptica e microscopia eletrônica de transmissão, observou-se que as glândulas apresentam camadas de fibras de músculos estriados, em contato com uma membrana basal que separa a região muscular da camada epitelial. As células epiteliais possuem um citoplasma rico em retículo endoplasmático rugoso, mitocôndrias, complexo de Golgi e vesículas secretoras contendo o veneno, uma mistura complexa de proteínas. Com as técnicas de lectina-blotting, cromatografia de afinidade lectínica e tratamentos com glicosidases, detectou-se no veneno estruturas do tipo alta-manose N-ligadas, proteínas com resíduos de fucose N-Iigados e proteínas com resíduos de N-acetilgalactosamina O-ligados, mas ausência de glicosaminoglicanos ou estruturas complexas contendo galactose ou ácido siálico terminais. Com veneno deglicosilado enzimática ou quimicamente, demonstrou-se que a agregação plaquetária (atividade trombocitopênica), como também os efeitos fibronectinolítico e fibrinogenolítico (hemorrágicos), são açúcar-independentes quando comparados com os efeitos do veneno glicosilado. Uma análise através de zimograma copolimerizado em géis de gelatina, mostrou que a loxolisina B, uma metaloprotease gelatinolítica de 32-35 kDa, é uma glicoproteína do tipo alta-manose e que após uma N-deglicosilação enzimática teve seu peso molecular reduzido em aproximadamente 2 kDa e seu efeito gelatinolítico residual em 28%, quando comparado com a molécula glicosilada. Nesta condição apontou também uma atividade gelatinolítica dependente da glicosilação pós-traducional. O tratamento químico ou enzimático do veneno de L. intermedia (deglicosilação), reduziu significativamente seu efeito dermonecrótico quando testado experimentalmente em coelhos. Este dado sugere fortemente que resíduos de oligossacarídeos exercem um importante papel nos efeitos lesivos do veneno da aranha marrom e abre a possibilidade de se postular uma terapia tópica das lesões cutâneas, baseada em carboidratos. Abstract: The objective of the present study was to describe the morphology of the venom glands of L. intermedia, and to study the profile and functions of the oligosaccharides in the proteins of the referred venom. The brown spider, genus Loxosceles, is becoming of great medical importance, with envenomation (Loxoscelism) occurring throughout the world. The biological activities of the brown spider venom usually include dermonecrotic lesions at the bite site accompanied by hemolytic and hemorrhagic effects and also by renal failure. Through light microscopy, transmission eletron microscopy and scanning eletron microscopy, it was demonstrated that the organization of the venom gland of Loxosceles intermedia follows the general architeture of spiders' venom glands. Scanning electron microscopy showed that the venom glands are paired organs located in the céphalothorax, which discharge their secretions directly via a duct to each chelicera. Using light microscopy and transmission electron microscopy we observed that the venom glands of L. intermedia present layers of striated muscle fibers in touch with an extracellular matrix which is a basement membrane structure separating the muscular region from epithelial cells of the venom gland. This structure has a cytosol extremely rich in rough endoplasmic reticulum, mitochondria, Golgi apparatus and secretory vesicles that ultimately produce the venom, a complex protein mixture. Using lectin-immunolabeling, lectin-affinity chromatography, glycosidases and proteinase-K treatments we were able to identify in venom several proteins as N- glycosylated and bearing high-mannose oligosaccharide structures, complex-type glycoconjugates as fucosylated glycans, but absence of galactose or sialic acid residues as complex sugars or glycosaminoglycan residues. Working with enzymatic or chemically deglycosylated venom we found that platelet aggregation (thrombocytopenic activity) as well as fibronectinolytic and fibrinogenolytic (haemorrhagic) effects were sugar-independent when compared to glycosylated venom. Nevertheless zymograph analysis in co-polimerized gelatin gels showed that loxolysin-B, a high-mannose glycoprotein of the venom with 32-35 kDa and gelatinolytic metalloproteinase activity, after enzymatic N-deglycosylation reduces its molecular weight by approximately 2 kDa and gelatinolytic effect to a residual activity of 28% when compared to the glycosylated molecule, pointing to post-translational glycosylation dependent gelatinolytic effect. Analysis of the chemically or enzymatically N-deglycosylated venom for its dermonecrotic effect detected only residual activity when compared with the glycosylated control. Thus, the present report suggests oligosaccharide moieties playing a role in destructive effects of brown spider venom and opens a possibility for a carbohydrate-based therapy.

Orientador: Prof. Dr. Waldemiro Gremski Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Curso de Pós-Graduação em Morfologia Inclui referências: p. 56-62 Área de concentração: Biologia Celular Resumo: O presente estudo objetiva esclarecer a organização histológica e histoquímica da mucosa gástrica do cavalo (Equus caballus, L.) mediante o uso da microscopia óptica e da microscopia eletrônica de varredura. Verificou-se que a mucosa gástrica do cavalo pode ser dividida em região aglandular ou proventricular, também denominada de esofágica, e região glandular. Na porção aglandular do órgão, ocorre um epitélio estratificado pavimentoso não-queratinizado, com provável função de proteção. A lâmina própria, destituída de glândulas, está separada da submucosa pela muscular da mucosa. A região glandular inicia-se abruptamente, no margo plicato, com uma mudança súbita para epitélio simples cilíndrico mucosecretor. Na mucosa glandular é possível distinguir três regiões: cárdica, fúndica e pilórica. A distinção entre as três regiões evidencia-se pela natureza dos produtos secretados pelas glândulas que ali ocorrem, bem como pela quantidade destas últimas. O epitélio de revestimento superficial e as criptas gástricas das três regiões são PAS positivas e AB pH 2,5 e pH 1,0 negativas, evidenciando a presença de carboidratos com características neutras. A região das glândulas, por sua vez, exibiu-se AB pH 2,5 positiva e pH 1,0 negativa, e PAS negativa. Nesse caso conclui-se que os carboidratos produzidos são ácidos não sulfatados. Além das células mucosas, nas glândulas cárdicas verificou-se grupos de células parietais e células APUD isoladas. As glândulas fúndicas são extensas devido à presença de grande quantidade de células mucosas, células parietais, principais e APUD. As glândulas pilóricas apresentam apenas células mucosas e células APUD. Abstract: The present study aims to show the histological and histochemical features of the horse gastric mucosa (Equus caballus, L.), by the use of light microscopy and scanning electron microscopy. It was showed that the horse gastric mucosa can be divided in two regions, the Pars proventricularis or esophagic, which does not present glands, and the glandular region. The non glandular mucosa is lined by nonkeratinized stratified squamous epithelium, probably to protect that area. The lamina propria, without glands, is separated from the underlying submucosa by the muscularis mucosae. The glandular region begins abruptly at the "margo plicato" where the epithelium becomes simple columnar with mucous secreting cells. The glandular stomach can be divided in cardiac, fundic and pyloric regions. The difference between the three regions is based on the nature of the product secreted by the glands and soby their number. The surface epithelium and the gastric pits from these regions were PAS - positive and negative for Alcian blue pH 2,5 and pH 1,0 , showing the neutral nature of the polysaccharides. The glands were AB pH 2,5 positive and negative for AB pH 1,0 and PAS, supporting the acid carboxilated nature of their polysaccharides. Beyond the mucous cells, groups of parietal cells and isolated enteroendocrine (APUD) cells were found on cardiac region. The fundic glands are large because the great number of mucous cells, parietal cells, peptic cells, and APUD cells. The pyloric glands showed mucous cells and APUD cells.

Orientador: Professor Doutor Waldemiro Gremski Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Curso de Pós-Graduação em Morfologia Inclui referências: p. 76-94 Área de concentração: Biologia Celular Resumo: O presente estudo foi elaborado com o objetivo de se comparar duas espécies de teleósteos de hábitos alimentares diversos: Hypostomus commersonii (REIS et al., 1990), iliófago e Rhamdia branneri (HASEMANN, 1911), onívoro. Foi elucidada a anatomia e histologia do estômago em ambas espécies. Embora a arquitetura das sub-camadas histológicas em ambos os animais utilizados obedeça ao plano estrutural válido para os vertebrados em geral, os resultados mostram que há sensíveis diferenças entre os dois órgãos, refletindo a existência de relação entre o hábito alimentar e a estrutura do órgão. Em H. commersonii o estômago tem a forma de um "U", com paredes delgadas, translúcidas e cheias de ar e desempenha função digestivo-respiratória. R. branneri possui estômago tubular, com parede muscular e espessa, funcionando como órgão de natureza digestiva. Em ambas as espécies o estômago pode ser dividido em três regiões: cárdica, fúndica e pilórica. Não há esfincter na junção com o esôfago, sendo que a ocorrência de um esfincter pilórico é nítida na transição com o intestino. A mucosa em H. commersonii é revestida por epitélio pavimentoso simples, com microvilosidades e sem a presença de qualquer tipo de glândula. E visível a presença de grande número de capilares dipostos na lâmina própria, próximos da luz do órgão. Já em R. branneri as células de revestimento são do tipo cilíndrico simples, com ausência de microvilosidades e presença de glândulas tubulares simples, formadas por células oxinto-pépticas intercaladas por algumas células enteroendócrinas. Summary: The present study was carried out with the objective of comparing the stomach of two species of distinct feeding habits teleosts. A normal anatomy and histology of the stomach of both the species was performed. The teleosts studied were Hypostomus commersonii (REIS et ah, 1990), an herbivorous fish and Rhamdia branneri (HASEMANN, 1911), an omnivorous fish. In spite of the four layers that are characteristic in the alimentary tract of the vertebrates have been seen in both the organs studied, it is shown that exist very clear anatomical and histological differences between them. The H. commersonii stomach presents an "U" form, with very thin and translucid walls and normally it is full of air. This kind of stomach can be considered a respiratory and digestive organ. The lamina exhibits many capillaries wich are disposed near the lumen of the organ. In R branneri was found a stomach with a tubular form and presenting a muscular thick wall. It is disposed in a siphonal way and is restricted to be a food deposit with digestive function. In both the species it can be divided in cardiac, fimdic and pyloric regions. At the point of junction with the esophagus is not possible to see any cardiac sphincter while the transition with the intestine occurs through an evident pyloric sphincter in both the animals used in this study. The H. commersonii mucosa is lined by a simple squamous epithelium with short microvilli and gastric glands are not present. In the R branneri stomach the mucosa is recovered by a simple columnar epithelium, the microvilli are absent and simple tubular gastric glands are present, consisting of oxinto-peptic cells, intercalated by some enteroendocrine cells.

Orientador: Prof. Dr. Waldemiro Gremski Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Curso de Pós-Graduação em Morfologia Inclui referências: p. 90-98 Área de concentração: Biologia Celular Resumo: Foi estudada a anatomia, histologia e histoquímica da musculatura estriada esquelética lateral do corpo do teleósteo Astyanax eigenmanniorum Eigenmann, 1910 (Pisces), com o objetivo de se conhecer os diferentes tipos de fibras musculares que ocorrem neste peixe, conhecidas como tipos I, II A e II B, bem como a sua distribuição no corpo do animal. Foram evidenciadas as unidades musculares do animal - os miômeros - entre os quais se interpõe uma delgada camada de tecido conjuntivo, o miosepto. Tais estruturas, observando-se o peixe com a pele destacada, oferecem um aspecto em ziguezague; enquanto isso os cortes transversais revelam uma série de secções cônicas incompletas que se sobrepõem. Cada miômero, quando isolado, evidencia três prolongamentos voltados para a porção anterior e dois voltados para a porção posterior do corpo do animal, o que confere para a unidade muscular a forma de um M. Utilizando-se técnicas histoquímicas, as fibras musculares reagiram de acordo com a sua localização e método adotado. Para as técnicas de detecção da SDH e NADH-TR, a camada muscular vermelha superficial respondeu positivamente, com o mesmo ocorrendo para a técnica para a ATPase miofibrilar a pH 4,6. Tal comportamento levou à conclusão de que esta camada muscular está constituída exclusivamente por fibras do tipo I. Além disso, há as fibras de diâmetro reduzido (FDR) que situam-se próximas ao miosepto que delimita esta camada muscular da seguinte. Tais fibras reagiram às técnicas histoquímicas da mesma forma que as fibras do tipo I. A situação se inverte para as fibras das camadas mais profundas, situadas abaixo da anterior. Nessa região a reação é fraca tanto para a SDH e NADH-TR como também para a ATPase. Por este motivo concluiu-se que tais células representam as fibras classificadas como do tipo II. Ao aplicar-se a reação para as enzimas oxidativas, notou-se uma heterogeneidade na resposta histoquímica das fibras, possibilitando tal método a subdivisão das fibras do tipo II nos subtipos II A e II B, fato que por vezes se repetiu na reação para a ATPase miofibrilar, onde as células do tipo II A e II B apresentaram-se respectivamente mais escuras e mais claras. As fibras do tipo II A ocupam uma região de transição entre as camadas de fibras do tipo I e tipo II B. Por apresentar reação histoquímica em nível intermediário, as fibras do tipo II A são também classificadas como intermediárias. As fibras do tipo II B, por sua vez, são conhecidas também como fibras brancas clássicas.

Orientador: Waldemiro Gremski Dissertaçao (mestrado) -Universidade Federal do Paraná. Curso de Pós-Graduaçao em Morfologia Resumo: No presente trabalho estudou-se o coração de Plecostomus commersornii CUVIER E VALENCIÈNNES, 1840 (PISCES), sob o aspecto anatômico, histológico e ultraestrutural de varredura. Anátomo-estruturalmente o sistema propulsor do sangue de Plecostonmus coumersoniii apresenta-se constituído por três câmaras: bulbo arterial, ventrículo e átrio. Não foi observado o seio venoso. 0 bulbo arterial não possui estrutura muscular, sendo sua parede formada por tecido conjuntivo elástico, cujas fibras dispõem-se em vários planos formando três camadas. Na cortical, abaixo do tecido conjuntivo, dispõem-se paralelas ao maior eixo; na mediana são perpendiculares e na interna novamente estão dispostas paralelas ao eixo maior do órgão. Não há válvulas entre o bulbo e a aorta. 0 ventrículo é o que possui paredes mais desenvolvidas, quando comparado com as outras duas câmaras. Apresenta uma cavidade central revestida por uma parede espessa, com numerosas fossetas, originando a camada esponjosa. Revestindo-a, há uma camada cortical ou compacta que é envolta por um tecido conjuntivo e externamente nota-se um epitélio formado por células pavimentosas. As fibras musculares apresentam estrias e esporadicamente discos intercalares. 0 átrio apresenta-se externamente de contorno irregular. Possui cinco lóbulos sendo, histologicamente, sua parede constituída por um epicárdio muito delgado, revestido por uma única camada de células bem achatadas. 0 miocárdio é formado por trabéculas pouco desenvolvidas, que conferem à parede miocardial grandes espaços que confluem para uma grande cavidade central. A câmara possui só uma camada - a esponjosa. As células musculares cardíacas apresentam estriações transversais nítidas, ramificações, anastomoses e discos intercalares.0 órgão possui duas válvulas átrio-ventriculares em forma de concha e duas ventrículo-bulbares com o formato de dobras.

Orientador: Waldemiro Gremski Dissertaçao (mestrado) -Universidade Federal do Paraná. Curso de Pós-Graduaçao em Morfologia Resumo: Este trabalho foi feito com o objetivo de comparar o glicocálix de células absortivas intestinais de camundongos, de diferentes idades, a nível ultraestrutural. A procura de possíveis diferenças morfológicas na estrutura, no recém-nascido ou nas diversas etapas até a maturidade, deveu-se à busca de correlações entre elas e o fato de este tipo celular apresentar progressiva perda da sua capacidade de transportar macromoléculas proteicas – as imunoglobulinas entre elas – à circulação. Levantou-se a possibilidade de que o glicocálix fosse o componente celular a agir como barreira a estas moléculas, à medida que se fosse elaborando com o desenvolvimento do animal. O material colhido para exame constituiu-se de segmentos do terço médio do intestino delgado de camundongos de 0, 1, 8, 15 e 22 dias, fixados em glutaraldeído e pós fixados em tetróxido de ósmio, ambos com tampão cacodilato e adicionados de vermelho de rutênio. Com este marcador, observou-se um glicocálix proeminente, morfologicamente uniforme em todas as etapas examinadas. Além desta estrutura, foram observados diferentes tipos de vesículas, entre elas, nas três primeiras etapas, as recobertas, visíveis tanto na porção apical como nas laterais das células. Uma elaboração progressiva dos microfilamentos provenientes dos microvilos e da trama terminal ficou bem evidente com o avançar da maturidade dos animais. Estas observações nos levaram a concluir ser o glicocálix um dos elementos envolvidos na seleção do material a ser transportado e para tanto devendo apresentar Summary: The aim of this work was to compare the ultra structure of the glycocalyx of intestinal absorptive cells from mice at different ages. We tried to find out whether any morphological difference, from the newborn to the adult, would explain the progressive loss of ability of these cells in the transport of intact proteins, including immunoglobulins, to the circulation. If the glycocalyx was the element acting as a barrier for these molecules in the adult, than it should be progressively more elaborated during the animal's postnatal development. Samples were colected from the small intestine of mice at the ages of 0, 1, 8, 15 and 22 days. Glutaraldehyde was used for fixation and osmium tetroxide for postfixation, both buffered with cacodylate and with the addition of ruthenium red. With the ruthenium red the glycocalyx showed conspicuous and ultrastructurally uniform in all the stages. Coated vesicles were evident in the cell apical region as well as nearby the lateral membranes at the first three stages examined. A progressive elaboration of the microfilaments coming from the microvilli and participating of the terminal web was verified with aging in the animals. These observations led us to conclude that the glycocalyx must be one of the elements involved in the selective uptake and transport of the molecules and therefore should progressively change the quality of its components since morphological changes cannot be detected. The other elements involved in the process must be the coated vesicles and membrane-associated cytoskeletal components.